專(zhuān)利名稱(chēng)：聚-β-1→4-N-乙?；咸前返闹谱鞣椒?br> 1.前言首先，本發(fā)明涉及一個(gè)純的，易制造的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺(p-GlcNAc)多糖類(lèi)。本發(fā)明的p-GlcNAc是一個(gè)由單糖類(lèi)糖按β-1→4形式連接成高分子量的多聚物，不含蛋白亦不含單個(gè)氨基酸和其它有機(jī)無(wú)機(jī)物的雜質(zhì)。另外，也敘述了p-GlcNAc的衍生物和再成型物。第二，本發(fā)明還涉及以微海藻，優(yōu)選硅藻為原料的本發(fā)明的p-GlcNAc的純化方法。第三，本發(fā)明涉及p-GlcNAc的衍生化和再成型的方法。第四，本發(fā)明涉及純的p-GlcNAc，它們衍生物和/或它的再成型物的應(yīng)用。
2.發(fā)明背景今天，由p-GlcNAc組成的聚糖類(lèi)的性質(zhì)、作用和應(yīng)用的文獻(xiàn)非常豐富。這類(lèi)物質(zhì)通常已被歸類(lèi)于如“殼多糖”。脫乙?；臍ざ嗵茄苌锉粴w于“脫乙酰殼多糖”。大約在1823年，當(dāng)這類(lèi)物質(zhì)首次被利用時(shí)，人們相信殼多糖和脫乙酰殼多糖總是來(lái)自大自然，作為一獨(dú)特的、好下定義的，唯一的和不變的化學(xué)種類(lèi)，殼多糖是完全乙?；M成和脫乙酰殼多糖是完全脫乙?；M成。然而，大約一世紀(jì)后，在它發(fā)現(xiàn)以前殼多糖(chitin)和脫乙酰殼多糖的稱(chēng)呼是很模棱兩可的，實(shí)際上這些化合物展示非常不同的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)。這些不同是由于不同的分子量、不同的乙?；潭群凸矁r(jià)雜質(zhì)的存在，特種蛋白，單氨基酸和無(wú)機(jī)雜質(zhì)的存在造成的。即使今天使用殼多糖和脫乙酰殼多糖的名稱(chēng)仍模棱兩可。并且，實(shí)際上很難給許多不同化合物的混合物下定義。
例如從傳統(tǒng)的來(lái)源，如甲殼動(dòng)物的外殼和真菌菌絲體分離到的殼多糖的性質(zhì)是無(wú)法預(yù)言它的變化。這些變化不僅是因種類(lèi)的不同，而且也受到環(huán)境、季節(jié)的變化的影響，這些因素決定了生產(chǎn)的各種殼多糖的一些生化特性。事實(shí)上，原料的不可預(yù)測(cè)的可變性對(duì)殼多糖基礎(chǔ)工業(yè)的緩慢增長(zhǎng)負(fù)有重大責(zé)任。
今天，在描述從原料分離和制備的科學(xué)文獻(xiàn)中，沒(méi)有關(guān)于完全乙酰化的p-GlcNAc純品，即一個(gè)或多個(gè)產(chǎn)物未被有機(jī)或無(wú)機(jī)雜質(zhì)污染的報(bào)告。當(dāng)McLachlan等(McLachlan，A.G.et al.，1965，Can.J.Botany 43707～713)報(bào)告了殼多糖的分離，隨后的研究工作展示得到了“純”品，事實(shí)上還是含有蛋白和其它雜質(zhì)。
去乙?；筒糠秩ヒ阴；臍ざ嗵钦故境鰸撛谟幸娴幕瘜W(xué)性質(zhì)，例如，高活性、密集的陽(yáng)電荷、強(qiáng)的金屬螯合力、共價(jià)連接蛋白的能力和在許多水溶液中的溶解度。如前所述這些制品的不可預(yù)測(cè)的可變性嚴(yán)重限止了這些多相化合物的利用。比如，實(shí)際結(jié)果表明，目前可得到的殼多糖和脫乙酰殼多糖的數(shù)據(jù)再現(xiàn)性差和難以接受的易變性。另外，可獲得的制劑不夠均勻或不夠純，特別是在醫(yī)學(xué)上使用的這些制劑的成分再現(xiàn)性不夠好。雖然非常希望得到一個(gè)真正純的殼多糖和脫乙酰殼多糖的制劑，這個(gè)制劑的性質(zhì)能高度復(fù)演，并且很容易生產(chǎn)，但，目前還不存在。
3.發(fā)明概述首先，本發(fā)明涉及一個(gè)分離的、易生產(chǎn)的、純的p-GlcNAc類(lèi)物質(zhì)。本發(fā)明的p-GlcNAc是一個(gè)由許多單糖按β-1→4構(gòu)型結(jié)合的高分子量的多聚物。此多糖不含蛋白，基本上不含其它有機(jī)雜質(zhì)和無(wú)機(jī)雜質(zhì)。
本發(fā)明的重要性在于這樣一個(gè)事實(shí)，即已克服了無(wú)法預(yù)測(cè)原料可變性的問(wèn)題?？梢酝ㄟ^(guò)簡(jiǎn)單的手段得到，具商業(yè)水準(zhǔn)、生物醫(yī)學(xué)純、高分子量和性質(zhì)一致的p-GlcNAc這是首次。本發(fā)明生產(chǎn)的物質(zhì)是高晶態(tài)的，是小心控制微藻(microalgae)，優(yōu)選硅藻的無(wú)菌培養(yǎng)基生產(chǎn)的，并已生長(zhǎng)在一個(gè)限定的介質(zhì)中。
本發(fā)明進(jìn)一步敘述了p-GlcNAc的衍生物和再成型物及生產(chǎn)方法。這衍生物可以包括，但不限于聚葡糖胺和它的衍生物，再成型物可以包括，但不限于薄膜、細(xì)絲、非編織的紡織品、海綿和三維基質(zhì)。本發(fā)明涉及來(lái)源于微藻、優(yōu)選硅藻及各種來(lái)源的本發(fā)明的p-GlcNAc的純化方法。另外，本發(fā)明涉及純的p-GlcNAc、它的衍生物和/或它的再成型物的應(yīng)用。這是新的商業(yè)用途，涉及生物醫(yī)學(xué)、制藥和美容等行業(yè)。所有這些行業(yè)均需要最高純度的原料。例如，本發(fā)明的p-GlcNAc材料可以被配方以顯示出可控的生物降解性質(zhì)，可被用于作為藥物緩釋系統(tǒng)、細(xì)胞膠丸系統(tǒng)和預(yù)防術(shù)后粘連的治療的部件。
4.附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1.100％p-GlcNAc的化學(xué)結(jié)構(gòu)。n為約4000～150,000的整數(shù)，約4000～15,000是優(yōu)選的。
圖2.p-GlcNAc的碳水化合物分析，氣相色譜-質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)。p-GlcNAc是用化學(xué)/生物學(xué)方法的酸處理/中和的變異法純化，敘述于下面5.3.2節(jié)。
圖3A.純的p-GlcNAc的固體薄膜的圓二色譜。
圖3B.脫乙酰p-GlcNAc薄膜的圓二色譜。純的p-GlcNAc在211nm和195nm處的最大吸收峰消失指出是完全脫乙?；?。脫乙?；臈l件將在5.4節(jié)中敘述。
圖4A.上圖為通過(guò)機(jī)械力純化法制得的純硅藻p-GlcNAc薄膜的紅外光譜圖，下圖通過(guò)化學(xué)/生物學(xué)純化法的紅外光譜圖。
圖4B.市售“聚多糖”的二種制劑的紅外光譜圖。按下面5.5節(jié)中詳述方法鑄膜。
圖4C.通過(guò)熱變性(上圖)和化學(xué)變性(下圖)改變的純p-GlcNAc的紅外光譜圖。方法詳述于5.4節(jié)。
圖4D.從硅藻海鏈藻屬的fluviatilis獲得的p-GlcNAc薄膜的紅外光譜圖。用化學(xué)/生物學(xué)純化法，詳見(jiàn)5.3.2節(jié)。
圖4E.通過(guò)機(jī)械力純化法又高壓滅菌制得的p-GlcNAc薄膜的紅外光譜圖。純化方法見(jiàn)5.3.1節(jié)。
圖5A.通過(guò)化學(xué)/生物學(xué)純化法純化的p-GlcNAc的NMR分析。圖表描述了峰的振幅、面積和參比物的比值，總峰面積比。純化方法述于5.3.2節(jié)。
圖5B.用化學(xué)/生物學(xué)純化方法純化的p-GlcNAc的NMR分析。圖表描述總峰面積比。純化方法述于5.3.2節(jié)。
圖6A-6B.通過(guò)機(jī)械力純化法制造的p-GlcNAc薄膜的透射電子顯微圖(TEM)，純化方法述于5.3.1節(jié)。
放大倍數(shù)6A4190倍；6B16,250倍。
圖7A-7B.通過(guò)HF處理的p-GlcNAc的TEM圖。純化方法見(jiàn)5.3.2節(jié)的化學(xué)/生物學(xué)純化方法的討論中。
放大倍數(shù)，7A5270倍，7B8150倍。
圖8A-8B.化學(xué)/生物學(xué)純化法的酸處理/中和變異法制備的p-GlcNAcTEM圖。純化方法述于5.3.2節(jié)。放大倍數(shù)，8A5270倍，8B16700倍。
圖9A.由化學(xué)/生物學(xué)純化法的酸處理/中和變異法制造的p-GlcNAc薄膜的掃描電子顯微圖(SEM)。純化方法見(jiàn)5.3.2節(jié)。放大倍數(shù)200倍。
圖9B.描繪由化學(xué)/生物學(xué)純化法的酸處理/中和變異法制造的p-GlcNAc薄膜的SEM圖。純化方法見(jiàn)5.3.2節(jié)。放大倍數(shù)1000倍。
圖9C.描繪由化學(xué)/生物學(xué)純化法的酸處理/中和法變異法制造的p-GlcNAc薄膜的SEM圖。純化方法見(jiàn)5.3.2節(jié)。放大倍數(shù)5000倍。
圖9D.描繪通過(guò)化學(xué)/生物學(xué)純化法的酸處理/中和變異法制造的p-GlcNAc薄膜的SEM圖。純化方法見(jiàn)5.3.2節(jié)。放大倍數(shù)10,000倍。
圖9E.描繪由化學(xué)/生物學(xué)純化法變異的酸處理/中和法制造的p-GlcNAc薄膜的SEM圖。純化方法見(jiàn)5.3.2節(jié)。放大倍數(shù)20,000倍。
圖10A-10B.純的p-GlcNAc薄膜的SEM圖。本品先用細(xì)胞溶解/中和純化法，敘述于5.3節(jié)，后來(lái)溶在二甲基乙酰胺/氯化鋰中，并在水中沉淀成一墊瓶狀(方法述于5.5節(jié))制得。放大倍數(shù)10A1000倍；10B10000倍。
圖11A-11B.脫乙?；痯-GlcNAc墊瓶的SEM圖。放大倍數(shù)11A1000倍；11B10,000倍。
圖12A-12B硅藻照片。注意p-GlcNAc纖維正從硅藻細(xì)胞中伸出。
圖13.圖解描繪本發(fā)明的一些可能的p-GlcNAc和脫乙酰的p-GlcNAc衍生物。(從S.Hirano，“Production and Application of Chitin andChitosan in Japan”改編入“Chitin and Chitosan”，1989，Skjak-Break，Anthonsen and Sanford，eds.Elsevier Science Publishing Co.，pp.37-43)。
圖14.在p-GlcNAc存在或缺席下生長(zhǎng)的細(xì)胞的細(xì)胞活力研究。閉環(huán)(●)生長(zhǎng)在p-GlcNAc基質(zhì)上的細(xì)胞；開(kāi)環(huán)(○)生長(zhǎng)在無(wú)p-GlcNAc基質(zhì)上的細(xì)胞。
圖15A-15B.生長(zhǎng)在p-GlcNAc薄膜上的已變性的小鼠成纖維細(xì)胞的SEM圖。放大倍數(shù)15A1000倍；15B3000倍。
圖16A.按13.1節(jié)所述方法制備的膠原對(duì)照材料的SEM圖。放大100倍。
圖16B.按13.1節(jié)所述方法制造的膠原/p-GlcNAc雜交材料的SEM圖。膠原懸浮劑(濃度為7.5mg/ml)p-GlcNAc懸浮劑(濃度為0.07mg/ml)等于3∶1。放大100倍。
圖16C.按13.1節(jié)所述方法制造的膠原/p-GlcNAc雜交材料的SEM圖。膠原懸浮劑(濃度為5.0mg/ml)p-GlcNAc懸浮劑(濃度為0.12mg/ml)等于1∶1。放大100倍。
圖16D.按13.1節(jié)所述方法制造的膠原/p-GlcNAc雜交材料的SEM圖。膠原懸浮劑(濃度為10.0mg/ml)p-GlcNAc懸浮劑(濃度為0.25mg/ml)等于2∶2。放大100倍。
圖16E.按13.1節(jié)所述方法制造的膠原/p-GlcNAc雜交材料的SEM圖。膠原懸浮劑(濃度為2.5mg/ml)p-GlcNAc懸浮劑(濃度為0.25mg/ml)等于1∶3。放大100倍。
圖17A.在圖16A的膠原對(duì)照材料上培養(yǎng)的小鼠3T3成纖維母細(xì)胞的SEM圖。放大100倍。
圖17B.在圖16B膠原/p-GlcNAc材料上培養(yǎng)的小鼠3T3成纖維母細(xì)胞的SEM圖。放大100倍。
圖17C.在圖16C的膠原/p-GlcNAc材料上培養(yǎng)的小鼠3T3成纖維母細(xì)胞的SEM圖。放大100倍。
圖17D.在圖16D的膠原/p-GlcNAc材料上培養(yǎng)的小鼠3T3成纖維母細(xì)胞的SEM圖。放大100倍。
圖18.轉(zhuǎn)化的NMR數(shù)據(jù)曲線(xiàn)，用以得到每個(gè)碳原子的面積，然后計(jì)算甲基面積對(duì)碳原子面積的比。
圖19.典型的p-GlcNAc的C13-NMR譜。單峰代表分子中每個(gè)碳的吸收。
圖20.轉(zhuǎn)化的NMR數(shù)據(jù)，計(jì)算甲基面積對(duì)碳原子面積的比。上圖圖解表示；下圖數(shù)字表示。
圖21A-G.在各種溶劑中制造的三維p-GlcNAc基質(zhì)的SEM圖。圖21A，21D在蒸餾水中制造；圖21B在10％甲醇蒸餾水溶液中制造，圖21C25％甲醇蒸餾水；圖21E10％乙醇蒸餾水；圖21F25％乙醇蒸餾水；圖21G40％乙醇蒸餾水。放大200倍。標(biāo)尺為200μm。
圖22A-G.生長(zhǎng)在三維p-GlcNAc基質(zhì)上的成纖維細(xì)胞SEM圖。此三維p-GlcNAc基質(zhì)冷凍干燥p-GlcNAc的蒸餾水溶液制造。放大倍數(shù)100倍(圖22A，22E)；500倍(圖22B)；1000倍(圖22C，22F)；5000倍(圖22D，22G)。標(biāo)尺為5、20、50或200μm。
圖23.用18.1節(jié)中所述的操作方法得到的典型的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。亦即18.1節(jié)中所述溶菌酶素-殼多糖酶實(shí)驗(yàn)使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
圖24.p-GlcNAc溶菌酶的消化數(shù)據(jù)。本圖介紹當(dāng)p-GlcNAc薄膜為溶菌酶消化時(shí)N-乙酰葡糖胺隨時(shí)間的累積量。本圖比較了完全乙?；痯-GlcNAc與部分(50％)去乙?；痯-GlcNAc的降解率。表明，部分去乙?；痯-GlcNAc的降解率高于完全乙酰化p-GlcNAc材料。
圖25.p-GlcNAc溶菌酶的消化數(shù)據(jù)。本圖介紹在p-GlcNAc薄膜被溶菌酶消化時(shí)N-乙酰葡糖胺隨時(shí)間的累積量。本圖比較了兩種部分脫乙?；痯-GlcNAc薄膜(25％和50％脫乙酰p-GlcNAc薄膜)的降解率。本資料說(shuō)明，當(dāng)去乙?；俜致试黾訒r(shí)，降解率增加；50％去乙?；痯-GlcNAc薄膜降解率高于25％去乙?；痯-GlcNAc薄膜的降解率。
圖26A-26E.p-GlcNAc體內(nèi)生物降解率。圖26A-26C.描繪采用18.1節(jié)中所述方法在大鼠腹部植入樣品1(完全乙?；痯-GlcNAc)薄膜。圖26A.一只大鼠一天中0次植入；圖26B.一只大鼠一天植入14次的結(jié)果；圖26C.一只大鼠一天植入21次后結(jié)果；圖26D-26E.描繪腹部已植入樣品3A(凍干和部分去乙酰化p-GlcNAc薄膜)，方法述于18.1節(jié)中；圖26D.一只大鼠一天0次種植；圖26E.一只大鼠一天種植14次。
圖27.本圖說(shuō)明沒(méi)受到治療(●)或受到p-GlcNAc乳酸鹽/5’-氟尿嘧啶(FU)治療(○)的動(dòng)物腫塊大小變化的百分率，述于20.1節(jié)。
圖28.本圖說(shuō)明受到p-GlcNAc乳酸鹽治療(●)或受到p-GlcNAc乳酸鹽/5’-氟尿嘧啶(FU)治療(○)的動(dòng)物的瘤塊增大的百分率，述于20.1節(jié)。
圖29.本圖說(shuō)明沒(méi)有受到治療(●)或用p-GlcNAc乳酸鹽/絲裂霉素(mito)治療(○)的動(dòng)物瘤塊增大的百分率。敘述于20.1節(jié)。
圖30.本圖說(shuō)明接受p-GlcNAc乳酸鹽治療(●)或受到p-GlcNAc乳酸鹽/絲裂霉素治療(○)的動(dòng)物腫塊增大的百分率，述于20.1節(jié)中。
圖31.條形圖說(shuō)明治療動(dòng)物中，每個(gè)動(dòng)物腫塊大小變化平均百分率。條形圖1為用p-GlcNAc/5’FU高劑量組；條形圖2為用p-GlcNAc/5’FU低劑量組；條形圖3為單用p-GlcNAc薄膜；條形圖4為空白組。1，2組n＝4；3，4組n＝2。
5.發(fā)明詳述首先說(shuō)明了本發(fā)明的純的p-GlcNAc類(lèi)、p-GlcNAc衍生物和它們的再成型物的物理特性。第二敘述了從微藻類(lèi)，優(yōu)選硅藻，起源物所得的本發(fā)明的p-GlcNAc的純化方法。第三敘述了p-GlcNAc的衍生物和再成型物和它們的生產(chǎn)方法。最后敘述了發(fā)明的p-GlcNAc，p-GlcNAc衍生物和/或p-GlcNAc再成型物的應(yīng)用。
5.1.p-GlcNAc發(fā)明的p-GlcNAc聚糖類(lèi)物質(zhì)是一個(gè)高分子量的多聚物，分子量范圍約800,000～3千萬(wàn)道爾頓，分子量是通過(guò)凝膠滲透色譜測(cè)定。這樣范圍的p-GlcNAc是有約4,000～150,000個(gè)N-乙酰葡糖胺單糖按β-1→4構(gòu)型連接，約4,000到15,000個(gè)N-乙酰葡糖胺聚合物是優(yōu)選的(圖1)。
發(fā)明的p-GlcNAc的可變性是很低的，它的純度很高，這二點(diǎn)被化學(xué)和物理的評(píng)判證實(shí)。這評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)是化學(xué)組成和非多糖雜質(zhì)。第一對(duì)于兩種不同純化方法制造的，述于5.3節(jié)的p-GlcNAc化學(xué)組成數(shù)據(jù)列在表1中。能看到通過(guò)兩種方法制造的p-GlcNAc的化學(xué)組成與p-GlcNAc的分子式一致，在實(shí)驗(yàn)誤差范圍內(nèi)。第二，在表1中也展示了制造的p-GlcNAc沒(méi)有檢出蛋白質(zhì)，沒(méi)有其它如游離氨基酸類(lèi)的有機(jī)雜質(zhì)和沒(méi)有如灰分和金屬離子類(lèi)的無(wú)機(jī)雜質(zhì)(發(fā)明的p-GlcNAc可以含約0.05％以下痕量金屬)。第三，發(fā)明的p-GlcNAc含有很低百分率的結(jié)合水。
表1化學(xué)分析數(shù)據(jù)(％重量)純p-GlcNAc理論值碳47.29氫6.40氮6.89氧39.41蛋白 0.00p-GlcNAc墊瓶(mats)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(各種型號(hào)薄膜的實(shí)驗(yàn)次數(shù)大于30)機(jī)械力方法化學(xué)/生物學(xué)方法規(guī)格化1％偏差規(guī)格化1％偏差碳47.21±0.08-0.1747.31±0.11+0.04氫6.45±0.08 +0.786.34±0.08 -0.94氮6.97±0.18 +0.876.94±0.16 +0.73氧39.55±0.36+0.3639.41±0.10+0.00平均值 平均值蛋白 0.00 0.00灰分 1.30 0.98含水量 2.01.21為計(jì)算樣品灰份和含水量，原始分析數(shù)據(jù)已被規(guī)格化(normalized)本發(fā)明的純的p-GlcNAc的碳水化合物分析結(jié)果與圖2所示相似。本發(fā)明的純的p-GlcNAc的單糖是N-乙酰葡糖胺，第三，本發(fā)明的純的p-GlcNAc不含單糖葡糖胺。本發(fā)明的p-GlcNAc的圓二色譜(CD)和紅外光譜(IR)見(jiàn)圖3A、4A和4D。生產(chǎn)方法見(jiàn)5.3節(jié)。這些物理數(shù)據(jù)證實(shí)本發(fā)明的p-GlcNAc是高純的和結(jié)晶形的(crystallinity)。用于得到CD和IR數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)方法述于第6節(jié)。
本發(fā)明的純p-GlcNAc的NMR分析與圖5A、5B、18和19相似。這一個(gè)NMR樣本的數(shù)據(jù)與本發(fā)明的完全乙?；亩嗑畚飌-GlcNAc的數(shù)據(jù)一致，而且這p-GlcNAc沒(méi)有有機(jī)雜質(zhì)。
用在5.3節(jié)中敘述的方法制造和在8和9節(jié)中所描述過(guò)的操作例子證明，本發(fā)明的p-GlcNAc的電子顯微鏡圖被描繪于圖6A到圖9E。
本發(fā)明的p-GlcNAc展示了高度的生物相容性。生物相容性可以通過(guò)各種手段測(cè)定，這些手段包括，但不限于象洗脫實(shí)驗(yàn)，肌內(nèi)植入法或皮內(nèi)或全身注射進(jìn)動(dòng)物體等方法。設(shè)計(jì)一個(gè)洗脫實(shí)驗(yàn)(U.S.Pharmacopia XXII，1990，pp.1415-1497；U.S.Pharmacopeia XXII，1991，Supplement 5.，pp 2702-2703)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)樣本提取物的生物相容性和檢驗(yàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系的生物活性，這哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系對(duì)可提取的細(xì)胞毒素是敏感的(例L929細(xì)胞系)。描述于第10節(jié)中操作實(shí)例證明本發(fā)明的p-GlcNAc的高生物相容性。
5.2.p-GlcNAc的微藻源的生產(chǎn)方法5.2.1.p-GlcNAc的微藻源可從微藻，優(yōu)選硅藻制造和純化p-GlcNAc。幾屬硅藻和幾屬中的大量硅藻可被用來(lái)作為p-GlcNAc的原料。每一種硅藻p-GlcNAc組成的纖維，p-GlcNAc從它們的細(xì)胞體中伸出。這種硅藻的照片看圖12A-12B。生產(chǎn)本發(fā)明的p-GlcNAc的硅藻原料包括，但不限于圓篩藻屬(硅藻)，黑海小環(huán)藻屬，海鏈藻屬，最好是海鏈藻屬。
在圓篩藻屬中，可用來(lái)制造本發(fā)明的p-GlcNAc硅藻包括，但不限于concinnus和radiatus這兩種。在黑海小環(huán)藻屬中，可用的硅藻包括，但不限于caspia，cyptica和meneghiniana這幾種?？捎脕?lái)制造本發(fā)明的p-GlcNAc的原料的海鏈藻屬硅藻包括，但不限于nitzschoides，aestivalis，antarctica，deciphens，eccentrica，floridana，fluviatilis，gravida，guillardii，hyalina，minima，nordenskioldii，oceanica，polychorda，pseudonana，rotula，tubifera，tumida和weissflogii等種類(lèi)，最好是fluviatilis和weissflogii兩種。
如上所述的硅藻可從the Bigelow Laboratory for Ocean Sciences，Center for Collection of Marine Phytoplankton(Mckown Point，WestBoothbay Harbor，Maine，0 45 75)的收集中得到。
5.2.2.生長(zhǎng)硅藻的方法在5.2.1.節(jié)中所述硅藻中的任一種可通過(guò)利用如本節(jié)中所述方法來(lái)生長(zhǎng)。通過(guò)在無(wú)菌條件下，用一成熟的硅藻培養(yǎng)物接種培養(yǎng)基新的硅藻培養(yǎng)開(kāi)始。這培養(yǎng)基必須沒(méi)有所有其它微生物，因此用于制造培養(yǎng)基的所有物質(zhì)，包括水、有機(jī)化合物和無(wú)機(jī)化合物都必須消毒。在這里所有的操作方法均在嚴(yán)格的無(wú)菌條件下進(jìn)行，即所有的容器，所有的物質(zhì)從一個(gè)容器轉(zhuǎn)移到另一個(gè)容器等等均在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行。一次制備培養(yǎng)基的量應(yīng)不超過(guò)一次新的培養(yǎng)所需的量。例如約占1平方英尺空間的Fernbach燒瓶可用作培養(yǎng)硅藻的容器。這樣的容器可容納1立升最適合硅藻生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。
培養(yǎng)基的制造包括如下操作a.海水的獲得和加工b.蒸餾水和去離子水的制造c.最初的營(yíng)養(yǎng)液的制造d.工作中的營(yíng)養(yǎng)液的制造e.最后營(yíng)養(yǎng)液的制造可從the Marine Biology Laboratory(Woods Hole，Massachusetts)得到濾過(guò)的海水。海水的容器應(yīng)在5℃儲(chǔ)藏。當(dāng)需要時(shí)，所需的水可以通過(guò)一個(gè)具0.45μm孔徑的硝化纖維濾膜布氏漏斗(微孔過(guò)濾器)。這海水然后被高壓滅菌，每升水在121℃經(jīng)15分鐘滅菌。在滅菌過(guò)程完成后蓋好貯罐，立即冷卻，最好轉(zhuǎn)移到一個(gè)冷房子，能使溶液冷卻到5℃。當(dāng)使用時(shí)，溶液可升至室溫。
用標(biāo)準(zhǔn)的裝置和方法蒸餾自來(lái)水并去離子，收集和保存在經(jīng)嚴(yán)格滅菌、嚴(yán)密蓋好最好為玻璃容器中。
下面列出制造培養(yǎng)基所需營(yíng)養(yǎng)液的處方。這些處方是作指導(dǎo)用的，意指，支持硅藻生長(zhǎng)滿(mǎn)足p-GlcNAc制造的培養(yǎng)基的制劑處方的常規(guī)改變亦是在本發(fā)明范圍內(nèi)。
1.痕量金屬的最初營(yíng)養(yǎng)液(TMPS)a. 39mM CuSO4·5H2O(5水合硫酸銅)(9.8g硫酸銅/升)b. 7.5mM ZnSO4·7H2O(7水合硫酸鋅)(22g硫酸鋅/升)c. 42mM CoCl2·6H2O(6水合氯化鈷)(10g氯化鈷/升)d. 91mM MnCl2·4H2O(4水合氯化錳)(18g氯化錳/升)e. 26mM NaMoO4·2H2O(2水合鉬酸鈉)(6.3g鉬酸鈉/升)f. 153.5mM H2SeO3(硒酸)(12.9g硒酸/升)用不大于0.2mm孔徑濾器無(wú)菌過(guò)濾每一營(yíng)養(yǎng)液。
2.維生素最初營(yíng)養(yǎng)液(VPS)a. 1mg/ml維他命B12b. 0.1mg/ml維他命H(生物素)
用不大于0.2mm孔徑濾器無(wú)菌過(guò)濾此二個(gè)營(yíng)養(yǎng)液。
3.鈉鹽工作營(yíng)養(yǎng)液(SSMS)a.硝酸鈉工作營(yíng)養(yǎng)液0.88M(75g NaNO3/升)b. 1水合磷酸二氫鈉工作營(yíng)養(yǎng)液36.2mM NaH2PO4·H2O(5gNaH2PO4·H2O/升)c. 9水合硅酸鈉工作營(yíng)養(yǎng)液0.11mM Na2SiO3·9H2O(30gNa2SiO3·9H2O/升)用不大于0.2mm孔徑濾器無(wú)菌過(guò)濾每一種SSWS。
4.痕量金屬工作營(yíng)養(yǎng)液(TMWS)11.7mM Na2EDTA(4.36g/升)11.7mM FeCl3·6H2O(3.15g/升)上面所列6個(gè)最初營(yíng)養(yǎng)液各1ml/升，用不超過(guò)0.2mm孔經(jīng)過(guò)濾器無(wú)菌過(guò)濾。注意痕量金屬工作營(yíng)養(yǎng)液必須在配成一個(gè)新的培養(yǎng)基時(shí)新鮮配制。
5.維生素工作營(yíng)養(yǎng)液(VWS)1.0μg/ml生物素(VH)(1.0ml最初生物素營(yíng)養(yǎng)液/100ml)1.0μg/ml維生素B12(0.1ml維生素B12初始營(yíng)養(yǎng)液/100ml)20.0mg鹽酸硫胺(鹽酸硫胺/100ml)用不大于0.2mm孔徑的濾器無(wú)菌過(guò)濾。注意維生素工作營(yíng)養(yǎng)液應(yīng)在配成一個(gè)新的培養(yǎng)基時(shí)新鮮配制。
為了制造培養(yǎng)基和為了培養(yǎng)硅藻的技術(shù)在下面敘述。顯然，除這些技術(shù)外，在此敘述過(guò)的處方和/或操作方法的任何常規(guī)改變和在這方法下制成的有支持硅藻生長(zhǎng)的能力的培養(yǎng)基均在本發(fā)明范圍內(nèi)。
培養(yǎng)基可以被制備如下每升過(guò)濾過(guò)的和滅菌過(guò)的海水可加入1ml NaNO3工作營(yíng)養(yǎng)液，1ml NaH2PO4·H2O工作營(yíng)養(yǎng)液，1ml痕量金屬工作營(yíng)養(yǎng)液和1mlNa2SiO3·9H2O工作營(yíng)養(yǎng)液。在加入NaSiO3·9H2O同時(shí)可加入2ml 1N HCl，振搖溶液使之混合。然后加入1.5ml 1N NaOH，溶液再一次振搖混合。最后加入0.5ml維生素工作營(yíng)養(yǎng)液。
為了生長(zhǎng)新的硅藻，可以轉(zhuǎn)移7ml成熟的培養(yǎng)基(細(xì)胞密度約為1×105個(gè)細(xì)胞/ml)到裝有100ml滅菌培養(yǎng)基的滅菌容器中，此培養(yǎng)基是按上述方法制得。接好種的培養(yǎng)基孵化8天，條件如下溫度20℃持續(xù)光照攪動(dòng)每天早晚各轉(zhuǎn)動(dòng)一次，每次2～3秒。
孵化8天后，在無(wú)菌條件下將80ml孵化好的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到1000ml培養(yǎng)基中，這個(gè)培養(yǎng)基可以裝在一個(gè)2.8升Fernbach燒瓶中，瓶口用一棉團(tuán)塞住并用干酪布包住。一旦，一個(gè)培養(yǎng)基達(dá)到所要求的細(xì)胞密度，就可收獲此培養(yǎng)基中的p-GlcNAc纖維，本發(fā)明的p-GlcNAc可以被純化，使用方法在5.3節(jié)敘述。
為了保持培養(yǎng)基的pH值約為7-8，約7.4是優(yōu)選的，可以在培養(yǎng)基內(nèi)通CO2。保持這中性pH的環(huán)境大大增加p-GlcNAc的產(chǎn)率，此產(chǎn)率可在每個(gè)硅藻培養(yǎng)中得到。
5.3.p-GlcNAc纖維的分離、純化和集中的方法可利用本節(jié)介紹的方法收獲上面5.2節(jié)所述的來(lái)自硅藻培養(yǎng)基的p-GlcNAc纖維。
下述對(duì)于源自微藻，優(yōu)選硅藻的p-GlcNAc的純化的方法各自生產(chǎn)很純的、沒(méi)有摻雜的、晶形的p-GlcNAc，每一個(gè)方法得到p-GlcNAc均有特殊的特性和有益的特征。例如，用在下面5.3.1.節(jié)介紹的機(jī)械力方法純化產(chǎn)生的本發(fā)明的p-GlcNAc薄膜，此膜提供一個(gè)使細(xì)胞連接到p-GlcNAc的優(yōu)越培養(yǎng)基。述于5.3.2節(jié)的第二個(gè)方法，化學(xué)/生物學(xué)方法，平均產(chǎn)率比機(jī)械力方法高得多。另外，敘述于5.3.2節(jié)的化學(xué)/生物學(xué)方法部分的酸處理/中和變異法產(chǎn)生非常長(zhǎng)的p-GlcNAc纖維，一些纖維長(zhǎng)度超過(guò)100μm和高到2～3千萬(wàn)道爾頓的分子量。
5.3.1機(jī)械力方法制造純p-GlcNAc通過(guò)使培養(yǎng)基內(nèi)容物受到適當(dāng)機(jī)械力可以從硅藻細(xì)胞體分離p-GlcNAc纖維。這樣一個(gè)機(jī)械力可以包括，但不只限于通過(guò)例如膠質(zhì)研磨機(jī)超聲裝置或氣泡發(fā)生器產(chǎn)生的剪切力，或Waring拌合機(jī)產(chǎn)生的切割力。
然后分離生成的硅藻細(xì)胞體和p-GlcNAc纖維的懸浮物。離心懸浮物使p-GlcNAc纖維與細(xì)胞體分離，得到一個(gè)清的僅有很少可見(jiàn)的絮狀物的上清液。在離心分離基階段，有一固定轉(zhuǎn)動(dòng)角度和10℃溫度是優(yōu)選的。離心速度和時(shí)間取決于特殊的離心機(jī)，但參數(shù)的測(cè)定顯然是本領(lǐng)域的基本技術(shù)。
上清液中的p-GlcNAc用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)濃集。這技術(shù)包括，但不限于吸濾的方法。
最后，濃集的p-GlcNAc纖維用蒸餾的去離子水、HCl和乙醇，或其它適當(dāng)溶劑洗滌，最好是醇類(lèi)，可溶解有機(jī)和無(wú)機(jī)物質(zhì)。
述于第7節(jié)的工作實(shí)例說(shuō)明這p-GlcNAc的純化方法的利用。
5.3.2 p-GlcNAc純化的化學(xué)/生物學(xué)方法在此方法中，通過(guò)使硅藻細(xì)胞體受到化學(xué)的或生物的試劑處理，分離出p-GlcNAc，詳述于后。
硅藻培養(yǎng)基可以用一化學(xué)試劑處理，削弱硅藻細(xì)胞壁的能力，導(dǎo)致p-GlcNAc纖維釋放而不改變他們的結(jié)構(gòu)。這化學(xué)試劑可以包括但不限于氫氟酸(HF)。一個(gè)成熟的硅藻培養(yǎng)基可以用可改變生物學(xué)過(guò)程的生物學(xué)試劑處理。此過(guò)程可以用于抑制p-GlcNAc纖維的合成，釋放纖維。這一試劑可以包括，但不限于polyoxin-D，N-乙酰葡糖胺-P-轉(zhuǎn)化酶抑制劑。
用上述化學(xué)或生物學(xué)試劑處理硅藻培養(yǎng)基，細(xì)胞體和p-GlcNAc纖維得以分離。硅藻培養(yǎng)基的內(nèi)容物可形成不相混的二層。上層主要含p-GlcNAc纖維，而底層則含細(xì)胞體。含p-GlcNAc纖維的上層可用虹吸法分出，留下了含細(xì)胞物質(zhì)的下層。
然后，虹吸出的p-GlcNAc纖維含有層可通過(guò)用一個(gè)清潔劑處理，進(jìn)一步純化除去蛋白和其它不希望有的物質(zhì)，此清潔劑將不損害此p-GlcNAc纖維。這種清潔劑可以是，但不限于十二烷基硫酸鈉(SDS)。
當(dāng)用酸處理時(shí)，如HF處理時(shí)，是用于從硅藻體上分離p-GlcNAc纖維，這一步還包括纖維的分散。這一步可以包括，但不限于用機(jī)械力使纖維分散，如纖維受到強(qiáng)烈攪拌分散。在進(jìn)一步用清潔劑處理純化前，酸處理的懸浮物可以被中和，使懸浮物的pH值從約1.8改變?yōu)榧s7.0，如加入適當(dāng)體積的1M的Tris(pH8.0)或適當(dāng)體積的氫氧化鈉(NaOH)。通常，中和得到的純的p-GlcNAc纖維比在此討論過(guò)的其它純化方法得到的纖維長(zhǎng)。
可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員都熟知的技術(shù)收集純的p-GlcNAc纖維，如吸濾的方法。最后p-GlcNAc纖維先后用蒸餾的去離子水、HCl和乙醇，或其它適當(dāng)溶劑，最好乙醇洗，有機(jī)和無(wú)機(jī)物溶解。
第8節(jié)工作實(shí)例證實(shí)了這種純化方法的成功利用。
5.4p-GlcNAc的衍生物通過(guò)利用各種控制條件和操作方法使本發(fā)明的純的完全乙?；膒-GlcNAc可以被衍生化，得到大量不同化合物?？磮D13，圖中畫(huà)出一部分化合物。這些衍生物可以包括但不限于部分的或完全的脫乙酰基p-GlcNAc，這p-GlcNAc的衍生物通過(guò)化學(xué)的和/或酶作用的手段，在下面進(jìn)一步詳細(xì)敘述。另外，p-GlcNAc或它的脫乙酰衍生物可以通過(guò)生成硫酸酯、磷酸酯和/或硝酸酯化衍生化。這些衍生物進(jìn)一步詳述如下O-硫?；琋-?；?，O-烷基，脫氧鹵素(deoxyhalogen)，N-烷烯基和芳烷烯基和其它衍生物，可以從本發(fā)明的p-GlcNAc或去乙酰基p-GlcNAc制造。本發(fā)明的脫乙酰化p-GlcNAc也可以被用來(lái)制造各種有機(jī)鹽和/或金屬螯合物。進(jìn)一步說(shuō)，本發(fā)明的p-GlcNAc或一個(gè)衍生物可以以共價(jià)或非共價(jià)形式連接到任何一種分子上。更進(jìn)一步，本發(fā)明的p-GlcNAc或其一個(gè)衍生物可以在控制水解條件下得到均質(zhì)的和分子量不連續(xù)的獨(dú)特的多組分子。
本發(fā)明的p-GlcNAc的一個(gè)或多個(gè)的單糖單元可以被水解形成一類(lèi)聚-β-1→4-N-葡糖胺。本發(fā)明的一類(lèi)聚-β-1→4-N-葡糖胺的每個(gè)單糖單元已被脫乙?；纬煞肿恿看蠹s640,000～24百萬(wàn)道爾頓，其中大約640,000～2.4百萬(wàn)道爾頓是優(yōu)選的。
具有這樣的分子量范圍的藥有4000～150,000個(gè)葡糖胺單體，按β-1→4構(gòu)型共價(jià)連接，約4,000～15,000葡糖胺是優(yōu)選的。至少這poly-β-1→4-N-葡糖胺類(lèi)的一個(gè)單糖單元可以保留乙?；?，具有25％～75％的乙?；锸莾?yōu)選的，約30％乙?；锸亲詈玫摹?br> 本發(fā)明的p-GlcNAc可以用一個(gè)堿處理脫乙?；玫骄哂坞x氨基的葡糖胺。用氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液的水解過(guò)程可在提高溫度條件下進(jìn)行。小心控制脫乙酰基的程度和避免聚糖分子的主要碳?xì)滏溄到?，然而，利用殼多糖脫乙酰酶?duì)p-GlcNAc脫?；姆椒ㄊ亲詈玫?。這脫乙酰酶的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的和可被實(shí)行，如在(U.S.Patent 5,219,749)中那樣。該專(zhuān)利全部并入本發(fā)明作為參考文獻(xiàn)。
本發(fā)明的p-GlcNAc的一個(gè)或多個(gè)單糖單元可以被衍生為含有至少一個(gè)硫酸酯基，或交替地可以被磷酸酯化或硝酸脂化，敘述如下 其中，在氫原子處的R和/或R1，和/或R2可以是一個(gè)硫?；?-SHO3)，一個(gè)磷?；?-P(OH)2)或一個(gè)硝酰基(-NO2)。
可以制造這些p-GlcNAc衍生物的方法敘述于下。如本節(jié)所述，在實(shí)行這些方法之前，首先冷凍干燥，液氮冷卻和粉碎p-GlcNAc原料是有利的。
硫?；痯-GlcNAc衍生物可以通過(guò)二步產(chǎn)生。第一步可用Tokura等(TokuraS.et al.，1893，Palym.J.15485)所述的技術(shù)，從本發(fā)明的p-GlcNAc和/或p-GlcNAc衍生物制造O-羰甲基(Carboxymerhyl)p-GlcNAc。第二步，磺酰化可以用N，N-二甲基甲酰胺-三氧化硫按本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，像Schweiger(Schweiger R.G.1972，Carbohydrate Res，21219)所述那樣操作分離出生成物的鈉鹽。
本發(fā)明的磷酸化的p-GlcNAc衍生物，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)制造，這技術(shù)被Nishi等(Nishi，N.et al.，1986，in“Chitin in Natureand Technology”，Muzzarelli et al.，eds，Plenum Press，New York，pp.297-299)敘述。簡(jiǎn)而言之，p-GlcNAc/甲磺酸混合物可以用五氧化二磷(大約0.5～4.0molar equivalent)在0～5℃攪拌處理。大約反應(yīng)2小時(shí)。然后用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的規(guī)范技術(shù)使生成物沉淀并加以洗滌。例如，樣品可用一溶劑如乙醚沉淀，離心分離，用溶劑如乙醚、丙酮或甲醇洗滌和干燥。
p-GlcNAc的硝化衍生物可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)制備，例如用Schorigin和Halt(Schorigin，R.and Halt，E.，1934，Chem.Ber.671712)所述的技術(shù)。簡(jiǎn)而言之，p-GlcNAc和/或一個(gè)p-GlcNAc衍生物可用濃硝酸處理，生成穩(wěn)定的硝酰化產(chǎn)物。
本發(fā)明的p-GlcNAc的一個(gè)或多個(gè)單糖單元可以含一個(gè)磺?；?，如下所述 其中R3可以是烷基、?；⑾┗蛉不?。這樣的衍生物可以用Kurita等(Kurita，K.et al.，1990，Polym.Prep[Am.Chem.Soc.，Div.Polym.Chem.]31624-625)敘述的方法生產(chǎn)。簡(jiǎn)而言之，一個(gè)p-GlcNAc的堿性水溶液可以和甲苯磺酰氯的氯仿溶液反應(yīng)，本反應(yīng)可在低溫下穩(wěn)定進(jìn)行。
本發(fā)明的p-GlcNAc或其脫乙酰衍生物的一個(gè)或多個(gè)單糖單體可以含有一個(gè)或多個(gè)O-酰基敘述如下 其中取代氫的R4和/或R5，可以是一個(gè)烷基、烯基或炔基，R6可以是一個(gè)烷基，烯基或炔基。一個(gè)這種衍生物的例子可用熟知的如Komai(Komai，T.et al.，1986，in“Chitin in Nature and Technology”，Muzzarelli et al.，eds.，Plenum Press，New York，pp.497-506)所述的方法生產(chǎn)。簡(jiǎn)而言之，p-GlcNAc可以和甲磺酸中的許多合適的酰氯中的任何一個(gè)反應(yīng)，得到p-GlcNAc的衍生物，此衍生物包括己酰、辛酰、lanroyl、或苯甲?；苌铩?br> 一個(gè)或更多的本發(fā)明的脫乙酰p-GlcNAc的單糖單元可含有一個(gè)N-酰基，敘述如下 其中R7可以是一個(gè)烷基、烯基、炔基。此衍生物可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)制得，如Hirano等人所述(Hirano，S.et al.，1976，CarbohydrateResearch 47315-320)。
脫乙?；鵳-GlcNAc可以溶解在許多有機(jī)酸水溶液中。把所選的酸酐加入到含p-GlcNAc的甲醇醋酸水溶液，生成N-酰化形式的p-GlcNAc衍生物。
一個(gè)或更多的本發(fā)明的脫乙酰基p-GlcNAc或它的脫乙?；苌锏膯翁强梢院粋€(gè)O-烷基，描述如下 其中R8可以是一個(gè)烷基、烯基或炔基。這樣一個(gè)化合物可以通過(guò)用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)得到。例如，用Maresh等所描述的過(guò)程(Maresh，G.et al.，in“Chitin and Chitosan”，Skjak-Brack，G.et al.，eds.，1989，Elsevier Pulelishing Co.，pp.389-395)。簡(jiǎn)而言之，脫乙酰基p-GlcNAc可以在二甲氧基乙烷(DME)中分散并與過(guò)量的環(huán)氧丙烷反應(yīng)。反應(yīng)時(shí)間為24小時(shí)，在壓熱器中于40～90℃反應(yīng)。把混合物用與水稀釋并過(guò)濾。DME可通過(guò)蒸餾除去。最后，終產(chǎn)物可以經(jīng)冷凍干燥法分離得到。
本發(fā)明的p-GlcNAc的一個(gè)或更多個(gè)單糖單元可以是一個(gè)堿化衍生物，描述如下 這樣一個(gè)衍生物可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法得到。例如，可用Noguchi等所敘述的方法(Noguchi，J.et al.，1969，Kogyo Kagaku Zasshi 72796-799)。簡(jiǎn)而言之，p-GlcNAc可在真空下約0℃浸泡在NaOH溶液(最好為43％)中約2小時(shí)。然后，過(guò)量的NaOH可通過(guò)例如籃式離心機(jī)和機(jī)械壓榨等方法除去。
一個(gè)或更多的本發(fā)明的p-GlcNAc脫乙?；苌锏膯翁菃卧梢院幸粋€(gè)N-烷基，敘述如下 其中R9可以是烷基、烯基或炔基。此衍生化產(chǎn)物可用如Maresh等描述的操作方法得到(Maresh，G.et al.，in“Chitin and Chitosan”，Skjak-Brack，G.et al.，eds.，1989，Elsevier Publishing Co.，pp.389-395)，此方法與上述O-烷基衍生物的制備方法相同。
一個(gè)或更多的本發(fā)明的p-GlcNAc的脫乙?；苌锏膯翁菃卧梢院兄辽僖粋€(gè)脫氧鹵素衍生物，敘述如下
其中R10可以是F、Cl、Br或I，其中I為最好。此衍生物可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)得到。例如，可以使用Kurita等所敘述的操作方法(Kurita，K.et al.，1990，Polym.Prep.[Am.Chem.Soc.，Div.Polym.Chem.]31624-625)。簡(jiǎn)而言之，甲苯磺?；膒-GlcNAc與鹵化鈉在二甲亞砜中反應(yīng)，生成脫氧鹵素衍生物。p-GlcNAc的甲苯磺酰化可以通過(guò)堿性p-GlcNAc水溶液與甲苯磺酰氯的氯仿溶液的反應(yīng)進(jìn)行。這樣的反應(yīng)可在低溫下平穩(wěn)進(jìn)行。
一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的p-GlcNAc的脫乙?；苌锏膯翁菃卧梢孕纬梢粋€(gè)鹽，敘述如下 其中R11可以是一個(gè)烷基、烯基或炔基。此衍生物可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)制得。例如，可以用Austin和Sennett所敘述的操作方法(Austin，P.R.and Sennett，S.，in“Chitin in Nature and Technology”，1986，Muzzarelli，R.A.A.et al.，eds，Plenum Press，pp.279-286)。簡(jiǎn)而言之，脫乙?；鵳-GlcNAc可以被懸浮在一種有機(jī)溶劑中，例如乙酸乙酯或異丙醇。在其中加入一種適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)酸，例如甲酸、乙酸、羥乙酸和乳酸。將混合物放置1～3小時(shí)。反應(yīng)和干燥的溫度可在12～35℃之間變化，而最適宜的溫度是20～25℃。通過(guò)過(guò)濾把鹽分離，并用新鮮溶劑洗滌，然后蒸除溶劑。
一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的p-GlcNAc的脫乙?；苌锏膯翁菃卧梢孕纬梢粋€(gè)金屬螯合物，敘述如下 其中R12可以是一個(gè)金屬離子，尤其是過(guò)渡金屬離子，X是通過(guò)脫乙?；鵳-GlcNAc上的取代氨基和氨基的氮原子上存在的弧電子對(duì)建立的配位鍵。
一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的p-GlcNAc脫乙酰基衍生物的單糖單元可以含有一個(gè)N-亞烷基或一個(gè)N-亞芳基，敘述如下 其中R13可以是一個(gè)烷基、烯基、炔基或者酰基。這種衍生物可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)制得。例如，可以用Hirano等敘述的操作方法(Hirano，S.etal.，1981，J.Biomed.Mat.Res.15903-911)。簡(jiǎn)而言之，脫乙?；鵳-GlcNAc可以和羧酸酐和/或芳醛發(fā)生N-取代反應(yīng)酰的和/或芳叉衍生物。
進(jìn)一步說(shuō)，可以控制本發(fā)明的p-GlcNAc或其衍生物的水解條件，得到質(zhì)量均勻的不連續(xù)分子量的和具有其它物理性質(zhì)的多組分子。例如，這樣的水解條件可以包括用酶和溶菌酶處理。為控制水解程度，可以使p-GlcNAc和酶的反應(yīng)控制在不同的作用時(shí)間。另外，用溶菌酶處理脫乙?；乃俾适强梢钥刂频?。脫乙酰的條件本節(jié)前面已敘述過(guò)。一個(gè)p-GlcNAc分子被脫乙?；匠浞郑鼘⑺庠酵耆?。通過(guò)水解和/或脫乙?；幚?，除了降低分子量以外，還會(huì)引起物理性質(zhì)的改變。徹底水解會(huì)導(dǎo)致p-GlcNAc的液化。以下第9節(jié)中的工作實(shí)例介紹了水解/脫乙?；^(guò)程的結(jié)果。
進(jìn)一步說(shuō)，熱交性可以改變p-GlcNAc結(jié)晶的結(jié)構(gòu)。p-GlcNAc結(jié)晶結(jié)構(gòu)的變更可以產(chǎn)生有益的影響，如p-GlcNAc的反應(yīng)性。
進(jìn)一步說(shuō)，各種分子可以通過(guò)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵功能性地連接到本發(fā)明的p-GlcNAc的脫乙?；苌锷?。這樣的分子可以包括如生長(zhǎng)因子這樣的多肽，例如神經(jīng)生長(zhǎng)因子，蛋白酶，例如胃蛋白酶，激素或多肽識(shí)別序列，例如RGD序列，層粘連蛋白，整合素，細(xì)胞粘附分子以及一些相似分子，但不僅限于此。脫乙?；鵳-GlcNAc上的暴露的伯胺上的共價(jià)附著是通過(guò)例如用用作特定長(zhǎng)度化學(xué)空間起作用的雙功能交聯(lián)試劑而完成的。這種技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，類(lèi)似于如Davis和Preston(Davis，M.and Preston，J.F.1981，Anal.Biochem.116404-407)與Staros等(Staros，J.V.et al.，1986，Anal.Biochem.156220-222)所敘述的方法。簡(jiǎn)而言之，被粘接到本發(fā)明的脫乙酰基或部分脫乙酰基p-GlcNAc上的肽上的羧端殘基可以被激活，然后交聯(lián)到這個(gè)p-GlcNAc上?；罨饔每梢酝ㄟ^(guò)將一溶液如碳二亞胺EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)加到肽的磷酸鹽緩沖溶液中完成。最好這種溶液另外含一種試劑如硫代-NHS(N-羥基硫代琥珀酰亞胺)以增強(qiáng)耦合力。在高pH緩沖溶液中，例如硫酸鹽緩沖液(pH9.0-9.2)混合后，激活的肽可以被交聯(lián)到脫乙酰基p-GlcNAc上。
或者，如上所述的這樣的分子可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)非共價(jià)地連接到脫乙?；鵳-GlcNAc分子上。例如，在冷凍干燥之前選好一個(gè)或多種分子與脫乙?；鵳-GlcNAc溶液相混合。
另外，可以形成包含p-GlcNAc和/或p-GlcNAc衍生物的雜交物。除了p-GlcNAc和/或p-GlcNAc衍生物以外，這樣的雜交物還可以包括任何天然和/或合成物。例如，p-GlcNAc和/或p-GlcNAc衍生物附加一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)形成雜交物。這種ECM組分可以包括膠原，fibronectin，葡萄糖胺聚糖和/或肽聚糖，但不僅限于此。雜交物也可以由p-GlcNAc和/或p-GlcNAc衍生物附加一個(gè)或多個(gè)合成物如聚乙烯而形成。這種p-GlcNAc聚乙烯或p-GlcNAc衍生物/聚乙烯雜交物可以通過(guò)加熱這種雜交物組分，例如高壓消毒制得。
另外，一個(gè)碘代-p-GlcNAc衍生物可以被異分子聚合，例如和苯乙烯，以制造新的可塑材料。碘代-p-GlcNAc能用類(lèi)似于Kurita和Inoue(Kurita，K.and Inoue，S.，1989，in“Chitin and Chitosan”，Skjak-Braek，et al.，eds.，Elsevier Science Publishing Co.，lnc.，p.365)所述的方法制造，發(fā)生p-GlcNAc甲磺?；偷饣＿@種p-GlcNAc碘化衍生物能在硝基苯中分散并與苯乙烯發(fā)生反應(yīng)，用氯化錫(SnCl4)作為催化劑。
簡(jiǎn)而言之，在膠原/p-GlcNAc雜交物的情況下，一個(gè)p-GlcNAc懸浮液和一個(gè)膠原懸浮液可以被混合，冷凍干燥和交聯(lián)，最好是脫氫熱交聯(lián)。這種雜交物的膠原種類(lèi)可以是天然的或是合成的，可以是人的或是非人的，例如牛的器官。p-GlcNAc/膠原和/或p-GlcNAc衍生物/膠原雜交物顯示同一的性質(zhì)，并形成一種多孔基質(zhì)，這種基質(zhì)可以用作，例如，一種細(xì)胞可以粘附和生長(zhǎng)的有效的三維基質(zhì)。下面13節(jié)所敘述的工作實(shí)例闡述了這樣一個(gè)p-GlcNAc/膠原雜交物的形式、性質(zhì)和應(yīng)用。
由脫乙?；鵳-GlcNAc和肝素，藻酸鈉和酰甲基p-GlcNAc等化合物組成的雜交物可以用這里所述技術(shù)形成。這樣的組合物可以形成或再形成為薄膜和纖維。
帶有多陰離子如聚丙烯酸或具有正電荷和負(fù)電荷的果膠與脫乙?；鵳-GlcNAc可以形成絡(luò)合物。這種絡(luò)合物的形成可按類(lèi)似于Mireles等描述的方法完成(Mireles，C.et al.，1992，in“Advances in Chitin and Chitosan”Brine，C.J.et al.，eds.，Elsevier Publishers，Ltd.)。脫乙?；鵳-GlcNAc和聚丙烯酸，角叉菜或果膠，若分別被溶在鹽酸和氯化鈉溶液中，和具有相同pH的反應(yīng)物溶液混合。此操作過(guò)程生成有效的絮狀分子，通常此分子帶有正性和負(fù)性的特征，例如，可以用于處理廢水。
5.5再成型(Reformulations)本發(fā)明的p-GlcNAc，象在5.4節(jié)中所述的它的脫乙?；苌锖?或它們的衍生物一樣，可以被溶解并再形成各種形狀和構(gòu)造。
用二甲基乙酰胺(DMA)/氯化鋰處理可以得到本發(fā)明的p-GlcNAc溶液。通過(guò)攪拌，p-GlcNAc可以很容易地溶解在含有5％LiCl(與DMA重量比)的DMA溶液中。水溶性的p-GlcNAc衍生物如p-GlcNAc鹽，可以溶在水中。至少約75％脫乙?；膒-GlcNAc可以溶于一個(gè)弱酸溶液中，例如1％醋酸溶液。不溶于水的p-GlcNAc衍生物可以溶于一種有機(jī)溶劑中。
在帶有異氰酸苯酯的DMA∶LiCl溶液中，p-GlcNAc的衍生化作用通常生成苯氨基甲酸鹽。在帶有對(duì)甲苯磺酰氯的DMA∶LiCl溶液中，p-GlcNAc衍生化生成對(duì)甲苯磺酸鹽。
本發(fā)明的p-GlcNAc，它的脫乙?；苌锖?或它們?cè)谌芤褐械难苌锒伎梢员怀恋恚⒃谝荒Ｐ椭性俪尚?，這些形狀，包括但不限于，墊狀、帶狀、繩狀、微球體、微有孔小珠、薄膜、纖維、粉末和海綿。可以形成極薄的(即厚度小于1微米)質(zhì)量均勻的膜。利用純p-GlcNAc不溶于水、乙醇等溶劑，特別是乙醇的特點(diǎn)可以進(jìn)行再成型。例如，含DMA/LiCl的p-GlcNAc混合物通過(guò)常規(guī)手段注入水或醇中，最好是乙醇，此溶液將產(chǎn)生沉淀，不溶的p-GlcNAc再成型。在下面第11節(jié)中進(jìn)行的工作實(shí)例說(shuō)明了這種純的p-GlcNAc的再成型。水溶性的p-GlcNAc衍生物可以通過(guò)在有機(jī)溶劑中沉淀再成型，這些有機(jī)溶劑如乙酸乙酯或異丙醇。至少有75％脫乙?；鵳-GlcNAc可以在一強(qiáng)堿溶液中沉淀并達(dá)到再成型。不溶于水的p-GlcNAc衍生物可以通過(guò)在水溶液，例如水中再沉淀成型。
與氧化纖維素連接的脫乙酰基p-GlcNAc可以產(chǎn)生p-GlcNAc/纖維素雜交物，雜交物改進(jìn)了紙制品的濕拉力。類(lèi)似于棉花，一個(gè)氧化棉培養(yǎng)基能被有一扁平帶狀的脫乙酰基p-GlcNAc鏈密切接近。這種接近最大限度地增加了范德華力的貢獻(xiàn)，這種力促進(jìn)了吸附作用，增加了雜交的p-GlcNAc-纖維素材料的濕拉力。
按規(guī)定的結(jié)構(gòu)控制薄膜或基質(zhì)的平均孔徑可以制成p-GlcNAc薄膜和三維p-GlcNAc基質(zhì)。在薄膜和基質(zhì)形成之前，能通過(guò)改變所用的p-GlcNAc材料的用量和加入某些溶劑如甲醇或乙醇來(lái)控制它們的孔徑，乙醇是優(yōu)選的，大約5-40％的含量。通常使用溶劑的百分?jǐn)?shù)越大，形成的平均孔徑將越小。在下面15節(jié)中敘述的例子說(shuō)明了多孔p-GlcNAc的結(jié)構(gòu)特征和合成方法。
5.6用途本發(fā)明的p-GlcNAc及它的脫乙?；苌锶缭谏厦?.4中敘述的衍生物，5.5節(jié)敘述過(guò)的再成型物有各種用途。例如，本發(fā)明的分子無(wú)毒、無(wú)熱性、可生物降解、生物兼容的性質(zhì)。除在此所說(shuō)的p-GlcNAc和它的衍生物的有利的性質(zhì)外，它們還可用于另外許多領(lǐng)域，如農(nóng)業(yè)、整容業(yè)、生物醫(yī)學(xué)工業(yè)、動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)和健康、食品、化學(xué)、攝影和藥物工業(yè)。
5.6.1p-GlcNAc材料的生物醫(yī)學(xué)用途5.6.1.1藥物的固定/釋放p-GlcNAc材料的生物醫(yī)學(xué)用途可以包括如酶和/或藥物的固定位和釋放的方法。例如，本發(fā)明的p-GlcNAc和它的衍生物可以有如上面5.4所述的以共價(jià)鍵與它們連接的感興趣的肽(如生長(zhǎng)因子)。含p-GlcNAc的肽可以按本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的常規(guī)方法給病人用藥。方法包括不限于注射、植入、關(guān)節(jié)鏡檢查、腹腔鏡檢查等手段。含p-GlcNAc的肽引入病人體內(nèi)，本發(fā)明的p-GlcNAc生物降解，這樣所連接的肽逐漸釋放到病人的血液中，這樣提供了一個(gè)控制藥物釋放的方法。
可預(yù)知脫乙?；虿糠置撘阴；膒-GlcNAc類(lèi)生物降解的速度。例如脫乙?；陌俜只视绊憄-GlcNAc類(lèi)的降解率。通常，較高的脫乙?；俜致蕦⒂休^快的速率生物降解力和再吸收。這樣，p-GlcNAc生物降解程度和在體內(nèi)再吸收的速率被控制于p-GlcNAc制造過(guò)程。這p-GlcNAc材料的生產(chǎn)和特性敘述于后面第18節(jié)中。具有可控的生物降解速度的p-GlcNAc材料可以被制成薄膜、凝膠、海綿、微球、纖維等等。這些p-GlcNAc產(chǎn)物粘附于軟的和硬的組織上，并對(duì)其產(chǎn)生影響，在人體中不需要縫合。這p-GlcNAc材料可以被用在一個(gè)一般的或最小侵襲性手術(shù)，例腹腔鏡檢查。
可控制生物降解速率的p-GlcNAc材料是有用的，如促進(jìn)出血組織、器官和血管的止血，對(duì)牙周手術(shù)后修復(fù)過(guò)程中分離軟、硬組織提供牙周屏障，提供外科填充劑，促進(jìn)軟組織的增生，特別是減少皮膚皺紋，增強(qiáng)尿括約肌控制尿失禁。在下面19節(jié)描述的例子證實(shí)使用p-GlcNAc材料可促進(jìn)止血。
另外，本發(fā)明的分子可以作為緩釋藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)賦形劑，對(duì)有興趣的藥物用p-GlcNAc或衍生物做成膠丸?？梢陨a(chǎn)一個(gè)藥/p-GlcNAc膠丸。如上面5.3.2節(jié)所述的化學(xué)/生物學(xué)純化方法的酸處理/中和法變異的改進(jìn)。不升高p-GlcNAc溶液的pH值至接近中性pH范圍(例如7.4)在p-GlcNAc純化完全后，通過(guò)升高pH值到接近9.0可以造成一個(gè)堿性環(huán)境。當(dāng)在堿性pH條件下，本發(fā)明的p-GlcNAc或它的衍生物超過(guò)三維或“開(kāi)放”構(gòu)型。當(dāng)pH較低時(shí)，分子的構(gòu)造轉(zhuǎn)為更緊密。這樣感興趣的藥被加到一個(gè)高pH條件下，一個(gè)p-GlcNAc中，然后這p-GlcNAc/藥懸浮劑的pH下降，從而，感興趣的藥進(jìn)入一個(gè)p-GlcNAc基質(zhì)的“陷阱”或膠丸中。
這樣p-GlcNAc膠丸用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)給病人用法，結(jié)果，當(dāng)膠丸的p-GlcNAc降解時(shí)，膠丸包著的藥被慢慢釋放到病人體內(nèi)。
作為治療藥的釋放體系p-GlcNAc凝膠和薄膜有多種用法。這些用法包括用作抗腫瘤藥釋放體系，在此所述的釋放體系用于任何抗腫瘤藥都是可行的。這些藥是為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，可以配制進(jìn)入p-GlcNAc凝膠或薄膜中，如將緩釋制劑直接放入腫瘤或手術(shù)后的瘤腔中。如此恒定的緩釋p-GlcNAc藥產(chǎn)品能作為術(shù)后一個(gè)重要的初期防御過(guò)程。這樣的p-GlcNAc抗腫瘤藥緩釋系統(tǒng)尤其是用于經(jīng)手術(shù)完全或部分不能達(dá)到的腫瘤，例如某些腦腫瘤。另外p-GlcNAc抗腫瘤系統(tǒng)的目標(biāo)包括(但不限于)皮膚、腸胃道、胰腺、肺、乳房、泌尿系腫瘤和愛(ài)滋病病毒有關(guān)的卡潑斯肉瘤。
放療增敏劑的抗癌藥是優(yōu)選的，例如替代手術(shù)或手術(shù)后被指定放療處理的藥物，這些藥物包括5-氟脲嘧啶、絲裂霉素、順鉑和它的衍生物、紫杉醇、阿霉素、放線(xiàn)菌素、博來(lái)霉素、正定霉素和間霉素。
抗腫瘤藥的劑量范圍可較低于、等于或較大于系統(tǒng)治療病人規(guī)定的經(jīng)典的一天劑量。藥物輸送到腫瘤局部可以耐受較高劑量。因此，其它組織包括血細(xì)胞不易遭受這些藥物的影響。這些藥物劑量是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。劑量可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的規(guī)范技術(shù)常規(guī)測(cè)定，例如述于本節(jié)結(jié)尾處。
此外，本發(fā)明中的p-GlcNAc/藥物釋放系統(tǒng)可用于治療感染。在應(yīng)用上，無(wú)論是水溶性或水不溶性的抗菌素，均可固定化/配制于含p-GlcNAc為基質(zhì)的材料中，如膠和膜?？咕叵禐楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，例如包括青霉素、頭孢菌素、四環(huán)素、氨芐青霉素、金絲菌素、桿菌肽素、氯霉素、環(huán)絲氨酸、紅霉素、慶大霉素、短桿菌肽、卡那霉素、新霉素、鏈霉素、妥布霉素和萬(wàn)古霉素。這些藥物的劑量是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，可利用所熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)常規(guī)地測(cè)定，例如下面在本節(jié)后一部分介紹的那些方法。
該p-GlcNAc抗菌素產(chǎn)物可用于治療細(xì)菌感染，包括既發(fā)生于外部的感染，如皮膚、頭皮、皮膚潰瘍或眼睛，又包括發(fā)生于內(nèi)部的感染，如大腦、肌肉、腹部的局部感染。一種重要的應(yīng)用是治療HIV相關(guān)的機(jī)會(huì)致病(opportunistic)感染。
本發(fā)明中的p-GlcNAc/藥物釋放系統(tǒng)可與抗炎藥物配制以控制炎癥和免疫過(guò)程中的機(jī)能障礙。例如，p-GlcNAc可與非甾體抗炎藥配制，用于減輕由類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性狼瘡等疾病引起的局部疼痛和炎癥。利用本發(fā)明中的p-GlcNAc膠或膜/藥物釋放系統(tǒng)局部釋放這些非甾體抗炎藥，可降低非甾體抗炎藥的副作用，包括胃刺激，氮血癥、血小板功能失調(diào)和肝功異常。非甾體抗炎藥系為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，包括環(huán)氧化酶抑制劑，如阿斯匹林、依托的拉克(etodolac)、苯氧基氫化阿托酸和萘普生。其它抗炎藥也可用作為本發(fā)明中的p-GlcNAc/藥物釋放系統(tǒng)的一部分，例如脂質(zhì)炎癥調(diào)節(jié)劑的抑制劑，如白三烯。這些藥物的劑量是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，可利用所熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)常規(guī)地測(cè)定，例如下面在本節(jié)最后介紹的那些技術(shù)。
本發(fā)明中的p-GlcNAc藥物釋放系統(tǒng)，還可用上述描述的技術(shù)與抗真菌劑配制，治療由真菌引起的疾病?？拐婢鷦┫禐楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，包括如二性霉素、茴香霉素、抗真菌酮(antifungone)、芽生菌素、灰黃霉素和制霉菌素。這些藥物的劑量是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，可利用所熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)常規(guī)地測(cè)定，例如下面在本節(jié)后一部分介紹的那些技術(shù)。
本發(fā)明中的p-GlcNAc/藥物釋放系統(tǒng)，利用上面描述的技術(shù)，也可與抗原生動(dòng)物劑配制，治療原生動(dòng)物引起的感染。抗原生動(dòng)物劑系為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，例如包括抗阿米巴藥、曲古霉素、抗原蟲(chóng)菌素、單霉素和巴龍霉素。這些藥物的劑量是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，可利用所熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)常規(guī)地測(cè)定，例如下面在本節(jié)后一部分介紹的那些技術(shù)。
本發(fā)明中的p-GlcNAc藥物釋放系統(tǒng)，利用上面描述的技術(shù)，可與殺精子化合物配制，生成有效的避孕藥。適宜的殺精子藥是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些殺精子藥物的劑量也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，可利用所熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)常規(guī)地測(cè)定，例如下面在本節(jié)后一部分介紹的那些技術(shù)。
本發(fā)明中的p-GlcNAc藥物釋放系統(tǒng)，可進(jìn)一步與具有治療作用的蛋白質(zhì)藥物配制。利用上面描述的技術(shù)可獲得配方。利用這種p-GlcNAc治療蛋白質(zhì)系統(tǒng)，可將特殊的蛋白質(zhì)直接釋放于期望達(dá)到的靶位，在該位使蛋白質(zhì)緩慢釋放。可用的蛋白質(zhì)的實(shí)例包括胰島素，單克隆抗體，乳腺癌免疫毒素，腫瘤壞死因子，干擾素，人生長(zhǎng)激素，淋巴因子，克隆刺激因子，白介素和人血清白蛋白，但不限于此。這些治療作用的蛋白質(zhì)藥物劑量為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，可利用所熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)常規(guī)地測(cè)定，例如下面在本節(jié)后一部分介紹的那些技術(shù)。
因?yàn)楸景l(fā)明中的p-GlcNAc材料本身是免疫中性的，它們不能引起人免疫反應(yīng)，上述描述的p-GlcNAc裝置，包括p-GlcNAc膜和包含固定化藥物的三維多孔基質(zhì)和/或膠，該裝置能以無(wú)免疫反應(yīng)的方式釋放藥物。一些其它的材料，例如天然的藻酸鹽和合成高分子，在某些情況下也可用來(lái)與p-GlcNAc材料組合建造這種裝置。
上述描述的任一藥物或藥劑的有效治療劑量，連同在此描述的含p-GlcNAc為基質(zhì)的系統(tǒng)，可用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)，常規(guī)地測(cè)定。有效治療劑量系指在此描述的，產(chǎn)生癥狀過(guò)程或疾病得到充分改善所需化合物的量。
藥物的毒性和治療效價(jià)，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)方法在細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物上測(cè)定，即測(cè)定LD50(對(duì)50％群體的致死劑量)和ED50(50％群體的有效治療劑量)。毒性和治療作用的劑量之比為治療指數(shù)，可表示為L(zhǎng)D50/ED50之比。顯示出大的治療指數(shù)的化合物是優(yōu)選的。而顯示出毒副作用的化合物也可使用，必須小心設(shè)計(jì)釋放系統(tǒng)，使這類(lèi)化合物靶向于受感染的部位，以減少對(duì)未感染細(xì)胞潛在的傷害，因此減少了副作用。
從細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)，可用于配制人用劑量的范圍。這些化合物的劑量最好落于微毒或無(wú)毒的，包括了ED50的通用濃度中。劑量可變范圍依賴(lài)于使用的劑型和給藥途徑。在本發(fā)明的方法中所用的任一化合物，其有效治療劑量開(kāi)始可從細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中估算。在動(dòng)物模型中可配制劑量，以獲得通用的，包括了IC50(即達(dá)到癥狀的最大抑制的一半時(shí)，測(cè)試化合物的濃度)的血漿濃度范圍，其測(cè)定方法與細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中相同。該方法可用來(lái)更準(zhǔn)確地測(cè)定有用的人用劑量。例如可用高效液相色譜測(cè)定血漿水平。
5.6.1.2.p-GlcNAc細(xì)胞包囊化用途可將p-GlcNAc包囊化細(xì)胞配制，并通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)讓病人服用。例如，見(jiàn)上面5.6.1.2.節(jié)描述的服用技術(shù)。又可見(jiàn)Aebisher等(Aebisher，P.et al.，in“Fundamentals of Animal Cell Encapsulation andImmobilization”，1993，CRC Press，pp.197-224)。此文獻(xiàn)并入本發(fā)明作為整體參考文獻(xiàn)?？赏ㄟ^(guò)或在p-GlcNAc，或部分脫乙酰化的p-GlcNAc膜，三維p-GlcNAc多孔基質(zhì)，或p-GlcNAc膠內(nèi)，使細(xì)胞包囊化。
三維基質(zhì)可埋植于細(xì)胞內(nèi)，不需進(jìn)一步包囊化而用于某種目的?；蛘撸?xì)胞可被包囊于含p-GlcNAc基質(zhì)的高分子膠制成的中心球或小滴上，例如乳酸化p-GlcNAc高分子電解質(zhì)聚合物(一種多陽(yáng)離子型聚合物)。在膠、小滴或中心球內(nèi)部，細(xì)胞埋藏于中。然后再用第二種帶相反電荷的高分子電解質(zhì)(即用多陰離子，例如藻酸鹽)覆蓋，形成一層外囊，得到免疫隔離的包囊化細(xì)胞，由此降低了宿主生物引起的免疫排斥的危險(xiǎn)。
此外，細(xì)胞包埋于p-GlcNAc膠，三維p-GlcNAc基質(zhì)或兩者之中，可裝入熱塑型膠囊中，構(gòu)成另一種配制方法。也可用熱塑型膠囊，使埋植于宿主生物的細(xì)胞獲得免疫保護(hù)作用。該熱塑型膠囊由諸如羥乙基甲基丙烯酸酯，甲基丙烯酸甲酯(HEMA-MMA)共聚物所制成。例如，通過(guò)將HEMA-MMA的聚乙烯乙二醇溶液和含細(xì)胞的p-GlcNAc基質(zhì)和/或膠介質(zhì)一起擠進(jìn)一種合適的有機(jī)溶劑，例如十六烷中，可制成熱塑性微膠囊。例如，可參見(jiàn)Aebisher等描述的方法(Aebisher，P.et al.，in“Fundamentals of Animal Cell Encapsulationand Immobilization”，1993，CRC Press，pp.197-224)。
p-GlcNAc細(xì)胞包囊化具有廣泛的用途。首先它們可用來(lái)釋放具有治療作用的化合物，該合成化合物被埋藏于細(xì)胞中，連結(jié)并包囊于膜，基質(zhì)或膠上。例如，p-GlcNAc/細(xì)胞包囊化可用于釋放胰島素以治療糖尿病，釋放神經(jīng)生長(zhǎng)因子以治療阿爾茨海默氏疾病，第八因子和其它凝血因子以治療血友病，釋放多巴胺以治療帕金森氏疾病，釋放通過(guò)腎上腺嗜鉻細(xì)胞的腦啡肽以治療慢性疼痛，釋放抗?fàn)I養(yǎng)不良藥(dystrophin)以治療肌營(yíng)養(yǎng)不良，以及釋放人生長(zhǎng)因子以治療不正常生長(zhǎng)。列舉的例子不限于此。
此外，由于本發(fā)明中的p-GlcNAc材料本身是免疫中性的，它們不誘發(fā)人的免疫反應(yīng)，因此可設(shè)計(jì)和建造包括由p-GlcNAc膜，三維多孔p-GlcNAc基質(zhì)和/或p-GlcNAc膠組成的裝置，它包含著連結(jié)的多個(gè)細(xì)胞，能釋放含細(xì)胞的治療藥，而這些細(xì)胞具有免疫隔離性，即不會(huì)引起抗細(xì)胞的宿主免疫反應(yīng)。除了p-GlcNAc材料本身以外，某些其它的材料，例如天然的藻酸鹽和合成的高分子，也可用來(lái)建造這種裝置。
p-GlcNAc/細(xì)胞包囊化組合物還可用來(lái)將細(xì)胞釋放以促使組織再生。將特殊的細(xì)胞類(lèi)型包囊化后，在受損部位可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，促使組織再生。其應(yīng)用包括皮膚、軟骨、神經(jīng)、骨、肝和血管，但不限于此。細(xì)胞包囊于p-GlcNAc材料中以促使組織再生的這種應(yīng)用是具有優(yōu)點(diǎn)的，部分因?yàn)閜-GlcNAc材料能粘附于受損組織，為人細(xì)胞生長(zhǎng)提供一種底物，進(jìn)行生物再吸收，在受損部位組織再生過(guò)程中同時(shí)伴隨著新的健康組織的生長(zhǎng)。實(shí)例包括皮膚、骨、軟骨、肝、腱和韌帶組織的再生，但不限于此。
5.6.1.3.用p-GlcNAc材料預(yù)防手術(shù)后粘連另外，可利用p-GlcNAc膜作為一種生物可降解的，生物可相容的機(jī)械屏障，以防止手術(shù)后的粘連。下面的17節(jié)中的實(shí)例表示了p-GlcNAc的應(yīng)用之一。配制成膜或紗布中的固態(tài)p-GlcNAc或p-GlcNAc衍生物，可用于這一目的。優(yōu)選的膜是薄的，一般厚度小于1mm。優(yōu)選的p-GlcNAc衍生物是約50-80％脫乙?；?。該p-GlcNAc衍生物在植入后約7-21天一般即被再吸收。
液態(tài)的p-GlcNAc衍生物也適用于預(yù)防手術(shù)后粘連。用于這一目的的優(yōu)選的液態(tài)p-GlcNAc衍生物為脫乙?；膒-GlcNAc鹽類(lèi)衍生物和羧甲基p-GlcNAc衍生物。對(duì)于預(yù)防手術(shù)后粘連特別優(yōu)選的p-GlcNAc衍生物是p-GlcNAc乳酸酯衍生物，特別是一種p-GlcNAc乳酸酯膠衍生物。按照諸如17.1節(jié)描述的方法，利用丙二醇如水，可配制這種p-GlcNAc乳酸酯衍生物。可制成高和低粘度的p-GlcNAc乳酸酯衍生物，使之能夠做成用于特殊指征的p-GlcNAc。例如，具有低粘度的p-GlcNAc產(chǎn)品是很有用的，可用注射器或噴霧器來(lái)釋放。而當(dāng)適用范圍是矯形外科時(shí)，具有高粘度的p-GlcNAc產(chǎn)品也合乎需要，它具有更高的潤(rùn)滑性能。
對(duì)預(yù)防手術(shù)后粘連，固態(tài)的p-GlcNAc配方適用于創(chuàng)面清晰的位置。該p-GlcNAc配方應(yīng)該按照外科手術(shù)步驟來(lái)應(yīng)用，材料也應(yīng)完全覆蓋于受傷組織。它也既可與一般的外科手術(shù)，又可與最小限度侵害性的外科手術(shù)(如腹腔鏡檢查)結(jié)合使用。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)外科手術(shù)步驟和儀器，固態(tài)p-GlcNAc配方可被切割使用。
為預(yù)防手術(shù)后粘連，液態(tài)p-GlcNAc配方能用于更大的面積上。例如，p-GlcNAc乳酸酯膠可在手術(shù)前使用，可保持另外的潤(rùn)滑作用，這樣就減少了受傷組織的量。或者，該液態(tài)p-GlcNAc配方，例如p-GlcNAc乳酸酯，可按外科手術(shù)要求使用，形成防止手術(shù)后粘連的物理屏障。
p-GlcNAc材料可著色，從注射器中噴涂或滴于受傷部位。例如，在腹腔鏡檢時(shí)，低粘度的材料可用標(biāo)準(zhǔn)的抽吸沖洗器釋放出來(lái)使高粘度的材料釋放至靶部位需要壓力。該壓力可通過(guò)壓縮氣體動(dòng)力活塞或注射器之類(lèi)的裝置來(lái)獲得。
用來(lái)防止手術(shù)后粘連所需的液態(tài)p-GlcNAc配方的量，例如p-GlcNAc乳酸酯膠配方，與受傷組織的程度成正比。所用p-GlcNAc材料應(yīng)在每平方厘米表面積0.1ml到1.5ml。
5.6.1.4.p-GlcNAc材料的其它生物醫(yī)學(xué)用途p-GlcNAc材料的其它生物醫(yī)學(xué)用途，包括如利用該材料作為細(xì)胞培養(yǎng)的底物。例如，象下面第12節(jié)所述的實(shí)例，本發(fā)明中的p-GlcNAc可作為哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的一種很有效的底物，更進(jìn)一步地，三維構(gòu)型的p-GlcNAc可作為促進(jìn)三維培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的一種中間成分。
本發(fā)明中p-GlcNAc能作為細(xì)胞培養(yǎng)的底物這種性能也可以用于體內(nèi)。正如這里所描述的，本發(fā)明中的p-GlcNAc或其衍生物，可促進(jìn)組織的再生(例如，在牙床線(xiàn)附近包含牙齒的連結(jié)組織的再生、血管移植物、韌帶、腱、軟骨、骨、皮膚及神經(jīng)組織的再生)。因此，本發(fā)明中的p-GlcNAc分子，例如在整形外科中，具有廣泛的用途。
對(duì)于用作為血管移植物的密封劑，脫乙?；膒-GlcNAc是優(yōu)選的。作為組織再生劑，脫乙酰化的p-GlcNAc衍生物，例如N-羧甲基和N-羧丁基脫乙?；痯-GlcNAc是優(yōu)選的。例如，N-羧甲基脫乙酰化p-GlcNAc可移植于角膜以誘導(dǎo)新血管的形成。
本發(fā)明中的p-GlcNAc或其衍生物的其它生物醫(yī)學(xué)用途，正如這里所描述的，可涉及到傷口的包裹，傷口愈合用的軟膏以及外科縫線(xiàn)，沙布等用途。
這些用途可進(jìn)一步用于，例如治療骨關(guān)節(jié)炎，用于降低血清膽固醇水平，作為抗病毒藥，作用抗菌藥，作為免疫調(diào)節(jié)劑，作為抗凝劑，作為透析和超濾膜，作為抗腫瘤藥，作為接觸透鏡材料和作為腎衰病人清除血中的(iremic)毒素的口服吸附劑。例如通過(guò)直接注入至關(guān)節(jié)炎癥部位，微晶狀p-GlcNAc懸浮劑或水溶性p-GlcNAc衍生物對(duì)于治療關(guān)節(jié)炎是優(yōu)選的。
p-GlcNAc還可另用作為人造或供體皮膚的成份。例如，p-GlcNAc，最好是p-GlcNAc無(wú)紡膜，可用來(lái)使供體皮膚變薄。
與蛋白酶例如胃蛋白酶相聯(lián)的脫乙?；痯-GlcNAc，可被用于調(diào)控與該p-GlcNAc/蛋白酶化合物相關(guān)的蛋白酶的消化作用。
對(duì)本發(fā)明中的p-GlcNAc或其衍生物作某些衍生化，可優(yōu)選用于特殊目的(衍生化作用參見(jiàn)上述5.4節(jié)所描述)。例如，硫酸化、磷酸化和/或硝酸化的p-GlcNAc衍生物，可優(yōu)選作為抗凝劑，或作為脂蛋白脂酶的激活劑。N-?；痯-GlcNAc衍生物也可優(yōu)選作為抗凝劑，也可優(yōu)選作為諸如制備人造血管，抗病毒化合物，抗腫瘤(特別是癌細(xì)胞聚集化合物)，透析和超濾膜，以及制造控釋藥物釋放系統(tǒng)。O-烷基化的p-GlcNAc和其脫乙酰化衍生物，也可被優(yōu)選用作制造控釋藥物釋放系統(tǒng)。N-烷基化的p-GlcNAc衍生物可優(yōu)選作為抗菌劑。氧化脫氨化衍生物可優(yōu)選作為抗癌藥，特別是用在與癌細(xì)胞免疫治療方面。脫乙?；膒-GlcNAc衍生物，可優(yōu)選作為傷口愈合劑。N-亞烷基和N-芳亞烷基p-GlcNAc衍生物，可優(yōu)選作為酶的固定化。
5.6.2.p-GlcNAc材料在農(nóng)業(yè)上的用途本發(fā)明中的p-GlcNAc或其衍生物，也可用于各種農(nóng)業(yè)目的。該應(yīng)用包括殺蟲(chóng)劑、殺真菌劑、殺菌劑和殺線(xiàn)蟲(chóng)劑，但不限于此。N-羧甲基脫乙?；痯-GlcNAc衍生物，可優(yōu)選作為有效的抑菌劑。N-烷基化p-GlcNAc衍生物可優(yōu)選作為殺真菌劑。該發(fā)明的分子可用于各種土壤處理方面，包括肥料組合物，但并不限于此。此外，可按照本節(jié)前面所描述的固定化，包囊化和其它方法，使農(nóng)用化學(xué)品包埋起來(lái)，達(dá)到控釋目的。另外，根瘤菌屬小結(jié)形成因子的類(lèi)似物和/或固氮誘導(dǎo)物，可通過(guò)本發(fā)明中的p-GlcNAc和/或其衍生物來(lái)固定化或施用。
5.6.3.p-GlcNAc材料在營(yíng)養(yǎng)/食品工業(yè)上用途這里所描述的本發(fā)明中的p-GlcNAc和其衍生物，還應(yīng)用在動(dòng)物和人類(lèi)營(yíng)養(yǎng)領(lǐng)域。例如，本發(fā)明中的分子可用為食物成分。在本節(jié)前面所描述的那些技術(shù)，可用于生產(chǎn)動(dòng)物用控釋產(chǎn)品。此外，通過(guò)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)的改良技術(shù)的引進(jìn)，上面描述的生物醫(yī)學(xué)用途也能用于動(dòng)物。
本發(fā)明中的p-GlcNAc及其衍生物，在食品工業(yè)上的應(yīng)用，正如在此描述的，可包括抗膽固醇藥(即低膽固醇化合物)，結(jié)合于脂肪的化合物、乳化劑、載體、防腐劑、調(diào)味品、和食用織物(food texturizers)，此外還包括水果覆膜劑和食品包裝產(chǎn)品，但不限于此。
5.6.4.p-GlcNAc材料在化妝品中的應(yīng)用本發(fā)明中的p-GlcNAc在化妝品中的應(yīng)用，可包括生產(chǎn)頭發(fā)用和皮膚用產(chǎn)品，但不限于此。例如，皮膚用產(chǎn)品可包括用脫乙?；痯-GlcNAc鹽，含羧甲基p-GlcNAc產(chǎn)品生產(chǎn)的化妝品，和含脫乙?；痯-GlcNAc及其衍生物如羥丙基，N-琥珀?；图緋-GlcNAc衍生物的化妝盒。例如，頭發(fā)用產(chǎn)品可包括含羧甲基p-GlcNAc產(chǎn)品，以及可成膜的p-GlcNAc衍生物。
5.6.5.p-GlcNAc材料在化工中的應(yīng)用本發(fā)明中的p-GlcNAc及其衍生物，在化工中具有許多有用的用途。例如，p-GlcNAc可用作為偶聯(lián)劑，將金屬聯(lián)結(jié)于高分子上，由乙二醇p-GlcNAc形成的膜，可用于脫鹽化作用，而由其它p-GlcNAc所形成的膜，可用于轉(zhuǎn)運(yùn)鹵離子。其它方面的應(yīng)用包括生產(chǎn)阻燃產(chǎn)品，制造金屬螯合物，和從液體及水溶性工業(yè)污染物，如PCBs，除去痕量和重金屬離子的化合物。p-GlcNAc和/或其衍生物可用于照像工業(yè)中。例如，p-GlcNAc和/或其衍生物具有的螯合金屬例如鹵化銀的能力，通過(guò)浸入顯影液使其能用于再鑲邊，例如含p-GlcNAc和/或其衍生物的薄膜的邊。
6.實(shí)施例純p-GlcNAc制劑的物理性質(zhì)在本實(shí)施例中提出了p-GlcNAc和脫乙?；痯-GlcNAc膜的圓二色譜(CD)和紅外光譜(IR)分析。
6.1.材料與方法p-GlcNAc和商品“殼多糖”制備用于CD研究的p-GlcNAc，按5.3.1.節(jié)描述的機(jī)械力純化法制備。
商品“殼多糖”購(gòu)于加拿大Novachem公司(Novachem，Ltd.，PO Box1030 Armdale，Halifax，Nova Scotia，Canada，B3L 4K9)。
用于IR研究的p-GlcNAc膜或按照5.3.1節(jié)描述的機(jī)械力純化法制備，或按照5.3.2節(jié)介紹的化學(xué)/生物純化法制備。商品“p-GlcNAc”制劑可通過(guò)溶于含5％氯化鋰的二甲基乙酰胺溶液，再分層浸于去離子蒸餾水中，直至膜沉淀這種方法制成膜。
p-GlcNAc衍生物及處理方法用于CD和IR研究的脫乙酰化p-GlcNAc，系通過(guò)將p-GlcNAc用50％氫氧化鈉，于60℃處理2小時(shí)的方法制取。用于IR研究的去熱p-GlcNAc膜，系通過(guò)在0.2mM EDTA中煮沸3分鐘使之改變的方法制取。壓熱p-GlcNAc系由122℃，30分鐘壓熱處理法制取。
CD技術(shù)固態(tài)技術(shù)基本參照Domard法進(jìn)行(Domard，A.，1986，Iht.J.Macromol.8243-246)。
6.2結(jié)果6.2.1CD分析在未經(jīng)處理的p-GlcNAc(圖3A)的CD光譜上，由于p-GlcNAc上的乙?；洗嬖隰驶?，因此觀察到所預(yù)期的n-π*和π-π*光活電子激發(fā)態(tài)(220-185nm)。在脫乙酰p-GlcNAc產(chǎn)品上，如圖所示，該峰則完全消失。
6.2.2.IR光譜分析該研究所獲的IR光譜，與p-GlcNAc化學(xué)結(jié)構(gòu)完全一致。此外，每個(gè)IR譜峰的明確歸屬，表明在p-GlcNAc纖維上存在著有序和規(guī)則的(即假晶形體)結(jié)構(gòu)。圖4A為由機(jī)械力純化法純化的p-GlcNAc IR譜；圖4B為商品“殼多糖”制劑的IR光譜。
從壓熱p-GlcNAc材料獲得的IR光譜(圖4E)與圖4A所示紅外光譜并無(wú)明顯差異。該資料表明，通過(guò)壓熱使p-GlcNAc材料消毒，而其原有的高分子結(jié)構(gòu)不會(huì)喪失。
7.實(shí)施例用機(jī)械力純化法純化p-GlcNAc本節(jié)中，利用5.3.1.節(jié)描述的機(jī)械力技術(shù)純化p-GlcNAc。
7.1材料和方法/結(jié)果硅藻培養(yǎng)條件硅藻種屬為T(mén)hallasiosira fluviatilis，按照5.1和5.2節(jié)描述的方法，培養(yǎng)生長(zhǎng)。
SEM方法在此使用的SEM技術(shù)，與下面12.1節(jié)描述的相同。
p-GlcNAc純化步驟用5.3.1節(jié)描述的機(jī)械力技術(shù)，從硅藻培養(yǎng)物中純化p-GlcNAc。特別是，從硅藻細(xì)胞體中分離p-GlcNAc纖維，是通過(guò)將培養(yǎng)內(nèi)容物注入含三次間歇高速混合運(yùn)動(dòng)的一個(gè)攪拌器中進(jìn)行的。三次間歇運(yùn)動(dòng)的總時(shí)間約為一秒鐘。所得懸浮物在Sorvall GS-4型固定角轉(zhuǎn)子上離心20分鐘，溫度為10℃，轉(zhuǎn)速為3500rpm。傾出上清液，再次于10℃離心20分鐘，轉(zhuǎn)速為4000rpm。再一次將上清液傾去，在10℃離心，轉(zhuǎn)速為4000rpm。第三次離心所得上清液是澄清的，或僅為極少的絮狀物漂浮于溶液中。將澄清的上清液倒入裝有0.8μm孔徑的硝基纖維素布氏過(guò)濾器中，吸濾，將纖維懸浮物從液體中濾出，收集于膜上。用1升去離子蒸餾水于70℃洗滌。當(dāng)水排凈后，于70℃用1N鹽酸1升吸濾洗滌。當(dāng)大部分酸液排出后，再于70℃，用1升去離子蒸餾水吸濾洗滌。當(dāng)大部分水排出后，用1升95％乙醇于室溫洗滌纖維，以真空抽吸。收集濾膜及其附于該膜上的白色纖維膜，從過(guò)濾器中取出，在干燥箱中于20℃干燥20分鐘，再置于干燥器中16小時(shí)。
按照這一純化步驟，從1000ml培養(yǎng)物中p-GlcNAc的產(chǎn)率為，每升硅藻培養(yǎng)物得6.85毫克。用該技術(shù)收集得p-GlcNAc纖維所制成的膜，其SEM照相如圖6A-6B所示。
8.實(shí)施例用生物/化學(xué)純化技術(shù)純化p-GlcNAc本節(jié)利用5.3.2節(jié)所描述的化學(xué)/生物兩種技術(shù)純化p-GlcNAc?；\統(tǒng)地說(shuō)，第一種技術(shù)是用氫氟酸處理純化p-GlcNAc，另一種技術(shù)是通過(guò)酸處理/中和來(lái)純化。
8.1材料與方法/結(jié)果硅藻培養(yǎng)條件硅藻種屬為T(mén)hallasiosira fluviatilis，按5.1和5.2節(jié)描述的方法培養(yǎng)生長(zhǎng)。
SEM方法該研究所使用的技術(shù)，系用下面12.1節(jié)所描述的方法。
純化步驟首先將p-GlcNAc用氫氟酸處理純化，結(jié)果見(jiàn)圖7A-7B。具體地，在一通風(fēng)柜中，于室溫將2.42ml 49％(29N)HF溶液加至硅藻培養(yǎng)物中，使每1000ml原培養(yǎng)物體積，得0.07M HF溶液。將混合物激烈振蕩約30秒鐘，使液體產(chǎn)生持久的泡沫。將內(nèi)容物靜置5-6小時(shí)，使重的顆粒沉降。最后形成一層泡沫，而液體本身分為兩層首先為一層窄的，深綠層沉于容器底部，另一層為淺灰綠色的不透明層，約占液體全部體積的85-90％。將泡沫層小心地用一毛細(xì)玻管和真空抽吸吸去。再將灰霧狀上清液吸去，并轉(zhuǎn)移到另一塑料容器中。注意不要破壞深色的底層，該層主要含沉淀的細(xì)胞體。將灰霧狀上清液靜置16小時(shí)。該溶液最初幾乎是無(wú)色，淺灰的，但不透明。16小時(shí)后，液面留有少量的泡沫，少量的綠色物質(zhì)沉淀于容器的底部。該液體色淡，但仍不透明。將液面的泡沫照前面的方法吸去。再將主要的液體小心地吸出，留下少量綠色物質(zhì)沉于容器的底部。照此分離的液體，含有大量的p-GlcNAc纖維和一些雜質(zhì)。
為除去前步從含纖維液體中所帶的蛋白質(zhì)和其它由硅藻釋放的無(wú)用物質(zhì)，用十二烷基硫酸鈉(SDS)洗滌纖維懸浮液和細(xì)胞殘留物。具體是，將一定體積的20％SDS溶液，加至溶液中，使最后所得溶液含0.5％SDS。將該溶液密封于容器之中，以水平位置放在振蕩器中，于每分鐘100次攪動(dòng)24小時(shí)。振蕩一開(kāi)始，大量白色p-GlcNAc纖維絮狀物出現(xiàn)于懸浮液中，并有大量的泡沫聚集于容器的上部。洗滌結(jié)束后，將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到裝有一個(gè)0.8μm濾膜(Gelman產(chǎn)，Supor過(guò)濾器)的布氏過(guò)濾裝置中。將該液體經(jīng)吸濾過(guò)濾，在濾膜上收集所得到的p-GlcNAc纖維。
將收集于濾膜上的p-GlcNAc纖維進(jìn)一步洗滌。首先，將纖維用相當(dāng)于原懸浮液體積三倍的熱的(70℃)去離子蒸餾水洗滌。利用去離子蒸餾水的水流，將收集于布氏過(guò)濾器的濾膜上的白色纖維凝塊，轉(zhuǎn)移至攪拌器中，用約10次短的間歇攪動(dòng)使塊狀纖維松散。將松散的纖維懸浮液轉(zhuǎn)移至前述的含硝基纖維素濾膜的布氏過(guò)濾漏斗中，抽濾除去液體。將收集的纖維用1000ml熱的(70℃)1N鹽酸溶液洗滌，再進(jìn)一步用1000ml熱的(70℃)去離心蒸餾水洗滌。最后于室溫用1000ml95％乙醇洗滌纖維，過(guò)濾至于。纖維膜及下面的濾膜于58℃在干燥爐中干燥20分鐘。再置于干燥器中16小時(shí)。再將纖維膜小心地從濾膜上剝離。
第二種純化p-GlcNAc的方法，是按照5.3.2節(jié)所描述的，用酸處理/中和的方法，具體是，將p-GlcNAc按本節(jié)前面所述方法處理，直至用SDS洗滌一步之前，此時(shí)加入2.9M Tris溶液，將溶液中和至pH約7.0。用這種方法純化的p-GlcNAc的產(chǎn)率是，每升硅藻培養(yǎng)物得20.20毫克。平均每升硅藻培養(yǎng)物可獲約60毫克產(chǎn)品。純化過(guò)程的SEM顯微照片于圖8A-8B和9A-9E所示。
9.實(shí)施例p-GlcNAc脫乙?；瘜-GlcNAc膜懸浮于50％氫氧化鈉溶液中，于80℃加熱2小時(shí)。將所得脫乙?；じ稍?，按圖11A-11B所示掃描電子顯微術(shù)進(jìn)行研究。
10.實(shí)施例p-GlcNAc生物相容性在本實(shí)施例中，試驗(yàn)證明未檢測(cè)出本發(fā)明中的p-GlcNAc顯示出生物反應(yīng)性。試驗(yàn)包括洗脫試驗(yàn)、在兔肌內(nèi)的埋植試驗(yàn)、給兔皮內(nèi)注射試驗(yàn)以及小鼠全身注射試驗(yàn)。
10.1.材料與方法10.1.1.洗脫試驗(yàn)洗脫試驗(yàn)的條件，遵照美國(guó)藥典XXII版，1990年，第1415至1497頁(yè)和美國(guó)藥典XXII版，補(bǔ)編5，1990年，第2702至2703頁(yè)的規(guī)定。
細(xì)胞培養(yǎng)用鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞株(American Type CultureCollection Rockville，MD；ATCC No.CCL1；NCTC colone 929)。在全最小基本介質(zhì)(MEM)中，將融合單層L929細(xì)胞繁殖24小時(shí)。
p-GlcNAc按5.3.1節(jié)機(jī)械力純化法制備p-GlcNAc固態(tài)膜，并按美國(guó)藥典XXII II(1990)版的要求，用20ml加血清MEM提取。
對(duì)照組用天然橡膠作為正對(duì)照，用硅烷作為負(fù)對(duì)照。按相同的條件，用p-GlcNAc作為測(cè)試項(xiàng)目進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
提取物于37℃，在24小時(shí)內(nèi)于含5％二氧化碳濕潤(rùn)空氣中制備提取物。通過(guò)pH的變化評(píng)價(jià)提取物，調(diào)節(jié)pH在原介質(zhì)pH的+/-0.2單位范圍內(nèi)。用鹽酸降低提取物的pH，用碳酸氫鈉升高提取物的pH。在用于細(xì)胞單層之前，將提取物通過(guò)0.22微米的濾膜進(jìn)行過(guò)濾消毒。
劑量用3ml p-GlcNAc或?qū)φ仗崛∥?，代替?xì)胞培養(yǎng)的介質(zhì)。所有提取物均重復(fù)測(cè)試。
評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)目測(cè)或在顯微鏡下評(píng)價(jià)細(xì)胞單層的應(yīng)答。生物活性，即細(xì)胞變性和/或畸形，按下面描述的0到4記分，進(jìn)行評(píng)價(jià)。如果對(duì)于負(fù)對(duì)照項(xiàng)未觀察到細(xì)胞反應(yīng)(評(píng)分0)，而正對(duì)照項(xiàng)顯示比輕度反應(yīng)(評(píng)分2)更高，則試驗(yàn)系統(tǒng)是合適的。如果用測(cè)試項(xiàng)(即p-GlcNAc)處理的培養(yǎng)物不顯出比輕度反應(yīng)更高的特性，那么測(cè)試項(xiàng)即符合生物相容性試驗(yàn)。評(píng)分反應(yīng)性 對(duì)反應(yīng)區(qū)域的描述0 無(wú) 胞質(zhì)內(nèi)顆粒分散；細(xì)胞無(wú)溶解1 極微 低于20％細(xì)胞是圓形的，松散連接的，無(wú)胞質(zhì)內(nèi)顆粒；偶爾存在溶解的細(xì)胞2 輕微 低于50％細(xì)胞是圓形的，缺乏胞質(zhì)內(nèi)顆粒；大量細(xì)胞溶解，細(xì)胞間空區(qū)多3 中度 圓形細(xì)胞和/或溶解細(xì)胞低于70％4 重度 細(xì)胞層幾乎全被破壞10.1.2.肌內(nèi)埋植動(dòng)物用健康的，新西蘭白兔，雄和雌性(Eastern Rabbit BreedingLaboratory，Taunton，MA)。用懸掛的不銹鋼籠子，單獨(dú)飼養(yǎng)白兔。按照試驗(yàn)的相同條件，收到動(dòng)物后置于隔離區(qū)內(nèi)8天。用硬木薄片(Sani-ChipsTM，J.P.Murphy Forest Products，Montvale，NJ)作為籠內(nèi)非接觸的棲歇物。動(dòng)物設(shè)施內(nèi)維持68±3°F，相對(duì)濕度30-70％，至少每小時(shí)進(jìn)行10-13次完全的空氣交換，用全譜熒光燈提供12小時(shí)白晝與黑晝變化。用市售的食物在一定的要求(Agway Prolab，Waverly NY)和市政自來(lái)水，飼養(yǎng)動(dòng)物。在食物、棲歇物或水中不存在可干擾測(cè)試結(jié)果的已知污染物。從大量的動(dòng)物中選擇所研究的動(dòng)物。每只兔約重10g，并經(jīng)耳紋檢查。
p-GlcNAc所用的p-GlcNAc如10.1.1.節(jié)所描述。
埋植試驗(yàn)每個(gè)埋植試驗(yàn)使用二只兔。試驗(yàn)當(dāng)日，剪去動(dòng)物身上脊柱兩側(cè)的毛。每只動(dòng)物均經(jīng)麻醉，以防肌肉運(yùn)動(dòng)。用消毒的皮針和通管絲，將四條測(cè)試的p-GlcNAc(1mm×1mm×10mm)埋植于每只兔脊柱一側(cè)的脊柱旁肌上(即平行于脊柱，離中線(xiàn)2.5到5cm，每條相隔2.5cm)。類(lèi)似此方式，兩條USP負(fù)對(duì)照的塑料RS(1mm×1mm×10mm)埋植于每只動(dòng)物相反一側(cè)肌肉上。讓動(dòng)物維持這一狀態(tài)7天，在觀察期結(jié)束，將動(dòng)物稱(chēng)重，并注射巴比妥鹽，安樂(lè)劑-5(Veterinary Laboratories，Inc.，Lenexa，KS)讓其安樂(lè)死。保證充足的時(shí)間，以便切割組織時(shí)不出血。用放大鏡檢查圍繞每個(gè)埋植條中心部分的組織區(qū)域。用下面的記分方法評(píng)定出血，壞死，變色和感染情況0等于正常，1等于輕微，2等于中度，和3等于重度。如存在包囊化，可通過(guò)先量膠囊(即埋植邊緣至膠囊邊緣的距離)，四舍五入至0.1mm，來(lái)評(píng)分。包囊化評(píng)分如下膠囊寬 評(píng)分無(wú) 00.5mm以下10.6-1.0mm21.1-2.0mm3大于2.0mm4計(jì)算p-GlcNAc平均分?jǐn)?shù)與正對(duì)照項(xiàng)之間的差別。如果對(duì)每只兔，p-GlcNAc每項(xiàng)生物反應(yīng)的平均分?jǐn)?shù)，與正對(duì)照塑料埋植部位的差異不超過(guò)1.0，則試驗(yàn)就被認(rèn)作為負(fù)結(jié)果的；或者，每個(gè)p-GlcNAc項(xiàng)的所有類(lèi)生物反應(yīng)的平均得分，與所有正對(duì)照塑料埋植部位的平均得分之間的差異不超過(guò)1.0，即不超過(guò)四條p-GlcNAc之一組，也被認(rèn)為是負(fù)結(jié)果。
10.1.3.皮內(nèi)注射動(dòng)物用新西蘭白兔，處理方法同10.1.2節(jié)。
p-GlcNAc按照5.3.1節(jié)描述的機(jī)械力純化法制備固態(tài)p-GlcNAc膜，并置于一個(gè)提取燒瓶中，加入20ml合適的溶媒。加熱至70℃進(jìn)行24小時(shí)提取。按照下面的步驟，將提取物冷至室溫。在用前激烈振搖每只提取瓶。
皮內(nèi)試劑試驗(yàn)當(dāng)天，剪去動(dòng)物兩邊的毛。對(duì)每一p-GlcNAc提取物，取其0.2ml皮下注射至每只兔每側(cè)的五個(gè)部位。每只兔均使用一次以上的p-GlcNAc提取物。在每只兔另一側(cè)的五個(gè)位置，注入0.2ml對(duì)照物。于注射后24、48和72小時(shí)，觀察注射部位紅斑，水腫和壞死情況。按照Draize評(píng)分法，評(píng)定皮膚反應(yīng)(美國(guó)藥典XXII II版，1990年，第1497至1500頁(yè)；美國(guó)藥典XXII II版，補(bǔ)編5，1991年，第2703至2705頁(yè))，見(jiàn)下面表II所示
表II評(píng)定皮膚反應(yīng)的Draize計(jì)分法值紅斑和焦痂的形成無(wú)紅斑………………………………………………………………0微量紅斑(僅感覺(jué)到)………………………………………………1確有紅斑……………………………………………………………2中重度紅斑…………………………………………………………3重度紅斑(充血)至少量焦痂形成(深度傷害)……………………4紅斑總分等于4水腫形成無(wú)水腫………………………………………………………………0微量水腫(僅感覺(jué)到)………………………………………………1少量水腫(有確定的隆起水腫邊)…………………………………2中度水腫(升高約1mm并向暴露處延伸) …………………………3重度水腫(升高超過(guò)1mm并向暴露處延伸) ………………………4水腫總分等于4在24，48和72小時(shí)，分別計(jì)算紅斑和水腫得分總數(shù)，并用12除(即2只動(dòng)物乘以3個(gè)計(jì)分段，再乘以2種記分項(xiàng))，以測(cè)定p-GlcNAc對(duì)相應(yīng)對(duì)照組的總平均得分。觀察后稱(chēng)重動(dòng)物，并注射巴比妥鹽，安樂(lè)劑-5(Veterinary Laboratories，Inc.，Lenexa，KS)使其安樂(lè)死。如果p-GlcNAc和對(duì)照組平均反應(yīng)的分?jǐn)?shù)的差別(紅斑/水腫)為1.0或更少，試驗(yàn)的結(jié)果即滿(mǎn)足要求。
10.1.4.全身注射動(dòng)物用Albino Swiss小鼠(Mus musculus)，雌性(Charles RiverBreeding Laboratories Wilmington，MA)。五組小鼠飼養(yǎng)于聚丙烯籠中，裝上不銹鋼蓋子。用硬木薄片(Sani-ChipTM，J.P.Murphy Forest Products，Montvale，NJ)作為籠中接觸性棲歇地。動(dòng)物設(shè)施置于一有限的面積之中，動(dòng)物房保持68±3°F，相對(duì)濕度為30-70％，每小時(shí)至少進(jìn)行10-13次完全空氣交換，用全譜熒光燈保持12小時(shí)白晝/黑晝。隨意用市售食物及市政自來(lái)水飼養(yǎng)動(dòng)物。在食物，棲歇地，或水中不存在可能干擾試驗(yàn)結(jié)果的污染物。研究用動(dòng)物選自大量的動(dòng)物中。稱(chēng)重小鼠，重量接近于0.1g，并分別在耳邊記號(hào)以資識(shí)別。
p-GlcNAc所用樣品如10.1.1.節(jié)所描述。按照10.1.3.節(jié)描述的方法制備提取物。
全身注射試驗(yàn)五組小鼠按下面的途徑，以同樣的量注射p-GlcNAc提取物，或相應(yīng)的對(duì)照物測(cè)試項(xiàng)或?qū)φ枕?xiàng)提取物 途徑 劑量/公斤注射速度0.9％氯化鈉注射液 靜脈 50毫升 0.1毫升/秒(美國(guó)藥典，0.9％NaCl) 靜脈 50毫升 0.1毫升/秒乙醇與0.9％氯化鈉(1∶20)注射液(美國(guó)藥典，EtOH∶NaCl) 靜脈 50毫升 0.1毫升/秒聚乙二醇400(PEG400) 腹膜內(nèi) 10克 --棉子油(CSO) 腹膜內(nèi) 50毫升 --用PEG400制備的p-GlcNAc提取物，以及相應(yīng)的對(duì)照物以0.9％氯化鈉稀釋?zhuān)妹亢辽琍EG400為200毫克。對(duì)靜脈注射試驗(yàn)，PEG400以0.9％氯化鈉稀釋得每毫升含PEG400為120毫克。
于注射后24小時(shí)，48小時(shí)和72小時(shí)，立即觀察動(dòng)物。觀察后稱(chēng)重并置于二氧化碳?xì)怏w中令其安樂(lè)死。如果用p-GlcNAc處理的動(dòng)物不比用對(duì)照物處理的動(dòng)物顯示出更大的生物反應(yīng)性，該試驗(yàn)即滿(mǎn)足需要。
10.2.結(jié)果10.2.1.洗脫試驗(yàn)用目測(cè)和顯微檢查，評(píng)價(jià)細(xì)胞單層對(duì)p-GlcNAc試驗(yàn)項(xiàng)目的應(yīng)答。評(píng)價(jià)時(shí)不使用細(xì)胞化學(xué)染色。暴露于負(fù)對(duì)照物或p-GlcNAc48小時(shí)后，觀察不到細(xì)胞生物反應(yīng)(評(píng)分0)。對(duì)于正對(duì)照物，觀察到重度反應(yīng)(評(píng)分4)，如表III所示表III反應(yīng)等級(jí)對(duì)照組時(shí)間p-GlcNAc負(fù)正A B ABAB0小時(shí) 0 0 000024小時(shí)0 0 004448小時(shí)0 0 0044因此，本發(fā)明中的p-GlcNAc符合生物相容性的洗脫試驗(yàn)的要求，是無(wú)細(xì)胞毒性的。
10.2.2.肌內(nèi)埋植兩組受試兔(A和B組)增加了體重，不顯示毒性反應(yīng)。見(jiàn)表IV數(shù)據(jù)。此外每只兔均無(wú)明顯的毒性反應(yīng)。對(duì)試驗(yàn)及對(duì)照組埋植部位進(jìn)行肉眼檢查，并不顯示炎癥，包囊化，出血，壞死或變色。結(jié)果見(jiàn)表IV。因此，該試驗(yàn)對(duì)每只兔，所有p-GlcNAc埋植部位的所有生物反應(yīng)項(xiàng)目的平均得分，與所有對(duì)照埋植部位的所有反應(yīng)項(xiàng)的平均得分差異，不超過(guò)1.0，證明受試的p-GlcNAc不顯示生物反應(yīng)性。
表IV埋植試驗(yàn)(肉眼觀察)測(cè)試項(xiàng)目P-GlcNAc動(dòng)物種類(lèi)兔動(dòng)物#A測(cè)試 對(duì)照組織位置 T1T2 T3T4 平均值 C1C2 平均值
炎癥包囊出血壞死變色總分 0000 0 0平均得分 0000 0 0(總分/5)平均對(duì)照值0
表IV(續(xù))動(dòng)物#B測(cè)試對(duì)照組織位置 T1 T2 T3T4 平均值 C1 C2 平均值
炎癥包囊出血壞死變色總分0 0 0 0 0 0平均得分0 0 0 0 0 0(總分/5)平均對(duì)照值0
10.2.3.皮內(nèi)試驗(yàn)所有動(dòng)物的體重均增加。見(jiàn)表V數(shù)據(jù)。對(duì)所有的p-GlcNAc或?qū)φ枕?xiàng)位置，均未觀察到紅斑或水腫。對(duì)所有動(dòng)物均未觀察到明顯的毒性反應(yīng)。由于p-GlcNAc和對(duì)照項(xiàng)平均反應(yīng)得分(紅斑/水腫)的差別小于1.0，p-GlcNAc符合皮內(nèi)試驗(yàn)的要求，結(jié)果見(jiàn)表VI。因此，以上試驗(yàn)證實(shí)，p-GlcNAc無(wú)生物反應(yīng)性。
表V皮內(nèi)和埋植試驗(yàn)體重和臨床觀察測(cè)試項(xiàng)P-GlcNAc 動(dòng)物種類(lèi)兔體重(公斤)組別 動(dòng)物# 件別 0天 3天體重變化毒性反應(yīng)*0.9％NaCl23113雄2.512.55 0.04無(wú)& CSO0.9％NaCl23114雌2.432.46 0.03無(wú)& CSOEtoHNaCl 23115雄2.472.50 0.03無(wú)& PEG 400EtoHNaCl 23116雌2.592.63 0.04無(wú)& PEG 4000天 7天埋植 A雄2.742.80 0.06無(wú)B雌2.662.74 0.08無(wú)*0至7天(埋植試驗(yàn))和0至3天(皮內(nèi)試驗(yàn))觀察小結(jié)表VI皮內(nèi)試驗(yàn)的Draize評(píng)分測(cè)試項(xiàng)P-GlcNAc(T為測(cè)試，C為對(duì)照)動(dòng)物種類(lèi)兔氯化鈉提取
表VI(續(xù))CSO提取
表VI(續(xù))氯化鈉/乙醇提取
表VI(續(xù))PEG提取
10.2.4.全身試驗(yàn)所有用p-GlcNAc或用對(duì)照物提取的小鼠的體重均增加。見(jiàn)表VII內(nèi)數(shù)據(jù)。此外，在用p-GlcNAc或?qū)φ瘴锏膭?dòng)物身上未觀察到明顯的毒性反應(yīng)。見(jiàn)表VI內(nèi)結(jié)果。因此，所有用p-GlcNAc試驗(yàn)的動(dòng)物與用對(duì)照物處理的動(dòng)物相比，均未顯示出更大的生物反應(yīng)性。
表VII動(dòng)物體重與臨床觀察組別性別 劑量(ml) 動(dòng)物號(hào)#體重(g) 重量變化 毒性0天 3天 反應(yīng)*NaCl 雌1.03I 20.6 22.8 2.2 無(wú)EtOH 雌1.06II21.1 23.4 2.3 無(wú)試驗(yàn) 雌1.02III 20.4 22.6 2.2 無(wú)50ml/kg 雌1.11IV22.2 24.5 2.3 無(wú)雌1.05V 21.0 23.2 2.2 無(wú)平均 21.1 23.3SD+/- 0.7 0.7NaCl 雌1.04VI20.7 23.2 2.5 無(wú)EtOH 雌1.04VII 20.8 23.5 2.7 無(wú)對(duì)照 雌1.02VIII 20.3 22.3 2.0 無(wú)50ml/kg 雌0.91IX18.2 20.6 2.4 無(wú)雌0.94X 18.7 20.9 2.2 無(wú)平均 19.7 22.1SD+/- 1.2 1.3PEG 雌1.02XI20.3 22.7 2.4 無(wú)試驗(yàn) 雌0.96XII 19.2 21.4 2.2 無(wú)10ml/kg 雌0.95XIII 18.9 21.6 2.7 無(wú)雌1.05XIV 20.9 22.7 1.8 無(wú)雌0.94XV18.7 21.2 2.5 無(wú)平均 19.6 21.9SD+/- 1.0 0.7PEG 雌1.01XVI 20.1 22.3 2.2 無(wú)對(duì)照 雌0.99XVII 19.8 22.0 2.2 無(wú)10g/kg 雌1.10XVIII 22.0 24.3 2.3 無(wú)雌1.07XIX 21.4 23.6 2.2 無(wú)雌1.03XX20.6 22.4 1.8 無(wú)平均 20.8 22.9SD+/- 0.9 1.0*注射后0、4、24、48和72小時(shí)觀察小結(jié)
11.實(shí)施例p-GlcNAc再成型物(Reformulation)在本節(jié)提出的實(shí)例中，取p-GlcNAc(16.2毫克)溶于含5％氯化鋰的1毫升二甲基乙酰胺溶液中。將含p-GlcNAc的溶液置于一注射器中，再擠入50毫升純水中，有纖維沉淀出來(lái)。將所得纖維按圖10A-10B所示用掃描電鏡進(jìn)行研究。
12.實(shí)施例細(xì)胞粘附于p-GlcNAc在本工作實(shí)例中，證明p-GlcNAc是細(xì)胞粘附和培養(yǎng)生長(zhǎng)的一種有效底物。
12.1.材料和方法細(xì)胞用轉(zhuǎn)型鼠3T3成纖維細(xì)胞株，令其生長(zhǎng)于添加了胎牛血清(FBS)的DMEM中。
p-GlcNAc膜按5.3.1和8節(jié)描述的方法制備p-GlcNAc。
用一滴水將p-GlcNAc膜粘于帶蓋的玻璃上，再于121℃壓熱30分鐘。將按此方式制備的膜置于含6塊培養(yǎng)板的培養(yǎng)皿中。
細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)前先將膜在基質(zhì)中用新鮮的溶媒(DMEM+10％FBS)清洗，再用胰蛋白酶(10％，37℃，5分鐘)處理。然后在介質(zhì)中直接用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定細(xì)胞數(shù)目。
SEM操作條件用Zeiss 962型儀器，加速電壓為10KV，工作距離為15mm。按所述方式，用偏振型55p/n(μ4)進(jìn)行各種放大觀察。樣品涂膜碳膜(100)和100aupd。
樣本的制備對(duì)于首次固定化，將細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基用無(wú)血清的2％戊二醛伊格爾氏(Eagle’s)DMEM溶液取代。要替換幾次，以確保生長(zhǎng)培養(yǎng)基完全過(guò)渡至固定化。固定化于室溫進(jìn)行，需0.5小時(shí)。將滑套(Cover slips)轉(zhuǎn)至另一小瓶中，瓶?jī)?nèi)含2％戊二醛在0.1M二甲胂酸鈉的溶液和0.1M蔗糖溶液，pH值為7.2，將此于室溫再固定1.5小時(shí)。
脫水，CPD，載片和噴涂將樣品于pH值7.2，用0.1M二甲胂酸鈉溶液清洗。將滑套轉(zhuǎn)至一個(gè)CPD柄中。在乙醇(30％，50％，75％，85％，95％和3×100％，每次5分鐘)中脫水，再將樣品在臨界點(diǎn)干燥。將滑套在鋁釘上載片，用真空蒸發(fā)法(@100)涂上碳層，并以100 AuPd噴涂。
12.2.結(jié)果測(cè)試p-GlcNAc作為細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)底物的能力。在有或無(wú)p-GlcNAc膜的存在下，使大鼠成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)于培養(yǎng)皿中，每日進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)以測(cè)試培養(yǎng)的可行性。細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果見(jiàn)圖14。正如所表明的，培養(yǎng)后第五天，僅僅含有p-GlcNAc膜的培養(yǎng)皿能持續(xù)維持細(xì)胞的生存，表明p-GlcNAc膜能作為培養(yǎng)基中細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)的有效底物。
此外，圖15A-15B中SEM顯微照片表明，健康的細(xì)胞強(qiáng)有力地粘附于p-GlcNAc膜上。
13.實(shí)施例p-GlcNAc/膠原雜交本實(shí)例介紹p-GlcNAc/膠原雜交材料的形成與表征。
13.1.材料與方法材料用I型牛膠原蛋白制備本研究所描述的雜交物。按5.3.2.節(jié)所述的機(jī)械力方法，制備p-GlcNAc。
雜交物的制備將膠原蛋白(10毫克/毫升)與p-GlcNAc(0.25毫克/毫升)懸浮物，按不同的比例混合，于液氮(-80℃)中冰凍，于-9℃保溫4小時(shí)，再凍干。將所得材料于60℃抽真空(約為0.030毫米汞柱)3天，使之熱脫水交聯(lián)。
細(xì)胞培養(yǎng)大鼠3T3成纖維細(xì)胞，于膠原/p-GlcNAc雜交物中培養(yǎng)生長(zhǎng)。按標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)步驟進(jìn)行操作，培養(yǎng)后8天攝制SEM顯微照片。
13.2.結(jié)果將膠原蛋白與p-GlcNAc懸浮物按不同的比例(即3∶1、1∶1、2∶2和1∶3)混合，冰冷，凍干與交聯(lián)。這一步驟可獲得膠原p-GlcNAc片。所得材料的SEM顯微照片見(jiàn)圖16B-E。圖16A代表僅為膠原的對(duì)照物。注意雜交物的多孔結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明中膠原/p-GlcNAc雜交物為細(xì)胞的粘附與生長(zhǎng)提供了一種有效的結(jié)構(gòu)，如圖17A-D SEM顯微照片所示。
14.實(shí)施例p-GlcNAc純制劑的NMR表征本實(shí)施例中提出純p-GlcNAc制劑的NMR(核磁共振)分析。
14.1.材料與方法p-GlcNAc制備用于NMR研究的p-GlcNAc按5.3.2節(jié)所述化學(xué)純化法制備，用氫氟酸為化學(xué)試劑。
NMR技術(shù)用Bruker 500MH NMR儀，獲取固態(tài)NMR數(shù)據(jù)。用計(jì)算機(jī)顯像分析技術(shù)處理NMR譜數(shù)據(jù)，以消除背景干擾和獲得正常基線(xiàn)。圖18表示這種數(shù)據(jù)處理的一個(gè)例子。如圖18所處理后獲得的NMR曲線(xiàn)，被用來(lái)獲取每種碳原子的面積，再以此計(jì)算CH3(面積)與C原子(面積)之比值。該值見(jiàn)圖20所示。
14.2.結(jié)果通過(guò)測(cè)定500毫克p-GlcNAc樣品的13C-NMR光譜，獲得固態(tài)NMR數(shù)據(jù)。典型的NMR譜見(jiàn)圖19所示。每個(gè)峰代表分子中每個(gè)獨(dú)特的碳原子的譜。通過(guò)計(jì)算譜圖中所有NMR峰的總面積，劃分每種碳所產(chǎn)生的峰面積，可以測(cè)出分子中每種碳原子所占的相對(duì)百分含量。這樣，可通過(guò)測(cè)量一個(gè)參照原子來(lái)計(jì)算分子中每個(gè)原子的比例。所有p-GlcNAc分子均由含C1、C2、C3、C4、C5和C6原子的N-乙?；咸烟前窔埢M成。如果高分子聚合物中所有的葡萄糖胺殘基均被N-乙?；?，那么，上面N-乙?；鵆H3碳原子的峰面積與任一葡萄糖胺殘基中碳原子的峰面積之比，應(yīng)為1.0。如圖20中的數(shù)據(jù)，可用來(lái)獲得CH3(面積)的比值。
圖20中的計(jì)算的比例值，在實(shí)驗(yàn)誤差允許范圍內(nèi)，大多數(shù)情況下等于或約等于1.0，例如CH3/C2＝1.097，CH3/C6＝0.984，CH3/C5＝1.007，CH3/C1＝0.886。這些結(jié)果與本發(fā)明p-GlcNAc材料無(wú)污染，且完全被乙酰化這一結(jié)論相一致(即基本上100％的葡萄糖胺殘基被乙酰化)。
15.特定孔徑的三維p-GlcNAc材料的合成與生物學(xué)特性下面描述的是生產(chǎn)具有特定平均孔徑的，基于三維p-GlcNAc材料的多孔基質(zhì)的方法。該基質(zhì)具有許多重要的用途，例如，特別是作為細(xì)胞包囊化的工具。這種細(xì)胞包囊化組合物，在基于細(xì)胞移植的治療方面，和細(xì)胞與組織工程學(xué)方面，如軟骨再生，是很有用的。這種很容易改變p-GlcNAc材料的形態(tài)和尺度的性能，為擴(kuò)展本發(fā)明中p-GlcNAc材料的潛在的應(yīng)用，提供了有力的方法。
15.1.材料與方法p-GlcNAc原料按5.3.2節(jié)所描述的化學(xué)純化法，以氫氟酸為化學(xué)試劑，制備p-GlcNAc。
基質(zhì)的形成在凍干前，按下面15.2節(jié)所列的溶劑，制備含有20毫克p-GlcNAc樣品的懸浮液(5毫升)。再將樣品倒入組織培養(yǎng)皿中，于-20℃冷凍。將冷凍的樣品凍干，再移出所得的具有三維結(jié)構(gòu)的基質(zhì)。
自旋電子顯微技術(shù)所用的方法按12.1節(jié)描述的方法。圖21A-G所示的是基質(zhì)材料經(jīng)200倍放大的圖像，每個(gè)圖中的一個(gè)刻度代表200微米。
15.2.結(jié)果按15.1節(jié)所述，從下列各溶劑中，制備p-GlcNAc樣品A.蒸餾水B.含10％甲醇的蒸餾水C.含25％甲醇的蒸餾水D.僅為蒸餾水E.含10％乙醇的蒸餾水F.含25％乙醇的蒸餾水G.含40％乙醇的蒸餾水用上述溶劑制備的基質(zhì)樣品，分別進(jìn)行掃描，電子顯微鏡(SEM)分析，如圖21A-G所示。這些圖示結(jié)果揭示，隨著每種懸浮液中甲醇或乙醇比例的增加，基質(zhì)的平均孔徑減小。
特別是，在兩種水懸浮液中(圖21A和21D)，孔徑平均接近于200微米。圖21C和21F(分別含25％甲醇和25％乙醇)中樣品的孔徑平均在30和50微米之間。
此結(jié)果說(shuō)明，乙醇和甲醇都可成功地用來(lái)控制p-GlcNAc孔徑的大小，而在控制孔徑的大小方面，乙醇可能比甲醇更為有效。
16.實(shí)施例在三維多孔p-GlcNAc基質(zhì)上細(xì)胞的生長(zhǎng)本節(jié)所描述的結(jié)果證明三維p-GlcNAc多孔材料作為基質(zhì)在細(xì)胞培養(yǎng)中成功的應(yīng)用。
16.1.材料和方法p-GlcNAc原料用5.3.2.節(jié)描述的化學(xué)純化法制備p-GlcNAc，用氫氟酸為化學(xué)試劑。
基質(zhì)的形成通過(guò)凍干在水、水-乙醇或水-甲醇混合物中的p-GlcNAc懸浮液，制備三維p-GlcNAc基質(zhì)。
在下列溶劑中配制含有200mg p-GlcNAc的懸浮液(5ml)，并將其冷凍干燥1.蒸餾水2.蒸餾水配制的10％甲醇3.蒸餾水配制的25％甲醇4.蒸餾水5.蒸餾水配制的10％乙醇6.蒸餾水配制的25％乙醇7.蒸餾水配制的40％乙醇將樣品倒入塑料組織培養(yǎng)皿的圓孔中，在-20℃冷凍。將冷凍樣品冷凍干燥，取出所得到的三維基質(zhì)，并對(duì)每個(gè)基質(zhì)中的樣品進(jìn)行掃描電鏡(SEM)分析。
細(xì)胞使用由ATCC得到的小鼠胚胎BALBC/3T3成纖維細(xì)胞(克隆A31)，在三維多孔p-GlcNAc基質(zhì)上進(jìn)行培養(yǎng)。
培養(yǎng)條件將1cm2多孔基質(zhì)樣品置于組織培養(yǎng)孔中，在上面覆蓋標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)基。在每個(gè)孔中放入樣品，置于CO2培養(yǎng)箱(5％CO2)中于37℃培養(yǎng)6天。
SEM程序?qū)⒒|(zhì)樣品固定，依照12.1所敘述的方法進(jìn)行SEM分析。所用的基質(zhì)是冷凍干燥的蒸餾水配制的p-GlcNAc。如圖22A-G所示，圖像放大100倍至5000倍。
16.2.結(jié)果圖22A-G是粘附有小鼠成纖維細(xì)胞的p-GlcNAc基質(zhì)的SEM照片。照片表明這些三維p-GlcNAc基質(zhì)中含有小鼠成纖維細(xì)胞，在這些細(xì)胞和p-GlcNAc基質(zhì)之間存在密切的相互作用和聯(lián)系。用此方法培養(yǎng)的細(xì)胞成活率高于95％，而且具有圓形的三維結(jié)構(gòu)，而直接在塑料培養(yǎng)皿中培養(yǎng)出的細(xì)胞則是扁平伸展的。
17.實(shí)例p-GlcNAc成功地防止術(shù)后傷口粘連本實(shí)例表明使用p-GlcNAc材料，尤其是p-GlcNAc薄膜和凝膠，可以成功地防止一系列動(dòng)物模型術(shù)后傷口粘連的形成。
17.1.材料和方法p-GlcNAc乳酸鹽的合成以氫氟酸作為化學(xué)試劑，用5.3.2中所敘述的方法制備p-GlcNAc薄膜。
用下述方法將p-GlcNAc轉(zhuǎn)化為脫乙酰基p-GlcNAc(應(yīng)當(dāng)指出，制備1gp-GlcNAc乳酸鹽大約需要1.4g p-GlcNAc，脫乙?；磻?yīng)約有15％的質(zhì)量損失)將200mg p-GlcNAc薄膜材料與200ml 60％的氫氧化鈉劇烈混合，劇烈振蕩以使p-GlcNAc薄膜材料盡可能分散。所用的氫氧化鈉溶液至少要在使用前12小時(shí)配制。將樣品置于80℃的水浴加熱6小時(shí)，不時(shí)加以振蕩以分散和濕潤(rùn)p-GlcNAc。6小時(shí)后，將樣品移出水浴并迅速分離氫氧化鈉溶液。室溫下用重水洗滌薄膜至pH為7，將薄膜在聚四氟乙烯薄板上晾干。
取2mg此時(shí)的樣品做碳、氫、氮的元素分析，以確定脫乙?；某潭?；測(cè)定樣品在1％乙酸溶液中的溶解度，如果溶解度為1mg/ml，則表明p-GlcNAc脫乙?；潭冗m宜。
用下述方法將部分脫乙?；鵳-GlcNAc轉(zhuǎn)化為p-GlcNAc乳酸鹽在250ml錐形燒瓶中放入1g部分脫乙?；鵳-GlcNAc，加入足量的2-丙醇(含水10％)，將其潤(rùn)濕并使其能夠被攪拌起來(lái)(大約需要30ml 2-丙醇)。所用的2-丙醇必須是試劑級(jí)，而且必須在每次反應(yīng)前新鮮制備。在攪拌的同時(shí)1.1ml...50％乳酸水溶液。所用的乳酸應(yīng)該是試劑級(jí)，必須分析測(cè)定其確切的有效濃度(即沒(méi)有被酯化的部分)，分析的方法是用0.1N的氫氧化鈉滴定，以酚酞指示終點(diǎn)(pH7.0)。每次反應(yīng)所用的乳酸的濃度必須保持恒定，即，必須+/-1％?；旌衔飻嚢柚辽?小時(shí)，可以低溫加熱以加快反應(yīng)速率。為了使反應(yīng)進(jìn)行完全，可以延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間或者增加50％乳酸水溶液的用量。攪拌后，將燒瓶?jī)?nèi)的混合物傾入鋪有無(wú)灰濾紙的布氏漏斗，用15ml無(wú)水2-丙醇洗滌后，在通風(fēng)櫥中干燥2小時(shí)，置于40℃的烘箱中過(guò)夜。每1g部分脫乙?；鵳-GlcNAc可以制得大約1.4g p-GlcNAc乳酸鹽(即質(zhì)量增加40％)。
p-GlcNAc乳酸鹽凝膠的形成用下述方法使p-GlcNAc乳酸鹽形成凝膠將p-GlcNAc乳酸鹽溶于去離子重水，配成濃度為0.1-4.0％的溶液，加入試劑級(jí)的丙二醇，使丙二醇的最終濃度為1-10％。在一些情況下，需要加入防腐劑以防止微生物和/或真菌對(duì)產(chǎn)品的污染。通常制得的p-GlcNAc乳酸鹽溶液的濃度為0.1-4.0％，隨著p-GlcNAc乳酸鹽百分比含量的增加，溶液的粘度急劇增大，這樣就有0.5％或者更多的p-GlcNAc乳酸鹽以凝膠的形式存在。
動(dòng)物模型Sprague-Dawley大鼠在本模型中，通過(guò)摩擦或者刺激盲腸的漿膜表皮并將其置于周邊腹膜的某一位置來(lái)產(chǎn)生粘連。據(jù)報(bào)道，在對(duì)照動(dòng)物中用本法產(chǎn)生粘連的成功率平均為80％。
使大鼠產(chǎn)生術(shù)后傷口粘連的手術(shù)過(guò)程如下所述動(dòng)物采用背臥式并做好無(wú)菌手術(shù)的準(zhǔn)備。沿中線(xiàn)切開(kāi)腹腔，小心地切除左腹腔壁一塊約0.5cm×1.0cm的腹膜，連帶切除一小薄層肌肉。
抬高并分離盲腸，用干紗布在盲腸近端側(cè)表面的一塊約0.5cm×1.0cm的區(qū)域摩擦十次，并用手術(shù)刀刃輕刮，使其產(chǎn)生細(xì)小的瘀血點(diǎn)。將盲腸的擦傷和腹膜的切口露置15分鐘。
15分鐘后，在盲腸的傷處使用測(cè)試物(即p-GlcNAc材料)或者對(duì)照物，用Allis組織鉗將盲腸的擦傷與腹膜的傷口鉗在一起15分鐘。
將盲腸移回腹腔，保持其擦傷部位與腹膜傷口的鄰接?？p合腹部切口，將動(dòng)物從麻醉中喚醒。
術(shù)后14天，將動(dòng)物無(wú)痛致死，診察擦傷部位是否形成術(shù)后傷口粘連。如果存在粘連，將粘連所涉及到的整個(gè)部位(即體壁，測(cè)試物或?qū)φ瘴镆约绑w內(nèi)的器官)從動(dòng)物身上切除。
根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估粘連涉及的程度和堅(jiān)韌程度涉及程度的得分0沒(méi)有粘連1粘連面積＜＝25％2粘連面積＜＝50％3粘連面積＜＝75％4粘連面積＞75％堅(jiān)韌程度的得分0沒(méi)有粘連1粘連可被鈍性的切割分離2粘連可被積極的切割分離3粘連需用鋒利的切割分離其它動(dòng)物模型使用大動(dòng)物豬和馬的腸模型來(lái)評(píng)價(jià)p-GlcNAc防止腹膜粘連的作用。
手術(shù)過(guò)程動(dòng)物采用背臥式并做好無(wú)菌手術(shù)的準(zhǔn)備。沿中線(xiàn)切開(kāi)腹腔，抬高小腸并造成一片2cm×2cm的區(qū)域大面積損傷(用手術(shù)刀刺大約200次)，晾干10分鐘。在損傷部位使用測(cè)試物(即p-GlcNAc材料)或者對(duì)照物，并將損傷部位移回腹腔。在這樣的腸模型上，六個(gè)相鄰四英寸的傷口使粘連極易形成。完成最后一個(gè)傷口后，縫合腹部切口，將動(dòng)物從麻醉中喚醒。
腹膜粘連的分析術(shù)后21天，將動(dòng)物無(wú)痛致死，診察損傷部位，用與Sprague-Dawley大鼠盲腸模型相同的方法來(lái)評(píng)價(jià)傷口粘連的形成。
17.2.結(jié)果一旦有傷口出現(xiàn)，身體就會(huì)通過(guò)一系列復(fù)雜的反應(yīng)來(lái)修復(fù)損傷部位。在痊愈的最后階段，受傷部位形成結(jié)締組織以使身體結(jié)構(gòu)得以再生，并保護(hù)已損傷的部位不再受到傷害。在一些情況下，這種級(jí)聯(lián)反應(yīng)不能正常進(jìn)行，進(jìn)而威脅到生命。
例如，在一個(gè)內(nèi)臟器官的術(shù)后恢復(fù)過(guò)程中，在手術(shù)過(guò)程中產(chǎn)生的血纖維蛋白凝塊可能會(huì)侵入到相鄰器官的表皮，形成允許成纖維細(xì)胞遷移的連接。這種遷移導(dǎo)致了膠原沉積和組織生長(zhǎng)，從而引起器官與器官之間的相互粘接。
這種粘連被叫做術(shù)后傷口粘連。它可以通過(guò)扭曲這個(gè)器官或者其它涉及到的器官而引起疼痛、梗死和功能紊亂。關(guān)節(jié)僵硬、腸道梗死和不育癥通常也與術(shù)后傷口粘連有關(guān)。此外，術(shù)后傷口粘連會(huì)造成周?chē)糠值氖中g(shù)過(guò)程復(fù)雜化，時(shí)間延長(zhǎng)。這一點(diǎn)對(duì)于開(kāi)心手術(shù)和剖腹產(chǎn)等需要附加手術(shù)的過(guò)程來(lái)說(shuō)十分重要。在腹腔、心血管和整形外科等手術(shù)后，傷口粘連的形成十分普遍。
當(dāng)粘連成為一種病理狀態(tài)并且嚴(yán)重地影響到器官的功能時(shí)，一般采用手術(shù)的方法來(lái)消除粘連(使用謹(jǐn)慎的外科技術(shù)切開(kāi)粘連)。1991年，大約實(shí)施了500,000例這樣的粘連分離手術(shù)。但是，這種手術(shù)后，粘連形成的再現(xiàn)率高達(dá)90％，而且沒(méi)有任何技術(shù)或者混合物能夠保證在手術(shù)后不形成新的傷口粘連。
因此，我們得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果十分重要，因?yàn)樗砻鱬-GlcNAc材料可以有效地防止術(shù)后傷口粘連。特別是它還表明，在大鼠和大動(dòng)物模型中，p-GlcNAc的固體和溶液形式均能有效地成為術(shù)后傷口粘連形成的屏障。
其中一個(gè)用來(lái)研究粘連形成的動(dòng)物模型使用了Sprague-Dawley大鼠腹腔周邊腹膜的粘連。與不經(jīng)治療和經(jīng)interCEEDTM(Johnson & Johnson)-目前市場(chǎng)上唯一可買(mǎi)到的此方面的產(chǎn)品-治療的對(duì)照模型相比，用部分脫乙?；鵳-GlcNAc薄膜和p-GlcNAc乳酸鹽凝膠治療均可防止和/或大幅度減少粘連形成的發(fā)生。
在p-GlcNAc乳酸鹽凝膠實(shí)驗(yàn)中一共用了18只大鼠。12只用作對(duì)照，其中6只不經(jīng)治療，6只用interCEEDTM治療；另外6只用含有0.25％p-GlcNAc乳酸鹽，10％丙二醇和水的凝膠治療。如表VIII所示，用p-GlcNAc乳酸鹽凝膠治療的動(dòng)物，其術(shù)后傷口粘連的出現(xiàn)比對(duì)照動(dòng)物有明顯的減少。
表VIII
同樣，用大鼠模型來(lái)測(cè)試部分脫乙?；鵳-GlcNAc薄膜防止術(shù)后傷口粘連出現(xiàn)的能力。研究一共用了22只大鼠。12只用作對(duì)照，其中6只不經(jīng)治療，6只用ihterCEEDTM治療；另外10只分別用1cm×1cm大小的約60％脫乙?；鵳-GlcNAc薄膜治療。如表9所示，用部分脫乙?；鵳-GlcNAc薄膜治療的動(dòng)物其術(shù)后傷口粘連的出現(xiàn)比對(duì)照動(dòng)物有明顯的減少。
表IX
大動(dòng)物的腸模型也用來(lái)測(cè)試p-GlcNAc組合物防止腹膜粘連的能力。用6頭豬和1匹馬對(duì)部分脫乙?；鵳-GlcNAc薄膜和p-GlcNAc乳酸鹽凝膠進(jìn)行了研究。所用的部分脫乙?；鵳-GlcNAc薄膜由2cm×2cm的60％脫乙?；鵳-GlcNAc薄膜組成，p-GlcNAc乳酸鹽凝膠由0.25％p-GlcNAc乳酸鹽，10％丙二醇和水組成。對(duì)照動(dòng)物的受傷部位不經(jīng)任何治療。
對(duì)這些大動(dòng)物的研究結(jié)果表明對(duì)照動(dòng)物的傷處形成多重粘連，并波及到周?chē)M織。使用p-GlcNAc薄膜和凝膠則可以有效地防止粘連的形成。
對(duì)照部位和治療部位的樣品用SEM進(jìn)行分析，結(jié)果表明對(duì)照部位的纖維化數(shù)量比治療部位有所增加。
18.實(shí)例p-GlcNAc材料的生物降解性本實(shí)例表明我們可以制備p-GlcNAc材料，并控制其在體外和體內(nèi)的生物降解性和再吸收速率。
18.1材料和方法p-GlcNAc材料用5.3.2中所敘述的方法，以氫氟酸作為化學(xué)試劑制得樣品1。樣品1為100％乙?；膒-GlcNAc。
樣品3A中的p-GlcNAc原料用5.3.2中所敘述的方法，以氫氟酸作為化學(xué)試劑制得。用5.4中所敘述的方法將p-GlcNAc脫乙?；０裵-GlcNAc用40％的氫氧化鈉在60℃處理30分鐘，得到30％脫乙?；臉悠?A。
樣品4中的p-GlcNAc原料用5.3.2中所敘述的方法，以氫氟酸作為化學(xué)試劑制得。把p-GlcNAc用40％的氫氧化鈉溶液在60℃處理30分鐘，使其脫乙?；?，然后將其制成蒸餾水中的懸浮液，在-20℃冷凍，并將冷凍物冷凍干燥。經(jīng)確定，樣品4也是30％脫乙?；膒-GlcNAc。
腹腔移植模型研究腹腔移植模型所用的是Sprague-Dawley白鼠。將動(dòng)物麻醉，并做好手術(shù)準(zhǔn)備，切開(kāi)腹部的皮膚和肌肉，找到并取出盲腸，將一塊1cm×1cm的p-GlcNAc薄膜置于盲腸上，用尼龍將切口縫合。對(duì)照動(dòng)物的盲腸不經(jīng)p-GlcNAc處理。
移植14-21天后將動(dòng)物重新開(kāi)腹，圖23A-E是移植和體外培植過(guò)程的照片。在體外培植過(guò)程之后，此盲腸樣品即可做組織病理學(xué)實(shí)驗(yàn)。
p-GlcNAc的體外乙?；鶜ざ嗵侨芫附到鈱?shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)是一個(gè)N-乙酰基氨基葡萄糖的比色實(shí)驗(yàn)，具體方法如下所述用吸量管將150μ1反應(yīng)樣品移入13×100mm的一次性玻璃試管，備份。在每個(gè)試管中加入25μl 0.25M磷酸鉀緩沖液(pH7.1)，然后再加入35μl 0.8M硼酸鉀溶液(pH9.8)。立即將試管浸入冰浴中至少2分鐘。將試管移出冰浴，加入1ml新制備的二甲基氨基苯甲醛(DMAB)試劑，旋轉(zhuǎn)樣品，并在37℃培養(yǎng)20分鐘。DMAB試劑是在8g對(duì)二甲基氨基苯甲醛中加入70ml冰醋酸和10ml 11.6N的鹽酸制得。
用下述方法制得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)用0.010M的醋酸鈉緩沖液(pH4.5)將GlcNAc原料液稀釋到0.1mg/ml，分別將0μl，20μl，30μl，90μl或120μl稀釋的GlcNAc溶液加入到一組試管中，再在試管中分別加入150μl，130μl，120μl，60μl或30μl 0.010M的醋酸鈉緩沖液(pH4.5)。然后在每個(gè)試管中加入25μl 0.25M磷酸鉀緩沖液(pH7.1)和35μl 0.8M硼酸鉀緩沖液(pH9.8)。用相同的方法制得一組備份試液。
將試管蓋上，在100℃煮沸3分鐘后，置于冰浴冷卻。將試管從冰浴中取出，在每個(gè)試管中加入1ml新制備的DMAB試劑-制備方法如本節(jié)上文所述-在37℃培養(yǎng)20分鐘。在585nm測(cè)定每個(gè)試管內(nèi)容物的吸光度，其數(shù)值要盡快讀取。將標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)畫(huà)在座標(biāo)紙上，以此來(lái)確定反應(yīng)樣品中N-乙酰基氨基葡萄糖的濃度。圖23是一個(gè)典型的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
18.2結(jié)果我們?cè)囼?yàn)了p-GlcNAc薄膜材料被溶菌酶降解的相對(duì)敏感性，以此來(lái)研究p-GlcNAc材料的體外生物降解性。將p-GlcNAc薄膜與過(guò)量的溶菌酶置于10mM醋酸緩沖液中，用18.1中所描述的實(shí)驗(yàn)來(lái)確定隨后釋放出的N-乙?；被咸烟堑臐舛?。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明部分脫乙酰基薄膜對(duì)于溶菌酶的消化更加敏感(見(jiàn)圖24)，而且，被溶菌酶降解的速率與脫乙酰化的程度直接相關(guān)(圖25比較了50％-25％脫乙?；鵳-GlcNAc薄膜的降解速率)。
另外，我們還測(cè)試了p-GlcNAc材料在體內(nèi)的生物降解性。這些實(shí)驗(yàn)使用腹腔移植模型，測(cè)試了以下三種p-GlcNAc材料測(cè)試的p-GlcNAc材料1)全部乙酰化的p-GlcNAc(樣品1)2)部分脫乙?；鵳-GlcNAc薄膜(樣品3A)3)冷凍干燥的部分脫乙?；鵳-GlcNAc薄膜(樣品4)圖26A-C表明，全部乙?；膒-GlcNAc(樣品1)在21天內(nèi)被再吸收。圖26D-E表明，部分脫乙?；鵳-GlcNAc薄膜(樣品3A)在14天內(nèi)完全被再吸收。冷凍干燥的部分脫乙?；鵳-GlcNAc薄膜(樣品4)在移植21天后仍未被完全再吸收。
組織病理學(xué)分析表明p-GlcNAc被再吸收后，在對(duì)照動(dòng)物和治療動(dòng)物的組織樣品中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)組織病理差異。
19.實(shí)例p-GlcNAc的止血研究本實(shí)驗(yàn)研究了p-GlcNAc材料控制出血的有效性，并將其控制出血的效果與市場(chǎng)上可買(mǎi)到的止血產(chǎn)品進(jìn)行了比較。
19.1材料和方法p-GlcNAc和對(duì)照材料以氫氟酸為化學(xué)試劑，用5.3.2中所敘述的分離技術(shù)和5.4中所敘述的技術(shù)制備部分脫乙?；?約70％)p-GlcNAc薄膜。所用的薄膜為2cm×1cm。用17.1中的方法制得p-GlcNAc乳酸鹽凝膠(4％的p-GlcNAc乳酸鹽，在丙二醇和水中形成)。脾臟和肝臟出血研究的對(duì)照材料是明膠海綿TM(Upjoin Company)；小血管出血研究的對(duì)照材料是明膠海綿TM和阿維烯TM(Medchem Products，Inc.)。
受試動(dòng)物使用新西蘭白兔。在3只動(dòng)物的脾臟造成兩處傷口，肝臟造成一處傷口。在4只動(dòng)物的末端腸系膜動(dòng)脈系統(tǒng)的5條大小相同的血管上造成5處手術(shù)傷口。
手術(shù)準(zhǔn)備用鹽酸克他命和賽拉嗪將動(dòng)物麻醉。動(dòng)物采用背臥式，除去腹部的體毛，用聚維酮碘和70％異丙醇涂擦并覆蓋以做無(wú)菌手術(shù)。
肝臟/脾臟的手術(shù)過(guò)程沿中線(xiàn)切開(kāi)腹部，將肝臟或脾臟取出，并用濕海綿將其覆蓋。用一個(gè)直徑3-4mm的穿孔器在脾臟的一端造成一個(gè)深約2mm的圓形傷口。當(dāng)脾組織被去除時(shí)，用一塊事先稱(chēng)重的4″×4″的海綿紗布吸收傷口的出血約1分鐘。將海綿再次稱(chēng)重以確定這個(gè)傷口的出血量。用治療材料中的一種治療受試動(dòng)物的傷口。記錄下止血時(shí)間和止血前的出血量。
第一個(gè)傷口止血后，用相同的方法造成脾臟的第二個(gè)傷口和肝臟的一個(gè)傷口。
小血管的手術(shù)過(guò)程沿中線(xiàn)切開(kāi)腹部，將小腸取出并使末端腸系膜動(dòng)脈系統(tǒng)暴露。用濕海綿將小腸覆蓋并確認(rèn)5條大小相同的血管。用手術(shù)刀在其中一條血管上造成一個(gè)深約1mm的傷口。用一塊事先稱(chēng)重的4″×4″的海綿紗布吸收傷口的出血約1分鐘。將海綿再次稱(chēng)重以確定這個(gè)傷口的出血量。用治療材料中的一種治療受試動(dòng)物的傷口。記錄下止血時(shí)間和止血前的出血量。
第一個(gè)傷口止血后，用相同的方法造成另外四處傷口。
19.2結(jié)果在大鼠模型的脾臟和肝臟測(cè)試了p-GlcNAc材料控制出血的能力。被測(cè)試的p-GlcNAc材料是1)部分脫乙?；?約70％)p-GlcNAc和2)p-GlcNAc乳酸鹽凝膠(4％的p-GlcNAc乳酸鹽，在丙二醇和水中形成)。把這些p-GlcNAc材料的有效性與明膠海綿TM(Upjohn Company)進(jìn)行了比較。
每種材料測(cè)試3次(脾臟兩次，肝臟一次)。與明膠海綿TM相比，兩種p-GlcNAc材料均在使用后1分鐘內(nèi)有效地控制了出血。
p-GlcNAc材料還有其它的優(yōu)點(diǎn)。特別是在作用過(guò)程中，p-GlcNAc材料不需要使用外力將其控制在作用點(diǎn)，它可以留在體內(nèi)，在2～3周內(nèi)被再吸收(明膠海綿TM沒(méi)有這種性質(zhì))，并與普通和最小侵入的手術(shù)過(guò)程相容。
另外還研究了p-GlcNAc材料控制小血管出血的有效性，并與市場(chǎng)上可買(mǎi)到的止血產(chǎn)品進(jìn)行了比較。
每種材料測(cè)試5次(兩次在一只動(dòng)物上，在另三只動(dòng)物上各一次)。p-GlcNAc薄膜和凝膠都非常容易作用于受傷部位，并在2分鐘內(nèi)控制住了出血。明膠海綿TM和p-GlcNAc材料一樣，也在2分鐘內(nèi)控制了出血，但它必須使用外力將其控制在受傷部位。而膠原纖維材料阿維烯TM則很難使用，并需要超過(guò)5分鐘的時(shí)間才能控制住出血。
因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所測(cè)試的p-GlcNAc材料是一種方便有效的止血?jiǎng)?br> 20.實(shí)例p-GlcNAc藥物運(yùn)送系統(tǒng)本研究表明p-GlcNAc材料可以成功地將抗腫瘤藥物運(yùn)送到惡性皮膚癌和結(jié)腸癌的作用部位，以使其發(fā)揮對(duì)腫瘤的治療作用。
20.1材料和方法p-GlcNAc乳酸鹽藥物運(yùn)送混合物5’-氟尿嘧啶(5’-FU)和p-GlcNAc乳酸鹽的混合物按下述方法制得將0.5ml 5’-FU(50mg/ml)與0.5ml丙二醇混合，再加入2.0ml 4％的p-GlcNAc乳酸鹽，三者混合。所使用的p-GlcNAc乳酸鹽用17.1節(jié)中所敘述的技術(shù)制得。盡管經(jīng)過(guò)劇烈混合，5’-FU仍不能完全溶解在p-GlcNAc乳酸鹽凝膠中。假定其完全混合，最后得到的5’-FU的濃度為6.25mg/ml。
絲裂霉素(Mito)和p-GlcNAc乳酸鹽的混合物按下述方法制得把0.5mgMito(冷凍干燥的粉末)溶于5ml丙二醇中。將0.5ml Mito溶液與0.5ml MPT的4％p-GlcNAc乳酸鹽制劑相混合，使得Mito的最終濃度為0.2mg/ml，p-GlcNAc乳酸鹽的最后濃度為2％。由于Mito很容易溶解在p-GlcNAc乳酸鹽凝膠中，所以這兩種材料具有相容性。
p-GlcNAc薄膜5’-FU運(yùn)送組合物將5’-FU樣品固定在用5.3.2中所敘述的化學(xué)分離法并以氫氟酸作為化學(xué)試劑制得p-GlcNAc薄膜的圓盤(pán)上。每個(gè)圓盤(pán)的直徑為1.5cm。
將0.64ml濃度為50mg/ml的5’-FU溶液與含有8mg純p-GlcNAc的懸浮液相混合，得到高劑量(HD)的圓盤(pán)。將混合物放置幾個(gè)小時(shí)，以促進(jìn)p-GlcNAc對(duì)5’-FU的吸收，然后在55℃干燥3.5小時(shí)。最后得到的HD圓盤(pán)共含有32mg 5’-FU，相當(dāng)于平常對(duì)癌癥病人14天給藥總劑量的兩倍。
用相同方法制得含有低劑量(LD)5’-FU的p-GlcNAc圓盤(pán)，不同的是其中含5’-FU 17mg。相當(dāng)于平常對(duì)癌癥病人14天給藥的總劑量。而且依據(jù)人每公斤體重的5’-FU給藥劑量，此劑量符合給試驗(yàn)小鼠給藥的標(biāo)準(zhǔn)。
受試動(dòng)物為了進(jìn)行5’-FU的研究，在SCID(嚴(yán)重的聯(lián)合免疫缺乏)小鼠的肋腹皮下注射用標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)法得到的HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞(ATCC；每管接種物中含1×105個(gè)細(xì)胞)，從產(chǎn)生HT-29結(jié)腸癌腫瘤。這種注射可以在14～21天后得到可觸知的腫瘤。切下腫瘤并切除周?chē)母瘮〗M織。將HT-29結(jié)腸癌腫瘤切成3×3×3mm的小塊。
腹腔注射標(biāo)準(zhǔn)劑量的三溴乙醇將受試的SCID小鼠麻醉，把一塊HT-29結(jié)腸癌腫瘤塊移植到每只小鼠的盲腸打開(kāi)小鼠的腹腔并找到盲腸，在盲腸上用手術(shù)刀造成一個(gè)小切口，用5.0絲縫合線(xiàn)將一塊3×3×3mm的腫瘤塊縫合到切口上。用Clay Adams纖維縫合腹部。
所有的小鼠被單獨(dú)喂養(yǎng)兩周。兩周后，所有小鼠都很健康，均沒(méi)有出現(xiàn)結(jié)腸阻塞。
第14天，將每只小鼠麻醉，重新打開(kāi)腹腔，測(cè)量生長(zhǎng)腫瘤的長(zhǎng)度和平展尺寸。用p-GlcNAc/抗腫瘤藥物治療腫瘤，或把腫瘤當(dāng)作對(duì)照物。
6只小鼠用作p-GlcNAc乳酸鹽5’-FU的研究，15只用作p-GlcNAc薄膜5’-FU的研究。
為了進(jìn)行絲裂霉素的研究，在9只SCID小鼠的皮下注射接種A431被鱗細(xì)胞皮膚癌細(xì)胞(ATCC；每管接種物中含1×105個(gè)細(xì)胞)，14天內(nèi)在所有小鼠身上得到腫瘤。
治療方法為進(jìn)行p-GlcNAc乳酸鹽5’-FU的研究，每天在動(dòng)物的腫瘤處涂擦含有5’-FU的p-GlcNAc凝膠混合物，并每天測(cè)量腫瘤的大小。對(duì)照動(dòng)物包括只用p-GlcNAc而不用5’-FU治療和不接受任何治療的動(dòng)物。
為進(jìn)行p-GlcNAc薄膜5’-FU的研究，當(dāng)HT-29結(jié)腸腫瘤在SCID小鼠的結(jié)腸生長(zhǎng)14天后，將含有藥物的p-GlcNAc薄膜移植到腫瘤表面。移植14天后，將小鼠殺死。在移植含有藥物的p-GlcNAc薄膜前當(dāng)天即第0天和第14天移植實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)測(cè)量腫瘤的體積。對(duì)照動(dòng)物包括只用p-GlcNAc薄膜而不用5’-FU治療和不接受任何治療的動(dòng)物。另外，還有兩只動(dòng)物每天全身注射相當(dāng)于HD和LD劑量的5’-FU。
為進(jìn)行p-GlcNAc乳酸鹽Mito的研究，與在p-GlcNAc乳酸鹽5’-FU的研究中一樣，有3只動(dòng)物使用含有Mito的混合物進(jìn)行治療。另外，3只動(dòng)物只用p-GlcNAc而不用Mito治療，2只動(dòng)物不接受任何治療，1只動(dòng)物用丙二醇治療。
20.2結(jié)果20.2.1p-GlcNAc乳酸鹽5’-FU如20.1中所述，我們進(jìn)行了p-GlcNAc乳酸鹽5’-FU藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)對(duì)腫瘤大小的影響的實(shí)驗(yàn)。
我們測(cè)量了每個(gè)腫瘤最大的長(zhǎng)、寬尺寸，并用這些尺寸計(jì)算了最具代表性的面積，其數(shù)值見(jiàn)表X
表X動(dòng)物號(hào)治療方法 腫瘤大小(cm2)0天4天11天15天1 CL+5’-FU 63 90 168 1562 CL+5’-FU 48 56 70 883 CL對(duì)照21 36 88 1084 CL對(duì)照58 110150 195,305 不經(jīng)治療的對(duì)照40 64 132 2346 不經(jīng)治療的對(duì)照28 42 100 132大小增加的百分比0天4天11天15天1 CL+5’-FU 0 43 167 1472 CL+5’-FU 0 17 47 843 CL對(duì)照0 71 319 4144 CL對(duì)照0 90 160 2895 不經(jīng)治療的對(duì)照0 61 232 4886 不經(jīng)治療的對(duì)照0 48 253 366p-GlcNAc乳酸鹽5’-FU治療的動(dòng)物與對(duì)照動(dòng)物進(jìn)行比較的數(shù)據(jù)見(jiàn)圖27-28。表X和圖27-28所歸納的數(shù)據(jù)表明與對(duì)照相比，用含有5’-FU的p-GlcNAc乳酸鹽凝膠治療小鼠HT-29皮下腫瘤，可以顯著地延緩其生長(zhǎng)速度。腫瘤的生長(zhǎng)比p-GlcNAc乳酸鹽凝膠對(duì)照延緩了2.5倍，比不經(jīng)治療的對(duì)照延緩了4倍。
20.2.2p-GlcNAc乳酸鹽Mito如20.1中所述，我們進(jìn)行了p-GlcNAc乳酸鹽Mito藥物運(yùn)送系統(tǒng)對(duì)腫瘤大小的影響的實(shí)驗(yàn)。
我們測(cè)量了每個(gè)腫瘤最大的長(zhǎng)、寬尺寸，并用這些尺寸計(jì)算了最具代表性的面積，其數(shù)值見(jiàn)表XI。
表XI動(dòng)物號(hào) 治療方法腫瘤大小(cm2)0天3天5天 8天1pGlcN-L+Mito 23 23 42 492pGlcN-L+Mito 23 16 54 633pGlcN-L+Mito 72 99 極限極限4pGlcN-L對(duì)照27 54 140 2035pGlcN-L對(duì)照30 54 96 1406pGlcN-L對(duì)照30 58 200 2217不經(jīng)治療的對(duì)照 48 75 126 3008不經(jīng)治療的對(duì)照 44 80 207 死亡9丙二醇對(duì)照 49 86 180 216大小增加的百分比0天3天5天 8天1pGlcN-L+Mito 0 0 83 1352pGlcN-L+Mito 0 -30135 1743pGlcN-L+Mito 0 38 極限極限4pGlcN-L對(duì)照0 100419 6525pGlcN-L對(duì)照0 80 220 3676pGlcN-L對(duì)照0 93 567 6377不經(jīng)治療的對(duì)照 0 56 163 5258不經(jīng)治療的對(duì)照 0 82 370 死亡9丙二醇對(duì)照 0 76 267 341p-GlcNAc乳酸鹽Mito治療的動(dòng)物與對(duì)照動(dòng)物進(jìn)行比較的數(shù)據(jù)見(jiàn)圖29-30。表XI和圖29-30所歸納的數(shù)據(jù)清楚表明用含有Mito的p-GlcNAc乳酸鹽凝膠治療小鼠腫瘤，可以顯著地延緩其生長(zhǎng)速度。腫瘤的生長(zhǎng)比p-GlcNAc乳酸鹽對(duì)照延緩了4倍，比不經(jīng)治療的對(duì)照延緩了4倍。
20.2.3p-GlcNAc薄膜5’-FU另外，如20.1中所述，我們還進(jìn)行了p-GlcNAc薄膜5’-FU藥物運(yùn)送系統(tǒng)對(duì)皮膚癌腫瘤大小的影響的實(shí)驗(yàn)。
表12歸納了研究中所得到的腫瘤體積的數(shù)據(jù)，包括使用不同的治療方法引起的體積變化百分比。假設(shè)腫瘤為圓柱形，它的體積由所測(cè)定的長(zhǎng)和寬決定，并用公式V＝πr2l計(jì)算得出。其中半徑r為0.5倍的寬，l為長(zhǎng)。
表XII p-GlcNAc薄膜+5’-氟尿嘧啶的動(dòng)物數(shù)據(jù)動(dòng)物號(hào) 治療方法 治療前腫瘤治病后腫瘤 變化率 備注體積(mm3)體積(mm3)A.高劑量5’-FU1高劑量5’-FU 393 283-28.02高劑量5’-FU 785 308-60.83高劑量5’-FU 98.1 62.8 -36.04高劑量5’-FU 785 550-30.0平均每只動(dòng)物 ……………………………………………………-38.7B.低劑量5’-FU5低劑量5’-FU 603 170-71.96低劑量5’-FU 603 6152.07低劑量5’-FU 269 198-26.08低劑量5’-FU 169 22633.3平均每只動(dòng)物……………………………………………………-15.7C.p-GlcNAc對(duì)照9p-GlcNAc對(duì)照 170 550320.010 p-GlcNAc對(duì)照 第12天死亡平均每只動(dòng)物…………………………………………………… 320.0D.不經(jīng)治療的對(duì)照11 不經(jīng)治療402 864215.0充滿(mǎn)腫瘤12 不經(jīng)治療21.2 5722700.0 充滿(mǎn)腫瘤平均每只動(dòng)物 ……………………………………………………1457.0E.靜注5’-FU對(duì)照13 低劑量 402 703 175.014 低劑量 402 402 0.0 第13天死亡15 高劑量 402 132 -67.0第13天死亡圖31中歸納了表XII中的一部分?jǐn)?shù)據(jù)， 這些數(shù)據(jù)有力地說(shuō)明，用高劑量(HD)的含有5’-FU的p-GlcNAc薄膜治療的腫瘤不僅停止了生長(zhǎng)，而且在所有病例中都有顯著的減小。用低劑量(LD)聚合體材料治療則使病情穩(wěn)定，并使腫瘤略微減小。相對(duì)而言，對(duì)照動(dòng)物的腫瘤則繼續(xù)迅速增大。有一點(diǎn)值得注意，3只通過(guò)全身注射5’-FU治療的對(duì)照動(dòng)物中，有2只在研究中死亡。這表明通過(guò)p-GlcNAc聚合體選擇性運(yùn)送5’-FU到作用部位可以有效地使動(dòng)物免除疾病，而全身運(yùn)送相同劑量的5’-FU則是致命的。
20.3結(jié)論本節(jié)顯示的數(shù)據(jù)有力地說(shuō)明，抗腫瘤藥物的選擇性運(yùn)送可以積極有效地延緩和逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長(zhǎng)。我們用制得的有p-GlcNAc乳酸鹽和p-GlcNAc薄膜兩種形式的p-GlcNAc藥物運(yùn)送組合物，并用了兩種不同的抗腫瘤藥-5’-FU和Mito，從而得到了以上成功的結(jié)果。因此，本發(fā)明的p-GlcNAc藥物運(yùn)送系統(tǒng)具有抗腫瘤活性。例如，它可以用于選擇性地運(yùn)送藥物到腫瘤細(xì)胞的作用部位。
很明顯，這里提出的本發(fā)明的許多修正和變化并沒(méi)有離開(kāi)本發(fā)明的精神和范圍。以上所敘述的具體實(shí)施方案只以實(shí)例的形式給出，而本發(fā)明則由所附權(quán)利要求書(shū)的條款所限定。
權(quán)利要求
1.一類(lèi)分離的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺(p-GlcNAc)，此葡糖胺包含有4,000到150,000個(gè)通過(guò)β-1→4構(gòu)型共價(jià)連接的N-乙酰葡糖胺單糖，不含有蛋白質(zhì)，也基本上不含其它的有機(jī)和無(wú)機(jī)雜質(zhì)，其分子重量為800,000至3千萬(wàn)道爾頓。
2.權(quán)利要求1的分離的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺(p-GlcNAc)，其特征在于這類(lèi)化合物包含有4,000到15,000個(gè)通過(guò)β-1→4構(gòu)型共價(jià)連接的N-乙酰葡糖胺單糖，其分子重量為800,000至3百萬(wàn)道爾頓。
3.權(quán)利要求1或2的分離的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺(p-GlcNAc)，其特征在于這類(lèi)化合物是一種細(xì)胞培養(yǎng)基基質(zhì)。
4.權(quán)利要求1或2的分離的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺(p-GlcNAc)，其特征在于這類(lèi)化合物是片狀、線(xiàn)狀、束狀、微球體、微球、薄膜、纖維、粉末或者海綿。
5.權(quán)利要求1或2的分離的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺(p-GlcNAc)，其特征在于這類(lèi)化合物是一種三維基質(zhì)成型物。
6.權(quán)利要求1或2的分離的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺(p-GlcNAc)，其中至少有一個(gè)N-乙酰葡糖胺單糖是脫乙?；?。
7.權(quán)利要求6的分離的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺(p-GlcNAc)，其中至少有25％至75％的N-乙酰葡糖胺單糖是脫乙?；?。
8.權(quán)利要求7的分離的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺(p-GlcNAc)，其中至少有70％的N-乙酰葡糖胺單糖是脫乙酰化的。
9.權(quán)利要求6的分離的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺(p-GlcNAc)，其特征在于這類(lèi)化合物是片狀、線(xiàn)狀、束狀、微球體、微球、薄膜、纖維、粉末或者海綿。
10.權(quán)利要求6的分離的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺(p-GlcNAc)，其特征在于這類(lèi)化合物是一種三維基質(zhì)成型物。
11.權(quán)利要求1或2的分離的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺(p-GlcNAc)，其中至少有一個(gè)單糖含有一個(gè)硫酸根、一個(gè)磺?；?、一個(gè)氧?；?、一個(gè)氨?；?、一個(gè)烷氧基、一個(gè)氮烷基、一個(gè)氮亞烷基或者一個(gè)氮亞芳基。
12.權(quán)利要求1或2的分離的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺(p-GlcNAc)，其中至少有一個(gè)單糖是一個(gè)磷酸化衍生物。一個(gè)硝化衍生物、一個(gè)堿衍生物或者一個(gè)脫氧鹵素衍生物。
13.權(quán)利要求1或2的分離的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺(p-GlcNAc)，其中至少有一個(gè)單糖形成一種鹽或者一種金屬螯合物。
14.權(quán)利要求1或2的分離的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺(p-GlcNAc)，其特征在于這類(lèi)化合物是從微藻原料分離得到。
15.權(quán)利要求14的分離的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺(p-GlcNAc)，其中微藻原料是一種硅藻原料。
16.權(quán)利要求15的分離的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺(p-GlcNAc)，其中的硅藻屬于Thallasiosira屬。
17.權(quán)利要求16的分離的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺(p-GlcNAc)，其中的Thallasiosira屬硅藻是Thallasiosira-fluviatilis或Thallasiosiraweissflogii。
18.一類(lèi)分離的聚-β-1→4-葡糖胺，此葡糖胺包含有4,000到150,000個(gè)通過(guò)β-1→4構(gòu)型共價(jià)連接的葡糖胺單糖，不含有蛋白質(zhì)，也基本不含其它的有機(jī)和無(wú)機(jī)雜質(zhì)，其分子重量為640,000至2千4百萬(wàn)道爾頓。
19.權(quán)利要求18的分離的聚-β-1→4-葡糖胺，其特征在于這類(lèi)化合物包含有4,000到15,000個(gè)通過(guò)β-1→4構(gòu)型共價(jià)連接的葡糖胺單糖，其分子重量為640,000至240萬(wàn)道爾頓。
20.一類(lèi)分離的聚-β-1→4-葡糖胺，該葡糖胺包含有4,000到150,000個(gè)通過(guò)β-1→4構(gòu)型共價(jià)連接的葡糖胺單糖，不含有蛋白質(zhì)，也基本不含其它的有機(jī)和無(wú)機(jī)雜質(zhì)，其中至少有一個(gè)葡糖胺單糖是乙?；?。
21.權(quán)利要求20的分離的聚-β-1→4-葡糖胺，其中至少有25％至75％的葡糖胺單糖是乙?；摹?br> 22.權(quán)利要求21的分離的聚-β-1→4-葡糖胺，其中至少有30％的葡糖胺單糖是乙?；?。
23.權(quán)利要求18或20的分離的聚-β-1→4-葡糖胺，其特征在于這類(lèi)化合物是墊狀、帶狀、繩狀、微球體、有孔小珠、薄膜、纖維、粉末或者海綿。
24.權(quán)利要求18或20的分離的聚-β-1→4-葡糖胺，其特征在于這類(lèi)化合物是一種三維基質(zhì)成型物。
25.權(quán)利要求18或20的分離的聚-β-1→4-葡糖胺，其中至少有一個(gè)單糖含有一個(gè)硫酸根、一個(gè)磺酰基、一個(gè)氧酰基、一個(gè)氮酰基、一個(gè)烷氧基、一個(gè)氮烷基、一個(gè)氮亞烷基或者一個(gè)氮亞芳基。
26.權(quán)利要求18或20的分離的聚-β-1→4-葡糖胺，其中至少有一個(gè)單糖是一個(gè)磷酸化衍生物。一個(gè)硝化衍生物、一個(gè)堿衍生物或者一個(gè)脫氧鹵素衍生物。
27.權(quán)利要求18或20的分離的聚-β-1→4-葡糖胺，其中至少有一個(gè)單糖形成一種鹽或者一種金屬螯合物。
28.分離這類(lèi)聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺(p-GlcNAc)的方法，此葡糖胺包含有4,000到150,000個(gè)通過(guò)β-1→4構(gòu)型共價(jià)連接的N-乙酰葡糖胺單糖，不含有蛋白質(zhì)，也基本不含其它的有機(jī)和無(wú)機(jī)雜質(zhì)，其分子重量為800,000至3千萬(wàn)道爾頓，該方法包括(a)對(duì)含有細(xì)胞體和聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺纖維的微藻施加長(zhǎng)時(shí)間的機(jī)械力，使細(xì)胞體足以與聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺纖維分離，(b)將聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺纖維從細(xì)胞體中分離出來(lái)，(c)從分離的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺纖維中除去所有的蛋白質(zhì)和基本除去其它有機(jī)和無(wú)機(jī)的雜質(zhì)，這樣可分離得到這一類(lèi)聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺。
29.權(quán)利要求28的方法，其中，分離得到的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺(p-GlcNAc)含有4,000到15,000個(gè)N-乙酰葡糖胺單糖，其分子重量為800,000至3百萬(wàn)道爾頓。
30.權(quán)利要求28的方法，其中的機(jī)械力是一種剪切力或者是一種切割力。
31.權(quán)利要求28的方法，其中的微藻是一種硅藻。
32.權(quán)利要求31的方法，其中的硅藻屬于Thallasiosira屬。
33.權(quán)利要求32的方法，其中的Thallasiosira屬硅藻是Thallasiosira-fluviatilis或Thallasiosira weissflogii。
34.分離這類(lèi)聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺(p-GlcNAc)的方法，該葡糖胺含有4,000到150,000個(gè)通過(guò)β-1→4構(gòu)型共價(jià)連接的N-乙酰葡糖胺單糖，不含有蛋白質(zhì)，也基本不含其它的有機(jī)和無(wú)機(jī)雜質(zhì)，其分子重量為800,000至3千萬(wàn)道爾頓，該方法包括(a)用能削弱硅藻細(xì)胞壁的化學(xué)品長(zhǎng)時(shí)間處理含有細(xì)胞體和聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺纖維的微藻足以使聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺纖維從細(xì)胞體中釋放出來(lái)；(b)將多聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺纖維從細(xì)胞體中分離出來(lái)；(c)從分離的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺纖維中除去所有的蛋白質(zhì)和基本除去其它有機(jī)和無(wú)機(jī)的雜質(zhì)，這樣分離得到這類(lèi)聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺。
35.權(quán)利要求34的方法，其中，分離得到的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺(p-GlcNAc)含有4,000到15,000個(gè)N-乙酰葡糖胺單糖，其分子重量為800,000至3百萬(wàn)道爾頓。
36.權(quán)利要求34的方法，其中，能削弱硅藻細(xì)胞壁的化學(xué)品是氫氟酸。
37.權(quán)利要求34的方法，還包括在(c)步驟之前，中和分離的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺纖維。
38.權(quán)利要求37的方法，還包括在(c)步驟之后(d)將這類(lèi)分離的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺置于一個(gè)堿性pH的環(huán)境中。
39.權(quán)利要求38的方法，還包括(e)在這類(lèi)分離的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺中加入一種藥物，使藥物和這類(lèi)化合物處于這種堿性pH的環(huán)境中。(f)降低堿性環(huán)境的pH值，使這種藥物能夠被包封在這類(lèi)聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺之內(nèi)。
40.權(quán)利要求34的方法，其中的微藻是一種硅藻。
41.權(quán)利要求40的方法，其中的硅藻屬于Thallasiosira屬。
42.權(quán)利要求41的方法，其中的Thallasiosira屬硅藻是Thallasiosira-fluviatilis或Thallasiosira weissflogii。
43.分離這類(lèi)聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺(p-GlcNAc)的方法，該葡糖胺含有4,000到150,000個(gè)通過(guò)β-1→4構(gòu)型共價(jià)連接的N-乙酰葡糖胺單糖，不含有蛋白質(zhì)，也基本不含其它的有機(jī)和無(wú)機(jī)雜質(zhì)，其分子量為800,000至3千萬(wàn)道爾頓，此方法包括(a)用能合成聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺纖維的生物試劑對(duì)含有細(xì)胞體和聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺纖維的微藻進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的處理，足以使聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺纖維從細(xì)胞體中釋放出來(lái)；(b)將聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺纖維從細(xì)胞體中分離出來(lái)；和(c)從分離的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺纖維中除去所有的蛋白質(zhì)和基本除去其它有機(jī)和無(wú)機(jī)的雜質(zhì)，這樣分離得到這類(lèi)聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺。
44.權(quán)利要求43的方法，其中，分離得到的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺(p-GlcNAc)含有4,000到15,000個(gè)N-乙酰葡糖胺單糖，其分子重量為800,000至3百萬(wàn)道爾頓。
45.權(quán)利要求43的方法，其中的生物試劑是多氧菌素D。
46.權(quán)利要求43的方法，其中的微藻是一種硅藻。
47.權(quán)利要求46的方法，其中的硅藻屬于Thallasiosira屬。
48.權(quán)利要求47的方法，其中的Thallasiosira屬硅藻是Thallasiosira-fluviatilis或Thallasiosira weissflogii。
49.通過(guò)權(quán)利要求28、29、34、35、43或44的方法分離得到的這類(lèi)聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺(p-GlcNAc)。
50.權(quán)利要求39所要求的方法制法得的藥物/聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺包囊。
51.分離的藥物/聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺包囊，此包囊包括用權(quán)利要求1的這類(lèi)聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺包封的藥物。
52.權(quán)利要求51的分離的藥物/聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺包囊，其中，被包封的藥物是一種抗腫瘤藥。
53.權(quán)利要求52的分離的藥物/聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺包囊，其中，抗腫瘤藥物是5’-氟尿嘧啶、絲裂霉素、順鉑、紫杉醇、阿霉素、放線(xiàn)霉素、一種爭(zhēng)光霉素、一種道諾霉素或一種間霉素抗腫瘤藥。
54.權(quán)利要求51的分離的藥物/聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺包囊，其中，被包封的藥物是一種抗生素類(lèi)，一種抗炎類(lèi)，一種抗真菌類(lèi)，一種抗原生動(dòng)物類(lèi)或一種殺精子類(lèi)藥物。
55.分離的藥物/聚-β-1→4-葡糖胺包膠，該包囊包括用權(quán)利要求20的這類(lèi)聚-β-1→4-葡糖胺包封的藥物。
56.權(quán)利要求55的分離的藥物/聚-β-1→4-葡糖胺包囊，其中，被包封的藥物是一種抗腫瘤藥。
57.權(quán)利要求56的分離的藥物/聚-β-1→4-葡糖胺包囊，其中，抗腫瘤藥物是5’-氟尿嘧啶、絲裂霉素、順鉑、紫杉醇、阿霉素、放線(xiàn)霉素、一種爭(zhēng)光霉素、一種道諾霉素或一種間霉素抗腫瘤藥。
58.權(quán)利要求55的分離的藥物/聚-β-1→4-葡糖胺包囊，其中，被包封的藥物是一種抗生素類(lèi)，一種抗炎類(lèi)，一種抗真菌類(lèi)，一種抗原生動(dòng)物類(lèi)或一種殺精子類(lèi)藥物。
59.分離的雜混組合物，此組合物包括與一類(lèi)膠原交聯(lián)的權(quán)利要求1或2的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺。
60.分離的雜混組合物，此組合物包括與一類(lèi)膠原交聯(lián)的權(quán)利要求6的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺。
61.分離的雜混組合物，此組合物包括與一類(lèi)膠原交聯(lián)的權(quán)利要求11的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺。
62.分離的雜混組合物，此組合物包括與一類(lèi)膠原交聯(lián)的權(quán)利要求12的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺。
63.分離的雜混組合物，此組合物包括與一類(lèi)膠原交聯(lián)的權(quán)利要求13的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺。
64.分離的雜混組合物，此組合物包括與一類(lèi)膠原交聯(lián)的權(quán)利要求18或19的聚-β-1→4-葡糖胺。
65.分離的雜混組合物，此組合物包括與一類(lèi)膠原交聯(lián)的權(quán)利要求20的聚-β-1→4-葡糖胺。
66.分離的雜混組合物，此組合物包括與一類(lèi)膠原交聯(lián)的權(quán)利要求25的聚-β-1→4-葡糖胺。
67.分離的雜混組合物，此組合物包括與一類(lèi)膠原交聯(lián)的權(quán)利要求26的聚-β-1→4-葡糖胺。
68.分離的雜混組合物，此組合物包括與一類(lèi)膠原交聯(lián)的權(quán)利要求27的聚-β-1→4-葡糖胺。
69.權(quán)利要求6的分離的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺，其中，至少有一個(gè)多肽通過(guò)官能鍵與一個(gè)脫乙?；鶈翁窍噙B。
70.權(quán)利要求69的分離的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺，其中的多肽通過(guò)共價(jià)鍵與一個(gè)脫乙?；鶈翁窍噙B。
71.權(quán)利要求69的分離的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺，其中的多肽通過(guò)非共價(jià)鍵與一個(gè)脫乙?；鶈翁窍噙B。
72.權(quán)利要求69的分離的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺，其中的多肽是一種生長(zhǎng)因子，激素，多肽識(shí)別序列，層粘連蛋白，整合素或細(xì)胞粘附分子。
73.權(quán)利要求18或19的分離的聚-β-1→4-葡糖胺，其中，至少有一個(gè)多肽通過(guò)官能鍵與一個(gè)葡糖胺單糖相連。
74.權(quán)利要求73的分離的聚-β-1→4-葡糖胺，其中的多肽通過(guò)共價(jià)鍵與一個(gè)葡糖胺單糖相連。
75.權(quán)利要求73的分離的聚-β-1→4-葡糖胺，其中的多肽通過(guò)非共價(jià)鍵與一個(gè)葡糖胺單糖相連。
76.權(quán)利要求73的分離的聚-β-1→4-葡糖胺，其中的多肽是一種生長(zhǎng)因子，激素，多肽識(shí)別序列，層粘連蛋白，整合素或細(xì)胞粘附分子。
77.權(quán)利要求20的分離的聚-β-1→4-葡糖胺，其中，至少有一個(gè)多肽通過(guò)官能鍵與一個(gè)葡糖胺單糖相連。
78.權(quán)利要求77的分離的聚-β-1→4-葡糖胺，其中的多肽通過(guò)共價(jià)鍵與一個(gè)葡糖胺單糖相連。
79.權(quán)利要求77的分離的聚-β-1→4-葡糖胺，其中的多肽通過(guò)非共價(jià)鍵與一個(gè)葡糖胺單糖相連。
80.權(quán)利要求77的分離的聚-β-1→4-葡糖胺，其中的多肽是一種生長(zhǎng)因子，激素，多肽識(shí)別序列，層粘連蛋白，整合素或細(xì)胞粘附分子。
81.一類(lèi)分離的細(xì)胞/聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺包囊，此包囊包括用權(quán)利要求1的這類(lèi)聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺包封的細(xì)胞。
82.權(quán)利要求81的分離的細(xì)胞/聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺包囊，其中，這類(lèi)包囊被裝在熱塑性小盒中。
83.一類(lèi)分離的細(xì)胞/聚-β-1→4-葡糖胺包囊，此包囊包括用權(quán)利要求20的聚-β-1→4-葡糖胺包封的細(xì)胞。
84.權(quán)利要求83的分離的細(xì)胞/聚-β-1→4-葡糖胺包囊，其中，這類(lèi)包囊被裝在熱塑性小盒中。
85.藥物控釋的方法，該方法包括給病人施用通過(guò)官能鍵與相同的多種多肽相連的，權(quán)利要求65的分離的聚-β-1→4-葡糖胺，以使給藥后，相連的多肽隨著聚-β-1→4-乙酰葡糖胺的降解而被釋放出來(lái)。
86.權(quán)利要求81的方法，其中，相同的多種多肽通過(guò)共價(jià)鍵與聚-β-1→4-乙酰葡糖胺相連。
87.權(quán)利要求81的方法，其中，相同的多種多肽通過(guò)非共價(jià)鍵與聚-β-1→4-乙酰葡糖胺相連。
88.分子藥物緩釋的方法，此方法包括給病人施用權(quán)利要求51或55的藥物/聚-β-1→4-乙酰葡糖胺包囊，以使給藥后，藥物隨著聚-β-1→4-乙酰葡糖胺的降解而被緩慢釋放至病人的體內(nèi)。
89.權(quán)利要求1的分離的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺(p-GlcNAc)，其中這類(lèi)葡糖胺是一類(lèi)聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺乳酸鹽。
90.權(quán)利要求18或20的分離的聚-β-1→4-葡糖胺，其中這類(lèi)葡糖胺是一類(lèi)聚-β-1→4-葡糖胺乳酸鹽。
91.減少術(shù)后傷口粘連的方法，此方法包括手術(shù)前，給病人施用權(quán)利要求85的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺乳酸鹽，以使手術(shù)后，病人的損傷組織的數(shù)量比沒(méi)有施用這類(lèi)化合物的病人有所減少，這樣就減少了術(shù)后傷口粘連的出現(xiàn)。
92.減少術(shù)后傷口粘連的方法，此方法包括手術(shù)前，給病人施用權(quán)利要求86的聚-β-1→4-葡糖胺乳酸鹽，以使手術(shù)后，病人的損傷組織的數(shù)量比沒(méi)有施用這類(lèi)化合物的病人有所減少，這樣就減少了術(shù)后傷口粘連的出現(xiàn)。
93.減少術(shù)后傷口粘連的方法，此方法包括手術(shù)以后，給病人施用權(quán)利要求85的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺乳酸鹽，在損傷組織和未損傷組織之間形成一道物理屏障，這樣術(shù)后傷口粘連的出現(xiàn)比沒(méi)有施用這類(lèi)化合物的病人有所減少。
94.減少術(shù)后傷口粘連的方法，此方法包括手術(shù)以后，給病人施用權(quán)利要求86的聚-β-1→4-N-乙酰葡糖胺乳酸鹽，在損傷組織和未損傷組織之間形成一道物理屏障，這樣術(shù)后傷口粘連的出現(xiàn)比沒(méi)有施用這類(lèi)化合物的病人有所減少。
全文摘要
敘述了一類(lèi)聚-β-1→4-N-乙?；咸前?p-GlcNAc)聚糖類(lèi)和它們的衍生物的制備和純化的方法。通過(guò)本法制得的聚糖不含蛋白、基本上不含單個(gè)氨基酸和其它有機(jī)和無(wú)機(jī)物雜質(zhì)。商業(yè)上這些p-GlcNAc多糖被生物醫(yī)學(xué)、制藥工業(yè)和美容工業(yè)利用，用于藥物緩釋系統(tǒng)、細(xì)胞膠丸系統(tǒng)和預(yù)防術(shù)后粘連的治療等。下圖表示100％p-GlcNAc的化學(xué)結(jié)構(gòu)，這里“n”大約是4000到150,000的一個(gè)整數(shù)。
文檔編號(hào)A61P7/04GK1142833SQ9419491
公開(kāi)日1997年2月12日 申請(qǐng)日期1994年12月1日 優(yōu)先權(quán)日1993年12月1日
發(fā)明者J·N·沃納吉斯, S·芬基爾斯坦, E·R·帕里澤, M·赫頓 申請(qǐng)人:海洋聚合物技術(shù)公司