專利名稱：動物胸腺生長因子口服液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從健康幼齡動物新鮮胸腺中提取的胸腺生長因子的無菌水溶液制劑領(lǐng)域。
胸腺是機(jī)體的中樞免疫器官，是T細(xì)胞發(fā)育分化的場所。已有實(shí)踐表明，胸腺中有免疫增強(qiáng)作用的多種激素和免疫抑制作用的因子，這兩類功能相對的因子，共同擔(dān)負(fù)著機(jī)體細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用。
動物胸腺，特別是從健康幼齡動物(乳豬、乳?；蚱渌g動物)的新鮮胸腺中提取的具有生物活性的中小分子量的胸腺生長因子能明顯促進(jìn)成纖維細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，對胃潰瘍有明顯的促愈合作用，在治療消化性潰瘍及創(chuàng)傷愈合方面可取得療程短，愈合率高，復(fù)發(fā)率低的良好效果，其臨床應(yīng)用、開發(fā)前景可觀。
本申請人已經(jīng)就此技術(shù)向中國專利局提出了題為《幼齡動物胸腺生長因子及其提取分離方法》的發(fā)明專利申請。
本發(fā)明的目的是，為了滿足上述治療消化性潰瘍及創(chuàng)傷愈合臨床應(yīng)用的急需，而提供的動物胸腺生長因子口服液，該口服液能明顯促進(jìn)成纖維細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞增殖；刺激消化性潰瘍受損組織局部表皮細(xì)胞再生、修復(fù)，本品適用于胃、十二指腸潰瘍患者的治療。
本發(fā)明特征如下1、本發(fā)明提供的動物胸腺生長因子口服液系以健康幼齡動物(乳豬、乳牛或其它幼齡動物)新鮮胸腺中提取的具有生物活性的中小分子量的蛋白類無菌水溶液，分子量小于60KD，每瓶蛋白含量為標(biāo)示量的90.0-110.0％，標(biāo)示量為5mg/ml?；钚詥挝淮笥?200單位，活力比值為2.0以上。
上述制品原材料為新鮮幼齡動物胸腺，特別是離體6小時之內(nèi)的乳豬，乳牛胸腺。在選材過程中，發(fā)現(xiàn)胸腺有包囊或結(jié)節(jié)，質(zhì)地粗糙，色澤不正?；蛴挟惓馕都半x體超過6小時者均不符合選材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
2、本發(fā)明提供的動物胸腺口服液為淡黃色澄清透明液體。
3、本口服液用水稀釋成30-50ug/ml的溶液，照分光光度法(按中國藥典1990年版二部附錄24頁)測定，在257±2nm波長處有最大特征吸收峰，在236±2nm波長處有最小特征吸收峰，最大吸收度與最小吸收度的比值為1.45以上。
本品中加雙縮脲試劑，混勻，即呈紫瑾色。
4、pH值為5.5-6.5。
5、核酸含量＜0.7mg/ml游離氨基酸含量＜5mg/ml6、本品的電泳分子量(用SDS-PAGE電泳法)，應(yīng)不少于5條蛋白電泳帶，分子量在12-55KD之間，其效果最佳。
本品通過凝膠過濾柱作組分分離，HPLC組份測定應(yīng)出現(xiàn)3個特征吸收峰，三個特征吸收峰相對百分面積總和在70-90％之間。
本口服液的作用與用途能明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞增殖；刺激消化性潰瘍受損組織局部表皮細(xì)胞再生、修復(fù)；本品適用于胃、十二指腸潰瘍患者的治療。
本口服液的用法與用量
胃、十二指腸潰瘍患者口服，每日2次(早晚各一次)每次一瓶(30mg/6ml)。15天為一療程。
規(guī)格每6ml含30mg，5mg/每瓶，活性單位≥1200單位。
儲藏嚴(yán)封，在室溫陰涼處保存。
有效期室溫條件下保存1年。
下面介紹本口服液中有效成份的測定方法及結(jié)果1、蛋白含量的測定對照品溶液的制備精密稱取牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品100mg，置100.0ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取10.0ml，置100.0ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻即得。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取對照品溶液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8及1.0ml，分別置具塞試管中，并加水使成1.0ml，每管各加堿性銅試液5.0ml，搖勻，室溫放置10分鐘，再依次快速加入酚試劑0.5ml，立即搖勻，置水浴(30℃)中保溫30分鐘，取出，放冷至室溫，以對照品溶液0.0ml管作空白，照分光光度法(中國藥典1990年版二部附錄24頁)，在680nm波長處測定吸收度。以吸收度為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
測定法精密量取樣品溶液5.0ml置100.0ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取10.00ml，置50.0ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取稀釋液1.0置具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下自“加堿性銅試液”起至測定吸收度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品中蛋白質(zhì)的含量，計算。
應(yīng)用LOWRY法檢測樣品8批，其蛋白含量范圍為標(biāo)示量(5mg/ml)的98-106％之間，結(jié)果見表1。所以本品規(guī)定蛋白含量為標(biāo)示量的90.0-110.0％。
表1為本口服液8批樣品蛋白含量測定結(jié)果樣品批號 蛋白含量(mg/ml)為標(biāo)示量％920620 5.1102.0920821 4.9 98.0921222 5.2104.0930301 5.1102.0930602 5.3106.0950301 5.1102.0950701 5.3106.0950702 4.9 98.02、用紫外吸收法測定本口服液的核酸含量(1)取2支離心管，每管各加入2.0ml待測的樣品溶液，再向甲管內(nèi)加2.0ml蒸餾水，向乙管內(nèi)加2.0ml沉淀劑。混勻，在冰浴(或冰箱)中放置30分鐘，3000r/min，離心10分鐘。將甲、乙兩管的上清液分別稀釋至光密度值在0.1-1.0之間。選用光程為1厘米的石英比色杯，在260nm波長下測其光密度。
(2)計算 沉淀劑鉬酸銨一過氯酸試劑2.15mol/L(0.25％)鉬酸銨溶于0.24mol/L(2.5％)過氯酸中。如配200ml，即在193ml蒸鎦水中加入7ml6.97mol/L(70％)過氯酸和0.5克鉬酸銨。
因本品系從胸腺中經(jīng)超濾提取的中小分子蛋白類口服液，其中肯定含有少量的核酸類物質(zhì)，根據(jù)生產(chǎn)工藝的實(shí)際情況和該物質(zhì)的存在又不影響本品藥效及引發(fā)副反應(yīng)的特點(diǎn)，故不必專門棄除。但應(yīng)作為常規(guī)含量測定項目之一控制和規(guī)定其限量，利于保證本品質(zhì)量。根據(jù)8批樣品測定結(jié)果(見表2)，限量規(guī)定小于0.7mg/ml。
表2為8批本口服液含核酸總量測定結(jié)果。
表2如下批 號 核量含量(mg/ml) 平均值920620 0.400 0.430 0.6110.480920821 0.630 0.590 0.6200.613921222 0.540 0.570 0.5800.563930301 0.640 0.620 0.6100.623930602 0.510 0.500 0.5200.510950301 0.540 0.560 0.5700.556950701 0.640 0.610 0.6000.616950702 0.590 0.600 0.6100.6003、游離氨基酸的測定因本品是用超濾工藝提取的中小分子混合物，故增加檢查游離氨基酸作為本品質(zhì)量控制的另一項指標(biāo)是必要的，根據(jù)8批樣品測定結(jié)果(見表7)其含量均在4-5mg/ml之間，故應(yīng)將游離氨基酸含量規(guī)定小于5mg/ml為宜。
表7.游離氨基酸含量測定結(jié)果批 號游離氨基酸含量(mg/ml)920620 4.72920821 4.32921222 4.58930301 4.51930602 4.55950301 4.56950701 4.18950702 4.01
4、活力的測定本品治療消化性潰瘍是通過營養(yǎng)局部受損粘膜并促進(jìn)表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞再生而達(dá)到治療目的，因此，測定本品促細(xì)胞增殖效應(yīng)是考核和鑒測其藥效學(xué)的一個重要指標(biāo)。
本標(biāo)準(zhǔn)選用Balb/c或Swiss小鼠3T3成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，以不同濃度的本品加入培養(yǎng)孔內(nèi)，加入[3H]-胸腺嘧啶苷核(3H-TRD)進(jìn)行體外細(xì)胞DNA合成摻入。經(jīng)一段時間后，溶解細(xì)胞，提取DNA，在液體閃爍儀上計數(shù)[3H]-TdR摻入的cpm值)，與對照組相比較，以此反映本品活性。
供試品溶液的配制精密量取樣品溶液適量，用培養(yǎng)基稀釋成10-1、10-2及10-3溶液，混勻，即得。
細(xì)胞培養(yǎng)取Balb/C或Swiss小鼠3T3成纖維細(xì)胞，接種于方瓶內(nèi)，用培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)及傳代。
測定法取生長良好的3T3細(xì)胞，用0.25％胰酶消化，并用培養(yǎng)基配成4×104個/ml細(xì)胞懸液。
取48孔培養(yǎng)板1塊，每孔接種細(xì)胞懸液0.5ml。置5％CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)10小時后，換0.2％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，每孔0.5ml。繼續(xù)培養(yǎng)36小時，加供試品溶液(10-1、10-2、10-3)50ul，每個濃度設(shè)3個孔。對照組設(shè)3個孔，每孔加培養(yǎng)基50ul。培養(yǎng)12小時后加入[3H]-TRD，每孔ZuCi(20ul)，再培養(yǎng)24小時后，去掉培養(yǎng)基，用生理鹽水洗2次，加甲醇固定2次，每次5分鐘；加水洗二次后，加5％三氯乙酸二次，每次固定15分鐘，再用水洗二次；用0.5mol/LNaOH 20ul溶解細(xì)胞，30分鐘后溶解液加到濾膜上，紅外燈下烤干，置含3ml閃爍液(0.01％POPO，0.4％PPO二甲苯溶液)的測定瓶中，于LKB2215液閃儀上測定每分鐘脈沖數(shù)(cpm)，按下式計算樣品組cpm值與對照組cpm組的比值，即得。 根據(jù)生物制品活性單位的制定原則，我們將每瓶蛋白含量(W)與該樣品活力比值(X)＞2.0時最大稀釋度的檢測含量(m)的比值定為每瓶樣品的活力定量單位(U)，即 下列表3為8批本口服液促3T3細(xì)胞增殖的cpm值檢測結(jié)果。
表3如下批 號樣品檢測 CPM值 活力比值**P濃度(mg/ml) X±SD(n＝3)9206025×10-38031.1±781 2.7 ＜0.059206205×10-31413.7±788 2.5 ＜0.059212225×10-36158.4±270 2.2 ＜0.05*Ctr. 2635.1±1369405285×10-37954.0±765 2.2 ＜0.059407205×10-38052.1±785 2.2 ＜0.059408265×10-37504.3±562 2.1 ＜0.05Ctr. 3618.0±1869507025×10-3348.7±33.2 3.1 ＜0.059505075×10-3326.1±132.0 1.9 ＜0.05Ctr. 101.3±32.7注*Ctr.為每次試驗時所設(shè)陰性對照樣，即含0.2％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，試驗均在每批樣品分裝后12個月內(nèi)進(jìn)行；**P值所示大小表示每次試驗樣品CPM值與對照樣比較差異的顯著性。
表3結(jié)果顯示，8批本口服液在同一稀釋度的檢測濃度時，經(jīng)三次試驗測定，各批樣品的CPM值與對照樣比較均具有顯著性差異(P＜0.05)，表明本口服液有較強(qiáng)的促細(xì)胞增殖活性。各批樣品的活力比值均在1.9以上，950507批樣品在X＝1.9時，其CPM值與對照組比較，經(jīng)統(tǒng)計處理已具有顯著性差異，即t＝2.857＞t0.05(2.78)，P＜0.05。因此，我們將檢測樣品活力比值(X)為2.0以上定為活力呈陽性的標(biāo)準(zhǔn)。
表4為8批本口服液(30mg/瓶)活力比值及活力單位檢測結(jié)果。
表4批 號 活力比值(X)活力單位/瓶*5×10-15×10-25×10-35×10-49206022.7 11.4 2.7 1.31.2×1049206203.8 10.4 2.5 1.11.2×1049212224.6 9.4 2.2 1.01.2×1049405281.8 3.6 2.2 1.51.2×1049407202.0 4.3 2.8 1.41.2×1049408261.9 4.3 3.6 1.21.2×1049507011.6 9.7 3.2 3.11.2×1059507021.8 10.6 3.1 1.91.2×104注*5×10-1為檢測樣品稀釋終濃度(mg/ml)。
表4.所示活力比值及活力單位均為各批樣品在成品分裝后12個月內(nèi)的試驗結(jié)果。盡管樣品在不同條件、儲存不同時間后，活力單位有一定程度的衰減，但根據(jù)動物藥效學(xué)試驗研究結(jié)果提示，活力比值X≥2.0時的樣品最大稀釋度不應(yīng)低于1∶100(5×10-2mg/ml)即活力單位≥1200u/瓶時，本品均具有顯著的促實(shí)驗性胃潰瘍愈合的藥效學(xué)作用。因此，在質(zhì)量控制上，我們將活單位為1200u/瓶定為本口服液活力檢測值的最低限度。規(guī)定每瓶樣品活力檢測的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)為1200u/瓶以上。
5、分子量范圍的測定本口服液為中小分子量蛋白質(zhì)，經(jīng)離子交換柱分離純化，我們獲得9個組份峰，其中峰1至峰5有明顯促細(xì)胞增殖活性，經(jīng)電泳證實(shí)，各活性峰分子量均在12-55KD范圍之內(nèi)。為控制工藝的穩(wěn)定性，我們將本品進(jìn)行SDS-PAGE檢測，確定本品的分子量范圍，以作為本品的工藝流程控制指標(biāo)，經(jīng)電泳，5批樣品結(jié)果均顯示在分子量12-55KD范圍內(nèi)，分子量分別為55KD、40KD、33KD、31KD、23KD、16KD、1.2KD，因此我們規(guī)定本品的電泳分子量應(yīng)在12-55KD之間，且不少于5條帶。
表5為5批本口服液樣品的SDS-PAGE電泳測定分子量結(jié)果。
表5樣品批號 分子量范圍 電泳帶數(shù)930301 12KD，16KD，31KD，33KD，55KD 5930602 12KD，16KD，31KD，33KD，40KD，55KD 6950301 12KD，16KD，23KD，31KD，55KD 5950701 12KD，16KD，23KD，31KD，33KD，55KD 6950701 12KD，16KD，31KD，33KD，55KD 56、HPLC組份測定
本口服液是一組中小分子量的蛋白質(zhì)，國內(nèi)外尚無相同的標(biāo)準(zhǔn)可尋，且本品屬蛋白質(zhì)類物質(zhì)，故不宜按常規(guī)的C18反相柱檢測，經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗篩選，選擇出蛋白凝膠過濾柱進(jìn)行檢測為好，按本法實(shí)驗，本品在規(guī)定色譜條件下有5個組份吸收峰，其中峰1、2、3有顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖活性，峰4、峰5促細(xì)胞增殖效應(yīng)不穩(wěn)定。因此我們將本口服液原液通過凝膠過濾柱作組份分離，收集活性峰1、2、3作為對照品，用于控制本口服液成品中的活性組份含量。經(jīng)用HPLC對6批樣品檢測，峰1，峰2，峰3的相對百分面積總和均在百分之七十至九十之間。見表6，而且以后生產(chǎn)的每批樣品均應(yīng)與提供的對照品作對照，符合者為合格。
表6為6批本口服液HPLC圖譜數(shù)據(jù)檢查表6樣品批號 峰號 占總面積(％)930301 1，2，3 79.35930601 1，2，3 75.51950301 1，2，3 74.86950401 1，2，3 80.60950701 1，2，3 74.43950702 1，2，3 80.38標(biāo)準(zhǔn)品 1，2，3 100本口服液能明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞增殖，刺激消化性潰瘍受損組織表面粘膜及創(chuàng)傷表面上皮細(xì)胞再生、修復(fù)。適用于胃、十二指腸、結(jié)腸、口腔潰瘍及燒傷、皮膚糜爛患者的治療。
根據(jù)初步穩(wěn)定性試驗結(jié)果，本口服液在4℃條件下儲藏，其生物學(xué)活性及藥效指標(biāo)在24個月時仍穩(wěn)定，室溫陰涼條件下儲藏，穩(wěn)定期為12個月以上。而在較高溫度條件下，其活性及藥效在短期內(nèi)(60天)仍可保存，故本品暫規(guī)定，室溫陰涼條件下儲藏有效期12個月。
下面介紹本口服的鑒別1、照分光光度法，本口服液在257±2nm及236±2nm波長處分別有最大及最小特征吸收峰，最大吸收度與最小吸收度的比值為1.45以上，見表8。因此，以此特征吸收峰來鑒別本品真?zhèn)巍?br> 表8為8批本口服液分光光度法鑒別測定結(jié)果。
表8吸收值樣品批號(257±2nm) (236±2nm) 比值920620 0.2794 0.1817 1.512920821 0.8552 0.5621 1.521921222 0.7709 0.5057 1.524930301 0.6217 0.3177 1.510930602 0.9194 0.6192 1.480950301 0.5070 0.3316 1.520950701 0.9052 0.5120 1.460950702 1.0333 0.6881 1.5002、蛋白定性本口服液以乳牛、乳豬等新鮮胸腺為原料，超濾提取制得的物質(zhì)主要是中小分子量蛋白類物質(zhì)，故經(jīng)蛋白質(zhì)定性檢查應(yīng)為陽性。蛋白質(zhì)檢查方法很多，如沉淀法、顯色法、電泳法、蛋白試紙法等。雙縮脲法靈敏、簡便，便于判斷結(jié)果。故本品采用雙縮脲法檢查蛋白質(zhì)，以作為質(zhì)量定性的初步鑒別。本口服液樣品8批，經(jīng)蛋白質(zhì)定性檢查均呈陽性反應(yīng)(見表9)。
表9為9批本口服液蛋白定性檢查結(jié)果。
表9樣品批號 雙縮脲反應(yīng)920620 陽性920821 陽性921222 陽性930301 陽性930602 陽性950301 陽性950701 陽性950702 陽性3、酸堿度檢查酸堿度是保持物質(zhì)活力穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，8批樣品加溶液稀釋后，測得pH在5.5-6.5之間(見表10)。根據(jù)臨床用藥安全要求及生產(chǎn)實(shí)際，故將本品酸堿度規(guī)定為pH5.5-6.5之間。
表10為8批賽姆斯pH值測定結(jié)果。
表10樣品批號 pH值(三次測定)平均值9206205.8，5.9，5.9 5.879208216.0，6.1，5.9 6.009212225.8，6.1，6.0 5.979303016.1，6.2，5.9 6.079306026.1，6.2，6.3 6.209503016.2，6.1，6.1 6.139507016.3，6.1，6.2 6.209507025.8，6.0，6.1 5.97
4、衛(wèi)生學(xué)檢查本口服液為高營養(yǎng)的蛋白質(zhì)類口服液制劑，為防止在超濾除菌及其它工序中被污染，以便室溫條件下儲存，故應(yīng)做衛(wèi)生學(xué)檢查。8批樣品經(jīng)檢查發(fā)現(xiàn)均符合口服液標(biāo)準(zhǔn)，見表11。
表11為8批本口服液衛(wèi)生學(xué)檢測結(jié)果。
表11樣品批號 大腸菌群 細(xì)菌總數(shù)致病菌(個/100ml) (個/ml)920620 ＜3 0未檢出920821 ＜3 0未檢出921222 ＜3 0未檢出930301 ＜3 0未檢出930602 ＜3 0未檢出950301 ＜3 0未檢出950701 ＜3 0未檢出950702 ＜3 0未檢出
權(quán)利要求
1.動物胸腺生長因子口服液，其特征在于本口服液為從健康幼齡動物(乳豬、乳牛或其它幼齡動物)新鮮胸腺中提取的具有生物活性的中小分子量的蛋白質(zhì)無菌水溶液，分子量小于60KD，每瓶蛋白質(zhì)含量為標(biāo)示量的90.0-110.00％，其標(biāo)示量為5mg/ml，活性單位大于1200單位，活力比值為2.0以上。
2.按權(quán)利要求1所述的動物胸腺生長因子口服液，其特征在于口服液的原材料即新鮮幼齡動物胸腺離開動物原體時間不得超過6小時，在選材過程中，發(fā)現(xiàn)胸腺有包囊或結(jié)節(jié)、質(zhì)地粗糙、色澤不正?；蛴挟惓馕都半x體時間超過6小時者均不符合本口服液選材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
3.按權(quán)利要求1所述的動物胸腺生長因子口服液，其特征在于口服液為淡黃色澄清透明液體。
4.按權(quán)利要求1所述的幼齡動物胸腺口服液，其特征在于本口服液用水稀釋成30-50ug/ml的溶液，照分光光度法測定，在2 57±2nm波長處有最大特征吸收峰，在236±2nm波長處有最小特征嘆收峰，最大吸收度與最小嘆收度的比值為1.45以上。本品中加雙縮脲試劑，混勻，即呈紫瑾色。
5.按權(quán)利要求1所述的動物胸腺生長因子口服液，其特征在于本口服液中核酸含量＜0.7mg/ml，游離氨基酸含量＜5mg/ml。
6.按權(quán)利要求1所述的動物胸腺生長因子口服液，其特征在于本口服液的電泳分子量在12-55KD之間，應(yīng)不少于5條蛋白電泳帶。
7.按權(quán)利要求1所述的動物胸腺生長因子口服液，其特征在于本口服液通過凝膠過濾 作組分分離HPLC組份測定應(yīng)出現(xiàn)3個特征吸收峰，三個特征吸收峰相對百分面積總和在70-90％之間。
全文摘要
本動物胸腺生長因子口服液是一種從健康幼齡動物(乳豬、乳?；蚱渌g動物)新鮮胸腺中提取的具有生物活性的中子分子量的蛋白質(zhì)無菌水溶液，分子量小于60KD，每瓶蛋白含量為標(biāo)示量的90.0-11.0％，活性單位大于1200單位，活性比值為2.0以上，能明顯促進(jìn)成纖維細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，對潰瘍及創(chuàng)傷愈合有明顯促愈合作用，在治療消化性潰瘍及創(chuàng)傷愈合方面可取得療程短、愈合率高、復(fù)發(fā)率低的良好效果，臨床應(yīng)用、開發(fā)前景可觀。
文檔編號A61K35/26GK1148959SQ9511765
公開日1997年5月7日 申請日期1995年10月20日 優(yōu)先權(quán)日1995年10月20日
發(fā)明者陳光明, 楊富強(qiáng), 王東曉 申請人:中國人民解放軍第四五八醫(yī)院