專利名稱：：含有抗血栓形成且不出血肝素的組合物及其制備方法和治療應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及含有肝素的組合物及其制備方法和治療應(yīng)用。更特別地，本發(fā)明涉及由魚精蛋白中和的含肝素組合物，該組合物具有抗血栓形成活性但卻明顯降低了出血和抗凝活性。人們已知道和使用肝素?cái)?shù)十年了。肝素被用于制備具有抗血栓形成和/或抗凝活性的藥物；這種活性可特別用作靜脈和動(dòng)脈血栓形成的預(yù)防性和治療性處理，或者用作預(yù)防體外循環(huán)中的凝固活性。人們?cè)跀?shù)十年前就知道如何制備低分子量肝素，該肝素已經(jīng)具備抗血栓形成活性，但其抗凝活性卻降低了。盡管如此，對(duì)于不分級(jí)的肝素或低分子量肝素，出血危險(xiǎn)仍然是基于肝素治療方法的主要并發(fā)問題。由此極大地限制了特別對(duì)于具有出血素因的患者、患有十二指腸潰瘍或胃潰瘍的病人或最近進(jìn)行過外科手術(shù)的患者使用肝素，在這些患者中借助肝素進(jìn)行抗血栓形成治療可能會(huì)引起出血。因此，當(dāng)考慮到與這種永恒的出血危險(xiǎn)有關(guān)的可觀副作用時(shí)，肝素的優(yōu)越性能，即抗血栓形成活性或抗凝活性，不能被正確地利用。當(dāng)利用肝素治療過程中出現(xiàn)出血時(shí)，該治療可使用能產(chǎn)生體內(nèi)肝素中和效果的硫酸魚精蛋白。盡管魚精蛋白如此使用過多年，但魚精蛋白中和肝素的機(jī)理卻不十分清楚。相對(duì)近期的研究簡(jiǎn)單地表明低分子量肝素可比不分級(jí)的肝素中和至較低的程度(“InVitroProta分鐘eNeutralizationProfile0fHeparineDifferinginSourceandMolecularWeight”，SE分鐘ARSINTHROMBOSISANDINHEMOSTASIS，vol.15，No.4，1989)。因此，本發(fā)明所要解決的問題之一是降低上述可觀的出血危險(xiǎn)，該問題限制了肝素的治療用途。更確切地，本發(fā)明的目的是盡可能地消除與肝素有關(guān)的出血危險(xiǎn)，與此同時(shí)能夠保持其主要的性能，特別是其抗血栓形成活性。由此，本發(fā)明的目的是提供具有非常優(yōu)越的藥理性能特別是抗血栓形成性能的肝素組合物，該組合物與目前使用的肝素組合物基本相同，而并不表現(xiàn)出可觀出血危險(xiǎn)的主要缺陷。本發(fā)明的另一目的是提供制備這類組合物的方法，該方法操作簡(jiǎn)單且便宜，而且可發(fā)展該組合物的治療應(yīng)用。本發(fā)明還涉及這些組合物的治療應(yīng)用。這些目的可通過使用本發(fā)明的肝素組合物達(dá)到，所述組合物具有抗血栓形成活性且基本上沒有出血活性。這些組合物的特征在于基本上由通過魚精蛋白體外中和肝素得到的肝素成分組成。所述魚精蛋白中和的肝素成分應(yīng)當(dāng)理解為由天然或已經(jīng)分級(jí)的肝素或由合成肝素衍生的任何成分，該肝素的出血能力已被魚精蛋白或任何具有相似的降低出血能力的類似物或其等同物的作用中和。本發(fā)明組合物優(yōu)越地由通過利用魚精蛋白體外中和不分級(jí)的肝素或低分子量肝素得到的肝素成分組成。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，組合物是由其中25％為分子量小于2.5kDa和40％為分子量大于20kDa的肝素成分組成。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，組合物只是由分子量小于2.5kDa的肝素成分組成。在另外的實(shí)施方案中，肝素成分的分子量光譜依賴于所使用的魚精蛋白中和的模式。本發(fā)明組合物基本上不含魚精蛋白。本發(fā)明還提供了制備上述組合物的方法，其特征在于包括借助魚精蛋白體外中和肝素的步驟。本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)肝素的出血活性可在體外被中和，特別是可使用魚精蛋白來中和，而且與此同時(shí)能夠保持其抗血栓形成性能。更確切地，本發(fā)明的方法包括在溶液中，使肝素與特別是以魚精蛋白鹽形式存在的魚精蛋白以不同的肝素/魚精蛋白比例進(jìn)行反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，將肝素溶液與魚精蛋白鹽溶液優(yōu)選在室溫下混合，再將所得混合物進(jìn)行離心并收集上清液。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語肝素溶液是指天然或已分級(jí)的肝素或合成肝素的溶液。魚精蛋白鹽優(yōu)越地由硫酸魚精蛋白組成。根據(jù)本發(fā)明，可使用任何具有相似的中和肝素能力并因此降低出血能力的魚精蛋白類似物或等同物。然后可將上清液凍干。可使用能夠基本消除與肝素有關(guān)的出血危險(xiǎn)的不同比例待處理肝素和魚精蛋白。該方法包括利用魚精蛋白或等同物中和肝素的步驟，優(yōu)選的肝素/魚精蛋白比例為2/1至1/2。根據(jù)該方法的一個(gè)實(shí)施方案，肝素/魚精蛋白比例約為1/1。在此情況下，得到了含有其中至少25％的分子量小于2.5kDa和至少40％的分子量大于20kDa的成分的肝素組合物。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，肝素/魚精蛋白比例約為1/2。在此情況下，得到了基本上含有分子量小于2.5kDa的成分的肝素組合物。根據(jù)本發(fā)明的方法，可得到不含魚精蛋白的肝素組合物。本發(fā)明肝素組合物的藥理研究出人意料地揭示該組合物基本上沒有出血活性，而且保持其抗血栓形成性能。藥理研究還出人意料地揭示根據(jù)本發(fā)明魚精蛋白中和得到的肝素成分具有抗血栓形成活性，該活性隨著給藥劑量的增加而增強(qiáng)，而不會(huì)同時(shí)增加其出血或抗凝活性。另外的實(shí)驗(yàn)步驟可以表明本發(fā)明組合物能夠比不分級(jí)的肝素更有效地抑制人體白細(xì)胞彈性蛋白酶的水解活性。根據(jù)本發(fā)明，抑制出血危險(xiǎn)可使得在治療某些支氣管肺病中設(shè)想通過非腸道路徑或通過作為氣溶膠的支氣管肺路徑給藥成為可能；上述支氣管肺病可能涉及白細(xì)胞彈性蛋白酶過高，如急性呼吸窘迫綜合癥、胰纖維性囊腫病和妨礙性慢性支氣管肺病。本發(fā)明穩(wěn)定且無毒的肝素組合物可用于制備用在各種治療應(yīng)用中的藥物。這些應(yīng)用為肝素及其標(biāo)準(zhǔn)衍生物的應(yīng)用場(chǎng)合，包括根據(jù)患者存在的出血危險(xiǎn)禁忌肝素的情形。所述組合物可特別地用于制備治療和預(yù)防靜脈或動(dòng)脈血栓形成或預(yù)防體外循環(huán)中凝固作用的藥物。因此本發(fā)明還涉及包含與可藥用載體組合的治療有效量的上述本發(fā)明肝素組合物的藥物組合物。它們可以是如抗血栓形成藥物組合物或者是用于抑制人白細(xì)胞彈性蛋白酶水解活性的組合物。這些組合物的肝素成分可以由標(biāo)準(zhǔn)方法得到的可藥用鹽形式存在。本發(fā)明藥物組合物優(yōu)越地為特別是通過非腸道給藥的注射制劑。對(duì)于其它應(yīng)用，如抑制白細(xì)胞彈性蛋白酶，可優(yōu)越地提供適用于支氣管肺給藥的劑型。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將通過閱讀下文給出的非限定性實(shí)施例和附圖而變得明顯，其中圖1為不分級(jí)的肝素、低分子量肝素和本發(fā)明肝素組合物中不出血肝素(S1、S2、S3)的出血活性比較圖；圖2為不分級(jí)的肝素、低分子量肝素和本發(fā)明肝素組合物(S1、S2、S3)的抗血栓形成活性比較圖。實(shí)施例使用的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)肝素(LEO)、硫酸魚精蛋白(CHOAY)和低分子量肝素(“依諾肝素”，商品名為“Lovenox”(PHARMUKA))。—實(shí)施例1制備上清液S1制備14.4ml滴定度為72,000IU(480mg)的標(biāo)準(zhǔn)肝素溶液和48ml滴定度為48,000HAU的硫酸魚精蛋白溶液。將這些溶液在室溫下一起混合。肝素/魚精蛋白的比例為1∶1，也就是說，用1mg硫酸魚精蛋白中和lmg肝素。將所得混合物離心10分鐘，回收上清液并凍干。—實(shí)施例2制備上清液S2根據(jù)實(shí)施例1中描述的方法進(jìn)行，使用9ml標(biāo)準(zhǔn)肝素溶液(即45,000IU，300mg)和60ml硫酸魚精蛋白(即60,000HAU)。肝素/魚精蛋白的比例為1/2，也就是說，用2mg硫酸魚精蛋白中和1mg肝素。—實(shí)施例3制備上清液S3根據(jù)實(shí)施例1中描述的方法進(jìn)行，使用4ml低分子量肝素溶液(“依諾肝素”(Lovenox))(即400mg)和40ml硫酸魚精蛋白(即40,000HAU)。肝素/魚精蛋白的比例為1/1，也就是說，用1mg硫酸魚精蛋白中和1mg低分子量肝素。生物特征—分子量分布表I由實(shí)施例1得到的上清液S1—由百分?jǐn)?shù)表示的分子量分布></tables>—上清液S1(實(shí)施例1)的紫外吸收光譜稀釋至1/20的溶液在下述波長(zhǎng)處具有兩個(gè)吸收峰212nmOD＝3.47和271.5nmOD＝2.22—滴定上清液S1(實(shí)施例1)在凍干由實(shí)施例1制得的上清液S1之前，每個(gè)燒瓶中裝入0.7ml上清液溶液。為了檢驗(yàn)可重現(xiàn)性，進(jìn)行12次相同的測(cè)定結(jié)果示于下表III表III</tables>AZUREAKleinM.D.等人的方法A-Xa肝素的計(jì)時(shí)測(cè)定(HepadotLaboratoireStago)A-IIa氨解方法—蛋白質(zhì)測(cè)定根據(jù)Pierce方法(Pierce實(shí)驗(yàn)室的試劑藥盒)測(cè)定分別由實(shí)施例1和2制得的上清液S1和S2中的蛋白質(zhì)。結(jié)果示于下表IV表IV—電解質(zhì)組成(mEq/l)上清液S1和S2中的電解質(zhì)組成示于下表V表V—確定pH表VI藥理研究A.在大鼠體內(nèi)以停滯誘導(dǎo)的靜脈血栓形成模型和按照出血誘導(dǎo)模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究根據(jù)C.Doutremepuich等人的“Experimentalvenousthrombosisinratstreatedwithheparinandlowmolecularweightheparinfraction”，Haemostasis，13，109-112(1983)中描述的方法進(jìn)行研究。a.治療模型(誘導(dǎo)血栓形成兩小時(shí)后皮下注射)根據(jù)下述步驟進(jìn)行兩次研究T0結(jié)扎腔靜脈T0+2小時(shí)皮下注射溶液T0+5小時(shí)30分鐘誘導(dǎo)出血T0+6小時(shí)取出樣品(血和凝塊)。進(jìn)行第一次研究后得到的結(jié)果排列在下表VII和VIII中表VII<tablesid="table8"num="008"><tablewidth="722">凝塊重量(mg)IHT(sec)CKT(sec)DTT(sec)對(duì)照組5.54±1.54108±2019.6±1.319.4±0.5肝素(2mg)1.76±0.53*420±00*180.0±0*180.0±0*S1(2mg)2.90±0.88*141±3623.2±1.820.5±1.5S2(2mg)4.19±1.07123±3221.4±2.119.6±1.4LovenoX(2mg)3.03±0.72*153±4825.2±2.120.8±0.9肝素(1mg)4.18±1.06144±6025.9±2.621.5±1.0S1(1mg)4.68±0.91122±2823.1±1.720.5±1.5S2(1mg)4.55±1.48123±3421.3±2.119.7±1.2Lovenox(1mg)4.84±0.94146±4021.6±2.020.0±1.5</table></tables>IHT誘導(dǎo)的出血時(shí)間CKT腦磷脂高嶺土?xí)r間DTT稀釋凝血酶時(shí)間*＝P＜0.05(MannWhitney試驗(yàn))表VIII第一次研究表明在產(chǎn)生上清液S1的肝素/魚精蛋白比例為1/1，劑量為2mg時(shí)，相對(duì)于不分級(jí)的肝素和Lovenox(低分子量肝素)，由魚精蛋白體外中和的肝素能夠得到更可觀的抗血栓形成活性，而且抗凝活性和出血活性僅有很弱的增加。上清液S1對(duì)血細(xì)胞沒有作用。進(jìn)一步地，由肝素/魚精蛋白比例為1/2中和得到的上清液S2沒有出血活性，卻具有降低的抗血栓形成活性。第二次研究的結(jié)果示于下表IX表IX</tables>Clotwt.實(shí)驗(yàn)?zāi)龎K的重量IHT誘導(dǎo)出血時(shí)間CKT腦磷脂高嶺土?xí)r間DTT稀釋凝血酶時(shí)間由得到的結(jié)果可以看出本發(fā)明成分S1、S2和S3的抗血栓形成活性隨著給藥劑量的增加而增加。當(dāng)我們考慮到劑量范圍為2mg/kg至10mg/kg的劑量-效果曲線時(shí)，可從圖1中看出，不論本發(fā)明治療的肝素類型如何，所得肝素成分具有與對(duì)照組類似的出血活性，即使是在很高的劑量范圍內(nèi)也是如此。當(dāng)與本發(fā)明的肝素成分相比時(shí)，未按照本發(fā)明進(jìn)行魚精蛋白中和的不分級(jí)的肝素和低分子量肝素(Lovenox)具有可觀的出血活性。圖2表明由本發(fā)明得到肝素成分具有優(yōu)越的抗血栓形成活性。在成分S1(肝素/魚精蛋白比例為1/1)的情形下，該活性與本發(fā)明未中和的肝素的活性不相上下。b.預(yù)防模型(誘導(dǎo)血栓形成之前一小時(shí)經(jīng)皮下給藥)。根據(jù)下述步驟，利用上清液S1(實(shí)施例1)進(jìn)行研究T0皮下注射溶液T0+1小時(shí)停滯誘導(dǎo)T0+24小時(shí)取出樣品(血和凝塊)。所得結(jié)果示于下表X表X<p>CKT腦磷脂高嶺土?xí)r間DTT稀釋凝血酶時(shí)間TiTitrarin(StagoLaboratory)時(shí)間*＝p＜0.05(mannWhitney試驗(yàn))所得結(jié)果表明對(duì)于預(yù)防目的，在誘導(dǎo)血栓形成24小時(shí)之后，S1具有與肝素和Lovenox相當(dāng)?shù)目寡ㄐ纬苫钚浴.在大鼠體內(nèi)以通過產(chǎn)生自由基誘導(dǎo)血栓形成模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究(參考文獻(xiàn)Doutremepuich-在印刷中-AnnalesdeCardiologieetAngiologie)根據(jù)下述步驟，利用S1(實(shí)施例1)進(jìn)行研究(T0皮下注射溶液)T0+25分鐘注射劑量為5mg/kg的玫瑰紅T0+30分鐘在第一小動(dòng)脈中通過光化學(xué)反應(yīng)誘導(dǎo)自由基T0+55分鐘注射相同劑量的玫瑰紅T0+60分鐘在第二小動(dòng)脈中誘導(dǎo)自由基T0+85分鐘注射相同劑量的玫瑰紅T0+90分鐘在小靜脈中誘導(dǎo)自由基。最后血栓形成后，心內(nèi)取出血樣品。刺激時(shí)間設(shè)在2分鐘，觀察時(shí)間設(shè)在10分鐘。得到下表XI中給出的結(jié)果表XI栓塞形成時(shí)間由凝塊中分離出第一個(gè)栓子和最后一個(gè)栓子之間的時(shí)間。栓子數(shù)量由凝塊分離的栓子數(shù)量。在此由自由基誘導(dǎo)的血栓形成模型中，與對(duì)照劑組比較，上清液S1(實(shí)施例1)具有可觀的抗血栓形成活性，該活性能夠持續(xù)90分鐘(T0＋90分鐘)。在30分鐘和60分鐘后(T0＋30和T0＋60分鐘)，該活性高于注射相同劑量的肝素活性。C.在大鼠體內(nèi)按照通過激光引起的內(nèi)皮損傷誘導(dǎo)血栓形成模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究(參考文獻(xiàn)Vesvres，Haemostasis1993，23，8-12)a.研究1根據(jù)下述步驟進(jìn)行研究T0皮下注射2mg/kg劑量的試驗(yàn)物質(zhì)T0+35分鐘利用激光束誘導(dǎo)動(dòng)脈血栓形成。觀察時(shí)間設(shè)在10分鐘。所得結(jié)果示于下表XII表XIIS1具有與注射相同劑量的未中和肝素相當(dāng)?shù)目寡ㄐ纬苫钚?，并且能夠以統(tǒng)計(jì)有效的方式減少栓子數(shù)量和縮短栓塞形成時(shí)間。b.研究2根據(jù)下述步驟進(jìn)行研究T0皮下注射2mg/kg劑量的試驗(yàn)物質(zhì)T0+1小時(shí)誘導(dǎo)第一動(dòng)脈血栓形成T0+3小時(shí)誘導(dǎo)第二動(dòng)脈血栓形成T0+6小時(shí)誘導(dǎo)第三動(dòng)脈血栓形成。觀察時(shí)間設(shè)在10分鐘。所得結(jié)果示于下表XIII表XIII<tablesid="table14"num="014"><tablewidth="726">T0+1hT0＋3hT0+6hS1HepS1HepS1Hep激光照射次數(shù)1.6±0.51.6±0.52.0±0.01.6±0.51.6±0.51.0±0.0栓子數(shù)目30±1.05.0±1.75.3±3.56.7±1.28.3±3.07.5±2.1栓塞形成時(shí)間1.3±0.52.6±1.22.3±1.53.0±1.04.3±2.43.0±1.4</table></tables>S1具有與未被魚精蛋白中和的肝素相當(dāng)?shù)目寡ㄐ纬苫钚?。概括地，上文描述的研究表明在三個(gè)實(shí)驗(yàn)的血栓形成模型中均觀察到了抗血栓形成活性，所述三個(gè)模型為由停滯誘導(dǎo)的靜脈模型、由自由基誘導(dǎo)的動(dòng)脈血栓形成模型和由利用激光引起的內(nèi)皮損傷誘導(dǎo)的動(dòng)脈血栓形成模型。根據(jù)本發(fā)明，由低分子量肝素(“依諾肝素”(Lovenox))得到的肝素成分具有比相同的未經(jīng)魚精蛋白體外處理的低分子量肝素高的抗血栓形成活性，該活性也比由未經(jīng)魚精蛋白體外處理的不分級(jí)的肝素的抗血栓形成活性高，而且不再具有出血危險(xiǎn)。本發(fā)明的方法可以以簡(jiǎn)單而又便宜的方式基本上消除肝素的出血活性而同時(shí)保持其抗血栓形成活性。權(quán)利要求1.具有抗血栓形成活性且基本上沒有出血活性的肝素組合物，其特征在于該組合物由通過魚精蛋白體外中和肝素得到的肝素成分組成。2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其特征在于該組合物由通過魚精蛋白體外中和不分級(jí)的肝素得到的肝素成分組成。3.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其特征在于該組合物由通過魚精蛋白體外中和低分子量肝素得到的肝素成分組成。4.根據(jù)上述權(quán)利要求之一的組合物，其特征在于該組合物由其中至少25％的分子量小于2.5kDa的肝素成分組成。5.根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，其特征在于該組合物由其中至少40％分子量大于20kDa的肝素成分組成。6.根據(jù)權(quán)利要求1至4之一的組合物，其特征在于該組合物由分子量小于2.5kDa的肝素成分組成。7.根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，其特征在于該組合物由具有如表I給出的分子量分布的肝素成分組成。8.根據(jù)權(quán)利要求7的組合物，其特征在于該組合物由如表II給出的分子量分布的肝素成分組成。9.根據(jù)上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的組合物，其特征在于該組合物基本上不含魚精蛋白。10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任意一項(xiàng)的組合物，其特征在于該組合物具有抑制人白細(xì)胞彈性蛋白酶水解活性的性能。11.制備權(quán)利要求1至10中任意一項(xiàng)組合物的方法，其特征在于包括用魚精蛋白體外中和肝素。12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其特征在于包括混合肝素溶液和魚精蛋白鹽溶液、離心所得的混合物以及收集上清液的步驟。13.根據(jù)權(quán)利要求11和12之一的方法，其特征在于所述魚精蛋白鹽為硫酸魚精蛋白。14.根據(jù)權(quán)利要求11至13中任一項(xiàng)的方法，其特征在于肝素和魚精蛋白以1/1的比例使用。15.根據(jù)權(quán)利要求11至13中任一項(xiàng)的方法，其特征在于肝素和魚精蛋白以1/2的比例使用。16.根據(jù)權(quán)利要求11至15中任一項(xiàng)的方法，其特征在于不分級(jí)的肝素被中和。17.根據(jù)權(quán)利要求11至16中任一項(xiàng)的方法，其特征在于低分子量肝素被中和。18.權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的肝素組合物在制備具有抗血栓形成活性和基本上沒有出血活性的藥物方面的用途。19.藥物組合物，其特征在于含有與可藥用載體組合的有效劑量的權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的組合物。20.根據(jù)權(quán)利要求19的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物為可注射溶液劑型。21.用于抑制人白細(xì)胞彈性蛋白酶水解活性的藥物組合物，其特征在于含有與可藥用載體組合的作為活性成分的有效劑量的權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的組合物。22.根據(jù)權(quán)利要求21的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物為適用于支氣管肺給藥的劑型。全文摘要具有抗血栓形成和基本上不出血活性的肝素組合物。本發(fā)明的目的是消除與肝素關(guān)聯(lián)的出血危險(xiǎn)，與此同時(shí)保持其主要特性。為此，本發(fā)明組合物(S1、S2、S3)由被魚精蛋白體外中和肝素得到的肝素成分組成。本發(fā)明還涉及制備這些組合物的方法。這些組合物適用于制備藥物。文檔編號(hào)A61P7/00GK1159162SQ95195343公開日1997年9月10日申請(qǐng)日期1995年5月29日優(yōu)先權(quán)日1994年8月29日發(fā)明者C·R·多里米普奇,F·E·P·M·薩頓布雷申請(qǐng)人:德比奧法姆股份有限公司