專利名稱：：來(lái)自自身抗原的用于自身免疫疾病的免疫治療的新的肽類的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新的自身抗原和由其得到的肽類，它們?cè)谧陨砻庖呒膊≈嘘P(guān)節(jié)軟骨慢性損傷的治療中的應(yīng)用，包括上述肽類的藥物組合物，一種用于檢測(cè)樣本中自身反應(yīng)性T細(xì)胞的診斷方法以及用于上述方法的測(cè)試盒。免疫系統(tǒng)建立在識(shí)別外來(lái)抗原(非自身抗原)和自身抗原(自身抗原，來(lái)自個(gè)體自身)的原則上，這種識(shí)別通過(guò)對(duì)自身抗原的耐受性的建立而完成。免疫系統(tǒng)保護(hù)個(gè)體抵抗外來(lái)抗原并且通過(guò)激活特異細(xì)胞如T和B淋巴細(xì)胞并產(chǎn)生像白細(xì)胞間素、抗體和補(bǔ)體因子這樣的可溶性因子來(lái)對(duì)外來(lái)抗原的暴露作出反應(yīng)。免疫系統(tǒng)對(duì)之作出反應(yīng)的抗原被抗原呈遞細(xì)胞(APCs)降解并且其片斷嵌在細(xì)胞表面與第二類主要組織相容性抗原復(fù)合體(MHC)的糖蛋白結(jié)合。此MHC-糖蛋白-抗原片斷復(fù)合物依靠其T細(xì)胞受體識(shí)別抗原片斷與第二類主要組織相容性抗原復(fù)合體蛋白的結(jié)合物并與之結(jié)合呈遞給T細(xì)胞。T細(xì)胞活化，即增生和/或產(chǎn)生白細(xì)胞間素，導(dǎo)致侵襲下針對(duì)抗原的淋巴細(xì)胞的擴(kuò)大(Grey等，Sci.Am.，26138-46，1989)。自身抗原也不斷地被處理并做為抗原片斷被MHC糖蛋白呈遞給T細(xì)胞(Jardetsky等，Nature353326-329，1991)。因此自身識(shí)別成為免疫系統(tǒng)的本質(zhì)。在正常情況下，免疫系統(tǒng)對(duì)自身抗原具有耐受性并且避免了這些自身抗原激活免疫反應(yīng)。當(dāng)對(duì)自身抗原的耐受性喪失時(shí)，免疫系統(tǒng)變得活化，抵抗一種或多種自身抗原，導(dǎo)致自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化并產(chǎn)生自身抗體。這種現(xiàn)象稱作自身免疫。由于總的說(shuō)免疫反應(yīng)具有破壞性，即意味消滅侵入的外來(lái)抗原，自身免疫反應(yīng)能引起機(jī)體自身組織的損害。一些研究證實(shí)了T細(xì)胞對(duì)自身免疫疾病的作用。在鼠類，高度受限制的T細(xì)胞群靠髓磷鞘堿性蛋白(MBP)的特異性的單一表位與第二類主要組織相容性抗原復(fù)合體(MHC)分子結(jié)合成為引起實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎(EAE)的媒介。在路易士鼠，做為對(duì)許多自身免疫疾病易感的物種，顯示T細(xì)胞為引起疾病的媒介。在人類自身免疫疾病也被認(rèn)為與自身侵襲的T細(xì)胞的發(fā)展有聯(lián)系。許多疾病和破壞性免疫反應(yīng)有牽連，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，由于大量活化的淋巴細(xì)胞和第二類MHC表達(dá)細(xì)胞的存在引起的慢性炎癥過(guò)程導(dǎo)致對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的完整性的破壞。僅存的軟骨顯示出對(duì)維持局部炎癥反應(yīng)的需求已經(jīng)證明軟骨的降解與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)情形中軟骨應(yīng)答的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化有聯(lián)系(Sigall等，ClinExp.Rheumat.659，1988；Glant等Biochem.Soc.Trans.18796，1990；Burmester等，RheumatoidarthritisSmolen，Kalden，Maini(Eds)Springer-verlagBerlinHeidelberg，1992)。而且通過(guò)外科手術(shù)除去類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)病人的軟骨證明能減弱炎癥過(guò)程(G.S.Panayi等，Clin.Exp.Rheumatol.11Csuppl.8)s1-s8，1993)。因此軟骨蛋白被認(rèn)為是能夠刺激T細(xì)胞的目標(biāo)自身抗原。自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化導(dǎo)致了自身免疫疾病的發(fā)展。一些藥物，例如甾類藥物可被用來(lái)治療導(dǎo)致軟骨的破壞的炎癥過(guò)程。然而，這些藥物常為非特異性的并且有毒副作用的免疫抑制藥物。非特異性免疫抑制的缺點(diǎn)使得此種治療極不適宜?？乖禺愋?、無(wú)毒性免疫抑制療法為非特異性免疫抑制提供了一種很有吸引力的可供選擇的方法。這種抗原特異性療法涉及用目標(biāo)自身抗原或來(lái)自自身抗原的合成的T細(xì)胞反應(yīng)性肽類來(lái)治療病人。這些合成的肽類相當(dāng)于自身抗原的T細(xì)胞表位，并且可被用來(lái)誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞對(duì)它們和自身抗原的耐受性。雖然看起來(lái)用使免疫系統(tǒng)激活的相同的抗原使免疫系統(tǒng)脫敏并不合理，但有控制地使用目標(biāo)(自身)抗原可以很有效地使免疫系統(tǒng)脫敏。為了有效地采用耐受性療法來(lái)治療T細(xì)胞引起的軟骨損傷，極需確認(rèn)反應(yīng)的自身抗原并且找到能降低病人對(duì)在炎癥過(guò)程中激活T細(xì)胞反應(yīng)的自身抗原的敏感度的T細(xì)胞反應(yīng)性肽類。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供這種自身抗原和來(lái)自上述自身抗原、能夠誘導(dǎo)患T細(xì)胞引起的軟骨損傷的病人對(duì)反應(yīng)的軟骨抗原的特異性T細(xì)胞耐受性的T細(xì)胞反應(yīng)性肽類。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)與關(guān)節(jié)軟骨損傷有關(guān)的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的方法和用于上述方法的測(cè)試盒。人的軟骨糖蛋白39(此后稱做HCgp-39)被驚奇地發(fā)現(xiàn)是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人的一種目標(biāo)自身抗原，它能激活特異性T細(xì)胞而引起或介導(dǎo)炎癥。由HCgp-39得到的肽類能夠最顯著地被類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人的自身反應(yīng)性T細(xì)胞識(shí)別而很少被健康供者的T細(xì)胞識(shí)別，因而表明HCgp-39是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一種自身抗原。HCgp-39的關(guān)節(jié)炎基因(arthritogenic)特性進(jìn)一步在Balb/c鼠被證明。在Balb/c鼠單劑量皮下注射上述蛋白質(zhì)能夠引發(fā)動(dòng)物的關(guān)節(jié)炎跡象。HCgp-39誘導(dǎo)的疾病過(guò)程其特征為前腳爪和/或后腳爪的周期性復(fù)發(fā)并且從輕關(guān)節(jié)炎逐漸發(fā)展為更嚴(yán)重的類型。同樣地特別是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，觀察到的對(duì)稱分布的關(guān)節(jié)痛和周期性復(fù)發(fā)及小瘤的形成，暗示著關(guān)節(jié)炎疾病的發(fā)展。更令人驚奇的是發(fā)現(xiàn)使用HCgp-39獲得了免疫學(xué)的耐受性，更重要的是延緩和/或抑制了關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。HCgp-39存在于病人和健康成人血清中，不過(guò)病人的這種蛋白的血清濃度是健康成人的2倍。而且在滑液標(biāo)本和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人的軟骨中可以得到編碼HCgp-39的mRNA，而通過(guò)外科手術(shù)得到的健康成人的軟骨中并不含有大量的上述mRNA。當(dāng)培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和滑液細(xì)胞時(shí)，它們主要的分泌產(chǎn)物即為HCgp-39(Hakala等，J.Biol.Chem.，Vol268，3425803，1993)。在Hakala等人的文獻(xiàn)及其它任何文獻(xiàn)中，對(duì)HCgp-39的關(guān)節(jié)炎基因本質(zhì)既無(wú)描述也無(wú)提示。本發(fā)明更進(jìn)一步的目的通過(guò)包含自身抗原HCgp-39的一個(gè)亞序列的肽類得以實(shí)現(xiàn)，其特征在于上述肽類包含氨基酸序列FGRSFTLAS(SEQIDNo.1)，F(xiàn)TLASSETG(SEQIDNo.2)，YDDQESVKS(SEQIDNo.3)和FSKIASNTQ(SEQIDNo.4)中的一種或多種。更特別地，根據(jù)本發(fā)明的肽包含氨基酸序列PTFGRSFTLASSE(SEQIDNo.5)，RSFTLASSETGVG(SEQIDNo.6)，VGYDDQESVKSKV(SEQIDNo.7)和SQRFSKIASNTQSR(SEQIDNo.8)中的一種或多種?！皝喰蛄小北焕斫舛x為“一部分”而不能錯(cuò)誤地理解為包括整個(gè)蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的肽最好是具有9-55個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列。更優(yōu)選本發(fā)明的肽具有的氨基酸序列為9-35個(gè)氨基酸殘基，特別是9-25個(gè)氨基酸殘基。更為優(yōu)選的肽具有的氨基酸序列為9-15個(gè)氨基酸殘基。極優(yōu)選的肽具有的氨基酸序列為13或14個(gè)氨基酸殘基，例如正如具有SEQIDNo.5-8給出的氨基酸序列的肽。本發(fā)明的肽的多聚體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，例如單體序列可選擇地被間隔殘基隔開的二聚體或三聚體。這些多聚體提供了大量的SEQIDNo.’s1-8中給出的T細(xì)胞表位。在本發(fā)明的肽類SEQIDNo.1-8中給出的氨基酸序列能夠受到側(cè)翼區(qū)的翼側(cè)攻擊，側(cè)翼區(qū)相當(dāng)于HCgp-39蛋白質(zhì)或其它存在上述氨基酸序列的蛋白質(zhì)的氨基酸序列上相應(yīng)氨基酸的自身側(cè)面部位。上述側(cè)翼區(qū)也可替代地是由無(wú)規(guī)則的氨基酸殘基構(gòu)成的非天然氨基酸序列。這些非天然側(cè)翼部位可用來(lái)穩(wěn)定肽類，從而提高其生物有效性。為提高本發(fā)明肽類的生物有效性，優(yōu)選非天然側(cè)翼部位。SEQIDNo.’s1-4給出的氨基酸序列，更特別的是SEQIDNo.’s5-8給出的氨基酸序列類似于第二類主要組織相容性抗原復(fù)合體限制的T細(xì)胞表位，其存在于HCgp-39上。HCgp-39上的第二類主要組織相容性抗原復(fù)合體限制的T細(xì)胞表位顯示在HCgp-39氨基酸序列的103-116，259-271，263-275和326-338區(qū)域(從信號(hào)序列中的蛋氨酸開始，見HaKala等，1993)。因此，根據(jù)本發(fā)明這些肽類也可被理解為包括含有一種或多種上述確定的第二類主要組織相容性抗原復(fù)合體限制的T細(xì)胞表位的自身抗原HCgp-39的片段而且它們也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的肽類為T細(xì)胞反應(yīng)性的肽，能夠被自身反應(yīng)性T細(xì)胞識(shí)別并能刺激T細(xì)胞的活化。這些自身反應(yīng)性T細(xì)胞可在類風(fēng)溫性關(guān)節(jié)炎病人的血中發(fā)現(xiàn)但極少存在于健康供者。因此，根據(jù)本發(fā)明HCgp-39蛋白質(zhì)或上述類似于目標(biāo)自身抗原HCgp-39上的第二類主要組織相容性抗原復(fù)合體限制的T細(xì)胞表位的合成肽類，極適合于對(duì)患有T細(xì)胞介導(dǎo)的關(guān)節(jié)損傷例如關(guān)節(jié)炎、尤其是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病人的治療來(lái)誘導(dǎo)特異的T細(xì)胞對(duì)HCgp-39的耐受性。WO95/01995和WO95/02188描述了HCgp-39做為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的標(biāo)記在診斷上的用途，HCgp-39的關(guān)節(jié)炎基因本質(zhì)從未揭示或提示過(guò)。對(duì)于HCgp-39，其片斷或根據(jù)本發(fā)明的T細(xì)胞反應(yīng)性肽類在軟骨遭到侵襲時(shí)誘導(dǎo)T細(xì)胞對(duì)HCgp-39的特異耐受性的抗原或肽特異性療法中的應(yīng)用也未在任何地方暗示過(guò)。本發(fā)明的肽的制備是通過(guò)已知的肽合成的有機(jī)化學(xué)方法之一得以實(shí)現(xiàn)的。HCgp-39和肽類也可借助重組DNA技術(shù)制備。肽合成的有機(jī)化學(xué)方法被認(rèn)為包括在均相中或依靠所謂的固相用縮合反應(yīng)偶聯(lián)所需的氨基酸?？s合反應(yīng)可如下進(jìn)行a)在縮合劑存在下，將具有自由羧基且其它反應(yīng)基團(tuán)被保護(hù)的化合物(氨基酸、肽)與具有自由氨基且其它反應(yīng)基團(tuán)被保護(hù)的化合物(氨基酸、肽)進(jìn)行縮合。b)將具有活化的羧基并且其它反應(yīng)基團(tuán)為自由的或保護(hù)的化合物(氨基酸、肽)與具有活化的氨基并且其它反應(yīng)基團(tuán)為自由的或保護(hù)的化合物(氨基酸、肽)進(jìn)行縮合。羧基的活化可以發(fā)生，特別是將羧基轉(zhuǎn)化為酸性鹵化物，疊氮化物，酐、咪唑胺或活化的酯，如N-羥基-琥珀酰亞胺，M-羥基-苯并三唑，對(duì)硝基苯酯、N-羥基-苯并三唑酯或五氟化苯酚酯。上述縮合反應(yīng)中最常用的方法為碳化二亞胺法、疊氮化物法、混合酐法和使用活化酯的方法，如同ThePeptides，Analysis，Synthesis，BiologyVol.1-3(Ed.gross，E.andMeienhofer，J.)1979，1980，1981(AcademicPress，Inc.)中描述的。使用“固相”制備上述提到的本發(fā)明的肽的片斷正如J.Amer.Chem.Soc.852149(1963)和Int.J.PeptideProteinres.35161-214(1990)中描述的。要制備的肽的氨基酸的偶聯(lián)通常從羧基末端開始。對(duì)這種方法需要一個(gè)具有反應(yīng)基團(tuán)或可引進(jìn)反應(yīng)基團(tuán)的固相。例如這可以為具有反應(yīng)性的氯甲基的苯和二乙烯基苯的共聚物或提供反應(yīng)性的羥甲基或胺官能團(tuán)的聚合的固相。例如，一個(gè)特別適合的固相為對(duì)烷氧芐醇樹脂(4-羥基-甲基-苯氧基-甲基-共聚苯乙烯-1％二乙烯基苯樹脂)，描述于J.Am.Chem.Soc.951328，作者為wang(1974)。合成后在溫和條件下肽可從固相上裂解。在所要求的氨基酸序列合成后，接著從樹脂上分開這些肽，例如使用含有清除劑的三氟乙酸，例如三異丙基硅烷，苯甲醚或乙二硫醇，苯硫基甲烷。如所陳述在不能參與縮合反應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)有效地被借助于酸、堿或還原作用很容易重新水解下來(lái)的基團(tuán)所保護(hù)。因此，羧基基團(tuán)可以有效地被保護(hù)，例如通過(guò)與鍵合于固相支持物上的甲醇、乙醇、叔丁醇、芐醇或?qū)ο趸S醇的酯化作用和與胺的結(jié)合。能夠有效保護(hù)氨基的基團(tuán)為乙氧羰基、芐氧羰基、叔丁氧羰基(t-boc)或?qū)籽跗S氧基羰基，或來(lái)自磺酸的酸性基團(tuán)如苯磺酰基或?qū)妆交酋；?，但其它基團(tuán)也可被使用，如取代或未取代的芳基或芳烷基，例如芐基和三苯甲基，或者象正硝基苯磺?；?-苯甲?；?1-甲基-乙烯基這樣的基團(tuán)。例如特別適宜的α-氨基保護(hù)基團(tuán)為堿敏感的9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)〔Carpino&Han(1970)J.Amer.Cbem.Soc.925748〕。對(duì)于可能的保護(hù)基團(tuán)的更深入的報(bào)道見于ThePeptides，Analysis，Synthesis，Biology，Vol.1-9(Eds.Gross，UdenfriendandMeienhofer)1979～1987(AcademicPress，Inc.)。根據(jù)特殊基團(tuán)的本質(zhì)保護(hù)基團(tuán)可通過(guò)各種常規(guī)的方法被裂解，例如借助于三氟醋酸或溫和的還原劑，例如使用氫和催化劑，如鈀，或使用溶于冰醋酸的HBr。如上所述，本發(fā)明的HCgp-39和肽類也可以借助于重組DNA技術(shù)來(lái)制備。出于這個(gè)目的，編碼HCgp-39或本發(fā)明的肽類或上述肽的多聚體的核酸序列被插入到表達(dá)載體中。合適的表達(dá)載體其中包括包含了復(fù)制及表達(dá)所需控制區(qū)的質(zhì)粒，粘粒，病毒和YAC’s(酵母人工染色體)。表達(dá)載體可以被帶到宿主細(xì)胞中表達(dá)。例如合適的宿主細(xì)胞為細(xì)菌，酵母細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。這些技術(shù)為本領(lǐng)域公知的技術(shù)(Sambrook等，MolecularCloningaLaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，1989)。雖然用激活免疫系統(tǒng)的相同抗原來(lái)降低免疫系統(tǒng)的敏感性看起來(lái)不合理，但控制劑量的HCgp-39和/或包含HCgp-39序列的肽類可以有效地降低免疫系統(tǒng)的敏感度。根據(jù)本發(fā)明，軟骨遭受自身反應(yīng)性T細(xì)胞侵害的病人可以用包含HCgp-39、本發(fā)明的一種或多種肽類和可以接受的藥物載體的藥物組合物來(lái)治療，以使這些病人的特異性自身反應(yīng)性T細(xì)胞對(duì)遭受侵害的軟骨中的HCgP-39和其它含有明確的T細(xì)胞表位的自身抗原產(chǎn)生耐受性T細(xì)胞表位具有SEQIDNo.1-8之一給出的氨基酸序列。并且減弱炎癥反應(yīng)。要用于本發(fā)明藥物組合物的非常適宜的肽類為具有SEQIDNo.5，6，7和8中給出的氨基酸序列的肽類。同樣非常適用于本發(fā)明藥物組合物的是包含對(duì)HCgp-39或本發(fā)明一種或多種肽類進(jìn)行編碼的DNA的DNA(表達(dá))載體。DNA(表達(dá))載體的傳遞表達(dá)為一定水平的重組HCgp-39蛋白或本發(fā)明的肽類，這與直接給予包含HCgp-39蛋白或肽類的藥物組合物得到的水平相似。自身抗原和本發(fā)明的肽類具有的優(yōu)點(diǎn)為與免疫抑制甾類藥物的非特異抑制作用相比對(duì)自身反應(yīng)性T細(xì)胞具有特異耐受作用而使免疫系統(tǒng)的其它成分未受觸動(dòng)。使用自身抗原或本發(fā)明的肽類的療法是安全的并且沒有毒副作用發(fā)生。通過(guò)使用高或低劑量的自身抗原或本發(fā)明的肽類可以獲得耐受性。自身抗原或肽的量取決于給藥途徑、給藥時(shí)間、病人的年齡及總的健康狀況和飲食。通常使用的劑量為每千克體重0.01到1000μg的肽或蛋白質(zhì)，優(yōu)選0.5到500μg，更優(yōu)選0.1到100μg的肽或蛋白質(zhì)。藥學(xué)上可接受的載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，例如包括無(wú)菌鹽，乳糖，蔗糖，磷酸鈣，白明膠，糊精，瓊脂，果膠，花生油，橄欖油，芝麻油和水。其它的載體可以是例如第二類MHC，如需要，嵌入脂質(zhì)體中。此外，本發(fā)明的藥物組合物可以包含一種或多種佐劑。適合的佐劑其中包括氫氧化鋁，磷酸鋁，兩性離子，維生素E，單磷酸苯脂A，胞壁酰二肽和皂角苷例如皂樹A(QuillA)。佐劑的量取決于其自身的性質(zhì)。此外，本發(fā)明的藥物組合物可包含一種或多種穩(wěn)定劑，例如碳水化合物包括山梨糖醇，甘露糖醇，淀粉，蔗糖，糊精和葡萄糖，蛋白質(zhì)如白蛋白和酪蛋白，以及緩沖液如堿性磷酸鹽。適宜的給藥途徑為肌肉注射，皮下注射，靜脈注射或腹膜內(nèi)注射，口服和鼻內(nèi)給藥?？诜捅莾?nèi)給藥為優(yōu)選的給藥途徑。由于它的關(guān)節(jié)炎基因本質(zhì)，HCgp-39或本發(fā)明的肽類可用于臨床誘導(dǎo)非人類哺乳動(dòng)物的關(guān)節(jié)炎。給小劑量的HCgp-39或一種或多種本發(fā)明的肽類，關(guān)節(jié)炎的癥狀將在上述哺乳動(dòng)物身上發(fā)展最終導(dǎo)致疾病模型暗示著關(guān)節(jié)炎，特別是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病的發(fā)展。當(dāng)給Balb/c鼠皮下注射HCgp-39蛋白質(zhì)時(shí)，這些動(dòng)物出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥狀。HCgp-39誘導(dǎo)的疾病過(guò)程其特征為前腳爪和/或后腳爪的周期性復(fù)發(fā)并且從輕的關(guān)節(jié)炎逐漸發(fā)展為更嚴(yán)重的類型。同樣，觀察到的對(duì)稱分布的關(guān)節(jié)痛和周期性復(fù)發(fā)及小瘤的形成，暗示著關(guān)節(jié)炎疾病特別是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。因此，這些患有疾病的動(dòng)物提供了適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型來(lái)研究關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生和發(fā)展的基礎(chǔ)機(jī)理。另外，上述患有疾病的動(dòng)物可以用來(lái)尋找治療關(guān)節(jié)炎的新的藥物并且研究這些藥物在關(guān)節(jié)炎發(fā)展中的作用。對(duì)于關(guān)節(jié)炎，特別是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎鼠被優(yōu)選用做動(dòng)物模型。為了誘導(dǎo)上述哺乳動(dòng)物的關(guān)節(jié)炎，應(yīng)給其適當(dāng)劑量的HCgp-39或本發(fā)明的一種或多種肽類。適當(dāng)?shù)膭┝繛槊壳Э梭w重0.1～1000μg，優(yōu)選1～100μg，更優(yōu)選10～50μg。HCgp-39或肽的量取決于給藥途徑，給藥時(shí)間和使用的動(dòng)物種類。適宜的給藥途徑與前面所述的相同。為了誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)的作用，HCgp-39蛋白質(zhì)或本發(fā)明的肽可以包含一種或多種如前所述的穩(wěn)定劑或佐劑。HCgp-39或本發(fā)明的肽類也非常適用于一種診斷方法來(lái)檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨慢性感染中活化的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的存在。本發(fā)明的診斷方法包含下述步驟a)從個(gè)體血樣分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)，b)在適合條件下培養(yǎng)上述PBMC，c)在自身抗原或由其得到的本發(fā)明的一種或多種肽存在下溫育上述PMBC培養(yǎng)物，d)檢測(cè)T細(xì)胞的反應(yīng)，例如增殖反應(yīng)，指明個(gè)體活化的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的存在。在通過(guò)測(cè)量自身反應(yīng)性T細(xì)胞的增殖反應(yīng)來(lái)檢測(cè)反應(yīng)的情況下，放射性同位素例如3H胸苷的結(jié)合是對(duì)增殖的一個(gè)量度。存在于PBMC中的自身反應(yīng)性T細(xì)胞反應(yīng)也可以通過(guò)使用細(xì)胞因子特異性ELISA測(cè)量細(xì)胞因子釋放或51鉻釋放測(cè)定的細(xì)胞毒性來(lái)檢測(cè)。另一種檢測(cè)方法是通過(guò)FACS分析來(lái)測(cè)量活化標(biāo)記的表達(dá)，例如Il-2R。因此，包含本發(fā)明的一種或多種肽類和適合的檢測(cè)試劑的診斷組合物構(gòu)成了本發(fā)明的一部分。根據(jù)檢測(cè)的類型，檢測(cè)試劑可以是放射性同位素，一種酶，或?qū)?xì)胞表面的特異性抗體或活化標(biāo)記。本發(fā)明的范圍還包括包含一種或多種本發(fā)明的肽類的測(cè)試盒。這些測(cè)試盒適用于本發(fā)明的診斷方法。因而，本發(fā)明提供了一種方法，用于檢測(cè)患T細(xì)胞介導(dǎo)軟骨損傷例如關(guān)節(jié)炎特別是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人是否存在對(duì)HCgp-39有反應(yīng)性的自身攻擊T細(xì)胞。如果存在HCgp-39特異性T細(xì)胞，那么這些T細(xì)胞對(duì)包含HCgp-39或本發(fā)明的肽的藥物組合物的耐受性能延緩或抑制關(guān)節(jié)炎發(fā)展。下面的實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的舉例說(shuō)明而且不能理解為限定本發(fā)明的范圍。圖1HCgp-39耐受和非耐受Balb/c鼠中關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生和發(fā)展。前腳爪和后腳爪致敏后每天患病的動(dòng)物總的關(guān)節(jié)炎得分。致敏后每天患病動(dòng)物的數(shù)目也給出。實(shí)施例1方法病人收集根據(jù)美國(guó)風(fēng)濕癥協(xié)會(huì)(ARA)標(biāo)準(zhǔn)(Amett等，ArthritisRheum.31315，1988)診斷的患類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人的外周血單核細(xì)胞(PBMC)。通過(guò)X射線評(píng)分(Rntgenscore)將類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人的嚴(yán)重程度分為程度I-IV。收集來(lái)自健康供者帶有DR4Dw4(DRB1*0401)或DR1特異性的外周血單核細(xì)胞做為對(duì)照。也收集了來(lái)自兩健康供者不帶有任一種類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎結(jié)合的DR分子的外周血單核細(xì)胞。MHC類型病人和健康供者PBMC染色體提取物使用DynalDR‘lowresolution’SSP測(cè)試盒進(jìn)行分析。DR4亞定型使用DynalDRB1*04-SSP測(cè)試盒(UniversityTransfusionservice，Radboudhospital，Hijmegen，TheNtherlands)來(lái)進(jìn)行。肽本發(fā)明的肽和一種對(duì)照肽通過(guò)固相肽合成法合成。簡(jiǎn)言之，具有自由氨基和羧基末端的肽在Milligen9050合成儀上合成，在PEG-PS樹脂上使用Fmoc/tBu保護(hù)的活化酯。在分解和去保護(hù)以后，肽使用制備型HPLC純化，用DowexAc樹脂轉(zhuǎn)變?yōu)榇姿猁}或轉(zhuǎn)變?yōu)槁然稃}并且凍干。這些肽類使用質(zhì)譜檢測(cè)。此研究中使用的肽類列于表1。一種N-末端生物素化的流感血凝集得到的肽(SEQIDNo.9)，生物素-間隔基團(tuán)-IHA(307-319)F，其中第三個(gè)殘基(Y)被F替代，(生物素-NH-(CH2)5-CO-PKFVKQNTLKLAT)，被使用為標(biāo)記肽用于與DR4Dw4(DRB1*0401)結(jié)合的研究中。具有SEQIDNo9的非生物素化的肽IHA(307-319)F被用做對(duì)照肽。表1合成肽的氨基酸序列</tables>給出了肽1-4和控制肽IHA(307-319)F的氨基酸序列，相應(yīng)的序列號(hào)。用于制備純化的HLA-DR分子的細(xì)胞培養(yǎng)兩個(gè)EBV一轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系，即BSM(A2，B62，Cw3，DR4Dw4，DQ8，Dpw2)和BM92(A25，B51，Cw1，DR4Dw14，DQ8)是由AcademicHospitalLeiden，theNetherlands贈(zèng)與的。細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM/HAM’sF12(GibcoLaboratories，GrandIsland，NY)中，添加有10％FCS(HycloneLaboratories)、1％非必需氨基酸(ICI)，L-谷氨酰胺、2-ME和抗生素。細(xì)胞按常規(guī)每隔2-3天按1∶2比率傳代。收集細(xì)胞后再用含有1mMPMSF的PBS(4℃)洗滌3次。細(xì)胞小顆粒貯存于-70℃直至使用。HLA-DR分子的親合純化從細(xì)胞溶胞產(chǎn)物通過(guò)使用單克隆抗體L243(ATCCHB55)親和純化HLA-DR分子，直接針對(duì)于DR復(fù)合物上的非多形性決定簇(Lampson等，J.Immunol125293，1980)。根據(jù)制備程序，蛋白質(zhì)G瓊脂糖凝膠純化的L243偶聯(lián)于NHS-瓊脂糖凝膠4FF(Pharmacia)上。HLA-DR表達(dá)細(xì)胞在PBS，1％NP-40，1mMAEBSF(Calbiochem)中于冰上融化后溶解30分鐘。溶胞產(chǎn)物于15000rpm(Sorvall，SS34rotor)離心30分鐘使之澄清。上清液經(jīng)0.45μM濾器過(guò)濾并加入到L243-NHS-瓊脂糖凝膠珠中。經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)，此珠被轉(zhuǎn)移到柱中并用5體積PBS、1％NP-40；5體積PBS、0.5％NP-40；15體積PBS、0.5％NP-40、0.1％SDS；5體積PBS、0.05％NP-40；5體積PBS、1％正辛基-葡糖苷(Sigma，st.Louis，USA)和5體積50mM二乙胺(Fluka)、150mMNaCl，1％正辛基-葡糖苷PH＝8.0洗滌。HLA-DR分子用50mM二乙胺，150mMNaCl，1％正辛基-葡糖苷PH＝11洗脫。收集后立即用2M甘氨酸PH4.8中和各級(jí)分。收集的各級(jí)分在非還原條件下用SDS-PAGE分析然后進(jìn)行銀染色。含有純化的HLA-DR的級(jí)分用30KD截流膜超濾濃縮。HLA-DR肽結(jié)合分析肽的結(jié)合研究使用前述半定量結(jié)合分析的改進(jìn)的方案(Joosten等，Int.Immunol.6751，1994)。純化的HLA-DR分子(0.5-500nM)在PH＝5.0下在50nM生物素化的標(biāo)記肽(生物素-間隔基-IHA(307-319)F及在最終體積為25μl結(jié)合緩沖液(PBS，1mMAEBSF，1mMN-乙基馬來(lái)酰亞胺，8mMEDTA，10μm胃蛋白酶抑制劑A，0.01％NaN3，0.05％NP-40和5％DMSO)中具有一定濃度范圍的竟?fàn)庪?肽1-4和IHA(307-319)F做為對(duì)照肽)中保溫。在室溫保溫約45小時(shí)后，結(jié)合或未結(jié)合的標(biāo)記肽可通過(guò)在硝酸纖維素濾膜(BioRad)上印跡并結(jié)合SDS-PAGE或在硝酸纖維素濾膜(BioRad)及96孔Hybry.Dot裝置(BRL)的真空DOT印跡法分離。印跡被0.1M馬來(lái)酸PH＝7.5，150mMNaCl中的0.5％DNA封閉試劑(BoehringerMannheim，Germany)所封閉。半小時(shí)后，印跡經(jīng)PBS，0.02％Tween20(Sigma，St.Louis，USA)洗滌并且分別以1∶40，000或1∶5，000的稀釋度用Streptavidin-HRPO(SouthernBiotechnology)溫育。DR-結(jié)合的生物素化的標(biāo)記肽用采用WesternBlotECL測(cè)試盒(Amersham，U.K.)的增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光法根據(jù)制備說(shuō)明檢測(cè)。預(yù)先發(fā)光(Preflashed)的膜(hyperfilm-ECL，Amersham，U.K.)被暴露10分鐘。所給肽的相對(duì)結(jié)合親和力與同標(biāo)記肽的競(jìng)爭(zhēng)有關(guān)。這種相對(duì)親和力定義為信號(hào)減少到50％(RIC50)時(shí)肽的濃度。在SDS-PAGE情況下，RIC50值的確定通過(guò)目視來(lái)檢查。DOT印跡-斑點(diǎn)的密度分析使用計(jì)算密度計(jì)(MolecularDynamics，USA)及ImageQuantandExcel軟件。血單核細(xì)胞的增殖反應(yīng)為了確定T細(xì)胞對(duì)HCgp-39中肽序列的反應(yīng)性，與健康的DR1或DR4對(duì)照品比較檢驗(yàn)肽1-4誘導(dǎo)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人PBMC增殖反應(yīng)的能力。由肝素化靜脈外周血經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)的菲可帕克(Ficoll-Paque)梯度離心，分離得到PBMC。細(xì)胞在平底的微量滴定板中于1，5×105細(xì)胞/孔的濃度下在添加有10％熱鈍化自身血漿、L-谷氨酰胺、2-ME和抗生素介質(zhì)中培養(yǎng)3或4次。細(xì)胞在介質(zhì)中單獨(dú)溫育或在PHA(2.5μg/ml)存在下或在抗原，包括此Candidaalbicans提取物(回憶抗原11μg/ml，0.1μg/ml)存在下或在肽1-4中一種濃度為100μg/ml、25μg/ml或10μg/ml存在下溫育。培養(yǎng)物在總體積210μl，于370℃，增濕的5％CO2環(huán)境中溫育7天。培養(yǎng)物在最后18小時(shí)與0.25μCi3H胸苷一起脈沖振動(dòng)。確定將對(duì)兩種濃度的至少一種試驗(yàn)肽產(chǎn)生反應(yīng)的病人評(píng)定為高應(yīng)答者(HR)，將對(duì)至少一種濃度的至少一種試驗(yàn)肽產(chǎn)生反應(yīng)的病人評(píng)定為應(yīng)答者(R)。而將對(duì)任一種試驗(yàn)肽都不產(chǎn)生反應(yīng)的病人評(píng)定為非應(yīng)答者(NR)。所給肽的相對(duì)結(jié)合的親和力與同標(biāo)記肽的競(jìng)爭(zhēng)有關(guān)。這種相對(duì)親和力定義為信號(hào)減少到50％(RIC50)時(shí)肽的濃度。結(jié)果為了確定T細(xì)胞對(duì)肽1-4的反應(yīng)性，分析了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人和健康供者的PBMC增殖反應(yīng)。至此，大多數(shù)對(duì)由HCgp-39得到的肽的高應(yīng)答者或應(yīng)答者帶有DR1、DR4Dw4、DR4Dw14或DR10的特異性，已知這些均與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)展的增大的風(fēng)險(xiǎn)相聯(lián)系。肽1-4與DR4Dw4和DR4Dw14的結(jié)合如表2中所示。表2肽1-4與HLA-DR分子的結(jié)合具有SEQIDNo.5-8給出的氨基酸序列的肽1-4分別與HLA-DR分子結(jié)合。在PH＝5，使用50nMIHA(307-319)F做為標(biāo)記肽，用半定量結(jié)合分析(如實(shí)施例1方法所描述)測(cè)定了肽的結(jié)合。其值為以微摩爾表示的RIC50值。(濃度競(jìng)爭(zhēng)肽其信號(hào)減少到?jīng)]有競(jìng)爭(zhēng)肽存在時(shí)信號(hào)的大約50％)。除了肽4外所有的結(jié)果均來(lái)自于兩個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)(分別為SDS-PAGE和斑點(diǎn)印跡)。大多數(shù)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人對(duì)本發(fā)明的一種或多種肽有反應(yīng)(表3)，而在健康供者群反應(yīng)極少發(fā)現(xiàn)(表4)。發(fā)現(xiàn)6例類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人對(duì)任何試驗(yàn)肽均不起反應(yīng)(結(jié)果未示出)。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人疾病的嚴(yán)重程度被評(píng)定為程度I-IV。這里所示X射線評(píng)分為對(duì)關(guān)節(jié)損傷程度的估計(jì)。對(duì)肽1-4的高應(yīng)答者和應(yīng)答者在所有程度的疾病中都有發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明的肽相當(dāng)于自身反應(yīng)性T細(xì)胞的表位并且對(duì)這些表位的反應(yīng)性被最顯著地發(fā)現(xiàn)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人但極少發(fā)現(xiàn)于健康供者。因而，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人具有直接針對(duì)自身抗原HCgp-39的活化的自身反應(yīng)性T細(xì)胞。很明顯，自身抗原HCgp-39遭到T細(xì)胞侵襲，導(dǎo)致了炎癥及對(duì)軟骨中HCgp-39抗原的損害。表4在10％自身血清中測(cè)得的健康供者新分離的PBMC對(duì)肽1-4的增殖反應(yīng)</tables>健康供者的PBMC分別對(duì)具有SEQIDNo.5-8給出的氨基酸序列的肽1-4的增殖反應(yīng)。結(jié)果表示為刺激指數(shù)(SI)值(＝抗原特異性Cp5m(測(cè)量平均值)/對(duì)照Cp5m(測(cè)量平均值)。SI值＜2被認(rèn)為陰性。R＝應(yīng)答者(在檢測(cè)的最高肽濃度下+反應(yīng))。-＝測(cè)量平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，超過(guò)了可接受的值，因此未給出值。實(shí)施例2方法從MG63骨肉瘤細(xì)胞系純化HCgp-39MG63細(xì)胞(人骨肉瘤ATCCCRL1427)在細(xì)胞工廠于DMEM/HAM’sF12無(wú)血清介質(zhì)中培養(yǎng)。由肝素親和色譜使隨后的葡聚糖(superder75)色譜從培養(yǎng)物上清液中純化HCgp-39。純度由SDS-PAGE檢測(cè)。而且，N-末端氨基酸測(cè)序證實(shí)此純化的蛋白質(zhì)與Hakala等人描述的蛋白質(zhì)相同。Balb/c鼠中HCgp-39的關(guān)節(jié)炎基因性質(zhì)將溶于100μl體積PBS(0.5MNaCl，0.01M磷酸鈉緩沖液，PH7.5)中的10或50μg純化的HCgp-39與不完全弗氏佐劑(IFA)按1∶1混合后皮下注射于雌性Balb/c鼠胸部2×4區(qū)域(HarlanCPB，Zeist，TheNetherlands)，同時(shí)用PBS(1∶1，IFA中)注射于4只對(duì)照鼠。每天檢查鼠的關(guān)節(jié)炎臨床癥狀。通過(guò)記錄每只腳爪0-3的分?jǐn)?shù)(根據(jù)Glant等人的文獻(xiàn))來(lái)評(píng)定關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度。簡(jiǎn)言之，得分0＝?jīng)]有變化，得分1＝紅斑疹和腫脹，得分2＝腫脹和出現(xiàn)畸形，得分3＝因失去彎曲和伸展能力而不能活動(dòng)。鼻內(nèi)給藥HCgp-39誘導(dǎo)耐受性使用PT45微導(dǎo)管和漢密爾頓(Hamilton)注射器給10只雌性Balb/c鼠(用Enflurance輕微麻醉)鼻內(nèi)給藥28μg蛋白質(zhì)。于誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎前15天、10天，5天給予抗原。對(duì)照(n＝10)經(jīng)同樣的程序但僅接受載體(PBS)(表5)。在0天如上描述使用10μg蛋白質(zhì)致敏后通過(guò)測(cè)定遲發(fā)型超敏(DTH)反應(yīng)來(lái)評(píng)價(jià)免疫耐受性。在第0天致敏后在第8天于左后爪肉趾注射溶于50μg體積的10μgHCgp-39(攻擊)。遲發(fā)型超敏(DTH)反應(yīng)的量度體現(xiàn)在爪肉趾上的反應(yīng)的增加(C左邊腫脹(mm×10-3)-右邊腫脹(mm×10-3)I/右邊腫脹(mm×10-3))×100％。在攻擊后0，24和48小時(shí)使用自己設(shè)計(jì)的μ測(cè)量?jī)x(μmeter)測(cè)量了爪肉趾的腫脹。每天檢查這些鼠對(duì)關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)的耐受性，直到致敏后31天為止。用前面提到的方法評(píng)定關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度。表5耐受性表DTH＝遲發(fā)型超敏反應(yīng)PBS＝0.5MNaCl，0.01M磷酸鈉緩沖液pH7.5結(jié)果HCgp-39的關(guān)節(jié)炎基因性(Arthritogenicity)一次注射與不完全弗氏佐劑(IFA)混合的50μgHCgp-39后，所有的鼠逐漸發(fā)展為嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎(表6)。在致敏后15～20天于4只動(dòng)物的3只前爪上第一次觀察到關(guān)節(jié)炎癥狀。那些在前爪未顯出任何癥狀的鼠于致敏后第34天后爪發(fā)展為關(guān)節(jié)炎。HCgp-39誘導(dǎo)的疾病過(guò)程其特征為前腳爪或后腳爪的周期性復(fù)發(fā)并且從輕的關(guān)節(jié)炎逐漸發(fā)展為更嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎(對(duì)疾病的進(jìn)程進(jìn)行了62天的觀察)。常常(＞50％)觀察到對(duì)稱分布的關(guān)節(jié)痛，意味著在相同時(shí)間前腳爪和后腳爪兩者都顯示出關(guān)節(jié)炎癥狀。使用與不完全弗氏佐劑(IFA)混合的10μg(而不是50μg)HCgp-39類似地獲得誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。然而，關(guān)節(jié)炎的得分有一些低(未列出數(shù)據(jù))。4只鼠中的3只發(fā)展為嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎。在試驗(yàn)期間一只鼠僅顯現(xiàn)出輕微癥狀。在整個(gè)試驗(yàn)期間對(duì)照鼠未顯現(xiàn)出關(guān)節(jié)炎癥狀?？傊?，10和50μg蛋白質(zhì)兩者都足以誘導(dǎo)Balb/c鼠的發(fā)展的關(guān)節(jié)炎。由HCgp-39誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的慢性特征(除周期性復(fù)發(fā)外還有對(duì)稱的關(guān)節(jié)痛)是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)疾病發(fā)展的征兆。表6用HCgp-39致敏的Balb/c鼠關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生和發(fā)展FP＝前腳爪HP＝后腳爪conlr＝對(duì)照。關(guān)節(jié)炎癥狀沒有得分＝0，中度每只動(dòng)物得分不超過(guò)2，重度每只動(dòng)物得分≥4。用遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)分析測(cè)定免疫耐受性在0天給對(duì)照鼠注射HCgp-39表現(xiàn)出強(qiáng)的抗原特異性DTH反應(yīng)，這意味著致敏后引發(fā)了對(duì)HCgp-39的細(xì)胞免疫反應(yīng)(表7)。然而鼻內(nèi)給藥HCgp-39完全消除了對(duì)自身抗原攻擊的遲發(fā)型超敏反應(yīng)，因此顯示出HCgp-39特異性T細(xì)胞實(shí)際上耐受了。值得注意的是，非耐受組10只動(dòng)物中的4只于攻擊側(cè)相鄰近的腳踝發(fā)展為關(guān)節(jié)炎。相反，耐受組于攻擊側(cè)相鄰近的關(guān)節(jié)并未發(fā)展為關(guān)節(jié)炎，因此表明，對(duì)HCgp-39的免疫耐受性導(dǎo)致了保護(hù)機(jī)體阻止關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。表7經(jīng)鼻內(nèi)給藥耐受后對(duì)HCgp-39的DTH反應(yīng)。</tables>對(duì)關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)或發(fā)展的耐受性進(jìn)一步監(jiān)測(cè)了對(duì)HCgp-39耐受和非耐受的Balb/c鼠關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生和發(fā)展。在對(duì)照(非對(duì)受的)組的所有鼠，經(jīng)HCgp-39致敏后產(chǎn)生了疾病(表8)。7只鼠逐漸發(fā)展為嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎同時(shí)3只鼠僅表現(xiàn)出輕微的癥狀(最高得分為2)。相反，試驗(yàn)期間HCgp-39耐受組中的5只鼠被保護(hù)阻止了疾病發(fā)展。此外，耐受組的兩只動(dòng)物在短暫時(shí)間內(nèi)顯現(xiàn)出僅僅是輕微的癥狀。三只動(dòng)物發(fā)展為得分為4的較嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎。令人感興趣的是，在耐受的動(dòng)物中，前腳爪和后腳爪關(guān)節(jié)炎的發(fā)作分別被延遲了最少7-9天(圖1)。雖然耐受組的少數(shù)動(dòng)物受到影響，每只動(dòng)物前腳爪關(guān)節(jié)炎得分可與非耐受動(dòng)物關(guān)節(jié)炎得分相比。然而耐受動(dòng)物中每只動(dòng)物后腳爪關(guān)節(jié)炎得分有些低(圖1)。表8HCgp-39耐受和非耐受的Balb/c鼠關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生和發(fā)展</tables>關(guān)節(jié)炎發(fā)作第一個(gè)癥狀出現(xiàn)-最大數(shù)量動(dòng)物受到傷害。關(guān)節(jié)炎癥狀沒有癥狀得分＝0，中度每只動(dòng)物得分不超過(guò)2，重度每只動(dòng)物得分≥4。上述試驗(yàn)說(shuō)明了在Balb/c鼠中HCgp-39的關(guān)節(jié)炎基因的特性。HCgp-39誘導(dǎo)的疾病過(guò)程其特征為前腳爪和/或后腳爪的周期性復(fù)發(fā)并且從輕的關(guān)節(jié)炎逐漸發(fā)展為更嚴(yán)重的類型。同樣，觀察到的對(duì)稱分布的關(guān)節(jié)痛和周期性復(fù)發(fā)，暗示著在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病的發(fā)展。HCgp-39的高度的關(guān)節(jié)炎基因特性通過(guò)單次皮下注射10或50μg能在所有動(dòng)物身上引起關(guān)節(jié)炎癥狀的蛋白質(zhì)予以說(shuō)明。通過(guò)誘導(dǎo)HCgp-39特異性遲發(fā)型超敏反應(yīng)表明實(shí)際上激發(fā)了HCgp-39特異性T細(xì)胞對(duì)HCgp-39的致敏反應(yīng)。這些數(shù)據(jù)通過(guò)對(duì)用HCgp-39在腳爪肉趾免疫過(guò)的動(dòng)物的HCgp-39特異性體外增殖反應(yīng)的說(shuō)明被進(jìn)一步證實(shí)(數(shù)據(jù)未給出)。重要的是，非耐受的動(dòng)物于注射部位鄰近的腳踝發(fā)展為關(guān)節(jié)炎，因此實(shí)際上意味著HCgp-39特異性T細(xì)胞涉及關(guān)節(jié)炎的誘導(dǎo)。肽類抗原鼻內(nèi)給藥被用于誘導(dǎo)抗原特異性免疫耐受性。試驗(yàn)表明HCgp-39鼻內(nèi)給藥導(dǎo)致免疫非反應(yīng)性。致敏后的DTH反應(yīng)在HCgp-39耐受鼠中完全消除而對(duì)照鼠表現(xiàn)出抗原特異性腫脹。這些現(xiàn)象表明給予HCgp-39導(dǎo)致了外周免疫耐受性。對(duì)非耐受動(dòng)物，10只鼠中4只的DTH反應(yīng)伴隨著腳踝(鄰近攻擊部位)關(guān)節(jié)炎。相反，HCgp-39耐受的動(dòng)物腳踝實(shí)際上被完全保護(hù)，這意味著自身反應(yīng)性T細(xì)胞被有效地抑制了。通過(guò)觀察到的耐受組10只動(dòng)物中的5只在整個(gè)試驗(yàn)期間完全被保護(hù)的現(xiàn)象，進(jìn)一步說(shuō)明了用HCgp-39產(chǎn)生的耐受性保護(hù)機(jī)體阻止疾病發(fā)展的概念。雖然這一組中其它5只動(dòng)物最終顯示出臨床癥狀，但關(guān)節(jié)炎的發(fā)作被顯著地延遲。因此可以斷定，HCgp-39特異性T細(xì)胞與關(guān)節(jié)炎基因的過(guò)程有關(guān)并且更重要的是，通過(guò)使用本發(fā)明的藥物組合物使T細(xì)胞耐受可以延遲或抑制關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。序列一覽表(1)一般資料(i)申請(qǐng)人(A)名稱AKZONOBELN.V.(B)街Velperweg76(C)城市Arnhem(E)國(guó)家荷蘭(F)郵政編碼(ZIP)6824BM(G)電話0412-666376(H)傳真0412-650592(I)電報(bào)37503akphanl(ii)發(fā)明名稱來(lái)自自身抗原的用于自身免疫疾病的免疫治療的新的肽類(iii)序列數(shù)目9(iv)計(jì)算機(jī)可讀型式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBMPC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，Version#1.25(EPO)(2)SEQIDNO1的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO1PheGlyArgSerPheThrLeuAlaSer15(2)SEQIDNO2的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO2PheThrLeuAlaSerSerGluThrGly15(2)SEQIDNO3的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO3TyrAspAspGlnGluSerValLysSer15(2)SEQIDNO4的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO4PheSerLysIleAlaSerAsnThrGln15(2)SEQIDNO5的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度13個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO5ProThrPheGlyArgSerPheThrLeuAlaSerSerGlu1510(2)SEQIDNO6資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度13個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO6ArgSerpheThrLeuAlaSerSerGluThrGlyValGly1510(2)SEQIDNO7的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度13個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO7ValGlyTyrAspAspGlnGluSerValLysSerLysVal1510(2)SEQIDNO8的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO8SerGlnArgpheSerLysIleAlaSerAsnThrGlnSerArg1510(2)SEQIDNO9的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度13個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO9ProLyspheValLysGlnAsnThrLeuLysLeuAlaThr1510權(quán)利要求1.包含HCgp-39的亞序列的肽，上述肽包含氨基酸序列FGRSFTLAS(SEQIDNO.1)，F(xiàn)TLASSETG(SEQIDNo.2)，YDDQESVKS(SEQIDNo.3)和FSKIASNTQ(SEQIDNo.4)中的一種或多種。2.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，上述肽包含氨基酸序列PTFGRSFTLASSE(SEQIDNo.5)，RSFTLASSETGVG(SEQIDNo.6)，VGYDDQESVKSKV(SEQIDNo.7)和SQRFSKIASNTQSR(SEQIDNo.8)中的一種或多種。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的肽，具有氨基酸序列PTFGRSFTLASSE(SEQIDNo.5)。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的肽，具有氨基酸序列RSFTLASSETGVG(SEQIDNo.6)。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2的肽，具有氨基酸序列VGYDDQESVKSKV(SEQIDNo.7)。6.根據(jù)權(quán)利要求1或2的肽，具有氨基酸序列SQRFSKIASNTQSR(SEQIDNo.8)。7.HCgp-39蛋白質(zhì)或根據(jù)權(quán)利要求1至6中任何一項(xiàng)的肽做為治療物質(zhì)的應(yīng)用。8.包含HCgp-39蛋白質(zhì)或根據(jù)權(quán)利要求1至6中任何一項(xiàng)的一種或多種肽和可接受的藥物載體的藥物組合物。9.HCgp-39蛋白質(zhì)或根據(jù)權(quán)利要求1至6中任何一項(xiàng)的一種或多種肽作為制備藥物制劑的應(yīng)用，該制劑用于患T細(xì)胞介導(dǎo)的軟骨損傷的病人來(lái)誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞對(duì)自身抗原HCgp-39的耐受性。10.HCgp-39蛋白質(zhì)或根據(jù)權(quán)利要求1至6中任何一項(xiàng)的一種或多種肽作為制備藥物制劑的應(yīng)用，該制劑用于患關(guān)節(jié)炎、特別是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病人來(lái)誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞對(duì)自身抗原HCgp-39的耐受性。11.HCgp-39蛋白質(zhì)或根據(jù)權(quán)利要求1至6中任何一項(xiàng)的一種或多種肽用于誘導(dǎo)非人類的哺乳動(dòng)物、特別是鼠的臨床關(guān)節(jié)炎的方法中。12.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任何一項(xiàng)的肽做為診斷物質(zhì)的應(yīng)用。13.包含根據(jù)權(quán)利要求1至6中任何一項(xiàng)的一種或多種肽和一種檢測(cè)試劑的藥物組合物。14.用于檢測(cè)活化的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的診斷方法，它包含下述步驟a)從一個(gè)個(gè)體血樣分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)，b)在適宜條件下培養(yǎng)上述PBMC，c)在HCgp-39，其片斷和/或根據(jù)權(quán)利要求1至6中任何一項(xiàng)的一種或多種肽存在下溫育上述PBMC培養(yǎng)物，并且d)檢測(cè)T細(xì)胞的反應(yīng)，指示個(gè)體中活化的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的存在。15.用于檢測(cè)活化的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的測(cè)試盒，上述的測(cè)試盒包含HCgp-39或根據(jù)權(quán)利要求1至6中任何一項(xiàng)的一種或多種肽。16.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任何一項(xiàng)的肽，具有9-55個(gè)氨基酸殘基的一個(gè)氨基酸序列。全文摘要本發(fā)明涉及得自自身抗原HCgp-39的新型肽類，該肽類至少含有氨基酸序列FGRSFTLAS(SEQIDNo.1)，F(xiàn)TLASSETG(SEQIDNo.2)，YDDQESVKS(SEQIDNo.3)和FSKIASNTQ(SEQIDNo.4)中的一種。這些肽類類似于關(guān)節(jié)軟骨中自身抗原HCgp-39上的MHCII類限制的T細(xì)胞表位。在自身免疫疾病中，HCgp-39和該肽類可用于關(guān)節(jié)軟骨損傷的特異性治療以誘發(fā)免疫系統(tǒng)耐受性。自身抗原HCgp-39和該肽類也適于誘導(dǎo)非人的動(dòng)物特別是小鼠的關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明還涉及含有該自身抗原和/或該肽類的藥物組合物、檢測(cè)試樣中自身反應(yīng)性T細(xì)胞的診斷方法以及用于該方法的測(cè)試盒。文檔編號(hào)A61K38/00GK1168677SQ95190944公開日1997年12月24日申請(qǐng)日期1995年10月25日優(yōu)先權(quán)日1994年10月27日發(fā)明者A·M·H·布茨,G·F·M·沃海登申請(qǐng)人:阿克佐諾貝爾公司