專利名稱：油性佐劑疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種油性佐劑疫苗，以及該疫苗的制備方法。
油性佐劑疫苗是已公知的可有效強(qiáng)化免疫性的疫苗。由于弗氏佐劑具有非常有效的免疫強(qiáng)化作用，尤其是和滅活抗原協(xié)同使用時，因此，試驗(yàn)中已經(jīng)將弗氏佐劑作為經(jīng)典的油性佐劑使用。以弗氏佐劑為代表的油性佐劑含有一種礦物油作為基本成分，具有可靠的免疫強(qiáng)化作用，但也會帶來很多問題，如導(dǎo)致嚴(yán)重的接種反應(yīng)、形成無菌性化膿損害、和接種部位周圍的肉芽腫，可產(chǎn)生外部可見的浮腫、腫脹、硬結(jié)和壞死。而且懷疑在接種部位有留存的可能，這便妨礙了疫苗的使用。如果家畜中存在這種局部反應(yīng)，那么家畜就不宜再作食用了。因此必須盡可能地減小這種留存趨勢?；谶@個原因，使用含有礦物油的油性佐劑的疫苗在接種的部位上有時是受到一定限制的。
有必要提高疫苗的效力和持續(xù)時間，以確保防止疾病的發(fā)生，或發(fā)揮出疫苗的作用。不過，考慮到疫苗是用于人類或獸醫(yī)用途的實(shí)際情況，疫苗的安全性比效力和持續(xù)時間更重要。
在這種情況下，為解決上述問題，人們進(jìn)行了各種研究。例如，日本特許公報(bào)(下文作“J.P.KOKOKU”)Hei 6-81731號公開了一種油包水型油基佐劑，其中無水甘露糖醇/油酸酯作表面活性劑，液體石蠟作油性成分。WO91/00107(TOKUHYO Hei 4-506521)公開了一種低粘度的油包水型油基佐劑，所用的油性成分含有一種可代謝的油如植物油，和一種不可代謝的油如礦物油的混合物。進(jìn)一步地，日本公開特許公報(bào)(下文稱“J.P.KOKAI”)Hei 6-172216號公開了一種油性佐劑疫苗，該疫苗含有一種植物油作油性成分，含有一種脫水山梨糖醇脂肪酸酯和一種聚氧乙二醇脫水山梨糖醇烷基酯的混合物作表面活性劑成分。J.P.KOKOKU Hei 6-39386公開了一種佐劑活體疫苗，該疫苗的制備方法是將一種活體免疫原和一種含礦物油的水包油型乳劑混合。
不過，上述油性佐劑疫苗都存在不足之外，不僅表現(xiàn)在注射后可觀察到的局部反應(yīng)和在注射部位的留存趨勢，還表現(xiàn)在疫苗制劑的穩(wěn)定性上。
疫苗應(yīng)當(dāng)盡可能地有效、安全，因?yàn)橐呙缡怯糜谌梭w或獸醫(yī)用途上的；考慮到疫苗又是一種藥物，它也應(yīng)當(dāng)盡可能地穩(wěn)定。
而對于油性佐劑疫苗來說，已知這種疫苗不僅在免疫強(qiáng)化作用方面，而且在藥物制劑的穩(wěn)定性方面，都在相當(dāng)大程度上受到乳劑類型、所用油性成分以及所結(jié)合的表面活性劑種類等的影響。尤其就滅活疫苗來說，制備出一種具有在較長時間內(nèi)誘導(dǎo)充分免疫保護(hù)作用、并有著良好再現(xiàn)性的疫苗來，是非常困難的。
此外，也有人提出了水包油包水型油性佐劑疫苗，以克服常規(guī)的油包水型油性佐劑疫苗的缺點(diǎn)，即注射部位的局部反應(yīng)和留存趨勢，但是，任一常規(guī)方式仍然受到藥物制劑上的長期穩(wěn)定性問題的困擾，因此，這種疫苗的實(shí)際應(yīng)用還很遙遠(yuǎn)。
本發(fā)明涉及一種油性佐劑疫苗，這種疫苗在常規(guī)應(yīng)用上是受到一定限制的，其原因是所帶來的不希望產(chǎn)生的局部反應(yīng)、留存趨熱和藥物制劑的不穩(wěn)定性，而本發(fā)明試圖解決疫苗的這些常規(guī)問題。因此，本發(fā)明的目的是提供一種油性佐劑疫苗，該疫苗能在較長時間內(nèi)保護(hù)較高的抗體產(chǎn)生能力，而無需在組成中使用任何免疫強(qiáng)化物質(zhì)。該疫苗對活體無害，并具有藥物制劑的優(yōu)異穩(wěn)定性。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了大量研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一種油包水型油性佐劑疫苗和一種水包油包水型油性佐劑疫苗，在接種部位表現(xiàn)出優(yōu)異的局部安全性，在較長時間內(nèi)表現(xiàn)出較強(qiáng)的誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生能力；該油包水型油性佐劑疫苗含有(i)一種常溫下呈液態(tài)的油性成分、(ii)含有一種特殊的親脂性非離子表面活性劑和一種聚氧乙烯羥基脂肪酸甘油三酯的乳化劑、和(iii)含有一種生理學(xué)上可接受的有效量的抗原成分的水相；該水包油包水型油性佐劑疫苗由內(nèi)相和含有一種特殊乳化劑的外層水相組成，該內(nèi)相由上述油包水型乳劑(即上述油性佐劑)組成。而且，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這種即使在低粘度區(qū)域穩(wěn)定性也較高、誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的能力以及保持高水平的抗體產(chǎn)生的能力都很強(qiáng)的油性佐劑疫苗的制備方法步驟為，向常溫下呈液態(tài)的油性成分中加入含有一種特殊的親脂性非離子表面活性劑和一種聚氧乙烯羥基脂肪酸甘油三酯的表面活性劑，和一種凝膠狀復(fù)合物，該復(fù)合物是將特殊的親脂性非離子表面活性劑與含有氨基酸或其鹽及特殊的糖或糖醇的水溶液乳化得到的；然后向所得混合物中加入含有抗原的水相，而形成乳劑。進(jìn)一步地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，有著良好安全性和穩(wěn)定性的水包油包水型油性佐劑疫苗和同類型的常規(guī)疫苗相比，還表現(xiàn)出持久的誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生能力，其制備方法是，先按上述方法制備油包水型油性佐劑疫苗，然后把油包水型油性佐劑疫苗加入到一種含有特殊乳化劑的水相中，進(jìn)行乳化即得?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，發(fā)明人完成了本發(fā)明。
按照本發(fā)明的第一種情形，所提供的油包水型油性佐劑疫苗含有20至90％重量比的常溫下呈液態(tài)的油相A)；0.5至30％重量比的乳化劑、和5至75％重量比的含有一種生理學(xué)上可接受的有效量抗原的水相D)組成，該乳化劑由一種非離子表面活性劑B)和一種聚氧乙烯(20至60摩爾)羥基脂肪酸甘油三酯C)組成，該非離子表面活性劑是由一種具有至少三個羥基的多元醇和一種脂肪酸衍生而來的偏酯，在40℃下呈液態(tài)。
按照本發(fā)明的另一種情形，所提供的水包油包水型油性佐劑疫苗含有油包水型油性佐劑相和外層水相F)，該油包水型油性佐劑相由30至90％重量比的常溫下呈液態(tài)油相A)、0.5至30％重量比的乳化劑、和5至65％重量比的含有一種生理學(xué)上可接受的有效量抗原的水相D)組成，該乳化劑由一種非離子表面活性劑B)和一種聚氧乙烯(20至60摩爾)羥基脂肪酸甘油三酯C)組成，該非離子表面活性劑是由一種具有至少三個羥基的多元醇和一種脂肪酸衍生而來的偏酯，在40℃下呈液態(tài)；該外層水相中含有0.2至20％重量比的總HLB值不小于10的乳化劑，該乳化劑中含有一種非離子表面活性劑。
按照本發(fā)明，油性佐劑疫苗的成分A)是一種常溫下呈液態(tài)的油性成分，術(shù)語“常溫”指15至25℃的溫度范圍。
可用于本發(fā)明的常溫下呈液態(tài)的油性成分選自各種酯型油性基質(zhì)或非酯型油性基質(zhì)，它們通常用在食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域，且在常溫下呈液態(tài)。常溫下呈液態(tài)的非酯型油性基質(zhì)的實(shí)例包括輕液體石蠟、角鯊烯、角鯊?fù)?squalane)和聚丁烯(polybutenes)。另外，常溫下呈液態(tài)的酯型油性基質(zhì)的實(shí)例包括各種由中鏈飽和脂肪酸如辛酸、癸酸或長鏈不飽和脂肪酸如油酸、亞油酸與醇衍生而來的酯，還包括天然存在的脂肪酸酯，例如液態(tài)植物油，有花生油、橄欖油、葵花籽油、紅花油和jojoba油(一種不飽和脂肪酸高的植物油)，以及來源于動物的液態(tài)油，如橙色粗制油。根據(jù)不同情況，它們可單獨(dú)使用也可結(jié)合使用。油酸的酯衍生物和植物油，連同其它油一道，具有很多優(yōu)點(diǎn)，對氧化作用的穩(wěn)定性相對較高，對器官-組織的親和性強(qiáng)，能降低局部的刺激和留存趨勢，因此，優(yōu)選為只從這些可代謝油中選出至少一種作為油性成分。而且，更優(yōu)選為使用一種含有脂肪酸酯的酯型油性基質(zhì)，該脂肪酸酯包含不少于85％重量比的順式-△9-十八碳烯酸和不少于90％重量比的順式-△9-鏈烯酸，及一種醇，如甘油、雙甘油、丙二醇、乙醇、癸醇、油醇，該醇包含不少于85％重量比的順式-△9-十八碳烯醇和不少于90％重量比的順式-△9-鏈烯醇。另一種選擇是，本發(fā)明也可以使用上述脂型油和角鯊烯的混合物。
作為構(gòu)成本發(fā)明的油性佐劑疫苗的乳化劑成分之一的成分B)是一種親脂性非離子表面活性劑，該表面活性劑是由一種具有至少三個羥基的多元醇和一種脂肪酸衍生而來的偏酯，在40℃下呈液態(tài)。所述偏酯可各不相同，這取決于所用醇的種類。例如，如果多元醇是具有三個羥基的甘油，則偏酯主要是其單酯、雙酯的混合物，并含有少量的三酯；如果多元醇是具有4個羥基的雙甘油或脫水山梨糖醇，則偏酯主要是其單酯、雙酯的混合物，并含有少量的三酯和四酯。由于這些偏酯在40℃下呈液態(tài)，又都是親脂性的，因此它們可單獨(dú)使用，也可任意組合使用。
作為制備偏酯的成分使用的具有至少三個羥基的多元醇的實(shí)例包括甘油、雙甘油、三甘油、四甘油、六甘油、八甘油、十甘油、木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇和脫水山梨糖醇。
用作制備偏酯的脂肪酸的實(shí)例為各種已知的脂肪酸，如辛酸、癸酸、月桂酸、油酸和亞油酸，只要它們能與上述多元醇反應(yīng)生成40℃下呈液態(tài)的偏酯即可。在這些脂肪酸中，更優(yōu)選的脂肪酸包含不少于85％重量比的順式-△9-十八碳烯酸和不少于90重量比的順式-△9-鏈烯酸。
舉例來說，特別適宜作為成分B)的偏酯為一油酸甘油酯、脫水山梨糖醇一油酸酯、脫水山梨糖醇二油酸酯、一油酸雙甘油酯和二油酸雙甘油酯，生成該偏酯的脂肪酸包含不少于85％重量比的順式-△9-十八碳烯酸和不少于90％重量比的順式-△9-鏈烯酸。由于這些偏酯中結(jié)合了高純度的油酸作?；?，因此偏酯對氧化作用的穩(wěn)定性很強(qiáng)，而這正是作為乳化劑所必需的；由于這些偏酯確保了在表面活性劑分子間的高度定位作用，因此具有優(yōu)異的乳劑穩(wěn)定化作用等功能特點(diǎn)。所以，和目前市場上所使用的常規(guī)油酸衍生物相比，這些偏酯提高了最終制得的油性佐劑疫苗的穩(wěn)定性，接種的安全性也得到了實(shí)質(zhì)性提高。
用作本發(fā)明的油性佐劑疫苗成分C)的聚氧乙烯(20至60摩爾)羥基脂肪酸甘油三酯中，羥基脂肪酸甘油三酯的實(shí)例為蓖麻油和氫化蓖麻油。在這點(diǎn)上，如果環(huán)氧乙烷的平均數(shù)量小于20摩爾，這樣一種成分C)不會在低粘度區(qū)域形成穩(wěn)定的乳劑，其結(jié)果是不能制得令人滿意的油性佐劑疫苗。另一方面，如果環(huán)氧乙烷的平均數(shù)量大于60摩爾，所得乳劑易發(fā)生轉(zhuǎn)相，最終也不能制得令人滿意的油性佐劑疫苗來。聚氧乙烯羥基脂肪酸甘油三酯結(jié)合在疫苗中的量以制劑的總重量計(jì)(油包水型油性佐劑疫苗的總重量)優(yōu)選為0.5至10％重量比。如果重量小于0.5％，所得乳化的疫苗穩(wěn)定性會被降低。另一方面，如果重量大于10％，所得乳劑易發(fā)生轉(zhuǎn)相，所得疫苗的穩(wěn)定性也因此會降低。
下文中稱“成分E)”的，是本發(fā)明的氨基酸或其鹽及分子中具有至少5個羥基的非還原性糖或糖醇。在油性佐劑疫苗中混入成分E)，即氨基酸或其鹽及分子中具有5個羥基的非還原性糖或糖醇，可進(jìn)一步提高本發(fā)明的乳化疫苗的穩(wěn)定性。此處所用氨基酸或其鹽可選自食品或藥品中所通常使用的氨基酸或其鹽，它們已載入多種標(biāo)準(zhǔn)中，如“日本藥典”、“未列入日本藥典中的藥物成分標(biāo)準(zhǔn)”、“日本藥物賦形劑”。氨基酸的實(shí)例為甘氨酸、丙氨酸、鹽酸精氨酸、天門冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、羥基脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸，優(yōu)選其中的中性氨基酸。進(jìn)一步地，氨基酸鹽的實(shí)例為一價(jià)金屬鹽，如鈉和鉀鹽，以及二價(jià)金屬鹽，如鈣和鎂鹽。在這些氨基酸及其鹽中，特別優(yōu)選為一水合天冬氨酸鈉、二水合天冬氨酸鉀、一水合谷氨酸鈉、一水合谷氨酸鉀。這些氨基酸一般為L式，但其異構(gòu)體如D式或這些同分異構(gòu)體的混合物DL式，同樣也能用在本發(fā)明中。
所用上述分子中具有至少5個羥基的非還原性糖或糖醇可選自食品或藥品中所通常使用的非還原性糖或糖醇，它們已載入多種標(biāo)準(zhǔn)中，如“日本藥典”、“未列入日本藥典中的藥物成分標(biāo)準(zhǔn)”、“日本藥物賦形劑”。本發(fā)明特別優(yōu)選為海藻糖、木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇，乳醇(lactitol)。
此處氨基酸或其鹽及分子中具有至少5個羥基的非還原性糖或糖醇的適宜用量范圍以組成的總重量計(jì)(油性佐劑疫苗的總重量)各自為0.01至10％重量比。
油性佐劑疫苗中，油性成分A)與成分D)，即含有抗原的水相的比例選擇取決于佐劑的應(yīng)用、目的，或所選擇的抗原的種類。尤其是由于結(jié)合使用了一種特殊的油性成分和一種特殊的乳化劑，本發(fā)明的油性佐劑疫苗保持了高度穩(wěn)定性，相應(yīng)地，油性成分與含抗原水相的比例可在較寬范圍內(nèi)選擇。一般來說，該比例的恰當(dāng)選擇是油性成分與水相的重量比例范圍在90∶5至20∶75，優(yōu)選為80∶15至30∶65。
制備佐劑所需上述成分B)即非離子表面活性劑、和成分C)即聚氧乙烯(20至60摩爾)羥基脂肪酸甘油三酯的總量范圍為0.5至30％重量比，優(yōu)選為3至20％重量比，以制劑的總重量計(jì)。這是因?yàn)?，如果重量小?.5％重量比，則不能制得任何穩(wěn)定的乳化系統(tǒng)；如果乳化劑的用量大于30％重量比，會形成在注射局部高反應(yīng)性的佐劑，不能提供本發(fā)明所需的高穩(wěn)定性油性佐劑疫苗。
按照本發(fā)明，油性佐劑疫苗的第一種具體體現(xiàn)形式涉及含有上述油性成分、乳化劑、含抗原水相的油性佐劑疫苗，可由下述方法制備。其方法是，向油性成分A)中加入40℃下呈液態(tài)的非離子表面活性劑[成分B)]和聚氧乙烯(20至60摩爾)羥基脂肪酸甘油三酯[成分C)]，然后，在攪拌下將這些成分混合，再加入含有一種生理學(xué)上可接受的有效量抗原的水相[成分D)]，在攪拌下混合得到乳劑。此方法制得的油包水型油性佐劑疫苗具有良好的乳化狀況。
本發(fā)明的油包水型佐劑疫苗，即使貯存在低溫環(huán)境中，仍具有低粘度和高穩(wěn)定性；在無損于安全性的情況下，其制備方法是，向常溫下呈液態(tài)的油相A)中加入非離子表面活性劑B)、聚氧乙烯(20至60摩爾)羥基脂肪酸甘油三酯C)、和成分B)與成分E)的混合產(chǎn)物，該產(chǎn)物是將非離子表面活性劑成分B)與含成分E)的水溶液按重量比為1∶1至1∶20混合、乳化，直至形成固定的凝膠狀復(fù)合物而得；所述非離子表面活性劑B)是由一種具有至少三個羥基的多元醇和一種脂肪酸衍生而來的偏酯，在40℃下呈液態(tài)；然后將這些成分混合，形成一分散系；向所得分散系中加入含有一種生理學(xué)上可接受的有效量抗原的水相D)；在攪拌下混合，使水相乳化。如果在上述制備固定的凝膠狀復(fù)合物的步驟中，由于攪拌機(jī)的原因使成分溫度升高了，那么攪拌操作可在冷卻下進(jìn)行，以保持溫度在不高于常溫的水平；所述固定的凝膠狀復(fù)合物由成分B)即非離子表面活性劑和含成分E)的水溶液組成，該表面活性劑是由一種具有至少三個羥基的多元醇和一種脂肪酸衍生而來的偏酯，在40℃下呈液態(tài)。
在這點(diǎn)上，成分B)與成分E)的水溶液的最適混合比例的選擇取決于存在于成分E)的水溶液中的氨基酸或其鹽及非還原性糖或糖醇的種類和濃度。舉例來說，如果成分E)的水溶液是含5％wt的一水合L-谷氨酸鈉和5％wt的乳醇(lactitol)，那么成分B)與成分E)的水溶液的適宜重量比例應(yīng)調(diào)整為1∶2至1∶10。此外，如果水溶液中含有30％wt的一水合L-谷氨酸鈉和20％wt的乳醇(lactitol)，那么成分B)與成分E)的水溶液的適宜重量比例應(yīng)調(diào)整為1∶2至1∶15。在這點(diǎn)上，有必要將水溶液中成分E)的濃度在氨基酸或其鹽及非還原性糖或糖醇各自的溶解度范圍內(nèi)調(diào)至盡可能高。
按照本發(fā)明，油性佐劑疫苗的第二種具體體現(xiàn)形式涉及水包油包水型油性佐劑疫苗，由內(nèi)相和外層水相組成，內(nèi)相含有上述油包水型油性佐劑疫苗，外層水相含有至少一種總HLB值(親水親油平衡值)不小于10的非離子表面活性劑。
本說明書中，″HLB″值(親水親油平衡值)根據(jù)W.C.Griffin提出的方程進(jìn)行測定(參見W.C.Griffin，化妝品學(xué)家協(xié)會雜志，1949，1，P311)。
用于構(gòu)成本發(fā)明的水包油包水型油性佐劑疫苗外相的總HLB值不小于10的乳化劑，可單獨(dú)使用，也可任意組合使用，只要總HLB值不小于10?？侶LB值不小于10的非離子表面活性劑可選自藥物領(lǐng)域的常用品，如聚氧乙烯羥基脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基(鏈烯基)醚、聚氧乙烯聚氧丙烯甘醇，它們的總HLB值不小于10。
其中，總HLB值不小于10的聚氧乙烯羥基脂肪酸甘油三酯可與用作油性佐劑疫苗成分的聚氧乙烯羥基脂肪酸甘油三酯相同，如蓖麻油和/或氫化蓖麻油，其環(huán)氧乙烷的平均數(shù)不小于20，優(yōu)選為20至60。這是因?yàn)?，使用環(huán)氧乙烷平均數(shù)小于20的聚氧乙烯羥基脂肪酸甘油三酯不能生成在外相中作為內(nèi)相的油包水型油性佐劑的穩(wěn)定分散系，也就不能形成良好的水包油包水型油性佐劑疫苗。另一方面，如果超過60，所得內(nèi)層的油包水型乳劑相容易發(fā)生轉(zhuǎn)相，再用它就不能最終制得令人滿意的水包油包水型油性佐劑疫苗。
進(jìn)一步地，總HLB值不小于10的聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯可以是聚氧乙烯脫水山梨糖醇不飽和脂肪酸(如油酸)酯和聚氧乙烯脫水山梨糖醇飽和脂肪酸(如月桂酸和辛酸)酯，其平均環(huán)氧乙烷數(shù)不小于10。特別地，優(yōu)選使用的聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸脂中的脂肪酸包含不少于85％wt的順式-△9-十八碳烯酸和不少于90％wt的順式-△9-鏈烯酸，其環(huán)氧乙烷平均數(shù)范圍為10至40。這是因?yàn)?，如果平均環(huán)氧乙烷數(shù)小于10，內(nèi)相的油包水型油性佐劑不能在外層水相中被穩(wěn)定地分散，再用它就不能制得令人滿意的水包油包水型油性佐劑疫苗。另一方面，如果超過40，內(nèi)相的油包水型油性佐劑易發(fā)生乳劑轉(zhuǎn)相，再用它就不能最終制得令人滿意的水包油包水型油性佐劑疫苗。
聚氧乙烯烷基(鏈烯基)醚可以是已公知的烷基醚型表面活性劑，如聚氧乙烯烷基醚，有聚氧乙烯十二烷基醚和聚氧乙烯十六烷基醚；又如聚氧乙烯鏈烯基醚，有聚氧乙烯油?；选?yōu)選為具有一個12至18碳原子的烷基(鏈烯基)，且平均環(huán)氧乙烷數(shù)不小于10，優(yōu)選為10至40。尤其優(yōu)選的聚氧乙烯油?；阎?，油醇包含不少于85％wt的十八碳烷基醇和不少于90％wt的鏈烯醇，及10至40摩爾的環(huán)氧乙烷。在這點(diǎn)上，如果烷基(鏈烯基)的碳原子數(shù)小于12，內(nèi)相的油包水型油性佐劑易發(fā)生轉(zhuǎn)相，再用它就不能制得令人滿意的水包油包水型油性佐劑疫苗；如果超過18，內(nèi)相的油包水型油性佐劑不能在外層水相中被穩(wěn)定地分散，再用它就不能最終制得令人滿意的水包油包水型油性佐劑疫苗。而且，使用環(huán)氧乙烷平均數(shù)小于10的聚氧乙烯烷基(鏈烯基)醚不能得到內(nèi)相的油包水型油性佐劑在外相中的穩(wěn)定的分散系，因此就不能形成良好的水包油包水型油性佐劑疫苗；另一方面，如果超過40，內(nèi)相的油包水型油性佐劑易發(fā)生轉(zhuǎn)相，再用它就不能最終制得令人滿意的水包油包水型油性佐劑疫苗。
此處可用的聚氧乙烯聚氧丙烯甘醇選自那些通常用于藥物和化妝品中且HLB值不小于10者。其中，優(yōu)選為環(huán)氧乙烷數(shù)(聚合的平均程度)范圍為50至200，1，2-環(huán)氧丙烷數(shù)(聚合的平均程度)范圍為5至80，環(huán)氧乙烷與1，2-環(huán)氧丙烷的摩爾數(shù)(聚合的平均程度)之比不小于2∶1。這是因?yàn)槿绻柋刃∮?∶1，內(nèi)相的油包水型油性佐劑不能在外層水相中被穩(wěn)定地分散，再用它就不能制得令人滿意的水包油包水型油性佐劑疫苗。
正如上文所解釋過的，用在構(gòu)成本發(fā)明的水包油包水型油性佐劑疫苗外相中的乳化劑可以是一種HLB值不小于10的乳化劑，或者是兩種或多種乳化劑的混合物，其中至少一種乳化劑是高HLB值的非離子表面活性劑，至少一種乳化劑是低HLB值的非離子表面活性劑，其總HLB值不小于10。在這點(diǎn)上，其中可用的低HLB值的非離子表面活性劑選自那些通常用于藥物等領(lǐng)域的非離子表面活性劑，如脫水山梨糖醇單油酸酯、脫水山梨糖醇倍半油酸酯、和單油酸甘油酯。高HLB值的非離子表面活性劑和低HLB值的非離子表面活性劑的混合物的一個實(shí)例是HLB值為15.0的聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯和HLB值為3.7的脫水山梨糖醇倍半油酸酯。這時，前者與后者混合的重量比例為2∶1，該混合乳化劑的總HLB值約為11.2。
本發(fā)明中，如果將上述總HLB值不小于10的乳化劑混合物與一種甘油磷脂組合使用作為混入外相中的乳化劑，就能進(jìn)一步提高所述水包油包水型油性佐劑疫苗的穩(wěn)定性。
與總HLB值不小于10的乳化劑混合物組合使用的甘油磷脂可選自各種天然存在的甘油磷脂，有來自大豆的(如大豆卵磷脂和氫化大豆卵磷脂)、來自蛋黃的(如蛋黃磷脂和氫化蛋黃磷脂)、各種高純度的磷脂(如磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺)、和溶血磷脂，它們可單獨(dú)使用或任意組合使用。當(dāng)將上述總HLB值不小于10的乳化劑混合物與一種甘油磷脂結(jié)合使用時，其混合比例(重量)非離子表面活性劑混合物/甘油磷脂的適宜比例范圍為20∶1至1∶2。
構(gòu)成本發(fā)明的水包油包水型油性佐劑疫苗外相中的乳化劑用量范圍以外相總重量計(jì)為0.2至20％wt，更優(yōu)選為0.5至10％wt。這是因?yàn)槿绻榛瘎┯昧啃∮?.2％wt，就不能得到任何穩(wěn)定的水包油包水型乳劑；如果超過20％wt，所得油性佐劑疫苗的粘度增加，使疫苗不利于接種，注射時的安全性有時也會降低。
此外，按照本發(fā)明，水包油包水型油性佐劑疫苗中內(nèi)相的油包水型油性佐劑相與外層水相的混合比例，根據(jù)使用目的不同，其適宜范圍為2∶1至1∶10，以重量比例表示。
在這樣制得的水包油包水型油性佐劑疫苗中，為了能有效地將抗原結(jié)合在內(nèi)層水相中，可以采取下述兩步的方法，即首先用含抗原的水相制得油包水型油性佐劑疫苗，然后將所得油包水乳劑作為內(nèi)相，加入到含有一種特殊的乳化劑的外層水相中，就形成了乳劑。
按照本發(fā)明，水包油包水型油性佐劑疫苗例如可按下述方法制備。首先制得按照本發(fā)明的含抗原的油包水型油性佐劑疫苗，然后將此油包水型油性佐劑疫苗加入到水相中，再次乳化含抗原的油包水型油性佐劑疫苗；所述的水相含有一種混合的乳化劑，該混合乳化劑含有至少一種非離子表面活性劑，且總HLB值不小于10；或者該水相為混合乳化劑與一種甘油磷脂的組合，所述的混合乳化劑含有至少一種非離子表面活性劑，且總HLB值不小于10。本發(fā)明的兩步乳化方法制得的水包油包水型油性佐劑疫苗穩(wěn)定性高，安全性好。
更確切地說，具有更高穩(wěn)定性、而無損于安全性的水包油包水型油性佐劑疫苗的制備方法是，首先向常溫下呈液態(tài)的油性成分中加入一種親脂性非離子表面活性劑(成分B)、一種聚氧乙烯(20至60摩爾)羥基脂肪酸甘油三酯(成分C)、和一混合產(chǎn)物，該產(chǎn)物是非離子表面活性劑成分B與含成分E的水溶液按重量比例1∶1至1∶20混合攪拌、直至形成固定的凝膠狀復(fù)合物而得；所述非離子表面活性劑是由一種具有至少三個羥基的多元醇和一種脂肪酸衍生而來的偏酯，在40℃下呈液態(tài)；將這些加入成分混合，分散；然后向所得分散系中加入含有一種生物學(xué)上可接受的有效量抗原的外層水相(成分D)，邊攪拌邊混合，使水相在油相中乳化，得到穩(wěn)定性高的油包水型油性佐劑疫苗；然后將此油包水型油性佐劑疫苗加入到一外層水相中，使含抗原的油包水型油性佐劑疫苗在水相中再乳化；該水相含有一混合的乳化劑，該混合乳化劑中含有至少一種非離子表面活性劑，且總HLB值不小于10，或者該水相為混合乳化劑與一種甘油磷脂的組合，該混合乳化劑中含有至少一種非離子表面活性劑，且總HLB值不小于10。
本發(fā)明的油包水型油性佐劑疫苗的水相、本發(fā)明的水包油包水型油性佐劑疫苗的內(nèi)層水相、或本發(fā)明的水包油包水型油性佐劑疫苗的外層水相可選自常規(guī)疫苗中用到的水相，如磷酸鹽緩沖溶液、生理鹽水溶液、或磷酸鹽緩沖鹽水。
本發(fā)明的水包油包水型油性佐劑疫苗中，由于制備條件等的不同，抗原可以只存在于油包水型乳劑中的內(nèi)層水相中作為內(nèi)相，或者因?yàn)閺膬?nèi)層水中的部分溢漏，抗原存在于兩層水相中，即內(nèi)層水相和外層水相，但是無論如何都不會有損于本發(fā)明的油性佐劑疫苗的作用。
本發(fā)明中，構(gòu)成油性佐劑疫苗的油相和內(nèi)層水相、構(gòu)成水包油包水型油性佐劑疫苗的外層水相等等當(dāng)然可以含有各種對疫苗活性沒有直接影響的成分，如緩沖系、穩(wěn)定劑和/或滲透壓調(diào)節(jié)成分，這些都曾用在多種藥物中。
進(jìn)一步地，在制備本發(fā)明的油性佐劑疫苗時，可使用一般可進(jìn)行乳化作用的任何方法，例如，目前常用的乳化器，如均化混合器，一種均化器和CLEARMIX(購自M技術(shù)有限公司)，及利用多孔玻璃膜的膜乳化器。
向構(gòu)成本發(fā)明的油性佐劑疫苗的水相中混入的抗原可包括多種種類和多種形式的抗原，例如疫苗制備中常用的滅活細(xì)菌細(xì)胞和滅活病毒粒子，以及保護(hù)性抗原，如附著蛋白質(zhì)和被膜。不過，既然本發(fā)明的油性佐劑疫苗非常穩(wěn)定，且很容易通過使用一種特殊油性成分和一種特殊乳化劑的組合得到，因此可以使用各種生物學(xué)上可接受的有效量抗原。
進(jìn)一步地，本發(fā)明的油性佐劑疫苗當(dāng)然可以在乳劑中含有各種藥物，如抗生素，來代替抗原。
正如上文已經(jīng)詳細(xì)討論過的，通過選擇多種成分混入組合物中，本發(fā)明中可制備多種藥物組合物的注射制劑，如油性佐劑疫苗。例如，獸醫(yī)用疫苗可通過皮下注射或肌內(nèi)注射及口服、直腸給藥、鼻飼途徑誘導(dǎo)免疫強(qiáng)化作用，但是給藥途徑的選擇應(yīng)取決于每一具體的給藥目的。
制備佐劑時，其組成成分，如所用的油性基質(zhì)、表面活性劑和水相都必須經(jīng)過滅菌處理。滅菌方法的選擇要考慮到這些化合物的特性。
正如上文已經(jīng)解釋過的，按照本發(fā)明制備的油性佐劑疫苗存在于一高穩(wěn)定、高質(zhì)量的乳劑中。因此，疫苗的穩(wěn)定性和安全性良好，在確保有效、安全的同時可以對多種生物體給藥。
參考下列實(shí)施例，將對本發(fā)明作更詳細(xì)地描述，但是本發(fā)明并不僅限于這些特例。下列實(shí)施例中，除非另外說明，術(shù)語“份”指“重量份”。實(shí)施例(油性佐劑疫苗的制備)下列實(shí)施例中用到的每一個油性佐劑疫苗按下述方法制備，考慮到每一具體成分的特性，選擇加熱或過濾對包括在組成中的全部成分進(jìn)行除菌處理。而且，全部操作如攪拌、乳化等都在無菌條件下的潔凈臺中進(jìn)行。例1疫苗a本例中，油酸乙酯(“NOFABLE EO-90”，購自NOF公司，?；M成88％wt順式-△9-十八碳烯酸成分和94％wt順式-△9-鏈烯酸成分)用作成分A。向12份油性成分中加入1.6份脫水山梨糖醇倍半油酸酯(“NOFABLE SO-992，購自NOF公司，酰基構(gòu)成99％wt順式-△9-十八碳烯酸成分和99％wt順式-△9-鏈烯酸成分)和0.4份加熱至50℃的聚氧乙烯(40)氫化蓖麻油，充分?jǐn)嚢?，并邊攪拌邊向上述混合物中逐漸加入6份含抗原的水相(磷酸鹽緩沖鹽水)，使用CLEARMIX CLM-0.85(購自M技術(shù)有限公司)在常溫下以8000轉(zhuǎn)/分混合乳化10分鐘，得到油包水型性佐劑疫苗a。例2疫苗b本例中，成分A為6份精制葵花籽油和6份角鯊烯的混合物。向油性成分中加入1.6份脫水山梨糖醇倍半油酸酯(“NOFABLE SO-902”，購自NOF公司；?；鶚?gòu)成88％wt順式-△9-十八碳烯酸成分和94％wt 順式-△9-鏈烯酸成分)和0.4份加熱至50℃的聚氧乙烯(40)氫化蓖麻油，充分?jǐn)嚢瑁⑦厰嚢柽呄蛏鲜龌旌衔镏兄饾u加入8份含抗原的水相(磷酸鹽緩沖鹽水)，按照與例1相同的過程使所得混合物混合乳化，得到油包水型油性佐劑疫苗b。例3疫苗C
本例中，油酸油酰基酯(“NOFABLE OO-9080”，購自NOF公司；?；鶚?gòu)成88％wt順式-△9-十八碳烯酸成分和94％wt順式-△9-鏈烯酸成分)用作成分A。向12份油性成分中加入0.8份脫水山梨糖醇倍半油酸酯(“NOFABLE SO-902”，購自NOF公司；酰基構(gòu)成88％wt順式-△9-十八碳烯酸成分和94％wt順式-△9-鏈烯酸成分)、0.7份-油酸甘油酯(“NOFABLEGO-901”，購自NOF公司；?；鶚?gòu)成88％wt順式-△9-十八碳烯酸成分和94％wt順式-△9-鏈烯酸成分)和0.5份加熱至50℃的聚氧乙烯(40)氫化蓖麻油，充分?jǐn)嚢?，并邊攪拌邊向上述混合物中逐漸加入8份含抗原的水相(磷酸鹽緩沖鹽水)，按照與例1相同的過程使所得混合物混合乳化，得到油包水型油性佐劑疫苗C。例4疫苗X1本例中，將5份-油酸甘油酯(“NOFABLE GO-901”，購自NOF公司；?；鶚?gòu)成88％wt順式-△9-十八碳烯酸成分和94％wt順式-△9-鏈烯酸成分)用作成分B，將3份-水合L-谷氨酸鈉和一份甘露糖醇溶解在6份蒸餾水中作為成分E。將成分B和成分E的水溶液混合，在常溫下在CLEARMIX CLM-0.8S(購自M技術(shù)有限公司)中以10,000轉(zhuǎn)/分乳化10分鐘，得到一凝膠狀產(chǎn)物。
然后，將6份油酸油?；?“NOFABLE OO-9080”，購自NOF公司；酰基構(gòu)成88％wt順式-△9-十八碳烯酸成分和94％wt順式-△9-鏈烯酸成分)與6份角鯊烯的混合物作為成分A，向其中加入1.6份脫水山梨糖醇倍半油酸酯(“NOFABLE SO-902”.購自NOF公司；?；鶚?gòu)成88％wt順式-△9-十八碳烯酸成分和94％wt順式-△9-鏈烯酸成分)成分B和0.4份加熱至50℃的聚氧乙烯(40)氫化蓖麻油成分C，充分?jǐn)嚢?，向所得混合物中加入一份上述凝膠狀產(chǎn)物，使前者在油相中分散，邊攪拌邊向上述混合物中逐漸加入8份含抗原的磷酸鹽緩沖鹽水的水相，然后使用CLEARMIX CLM-0.8S(購自M技術(shù)有限公司)在常溫下以8000轉(zhuǎn)/分混合乳化10分鐘，得到油包水型油性佐劑疫苗X1。實(shí)施例5疫苗X2在本實(shí)施例中，用6份一油酸雙甘油酯[“NOFABLE PG0-9021L”，可由NOF公司購得；?；鶚?gòu)成88重量％的順-△9-十八烯酸和94重量％順-△9-鏈烯酸]作為組分B，將4份L-谷氨酸鈉-水合物和1份乳醇(lactitol)溶于7份蒸餾水中，所得水溶液作為組分E，將組分B和組分E的水溶液混合并采用實(shí)施例4中相同的方法將其乳化后得到凝膠狀產(chǎn)物。
然后，向作為油性成分的6份精制葵花子油和6份油酸乙酯[“NOFABLE EO-90”，可由NOF公司購得；?；鶚?gòu)成88重量％的順-△9-十八烯酸和94重量％順-△9-鏈烯酸]的混合物中加入1.6份脫水山梨糖醇倍半油酸酯[“NONION OP-83RAT”，可由NOF公司購得；酰基構(gòu)成55重量％的順-△9-十八烯酸和78重量％順-△9-鏈烯酸]和0.4份聚氧乙烯(40)氫化的蓖麻油，將它們加熱到50℃，并予以充分?jǐn)嚢?，接著?份前面得到的凝膠狀產(chǎn)物加入該混合物中使其分散于油相內(nèi)，再邊攪拌邊逐漸加入8份由含有抗原的磷酸鹽緩沖液組成的水相，然后將它們混合并采用實(shí)施例4中相同的方法進(jìn)行乳化，從而得到油包水型油性佐劑疫苗X2。實(shí)施例6疫苗X3在本實(shí)施例中，用4份-油酸甘油酯[“NOFABLE GO-991P”，可由NOF公司購得，?；鶚?gòu)成99重量％的順-△9-十八烯酸和99重量％順-△9-鏈烯酸]和4份二油酸甘油酯[“NOFABLEGO-902P”，可由NOF公司購得；酰基構(gòu)成88重量％的順-△9-十八烯酸和94重量％順-△9-鏈烯酸]作為組成B，將4份L-天冬氨酸鈉-水合物和1份海藻糖溶于11份蒸餾水中，所得水溶液作為組分E，將組分B和組分E混合并采用實(shí)施例4中相同的方法將其乳化后得到凝膠狀產(chǎn)物。
然后，向作為油性成分的8份油酸癸酯[“NOFABLE DO-99”，可由NOF公司購得；?；鶚?gòu)成99重量％的順-△9-十八烯酸和99重量％的順-△9-鏈烯酸]和4份角鯊烯的混合物中加入0.8份脫水山梨糖醇倍半油酸酯[“NOFABLE SO-992”，可由NOF公司購得；?；鶚?gòu)成99重量％的順-△9-十八烯酸和99重量％的順-△9-鏈烯酸]、1.2份-油酸甘油酯[“NOFABLE GO-991”，可由NOF公司購得；?；鶚?gòu)成99重量％的順-△9-十八烯酸和99重量％的順-△9-鏈烯酸]和0.4份聚氧乙烯(40)氫化蓖麻油，將它們加熱到50℃，并予以充分?jǐn)嚢?，接著，?份前面得到的凝膠狀產(chǎn)物加入該混合物中使其分散于油相內(nèi)，再邊攪拌邊逐漸加入10份由含有抗原的磷酸鹽緩沖液組成的水相，然后將它們混合并采用實(shí)施例4中相同的方法進(jìn)行乳化，從而得到油包水型油性佐劑疫苗X3。實(shí)施例7疫苗d在本實(shí)施例中，用油酸乙酯[“NOFABLE EO-99”，可由NOF公司購得；?；鶚?gòu)成99重量％的順-△9-十八烯酸和99重量％的順-△9-鏈烯酸]作為組分A。向12份該油性成分中加入1.7份脫水山梨糖醇倍半油酸酯[“NOFABLE SO-902”，可由NOF公司購得；?；鶚?gòu)成88重量％的順-△9-十八烯酸和94重量％的順-△9-鏈烯酸]和0.3份聚氧乙烯(40)氫化蓖麻油，將它們加熱到50℃，并予以充分?jǐn)嚢?，再邊攪拌邊逐漸加入8份含有抗原的水相(磷酸鹽緩沖液)，然后將它們混合并采用實(shí)施例1中相同的方法進(jìn)行乳化，從而得到油包水型油性佐劑疫苗。
然后用0.4份聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)甘醇(HLB值為16.0)作為表面活性劑，將其加入并均勻溶解于10份磷酸鹽緩沖液中，接著，邊攪拌邊逐漸加入10份前面得到的油包水型油性佐劑，然后將它們混合并在常溫和8,000rpm的條件下，用CLEARMIX CLM-0.8S(可由MTECHNIQUE Co.Ltd.購得)使其乳化5分鐘，從而得到水包油包水型油性佐劑疫苗d。實(shí)施例8疫苗e在本實(shí)施例中，用6份精制jojoba油(一種不飽和脂肪酸高的植物油)和6份角鯊烯的混合物作為組分A。向該油性成分中加入1.6份脫水山梨糖醇倍半油酸酯[“NONION OP-83RAT”，可由NOF公司購得；?；鶚?gòu)成55重量％的順-△9-十八烯酸和78重量％的順-△9-鏈烯酸]和0.4份聚氧乙烯(40)氫化蓖麻油，將它們加熱到50℃，并予以充分?jǐn)嚢?，再邊攪拌邊逐漸加入8份含有抗原的水相(磷酸鹽緩沖液)，然后將它們混合并采用實(shí)施例1中相同的方法進(jìn)行乳化，從而得到油包水型油性佐劑疫苗。
然后用0.2份聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇-油酸酯(“NONIONOT-221”，可由NOF公司購得；酰基構(gòu)成55重量％的順-△9-十八烯酸和78重量％的順-△9-鏈烯酸；HLB15.8)作為表面活性劑，將其加入并均勻溶解于10份磷酸鹽緩沖液中，接著邊攪拌邊逐漸加入10份前面得到的油包水型油性佐劑，然后將它們混合并采用實(shí)施例7中相同的方法進(jìn)行乳化，從而得到水包油包水型油性佐劑疫苗e。實(shí)施例9疫苗f在本實(shí)施例中，把由6份油酸油酯[“NOFABLE OO-9080”，可由NOF公司購得；?；鶚?gòu)成88重量％的順-△9-十八烯酸和94重量％的順-△9-鏈烯酸]和6份三油酸甘油酯[“NOFABLE GO-993”，可由NOF公司購得；酰基構(gòu)成99重量％的順-△9-十八烯酸和99重量％的順-△9-鏈烯酸)組成的混合物用作組分A。向該油性成分中加入0.9份脫水山梨糖醇倍半油酸酯[“NOFABLE SO-902”，可由NOF公司購得；?；鶚?gòu)成88重量％的順-△9-十八烯酸和94重量％的順-△9-鏈烯酸]、0.8份-油酸甘油酯[“NOFABLEGO-991”，可由NOF公司購得；?；鶚?gòu)成99重量％的順-△9-十八烯酸和99重量％的順-△9-鏈烯酸]和0.3份聚氧乙烯(40)氫化蓖麻油，將它們加熱到50℃，并予以充分?jǐn)嚢瑁龠厰嚢柽呏饾u加入8份含有抗原的水相(磷酸鹽緩沖液)，然后將它們混合并采用實(shí)施例1中相同的方法進(jìn)行乳化，從而得到油包水型油性佐劑疫苗。
然后用0.14份聚氧乙烯(60)氫化蓖麻油(HLB值為14.8)和0.06份氫化大豆卵磷脂(“COATSOME NC-21”，可由NOF公司購得)作為表面活性劑，將其加入并均勻溶解于10份磷酸鹽緩沖液中，再邊攪拌邊逐漸加入10份前面得到的油包水型油性佐劑，然后將它們混合并采實(shí)施例7中相同的方法進(jìn)行乳化，從而得到水包油包水型油性佐劑疫苗f。實(shí)施例10疫苗X4在本實(shí)施例中，用5份-油酸甘油酯[“NOFABLE GO-901”，可由NOF公司購得；?；鶚?gòu)成88重量％的順-△9-十八烯酸和94重量％的順-△9-鏈烯酸]作為組分B，將3份L-谷氨酸鈉-水合物和1份甘露糖醇溶于6份蒸餾水中，所得水溶液作為組分E，將組分B和組分E混合并采用實(shí)施例4中相同的方法將其乳化，則得到凝膠狀產(chǎn)物。
然后，向作為油性成分的12份油酸乙酯[“NOFABLE EO-90”，可由NOF公司購得；酰基構(gòu)成88重量％的順-△9-十八烯酸和94重量％順-△9-鏈烯酸]中加入1.7份脫水山梨糖醇倍半油酸酯[“NOFABLE SO-902”，可由NOF公司購得；?；鶚?gòu)成88重量％的順-△9-十八烯酸和94重量％的順-△9-鏈烯酸]和0.3份聚氧乙烯(40)氫化蓖麻油，將它們加熱到50℃，并予以充分?jǐn)嚢瑁又鴮?份前面得到的凝膠狀產(chǎn)物加入該混合物中使其分散于油相內(nèi)，再邊攪拌邊逐漸加入8份由含有抗原的磷酸鹽緩沖液組成的水相，然后將它們混合并采用實(shí)施例4中相同的方法進(jìn)行乳化，從而得到油包水型油性佐劑疫苗。
然后用0.4份聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)甘醇(HLB值為16.0)作為表面活性劑，將其加入并均勻溶解于10份磷酸鹽緩沖液中，再邊攪拌邊逐漸加入10份前面得到的油包水型油性佐劑疫苗，然后將它們混合并在常溫和8,000rpm的條件下，用CLEARMIX CLM-0.8S(可由MTECHNIQUE Co.Ltd.購得)使其乳化5分鐘，從而得到水包油包水型油性佐劑疫苗X4。實(shí)施例11疫苗X5在本實(shí)施例中，用6份脫水山梨糖醇-油酸酯[“NOFABLE SO-901”，可由NOF公司購得；?；鶚?gòu)成88重量％的順-△9-十八烯酸和94重量％的順-△9-鏈烯酸]作為組分B，將4份L-谷氨酸鈉-水合物和1份乳醇(lactitol)溶于7份蒸餾水中，所得水溶液作為組分E。將組分B和組分E混合并采用實(shí)施例4中相同的方法將其乳化，得到凝膠狀產(chǎn)物。
然后，以10份精制葵花子油和2份角鯊?fù)榻M成的混合物作為油性成分，向其中加入1.7份脫水山梨糖醇倍半油酸酯[“NOFABLE SO-902”，可由NOF公司購得；酰基構(gòu)成88重量％的順-△9-十八烯酸和94重量％的順-△9-鏈烯酸]和0.3份聚氧乙烯(40)氫化蓖麻油，將它們加熱到50℃，并予以充分?jǐn)嚢?，接著?份前面得到的凝膠狀產(chǎn)物加入該混合物中使其分散于油相內(nèi)，再邊攪拌邊逐漸加入8份由含有抗原的磷酸鹽緩沖液組成的水相，然后將它們混合并采用實(shí)施例1中相同的方法進(jìn)行乳化，從而得到油包水型油性佐劑疫苗。
然后，用0.14份聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇-油酸酯(“NONION OT-221”，可由NOF公司購得；?；鶚?gòu)成55重量％的順-△9-十八烯酸和78重量％的順-△9-鏈烯酸；HLB15.8)和0.06份氫化的大豆卵磷脂(“COATSOME NC-21”，可由NOF公司購得)作為表面活性劑，將它們加入并均勻溶解于10份磷酸鹽緩沖液中，再邊攪拌邊逐漸加入10份前面得到的油包水型油性佐劑疫苗，然后將它們混合并采用實(shí)施例7中相同的方法進(jìn)行乳化，從而得到水包油包水型油性佐劑疫苗X5。對比例1疫苗g向作為油性成分的輕液體石蠟(“CRYSTOL52”，可由ESSO公司購得)中加入0.8份脫水山梨糖醇倍半油酸酯(“NONIONOP-83RAT”，可由NOF公司購得；?；鶚?gòu)成55重量％的順-△9-十八烯酸和83重量％的順-△9-鏈烯酸]和0.2份降氧乙烯(20)脫水山梨糖醇-油酸酯(“NONI ON OT-221”，可由NOF公司購得；?；鶚?gòu)成55重量％的順-△9-十八烯酸和78重量％的順-△9-鏈烯酸)，接著邊充分?jǐn)嚢柽呏饾u加入3份含有抗原的水相(磷酸鹽緩沖液)，然后將它們混合并采用實(shí)施例1中相同的方法進(jìn)行乳化，得到用作對比的油包水型油性佐劑疫苗g。
對比例2疫苗h由6份油酸油?；?“NOFABLE OO-9080”，可由NOF公司購得；?；鶚?gòu)成88重量％的順-△9-十八烯酸和94重量％的順-△9-鏈烯酸)和6份角鯊?fù)榻M成的混合物作為組分A，向其中加入1.6份脫水山梨糖醇倍半油酸酯(“NONI ON OP-83RAT”，可由NOF公司購得；?；鶚?gòu)成55重量％的順-△9-十八烯酸和78重量％的順-△9-鏈烯酸)0.4份聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇-油酸酯(“NONI ON OT-221”，可由NOF公司購得；?；鶚?gòu)成55重量％的順-△9-十八烯酸和78重量％的順-△9-鏈烯酸)，然后加以充分?jǐn)嚢?，再邊攪拌邊逐漸加入8份含有抗原的水相(磷酸鹽緩沖液)，然后將它們混合并采用實(shí)施例1中相同的方法進(jìn)行乳化，從而得到用作對比的油包水型油性佐劑疫苗h。對比例3疫苗i由6份油酸油酰酯(“NOFABLE OO-9080”，可由NOF公司購得；?；鶚?gòu)成88重量％的順-△9-十八烯酸和94重量％的順-△9-鏈烯酸)和6份角鯊?fù)榻M成的混合物作為組分A，向其中加入1.6份脫水山梨糖醇倍半油酸酯(“NONI ON OP-83RAT”，可由NOF公司購得；?；鶚?gòu)成55重量％的順-△9-十八烯酸和78重量％的順-△9-鏈烯酸)和0.4份聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇-油酸酯(“NONI ON OT-221”，可由NOF公司購得；酰基構(gòu)成55重量％的順-△9-十八烯酸和78重量％的順-△9-鏈烯酸)然后加以充分?jǐn)嚢瑁龠厰嚢柽呏饾u加入8份含有抗原的水相(磷酸鹽緩沖液)，然后將它們混合并采用實(shí)施例1中相同的方法進(jìn)行乳化，得到油包水型油性佐劑疫苗。
然后用0.14份聚氧乙烯(60)氫化蓖麻油(HLB14.8)和0.06份氫化大豆卵磷脂(“COATSOME NC-21”，可由NOF公司購得)作為表面活性劑，將其加入并均勻分散于10份磷酸鹽緩沖液中，再邊攪拌邊逐漸加入10份前面得到的油包水型油性佐劑，然后將它們混合并采用實(shí)施例7中相同的方法進(jìn)行乳化，從而得到用作對比的水包油包水型油性佐劑疫苗i。對比例4疫苗Y1用實(shí)施例4中相同的方法，將5份脫水山梨糖醇-油酸酯[“NOFABLE SO-901”，可由NOF公司購得；?；鶚?gòu)成88重量％的順-△9-十八烯酸和94重量％的順-△9-鏈烯酸]和將4份乳醇(lactitol)溶于6份蒸餾水中后得到的水溶液進(jìn)行乳化，得到凝膠狀產(chǎn)物。
然后，向12份三油酸甘油酯[“NOFABLE GO-903”，可由NOF公司購得；酰基構(gòu)成88重量％的順-△9-十八烯酸和94重量％的順-△9-鏈烯酸]中加入1份脫水山梨糖醇倍半油酸酯[“NOFABLESO-902”，可由NOF公司購得；?；鶚?gòu)成88重量％的順-△9-十八烯酸和94重量％的順-△9-鏈烯酸]和0.5份聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇-油酸酯(“NONI ON OT-221”，可由NOF公司購得；?；鶚?gòu)成55重量％的順-△9-十八烯酸和78重量％的順-△9-鏈烯酸)，再加以充分?jǐn)嚢?，并加?份前面得到的凝膠狀產(chǎn)物；使其分散于油相內(nèi)，然后再邊攪拌邊逐漸加入6份由含有抗原的磷酸鹽緩沖液組成的水相，將它們混合并采用實(shí)施例4中相同的方法進(jìn)行乳化，從而得到用作對比的油包水型油性佐劑疫苗Y1。對比例5疫苗Y2向作為油性成分的6份輕液體石蠟(“CRYSTOL 52”可由ESSO公司購得)中加入0.8份脫水山梨糖醇倍半油酸酯(“NONI ONOP-83RAT”，可由NOF公司購得；?；鶚?gòu)成55重量％的順-△9-十八烯酸和78重量％的順-△9-鏈烯酸)和0.2份聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇-油酸酯(“NONI ON OT-221”，可由NOF公司購得；?；鶚?gòu)成55重量％的順-△9-十八烯酸和78重量％的順-△9-鏈烯酸)，接著再邊充分?jǐn)嚢柽呏饾u加入3份由含有抗原的磷酸鹽緩沖液組成的水相，然后將它們混合并采用實(shí)施例1中相同的方法進(jìn)行乳化，得到油包水型油性佐劑疫苗。
然后用0.2份聚氧乙烯(60)氫化蓖麻油(HLB14.8)作為表面活性劑，將其加入并均勻分散于10份磷酸鹽緩沖液中，接著再邊攪拌邊逐漸加入10份前面得到的油包水型油性佐劑疫苗，然后將它們混合并采用實(shí)施例10中相同的方法進(jìn)行乳化，從而得到作為對比的水包油包水型油性佐劑疫苗Y2。免疫接種試驗(yàn)用含有不同抗原的特異性油性佐劑疫苗進(jìn)行免疫接種試驗(yàn)。在個體疫苗的識別中，以實(shí)施例或?qū)Ρ壤_的成分為基礎(chǔ)制備的疫苗，都有相對應(yīng)的、附著在特異性疫苗上的記號來指示。試驗(yàn)例1用于傳染性豬放線桿菌病的滅活疫苗將放線桿菌胸膜肺炎NG-22菌株(血清型2)接種到培養(yǎng)基上，在37℃下，進(jìn)行通氣-旋動培養(yǎng)，所得培養(yǎng)基用福爾馬林滅活，再通過離心收集細(xì)菌細(xì)胞并進(jìn)行洗滌。收集到的這些細(xì)胞即作為抗原。再以1010CFU/劑量(CFU集落形成單位)的濃度(在滅活前)將抗原分散于磷酸鹽緩沖液中，所得分散系即為含有抗原的水相。
以1ml/只的量將疫苗a、c或X2、或者以2ml/只的量將疫苗d、f或X4對免疫組(每組包括5只4周大的SPF(無特定病原體)小豬)的小豬進(jìn)行肌肉注射，每四周注射一次，共注射2次。對于免疫對照組(每組包括5只4周大的SPF小豬)的小豬，則以1ml/只的量將疫苗g或h、或者以2ml/只的量將疫苗i或Y2對其進(jìn)行肌肉注射，每四周注射一次，共注射2次。此外，未經(jīng)免疫的空白對照組也包括5只小豬，并將它們與免疫組或免疫對照組的小豬安置在一起。觀察每只小豬的臨床癥狀，包括在每次免疫接種后觀察其注射部位2周，在整個試驗(yàn)期間，間隔一定時間即收集每只小豬的血清，并通過補(bǔ)體結(jié)合(CF)試驗(yàn)來測定抗體效價(jià)。從最初疫苗注射起，16周后，通過尸體解剖來檢查注射部位所形成的結(jié)節(jié)的大小及分布，并以損傷情況為基礎(chǔ)記錄檢查結(jié)果(無損傷0；～嚴(yán)重?fù)p傷；3)，然后再對每組中的5只動物求平均值。
關(guān)于安全性的結(jié)果列于表1中。在臨床癥狀上，免疫組沒有出現(xiàn)發(fā)熱，也沒有顯示任何不正?，F(xiàn)象。免疫對照組則觀察到了體溫的短暫升高，但很快降下來了。從最初免疫注射起16周后進(jìn)行的尸檢中，免疫組沒有觀察到任何特別的損傷，但免疫對照組則觀察到了結(jié)節(jié)，這有可能是由注射物質(zhì)引起的。
表1關(guān)于傳染性豬放線桿菌病的滅活疫苗的安全性試驗(yàn)組 疫苗最初免疫接種后 加強(qiáng)劑量后損傷情況C.S.1)B.T.2)C.S.1)B.T.2)評分免疫組 疫苗a 0/53)0/53)0/50/5 0疫苗c 0/5 0/5 0/50/5 0疫苗d 0/5 0/5 0/50/5 0疫苗f 0/5 0/5 0/50/5 0疫苗X20/5 0/5 0/50/5 0疫苗X40/5 0/5 0/50/5 0免疫對 疫苗g 5/5 5/5 5/55/5 3照組 疫苗h 3/5 3/5 3/53/5 2疫苗i 5/5 5/5 4/55/5 1疫苗Y25/5 5/5 5/55/5 2空白對 --0/5 0/5 0/50/5 0照組1)臨床癥狀2)體溫3)(出現(xiàn)任何不正?，F(xiàn)象的試驗(yàn)動物數(shù))/(試驗(yàn)動物總數(shù))。
疫苗功效的觀察結(jié)果總結(jié)在表2-1和表2-2中。注射了疫苗a、c或X2的免疫組，從疫苗注射起4周后，CF-抗體效價(jià)開始升高，從疫苗注射起8周后，觀察到良好的抗體應(yīng)答(1128到1256)，這與注射了疫苗g的免疫對照組觀察到的結(jié)果幾乎相同，但明顯高于注射了疫苗h的免疫對照組觀察到的結(jié)果。本發(fā)明中的水包油包水型油性佐劑疫苗d、f和X4可以良好的乳劑形式存在，并顯示出與前面提到的油包水乳劑型油性佐劑疫苗幾乎同樣好的抗體應(yīng)答。上述制備的用于免疫對照組的疫苗i和Y2以不穩(wěn)定的乳劑形式存在，注射后所顯示出的抗體應(yīng)答明顯低于注射了疫苗d和f的組。
上述結(jié)果清楚地表明，本發(fā)明的油性佐劑疫苗即使只包含一種可代謝的油，也能顯示出與含有不可代謝的礦物油的疫苗大致相同的免疫增強(qiáng)作用，并且，與含有礦物油的疫苗相比，本發(fā)明的油性佐劑疫苗具有極好的局部反應(yīng)能力。
此外，這些結(jié)果也表明，按照本發(fā)明的方法制備的油性佐劑疫苗即使只含有一種可代謝的油，其穩(wěn)定性也較高，并且這些疫苗在長時間內(nèi)所顯示的免疫作用，與慣用的僅含有不可代謝的礦物油的油性佐劑疫苗所達(dá)到的效果基本相同，且與慣用的僅含礦物油的疫苗相比，本發(fā)明的油性佐劑疫苗有極好的局部反應(yīng)能力。
表2-1用于傳染性豬放線桿菌病的滅活疫苗的功效試驗(yàn)組 疫苗 注射后經(jīng)過的時間(周)0 4 6 8免疫組 疫苗a ＜41)1456147疫苗c ＜418111 169疫苗d ＜4124284疫苗f ＜4113774免疫對 疫苗g ＜43797111照組疫苗h ＜4 ＜4 4 4疫苗i ＜4 ＜4 4 ＜4空白對 -- ＜4 ＜4 ＜4 ＜4照組1)最高稀釋顯示≥50％固定的倒數(shù)的幾何均數(shù)，用App(2型)。
表2-2用于傳染性豬放線桿菌病的滅活疫苗的功效試驗(yàn)組 疫苗 注射后經(jīng)過的時間(周)0 4 6 8 1216免疫組 疫苗X2 ＜41)24147 169 14774疫苗X4 ＜432111979742免疫對 疫苗g ＜43797111128 84照組疫苗Y2 ＜4 ＜4 4 4＜4 ＜4空白對 -- ＜4 ＜4 ＜4 ＜4＜4 ＜4照組1)最高稀釋顯示≥50％固定的倒數(shù)的幾何均數(shù)，用App(2型)。試驗(yàn)例2用于日本腦炎的滅活疫苗將日本腦炎病毒(JEV)Nakayama菌株接種到小鼠腦內(nèi)并加以培養(yǎng)，當(dāng)病毒增殖到極點(diǎn)時即收獲該小鼠的腦。將其制成腦勻漿并通過離心沉淀，所得上清液用福爾馬林滅活。該上清液即用作抗原。加入了福爾馬林的磷酸鹽緩沖液作為水相，其所含病毒在滅活之前已調(diào)整到106.0LD50/劑量。以1ml/只的量將疫苗b、或者以2ml/只的量將疫苗e對免疫組(每組包括5只10周大的SPF小豬)的小豬進(jìn)行肌肉注射。以1ml/只的量將疫苗g肌肉注射到免疫對照組(每組包括5只10周大的SPF小豬)的每只小豬體內(nèi)。此外，未經(jīng)免疫的空白對照組包括5只小豬，它們與免疫組或免疫對照組的小豬安置在一起。觀察每只小豬的臨床癥狀，包括在每次免疫接種后觀察其注射部位2周，在整個試驗(yàn)期間，每間隔一定時間即采集每只小豬的血清，并通過血凝抑制(HI)試驗(yàn)來測定抗體效價(jià)。從最初疫苗注射起16周后，通過尸體解剖來檢查注射部位所形成的結(jié)節(jié)的大小及分布，并記錄其損傷情況(無損傷0；～嚴(yán)重?fù)p傷3)，然后再對每組中的5只小豬求平均值。
關(guān)于安全性的結(jié)果列于表3中。在臨床癥狀上，免疫組和免疫對照組均未出現(xiàn)發(fā)熱，也未顯示其它任何不正常現(xiàn)象。在免疫注射16周后進(jìn)行的尸檢中，免疫組沒有觀察到任何特別的損傷，但免疫對照組則觀察到了結(jié)節(jié)，這有可能是由注射物質(zhì)引起的。
表3用于日本腦炎的滅活疫苗的可靠性試驗(yàn)組 疫苗 結(jié)果 損傷情況C.S.1)B.T.2)評分免疫組 疫苗b 0/53)0/53)0疫苗e 0/5 0/5 0免疫對 疫苗g 0/5 0/5 2.6照組空白對 -- 0/5 0/5 0照組1)臨床癥狀2)體溫3)(出現(xiàn)任何不正?，F(xiàn)象的試驗(yàn)動物數(shù))/(試驗(yàn)動物總數(shù))。
關(guān)于疫苗功效的觀察結(jié)果總地在表4中。注射了疫苗b的免疫組，從疫苗注射起4周后，HI-抗體效價(jià)開始升高；8周后，觀察到良好的抗體應(yīng)答(1∶80到1∶160)，這與注射了疫苗g的免疫對照組觀察到的結(jié)果幾乎相同。本發(fā)明中的水包油包水型油性佐劑疫苗e能以良好的乳劑形式存在，即使單獨(dú)注射也能提高HI-抗體效價(jià)，并且顯示出與上面提到的油包水乳劑型油性佐劑疫苗大致相同的抗體應(yīng)答。
表4用于日本腦炎的滅活疫苗的功效試驗(yàn)組疫苗注射后經(jīng)過的時間(周)0 4 6 8免疫組 疫苗b＜101)6180139疫苗e＜109292 92免疫對 疫苗g＜107092 92照組空白對 --- ＜10 ＜10 ＜10 ＜10照組1)血凝抑制試驗(yàn)幾何均數(shù)效價(jià)的倒數(shù)上述結(jié)果清楚地表明，即使用JEV作為抗原時，本發(fā)明的油性佐劑疫苗所顯示的免疫作用，也與含不可代謝的油的疫苗所顯示的作用幾乎相同，并且與后者相比，前者具有極好的局部反應(yīng)能力。試驗(yàn)例3用于新城病(ND)的滅活疫苗將新城病病毒Ishii菌株接種(105.0EID50/卵)到10天大的胚胎卵的尿囊腔中，在37℃下培養(yǎng)4天，收集尿囊液。該尿囊液用福爾馬林水溶液滅活后，用作抗原。用磷酸鹽緩沖液作為水相，其中加入了福爾馬林，且它所含的病毒在滅活之前調(diào)整到108.0EID50/劑。
對于免疫組(每組包括10只5周大的SPF小雞)，用0.5ml/只的量肌肉注射疫苗a或b，或者以1ml/只的量肌肉注射疫苗d或e；對于其他免疫組(每組包括20只5周大的SPF小雞)，以0.5ml/只的量肌肉注射疫苗X1或X2，或者以1.5ml/只的量肌肉注射疫苗X5。對于免疫對照組(每組包括10只5周大的SPF小雞)，以0.5ml/只的量肌肉注射疫苗g，或者以1ml/只的量肌肉注射疫苗i；對于其它免疫對照組(每組包括20只5周大的SPF小雞)，以0.5ml/只的量肌肉注射疫苗Y2。此外，未經(jīng)免疫的空白對照組，每組包括10只或20只小雞，它們分別與包括10只或20只小雞的免疫組安置在一起。
對于注射了疫苗a、b、d和e的組，觀察其中每只小雞的臨床癥狀，包括在免疫接種后觀察其注射部位10周，從免疫接種起10周后，采集每只小雞的血清并測定其HI-抗體效價(jià)。從免疫接種起10周后，通過尸體解剖(每組解剖5只)來檢查其注射部位，由此檢定殘留物的殘留程度及其分布，并記錄為損傷情況(無損傷0；～嚴(yán)重?fù)p傷3)，然后對每組求平均值。每組中剩下的5只小雞再進(jìn)一步肌肉注射ND病毒Sato菌株，注射量為104MLD/只(MLD最小致死量)，注射后觀察其臨床癥狀2周，同時在注射2周后采集血樣，測定血樣的HI抗體效價(jià)，從而檢定該動物是否感染了ND病毒。
對于注射了疫苗X1、X2、X5和Y2的組，觀察每只小雞的臨床癥狀，包括在免疫接種后觀察注射部位20周，采集每只小雞的血清并測定其HI抗體效價(jià)。從免疫接種起10周后，通過尸體解剖(每組解剖10只小雞)檢查注射部位的殘留物的殘留程度及分布，并記錄為損傷情況(無損傷0；～嚴(yán)重?fù)p傷3)，然后再對每組求平均值。從注射起20周后，每組中剩下的10只小雞再進(jìn)一步肌肉注射ND病毒Sato菌株，注射量為104MLD/只，(MLD最小致死量)，注射后觀察其臨床癥狀2周，同時在注射2周后采集血樣，測定血樣的HI抗體效價(jià)，從而檢定該動物是否感染了ND病毒。
關(guān)于安全性的結(jié)果列于表5-1和表5-2中。注射了疫苗g、i和Y2的免疫對照組的小雞，注射后立即出現(xiàn)了短暫的跛行。另一方面，在整個試驗(yàn)期間，注射了本發(fā)明的疫苗的免疫組，沒有出現(xiàn)任何不正?，F(xiàn)象。從免疫接種起10周后進(jìn)行的尸檢中，注射了疫苗b的5只小雞，其中有2只觀察到少量的油狀物質(zhì)；注射了疫苗X2的5只小雞，其中有3只觀察到少量的油狀物質(zhì)，其它免疫組則沒有觀察到任何損傷。然而，注射了疫苗g、i和Y2的所有免疫對照組，則觀察到了從介質(zhì)到強(qiáng)列殘留物的存在。
表5-1用于新城病的滅活疫苗的安全性試驗(yàn)組 疫苗注射后經(jīng)過的時間 損傷情況0 2 3 4 6 10 評分免疫組 疫苗a 0/101)0/10 0/10 0/10 0/10 0/100疫苗b 0/100/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0.4疫苗d 0/100/10 0/10 0/10 0/10 0/100疫苗e 0/100/10 0/10 0/10 0/10 0/100免疫對 疫苗g 6/100/10 0/10 0/10 0/10 0/10 2.2照組疫苗i 4/100/10 0/10 0/10 0/10 0/10 1.8空白對 -- 0/100/10 0/10 0/10 0/10 0/100照組1)(出現(xiàn)任何不正?，F(xiàn)象的動物數(shù))/(參加試驗(yàn)動物數(shù))
表5-2用于新城病的滅活疫苗的安全性試驗(yàn)組 疫苗 注射后經(jīng)過的時間0 2 3 4 6 812免疫組 疫苗X1 0/201)0/20 0/20 0/20 0/20 0/20 0/10疫苗X2 0/200/20 0/20 0/20 0/20 0/20 0/10疫苗X5 0/200/20 0/20 0/20 0/20 0/20 0/10免疫對 疫苗Y2 9/200/20 0/20 0/20 0/20 0/20 0/10照組空白對 -- 0/200/20 0/20 0/20 0/20 0/20 0/10照組1)(出現(xiàn)任何不正常現(xiàn)象的動物數(shù))/(參加試驗(yàn)動物數(shù))
表5-2(續(xù))試驗(yàn)組注射后經(jīng)過的時間損傷情況1620評分免疫組 0/10 0/10 00/10 0/100.60/10 0/10 0免疫對 0/10 0/101.8照組空白對 0/10 0/10 0照組對疫苗功效的觀察結(jié)果總結(jié)于表6-1和表6-2中。將注射了油包水型油性佐劑疫苗a、b、X1和X2的免疫組觀察到的結(jié)果，與注射了疫苗g的免疫對照組觀察的結(jié)果進(jìn)行對比，二者之間沒有任何不同，因此認(rèn)為它們的功效是相同的。另一方面，將注射了水包油包水型油性佐劑疫苗d、e和X5的免疫組觀察的結(jié)果，與注射了疫苗i和Y2的免疫對照組觀察的結(jié)果進(jìn)行對比，后者的HI-抗體效價(jià)明顯低于前者。
上述結(jié)果清楚地表明，本發(fā)明的油性佐劑疫苗即使僅包含一種可代謝的油，它所顯示的免疫作用也與含有不可代謝的礦物油的疫苗的作用基本相同，且與含礦物油的油性佐劑疫苗相比，本發(fā)明的油性佐劑疫苗有非常好的局部反應(yīng)能力。
此外，這些結(jié)果也表明，按照本發(fā)明的方法制備的油性佐劑疫苗具有高穩(wěn)定性，它們所顯示的免疫作用，與慣用的僅含不可代謝的礦物油的油性佐劑疫苗所達(dá)到的效果基本相同，且與慣用的油性佐劑疫苗相比，本發(fā)明的油性佐劑疫苗有極好的局部反應(yīng)能力。此外，上述結(jié)果也證明，本發(fā)明的水包油包水型油性佐劑疫苗同樣具有高穩(wěn)定性，在長時間內(nèi)顯示出極好的功效，同時也有極好的局部反應(yīng)能力。
表6-1 用于新城病的滅活疫苗的功效試驗(yàn)組 疫苗 注射后經(jīng)過的時間(周) 存活率0周10周 (％)2)免疫組 疫苗a ＜51)520 100疫苗b ＜5 453 100疫苗d ＜5 422 100疫苗e ＜5 394 100免疫對 疫苗g ＜5 597 100照組疫苗i ＜5 171 100空白對 -- ＜5＜50照組1)HI幾何均數(shù)效價(jià)的倒數(shù)2)(允許無癥狀的動物數(shù))/(試驗(yàn)動物總數(shù))
表6-2用于新城病的滅活疫苗的功效試驗(yàn)組 疫苗注射后經(jīng)過的時間(周) 存活率0 101520 (％)2)免疫組 疫苗X1 ＜51)557520 453 100疫苗X2 ＜5640485 520 100疫苗X5 ＜5597422 368 100免疫對 疫苗Y2 ＜5171 8 ＜5 100照組空白對 -- ＜5＜5＜5 ＜50照組1)HI幾何均數(shù)效價(jià)的倒數(shù)2)(允許無癥狀的動物數(shù))/(試驗(yàn)動物總數(shù))試驗(yàn)例4用于牛短暫熱的滅活疫苗將牛短暫熱(BEF)病毒YHL菌株接種到由Hmlu-1細(xì)胞構(gòu)成的該細(xì)胞的單層，將MDI(感染復(fù)數(shù))調(diào)節(jié)至0.01，然后在37℃下經(jīng)過60分鐘，使該病毒吸附到此單層上，再將它加到培養(yǎng)基上，在34℃下培養(yǎng)3天，并將上清液用福爾馬林滅活。用加有福爾馬林的磷酸鹽緩沖液作為水相，它所含的病毒在滅活之前已被調(diào)整到106.0TCID50/劑。
對免疫組(每組包括兩頭體重約150kg的牛)的牛，以1ml/牛的量肌肉注射疫苗a、X1或X3，或者以3ml/牛的量肌肉注射疫菌d；對免疫對照組(每組包括兩頭體重為150kg的牛)的牛，則以1ml/牛的量肌肉注射疫苗g或Y1。此外，未經(jīng)免疫的空白對照組也包括兩頭牛，并將它們與免疫組或免疫對照組的牛安置在一起。觀察每頭牛的臨床癥狀，包括在免疫接種后，觀察注射部位及體溫2周。此外，從免疫注射后，每間隔一定時間即采集每頭牛的血清，用來檢測中和抗體效價(jià)。從免疫注射起20周后，通過尸體解剖來檢查注射部位。
關(guān)于安全性的結(jié)果列于表7中。在臨床癥狀和體溫方面，免疫組和免疫對照組均未出現(xiàn)任何不正?，F(xiàn)象。對免疫注射部位進(jìn)行的尸檢中，僅在免疫對照組觀察到了疫苗殘留物。
表7 用于牛短暫熱的滅活疫苗的安全性試驗(yàn)組 疫苗 結(jié)果 損傷情況C.S.1)B.T.2)評分免疫組 疫苗a 0/23)0/23)0疫苗b 0/2 0/2 0疫苗X1 0/23)0/23)0疫苗X3 0/2 0/2 0免疫對 疫苗g 0/2 0/2 1照組疫苗Y1 0/2 0/2 0空白對 --- 0/2 0/2 0照組1)臨床癥狀；2)體溫3)(出現(xiàn)任何不正常現(xiàn)象的動物數(shù))/(試驗(yàn)動物總數(shù))
對疫苗功效的觀察結(jié)果總結(jié)于表8-1和表8-2中。從免疫接種起4周后，免疫組的抗體效價(jià)開始升高，抗體效價(jià)出現(xiàn)的變化與免疫對照組觀察的結(jié)果相同。注射了疫苗X1和X3的免疫組顯示的抗體效價(jià)的變化優(yōu)于注射了疫苗Y1的免疫對照組的觀察結(jié)果，并且這種趨勢一直保持到接種后20周。
表8-1用于牛短暫熱的滅活疫苗的功效試驗(yàn)組疫苗注射后經(jīng)過的時間(周)0 4 6 8免疫組 疫苗a＜21)163232＜2326464疫苗d＜2323232＜2643232免疫對 疫苗g＜2326432照組＜2326464空白對 --- ＜2 ＜2 ＜2 ＜2照組--- ＜2 ＜2 ＜2 ＜21)BEF中和抗體效價(jià)表8-2 用于牛短暫熱的滅活疫苗的功效試驗(yàn)組 疫苗 注射后經(jīng)過的時間0 4 6 812 1620免疫組 疫苗X1 ＜21)8163232 3232疫苗X1 ＜232326464 6464疫苗X3 ＜232323232 3232疫苗X3 ＜232646464 3232免疫對 疫苗Y1 ＜2 8 8 4 44 4照組疫苗Y1 ＜216 8 8 88 8空白對 -- ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2照組＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜21)BEF中和抗體效價(jià)上述結(jié)果清楚地表明，即使本發(fā)明的油性佐劑疫苗僅包含一種可代謝的油時，它所顯示的免疫作用也與含不可代謝的礦物油的疫苗的作用基本相同，且與含礦物油的佐劑疫苗相比，本發(fā)明的油性佐劑疫苗有相當(dāng)好的局部反應(yīng)能力。
上述結(jié)果也證明，按照本發(fā)明的方法制備的油性佐劑疫苗具有高穩(wěn)定性，顯示的免疫作用長久，且具有極好的局部反應(yīng)能力。穩(wěn)定性將實(shí)施例4-6、7-11以及對比例4-5中制得的油性佐劑疫苗，按照下述方法操作后，立即觀察它們的穩(wěn)定性，結(jié)果總結(jié)于表9中。試驗(yàn)例5油包水型佐劑疫苗將每種油包水型油性佐劑疫苗(5ml)放入容積為15ml的、帶頂蓋的聚丙烯Spitz管(無菌)內(nèi)，隨即在不同溫度條件下觀察其穩(wěn)定性。分別于1天、3個月及12個月后用肉眼觀察三次，然后再用相差顯微鏡(放大率×1000)(每種5個可見區(qū))觀察每種樣品，所得結(jié)果以下列判斷標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)進(jìn)行記錄◎無(或極少)相分離，滴液大小無(或極小)變化○油相僅輕微分離，和/或滴液大小有輕微變化△水相分離，和/或滴液部分“損壞*”×油相、水相均分離，和/或清楚地觀察到滴液“損壞*”××清楚地觀察到相分離，和/或相內(nèi)幾乎不含抗原*)“損壞”是指乳劑中的小滴液自發(fā)的結(jié)合形成大滴液(融合)。試驗(yàn)例6水包油包水型油性佐劑疫苗將每種水包油包水型油性佐劑疫苗(10ml)放入20ml的、帶頂蓋的玻璃螺旋管(無菌)中，隨即在不同溫度條件下觀察其穩(wěn)定性。分別于1天、3個月和12個月后肉眼觀察三次，然后再用相差顯微鏡(放大率×1000)(每種5可見區(qū))觀察每種樣品，所得結(jié)果以下列判斷標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)進(jìn)行記錄◎無(或極少)相分離，滴液大小無(或極小)變化○滴液大小有輕微變化，但仍保持水包油包水形式。
△清楚地觀察到滴液融合，但仍保持水包油包水形式。
×清楚地觀察到滴液“損傷”，以至于水包油包水型結(jié)構(gòu)保存不再良好××水包油包水型結(jié)構(gòu)幾乎已被破壞，清楚地觀察到相分離※“損傷”是指乳劑中的小液滴自發(fā)的結(jié)合形成大滴液(融合)。
表9油性佐劑疫苗的穩(wěn)定性疫苗在4℃下保存(月) 在室溫下保存(月)No.1(天)3 12 1(天)3 12X1 ◎ ◎ ◎◎ ◎ ◎X2 ◎ ◎ ◎◎ ◎ ◎X3 ◎ ◎ ◎◎ ◎ ◎X4 ◎ ◎ ◎◎ ◎ ◎X5 ◎ ◎ ◎◎ ◎ ◎Y1 ◎ ○ △◎ ○ ×Y2 ○ × ×× ○ × ××
列于表1-9中的結(jié)果清楚地表明，本發(fā)明制備的油性佐劑疫苗具有極好的安全性和誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的能力；按照下述方法制備的油性佐劑疫苗具有低粘滯性和極好的長期穩(wěn)定性和持續(xù)不斷地誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的能力，該方法包括以下步驟將聚氧乙烯羥基脂肪酸甘油三酯和由本發(fā)明中的組分B和E的水溶液組成的凝膠狀物質(zhì)加入到油性成分中，將這些原料混合后，再加入含有生物學(xué)上可接受的、有效量的抗原的水相，使水相乳化于油相中。包括以下幾個步驟的方法則可制備出安全性和抗體產(chǎn)生能力極佳的水包油包水型油性佐劑疫苗將前面制得的油包水型油性佐劑疫苗加入到含有本發(fā)明的混合乳化劑的水相中，使該疫苗再次乳化到水相中。
發(fā)明效果正如上面詳細(xì)敘述的那樣，本發(fā)明能制備出有用的油性佐劑疫苗，在不使用任何免疫刺激劑，如植物血凝素等藥物的情況下，該疫苗也能在較長時間內(nèi)顯示出誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的良好能力，并具有藥物所必需的出色的穩(wěn)定性和安全性。
權(quán)利要求
1.一種油包水型油性佐劑疫苗，由20至90％重量比的常溫下呈液態(tài)的油相A)、0.5至30％重量比的乳化劑和5至75％重量比的含有一種生物學(xué)上可接受的有效量抗原的水相D)組成，該乳化劑含有一種非離子表面活性劑B)和一種聚氧乙烯(20至60摩爾)羥基脂肪酸甘油三酯C)，該非離子表面活性劑是由一種具有至少三個羥基的多元醇和一種脂肪酸衍生而來的偏酯，在40℃下呈液態(tài)。
2.一種油包水型油性佐劑疫苗，含有20至90％重量比的常溫下呈液態(tài)的油相A)、0.5至30％重量比的乳化劑、E)0.01至10％重量比的氨基酸或其鹽及0.01至10％重量比的分子中具有至少5個羥基的非還原性糖或糖醇、和5至75％重量比的含有一種生物學(xué)上可接受的有效量抗原的水相D)組成，所說的乳化劑含有一種非離子表面活性劑B)和一種聚氧乙烯(20至60摩爾)羥基脂肪酸甘油三酯C)，該非離子表面活性劑是由一種具有至少三個羥基的多元醇和一種脂肪酸衍生而來的偏酯，在40℃下呈液態(tài)。
3.一種水包油包水型油性佐劑疫苗，由油包水型油性佐劑相和外層水相F)組成，該油包水型油性佐劑相由30至90％重量比的常溫下呈液態(tài)的油相A)、0.5至30％重量比的乳化劑和5至65％重量比的含有一種生物學(xué)上可接受的有效量抗原的水相D)組成，所說的乳化劑含有一種非離子表面活性劑B)和一種聚氧乙烯(20至60摩爾)羥基脂肪酸甘油三酯C)，該非離子表面活性劑是由一種具有至少三個羥基的多元醇和一種脂肪酸衍生而來，在40℃下呈液態(tài)；該外層水相F)中含有0.2至20％重量比的乳化劑，該乳化劑中含有一種非離子表面活性劑，該乳化劑的總HLB值不小于10。
4.一種水包油包水型油性佐劑疫苗，由油包水型油性佐劑相和外層水相F)組成，該油包水型油性佐劑相含有30至90％重量比的常溫下呈液態(tài)的油相A)、0.5至30％重量比的乳化劑E)0.01至10％重量比的氨基酸或其鹽及0.01至10％重量比的分子中具有至少5個羥基的非還原性糖或糖醇、和5至65％重量比的含有一種生物學(xué)上可接受的有效量抗原的水相D)組成，所說的乳化劑含有一種非離子表面活性劑B)和一種聚氧乙烯(20至60摩爾)羥基脂肪酸甘油三酯C)，該非離子表面活性劑是由一種具有三個羥基的多元醇和一種脂肪酸衍生而來，在40℃下呈液態(tài)；該外層水相中含有0.2至20％重量比的總HLB值不小于10的乳化劑，該乳化劑中含有一種非離子表面活性劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)權(quán)利要求的油性佐劑疫苗，所述常溫下呈液態(tài)的油相A)是一種脂肪酸酯。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)權(quán)利要求的油性佐劑疫苗，所述常溫下呈液態(tài)的油相A)是一種脂肪酸酯與角鯊烯的混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)權(quán)利要求的油性佐劑疫苗，所述常溫下呈液態(tài)的油相A)是一種脂肪酸和一種醇的酯，該脂肪酸包含不少于85％重量比的順式-△9-十八碳烯酸和不少于90％重量比的順式-△9-鏈烯酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)權(quán)利要求的油性佐劑疫苗，所述組成非離子表面活性劑B)的脂肪酸包含不少于85％重量比的順式-△9-十八碳烯酸和不少于90重量比的順式-△9-鏈烯酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求3或4的油性佐劑疫苗，所述外層水相F)含有0.2至20％重量比的一種乳化劑和一種甘油磷脂的混合物，所說的乳化劑含有一種非離子表面活性劑，且總HLB值不小于10。
10.一種如權(quán)利要求2所述的油包水型油性佐劑疫苗的制備方法，其步驟包括，向常溫下呈液態(tài)的油相A)中加入一種非離子表面活性劑B)、一種聚氧乙烯(20至60摩爾)羥基脂肪酸甘油三酯C)、和非離子表面活性劑B)與含有成分E)的水溶液按重量比例1∶1至1∶20混合乳化產(chǎn)物，該成分E)為氨基酸或其鹽和分子中具有至少5個羥基的非還原性糖或糖醇，所述非離子表面活性劑是由一種具有至少三個羥基的多元醇和一種脂肪酸衍生而來的偏酯，在40℃下呈液態(tài)；然后加入含有一種生物學(xué)上可接受的有效量抗原的水相D)，以使水相在油相中乳化。
11.一種如權(quán)利要求4所述的水包油包水型油性佐劑疫苗的制備方法，其步驟包括，向常溫下呈液態(tài)的油相A)中加入一種非離子表面活性劑B)、一種聚氧乙烯(20至60摩爾)羥基脂肪酸甘油三酯C)、和非離子表面活性劑B)與含有成分E)的水溶液按重量比例1∶1至1∶20的混合乳化產(chǎn)物，該成分E)為氨基酸或其鹽和分子中具有至少5個羥基的非還原性糖或糖醇，所述非離子表面活性劑是由一種具有至少三個羥基的多元醇和一種脂肪酸衍生而來的偏酯，在40℃下呈液態(tài)；然后加入含有一種生物學(xué)上可接受的有效量抗原的水相D)，以形成油包水型油性佐劑疫苗；將此油包水型油性佐劑疫苗加入到含有0.2至20％重量比乳化劑的水相F)中，以使油包水型油性佐劑疫苗在水相中乳化，所述乳化劑含有一種非離子表面活性劑，且總HLB值不小于10。
全文摘要
一種油包水型油性佐劑疫苗，包括20至90％重量比的常溫下呈液態(tài)的油相A)、0.5至30％重量比的乳化劑、和5至75％重量比的含有一種生物學(xué)上可接受的有效量抗原的水相D)，該乳化劑由一種非離子表面活性劑B)和一種聚氧乙烯(20至60摩爾)羥基脂肪酸甘油三酯C)組成，該非離子表面活性劑是由一種具有至少三個羥基的多元醇和一種脂肪酸衍生而來的偏酯，在40℃下呈液態(tài)；所述疫苗還可包括可選的組分E)，為0.01至10％重量比的氨基酸或其鹽與0.01至10％重量比的分子中具有至少5個羥基的非還原性糖或糖醇。此外，一種水包油包水型油性佐劑疫苗，由作為內(nèi)相上述油包水型油性佐劑疫苗和一外層水相F)組成，該水相含有0.2至20％重量比的總HLB值不小于10的乳化劑，該乳化劑含有一種總HLB值不小于10的非離子表面活性劑。所述油性佐劑疫苗在較長時間內(nèi)顯示了較高的誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的能力，還具有藥物所需的優(yōu)異的穩(wěn)定性和安全性。
文檔編號A61K39/39GK1159914SQ96123100
公開日1997年9月24日 申請日期1996年11月30日 優(yōu)先權(quán)日1995年11月30日
發(fā)明者宮原德治, 高瀨公三, 齋藤晃一, 岸本洋子, 德山悟 申請人:財(cái)團(tuán)法人化學(xué)及血清療法研究所, 日本油脂株式會社