專利名稱：新型甙類抗血栓藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大蒜皂甙、大花紅景天黃酮甙、土貝母皂甙及其衍生物對(duì)于防治血栓病的新用途和以其為主要成分制成的一類新型抗血栓藥物。
大蒜是百合科蔥屬植物蒜(Allium sativum L.)的鱗莖。大量現(xiàn)代藥理和臨床研究發(fā)現(xiàn)，大蒜具有較強(qiáng)的抑制血小板聚集作用，對(duì)抗血脂升高及提高纖溶活性，從而具有抗血栓、抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用(陳靜波等，中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，1991，7(2)88；韓金祥等，國(guó)外醫(yī)學(xué)中醫(yī)中藥分冊(cè)，1990，12(1)1)。關(guān)于大蒜水溶性成分的化學(xué)研究，日本學(xué)者M(jìn)atsuura報(bào)告得自大蒜的呋甾皂甙proto-eruboside-B，sativoside-B1，和兩個(gè)甾體皂甙sativoside-R1，sativoside-R2的結(jié)構(gòu)(Matsuura H，et al.，Chem Pharm Bull，1988，363659；Chem Pharm Bull，1989，37(10)2741)。至于其藥理作用，尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
大花紅景天Rhodiola crenulata SH.Fu為紅景天的一種，前人曾報(bào)道其化學(xué)成分有紅景天甙，酪醇，rhodionin，和rhodiosin(王曙等，藥學(xué)學(xué)報(bào)，1992，27(2)117；彭江南等，中草藥，1995，26(4)177)等，其中后兩者為紅景天中草質(zhì)素類黃酮化合物，更具特征性。其藥理作用尚未有人研究。
土貝母為葫蘆科植物土貝母Bolbostemma paniculatum(Maxim.)Franquet的干燥塊莖。具有散結(jié)、消腫、解毒之功能，用于治療乳癰瘰疬、乳腺炎、頸淋巴結(jié)核、慢性淋巴結(jié)炎、肥厚性鼻炎(《中華人民共和國(guó)藥典》90版第11頁(yè))。大環(huán)三萜皂甙為土貝母中含量較大的成分，此類成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜獨(dú)特，現(xiàn)已鑒定的有土貝甙甲，乙和丙〔孔凡華等，化學(xué)學(xué)報(bào)1988，46，772-778；1988，46，409-411〕等(結(jié)構(gòu)見(jiàn)表3)。于立堅(jiān)等人發(fā)現(xiàn)土貝甙甲有很強(qiáng)的抗癌活性及對(duì)癌促過(guò)程強(qiáng)的抑制作用〔Planta Medica1994，60，204-208；科學(xué)通報(bào)1991，(18)1421-1424〕，但是迄今為止關(guān)于土貝母皂甙對(duì)心血管系統(tǒng)的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。
本發(fā)明的目的是研究上述甙類化合物對(duì)心血管系統(tǒng)的作用，尋找防治血栓病的有效藥物。
本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)大蒜皂甙proto-iso-eruboside-B(I)和iso-eruboside-B(II)、大花紅景天黃酮甙rhodionin(III)和rhodiosin(IV)以及從土貝母總甙中分得土貝母甙甲(V)，乙(VI)和丙(VII)及其經(jīng)纖維素酶酶解得衍生物1(VIII)，2(IX)和3(X)(結(jié)構(gòu)見(jiàn)表1，2和3)均具有很強(qiáng)的抑制血小板聚集作用和提高纖維蛋白溶解活性，并可明顯延長(zhǎng)血液凝固時(shí)間(結(jié)果見(jiàn)表4)。提示，此類化合物可用作血栓病(如腦血栓、心肌梗塞、動(dòng)脈粥樣硬化等)的防治。
以上述任一有效單體或由其組成的混合物為原料，所作成的藥物可以是各種劑型，包括口服和注射兩種途徑。劑量范圍可以是3-200mg/千克體重/日，較好的用量為3-50mg/千克體重/日，優(yōu)選用量為5-25mg/千克體重/日。
實(shí)施例1.各種甙類化合物的制備工藝大蒜新鮮鱗莖、大花紅景天塊莖和土貝母塊莖，各2公斤，分別粉碎，含水醇(可以是含水甲醇、乙醇)浸提4次(4000ml×4)，每次24小時(shí)，合并濃縮液，減壓蒸除其中醇類至2500ml。所得提取液氯仿萃取三次(1000ml，500ml，500ml)。
水層再與正丁醇分配三次(1300ml，1200ml，500ml)。合并正丁醇層減壓濃縮得正丁醇萃取部位，溶于水中，凍干，分別得大蒜總皂甙(TSG，收率0.58％)，大花紅景天總甙(TSR，收率4.34％)和土貝母總皂甙(TSB，收率2.75％)。性質(zhì)均可溶于水、甲醇。
各總甙樣品經(jīng)Prep.HPLC分離制備單體。條件如下ODS柱(7.8mm×250mm)；流動(dòng)相MeOH-H2O(70∶30→55∶45)；檢測(cè)RI(衰減1024)或UV；流速1.0ml/min；進(jìn)樣量0.7ml/次；分析時(shí)間35-45min/針；紙速0.25cm/min。分別從大蒜總甙中分得proto-iso-eruboside-B(I)和iso-eruboside-B(II)(見(jiàn)表1)；從大花紅景天總甙中分得兩個(gè)黃酮甙rhodionin(III)和rhodiosin(IV)(見(jiàn)表2)；從土貝母總甙中分得土貝母甙甲(V)，乙(VI)和丙(VII)；土貝母甙甲，乙和丙分別經(jīng)纖維素酶酶解得衍生物1(VIII)，2(IX)和3(X)(見(jiàn)表3)。
2.結(jié)構(gòu)鑒定主要利用光譜，包括紅外、紫外、核磁共振譜(1H-NMR，13C-NMR，DEPT，1H-1H，1H-13C COSY和HMBC)和FAB-MS分析，鑒定其結(jié)構(gòu)。運(yùn)用酶解、酸水解、堿水釋及糖醇醋酸酯GC-MS分析技術(shù)解決了含糖較多的皂甙中糖的連接順序和連接位置。
3.生物活性測(cè)定(1)抗血小板聚集實(shí)驗(yàn)取健康兔靜脈血，離心(1000rpm)20min，取上清液為PRP(富血小板血漿)，剩余部分經(jīng)離心(3000rpm)10min，取上清液為PPP(貧血小板血漿)。用取樣器取不同體積的待測(cè)樣品溶液(根據(jù)溶解性用生理鹽水或甲醇溶解)置入直徑為6mm比色杯中，放入自動(dòng)比色槽中，定量取PRP及PPP，將血小板數(shù)調(diào)至28-30萬(wàn)/μl，于37℃培養(yǎng)，加入2μM ADP(0.05ml)誘導(dǎo)，比濁法測(cè)定血小板聚集性，計(jì)算抑制率及IC50。所用儀器為日本產(chǎn)Aggregometer PAM-8T血小板聚集測(cè)定儀。
(2)血液凝固時(shí)間測(cè)定取健康兔靜脈血，0℃離心(3000rpm)10min，取上清液為PPP，用取樣器取待測(cè)樣品溶液(DMSO溶解)30μl，向其中加入150μl PPP，37℃培養(yǎng)50秒，再加入150μl 0.025M CaCl2溶液，旋轉(zhuǎn)攪拌，待旋轉(zhuǎn)停止，即為血液凝固時(shí)間，以溶劑為空白對(duì)照計(jì)算血液凝固的時(shí)間延長(zhǎng)率，以不同濃度樣品溶液測(cè)定IC50。所用儀器為日本產(chǎn)血液凝固時(shí)間測(cè)定儀。
(3)纖溶活性測(cè)定(a)瓊脂培養(yǎng)皿的制作磷酸緩沖液(pH7.4)400ml加入瓊脂4.8g，NaN3200mg直火沸騰，5ml分裝在試管中60-80℃水浴保溫，以免凝固。用磷酸緩沖液將凝血酶(thrombin)調(diào)成100u/ml(1支5ml磷酸緩沖液)勿使起泡，標(biāo)上標(biāo)記。右手拿瓊脂5ml(50℃)，左手拿纖維蛋白原(fibrinogen)(得自小牛血清，持田制藥會(huì)社)5ml一起加入培養(yǎng)皿中，迅速用手旋轉(zhuǎn)幌動(dòng)(7-10圈)混勻，為了不讓起泡，可以攙上述凝血酶溶液(5次)。在上述培養(yǎng)皿中用一小管按對(duì)角線方向打六個(gè)小孔穴，中心打一個(gè)小孔穴，將孔中的瓊脂去掉。
(b)樣品活性測(cè)定不同樣品(2mg)用100μl磷酸緩沖液(不溶時(shí)用DMSO)溶解，加尿激酶(Urokinase)(用磷酸鹽緩沖液溶解成500IU/ml)15μl。取上述樣品溶液10μl加入孔穴中，每個(gè)樣品兩個(gè)孔穴，中心孔穴為空白樣品，37℃培養(yǎng)18小時(shí)。向培養(yǎng)皿中注入5％NaCl水溶液，放置20分鐘，反復(fù)操作2次，下一步用精制水洗凈，同樣反復(fù)操作2次。洗凈后，60℃干燥(約需3小時(shí))。用0.2％Coomassie Brilliant BlueR-250染色液染色，放置20分鐘將染色液倒掉，盤(pán)中加入洗凈液(EtOH∶EtOAc∶H2O＝45∶10∶45)放置20分鐘，進(jìn)行脫色處理，60℃干燥3小時(shí)。測(cè)量孔穴直徑，計(jì)算面積，求出與空白對(duì)照組的面積比，得出纖溶活性提高率(樣品面積/對(duì)照組面積-1)×100％，以不同濃度樣品溶液反復(fù)測(cè)量，算出其IC50。
上述生物活性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，大蒜總甙TSG具有抗血小板聚集和提高纖溶活性；proto-iso-eruboside-B(I)具有顯著的提高纖溶活性；iso-eruboside-B(II)具有明顯的延長(zhǎng)血液凝固時(shí)間和提高纖溶活性；大花紅景天中的rhodionin(III)具有抗血小板聚集作用，并可延長(zhǎng)血液凝固時(shí)間，rhodiosin(IV)則有抗血小板聚集活性；而土貝母總甙TSB及土貝母皂甙(V-X)均具有很強(qiáng)的抗血小板聚集活性，明顯延長(zhǎng)血液凝固時(shí)間和提高纖溶活性(見(jiàn)表4)。腺苷作為陽(yáng)性對(duì)照在此實(shí)驗(yàn)中則有抗血小板聚集活性和提高纖溶活性。
表1得自大蒜的甙類化合物的結(jié)構(gòu) Proto-iso-eruboside-B(I) Iso-eruboside-B(II)
表2得自大花紅景天的甙類化合物的結(jié)構(gòu) Rhodionin(III) Rhodiosin(IV)
表3得自土貝母的甙類化合物的結(jié)構(gòu) 土貝母甙甲(V)R1＝-β-D-Xyl R2＝-HR3＝1 Ara 4土貝母甙乙(VI) R1＝-β-D-Xyl R2＝-OH R3＝1 Ara 4土貝母甙丙(VII) R1＝-β-D-Xyl R2＝-OH R3＝1 Glc 6衍生物1 (VIII) R1＝-HR2＝-HR3＝1 Ara 4衍生物2 (IX) R1＝-HR2＝-OH R3＝1 Ara 4衍生物3 (X)R1＝-HR2＝-OH R3＝1 Glc 6
表4生物活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果抑制血小板聚集實(shí)驗(yàn) 延長(zhǎng)血液凝固時(shí)間實(shí)驗(yàn) 提高纖溶活性實(shí)驗(yàn)甙類樣品IC50* IC50* IC50*mg/ml(mM) mg/ml(mM) mg/ml(mM)腺苷1.9 (7.1) ------ 25 (93.6)TSG27.3 -----13I -----------13 (10.5)II------ 1.5 (1.4) 19 (17.6)III 3.7 (8.2)6.8(15.2) ------IV 7.5(12.3) ------ ------TSB 3.6 1.5 15V 1.8 (1.3)2.6 (1.9) 14 (10.6)VI 0.3 (0.2)2.5 (1.8) 14 (10.3)VII 0.5 (0.3)2.3 (1.6) 13 (9.3)VIII5.2 (4.3)5.7 (4.8) 21 (17.7)IX 4.1 (3.3)4.4 (3.6) 30 (24.3)X 2.7 (2.1)3.6 (2.8) 28 (22.2)*表中所指相當(dāng)與給藥濃度，并非終濃度；------為活性不強(qiáng)，未測(cè)IC50；樣本數(shù)4-權(quán)利要求
1.從大蒜中分得的兩種甾體皂甙proto-iso-eruboside-B(I)和iso-eruboside-B(II)，結(jié)構(gòu)見(jiàn)下頁(yè)。
2.一類新型抗血栓藥物，其特征是以大蒜皂甙proto-iso-eruboside-B(I)和iso-eruboside-B(II)、大花紅景天黃酮甙rhodionin(III)和rhodiosin(IV)以及從土貝母總甙中分得土貝母甙甲(V)，乙(VI)和丙(VII)及其經(jīng)纖維素酶酶解得衍生物1(VIII)，2(IX)和3(X)(結(jié)構(gòu)見(jiàn)下頁(yè))中的任一有效單體或由其中的幾種組成的混合物為有效成分。
3.權(quán)利要求2所述藥物可以是各種劑型，包括口服和注射兩種途徑。
4.權(quán)利要求2所述藥物的劑量范圍可以是3-200mg/千克體重/日，較好的用量為3-50mg/千克體重/日，優(yōu)選用量為5-25mg/千克體重/日。
5.權(quán)利要求2所述藥物抗血栓作用的用途。
6.甙類化合物I-X抗血栓作用的用途。得自大蒜的甙類化合物的結(jié)構(gòu) Proto-iso-eruboside-B(I) Iso-eruboside-B(II) 得自大花紅景天的甙類化合物的結(jié)構(gòu) Rhodionin(III) Rhodiosin(IV)得自土貝母的甙類化合物的結(jié)構(gòu) 土貝母甙甲(V) R1＝-β-D-Xyl R2＝-HR3＝1 Ara 4土貝母甙乙(VI) R1＝-β-D-Xyl R2＝-OH R3＝1 Ara 4土貝母甙丙(VII) R1＝-β-D-Xyl R2＝-OH R3＝1 Glc 6衍生物1 (VIII)R1＝-H R2＝-HR3＝1 Ara 4衍生物2 (IX) R1＝-H R2＝-OH R3＝1 Ara 4衍生物3 (X) R1＝-H R2＝-OH R3＝1 Glc 全文摘要
本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)大蒜皂甙proto-iso-eruboside-B和iso-eruboside-B、大花紅景天黃酮甙rhodionin和rhodiosin、以及從土貝母總甙中分得土貝母甙甲，乙和丙及其經(jīng)纖維素酶酶解得衍生物1，2和3均具有很強(qiáng)的抑制血小板聚集作用和提高纖維蛋白溶解活性，并可明顯延長(zhǎng)血液凝固時(shí)間。進(jìn)而首次發(fā)現(xiàn)這些甙類化合物可用作血栓病(如腦血栓、心肌梗塞、動(dòng)脈粥樣硬化等)防治的新用途。以上述任一有效單體或由其中的幾種組成的混合物為有效成分制成一類新型抗血栓藥物。
文檔編號(hào)A61K31/58GK1138984SQ95106768
公開(kāi)日1997年1月1日 申請(qǐng)日期1995年6月26日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月26日
發(fā)明者彭軍鵬, 陳浩, 喬艷秋, 馬成禹 申請(qǐng)人:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所