專利名稱：用于感染或炎癥病灶位點造影的標記趨化肽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及趨化肽和它們在檢測個體中感染和炎癥位點及治療組織損傷中的應用。
相關技術的描述對各種形式的組織損傷應答而發(fā)生炎癥。這種組織損傷可以是由微生物侵入、自身免疫過程、組織或器官同種移植排斥、或諸如熱、冷、放射能量、電或化學刺激、或機械創(chuàng)傷的傷害性外部影響造成的。無論其原因和軀體位點，隨后的炎癥反應是很相似的，由一系列復雜的功能和細胞調節(jié)組成，包括微循環(huán)、液體運動的變化、及炎癥細胞(白細胞)的流入和激活。這種應答方式構成了宿主抗感染的固有防衛(wèi)機制的重要部分，雖然這帶來了由炎癥過程自身造成進一步組織損傷的“代價”，但它最終促進了隨后的修復過程。
當微生物感染時或受到某種形式的組織損傷后，會合成可溶性化學物質，它們引發(fā)炎癥的級聯反應，包括一系列復雜的過程。炎癥位點血流增加，并因毛細血管通透性增加，有液體從血液滲出。在受傷位點的這種液體滲出包括正常時離開毛細血管速度相當慢的血漿蛋白。通過被動或主動過程，白細胞也通過毛細血管進入炎癥位點。炎癥細胞滲出物起始主要由多形核(PMN)白細胞(也稱為中性白細胞或粒細胞)組成。隨后，在炎癥浸潤物中可見單核細胞、淋巴細胞和漿細胞。
感染和炎癥位點的鑒別和鑒定對人類醫(yī)學和獸醫(yī)中的診斷很重要。在早期局部感染時，常常需要搜尋個體中的“隱藏的炎癥位點”，其臨床癥狀無特異性，只是發(fā)熱和體重減輕。與此相似，在患自身免疫疾病如類風濕性器節(jié)炎的病人中，或在排斥組織或器官同種移植物的受體中，確定炎癥位點、限定其范圍、及在治療開始后監(jiān)視其變化的能力對有效的臨床醫(yī)護都很重要。
因而，已付出很大努力并開發(fā)了許多技術以確定炎癥位點并估計炎癥過程的程度，這一點就不足為奇了。這些技術包括傳統(tǒng)X-射線技術、CAT掃描、和各種放射核掃描。(Sutton，A Textbookof Radiology and Imaging，3rd Ed.，Churchill Livingston(1980)；Maysey et al，Clinical Nuclear Medicine Ed.，W.B.Sanders(1983))。已使用的放射核掃描技術的例子包括1.67Ga(鎵)，注射后其與漿蛋白結合并趨于定位在慢性炎癥位點；
2.111In(銦)標記的粒細胞，當重新注入宿主時，其在炎癥位點累積；3.放射標記的螯合物，其進入細胞外液中然后在液體聚積點累積；和4.鉈掃描或所謂的首過放射核素血管造影，以估測血流增加的面積。
傳統(tǒng)的核醫(yī)學技術使用下列放射性藥物用于感染炎癥造影67Ga檸檬酸鹽，111In標記白細胞，99mTc標記的白細胞，和111In標記的人多克隆IgG。雖然這些試劑中每種在特定情況下可產生有用的結果，但仍有相當大的待改進之處。
67Ga檸檬酸鹽在機制上可與111In-IgG(Mw150KD)一起歸類為標記蛋白，因為靜脈注射后67Ga檸檬酸鹽立即轉而與血漿中的循環(huán)運鐵蛋白(MW100KD)和乳鐵蛋白(MW～100KD)螯合。用標記蛋白進行炎癥造影是其在炎癥位點的積累率和從正常組織清除的速率不同所造成的(Juweid，M.，et al.，Eur.J.Nucl，Med，19159-165(1992))。由于從正常組織優(yōu)先洗出和血液清除的原因，用這些試劑進行損傷檢測的最佳時間一般是注射后≥24小時。
Thakur等人廣泛分析和討論了基于中性白細胞體外標記的方法(Sem.Nucl.Med.14107-117(1984))。在此方法中，個體的中性白細胞用γ發(fā)射性放射核素(選擇111In核素)標記。這樣標記的中性白細胞可用于體內動力學研究和炎癥病灶的造影。這一技術的一個缺點是在體外標記前需要取出并分離中性白細胞。
白細胞產生許多介質控制炎癥反應的范圍和持續(xù)時間，并在其表面帶有許多受體，可與這些化學介質和存在于炎癥液中的其他蛋白結合并反應。這種受體一介質相互作用對控制炎癥位點白細胞功能很重要。炎癥介質中有趨化因子(也稱為化學引誘物)，其具有誘導PMN和巨噬細胞定向遷移和活化的能力(綜述和討論見Roitt等等，Immunology，Gower Medical Pub.，London(1985))。
111In標記的白細胞已是很成功的造影劑，但需要較長的準備時間和血液操作。研究時間還要進一步延長，因為放射標記細胞注射后需要數小時去定位，因為它們必須先尋找趨化信號，然后遷移到炎癥位點。另外，劑量測定法方面的考慮限制了可施用的放射活性量，常導致造影質量差。雖然可使用劑量高得多的99mTc標記白細胞，但放射活性在非靶標器官中的積累限制了其普遍實用性。
通過發(fā)展低分子量放射藥物可顯著降低從注射到損傷檢測間的時間，這種放射藥物與循環(huán)炎癥細胞以及已存在于炎癥位點的細胞結合。具有這些特征的候選分子包括IL-8(Baggiolini，M.等，J.Clin.Invest.84(4)1045-1049(1989))，血小板因子-4(Deuel，T.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1)4584-4587(1981)和肽N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(For-MLF)(MW437)(Showell，H.J.等，J.Fxper，Med.1431154-1169(1976)；Schiffmann，E.等，Proe.Natl Acad.Sci.USA 721059-1062(1975)；Williams，L.T.等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 741204-1208(1977))。
For-MLF是一種細菌產物，它通過與白血細胞膜上高親和力受體結合而引發(fā)白細胞趨化性(Williams，L.T.等，Proc.Nat.Acad.Sci USA 741204-1208(1977)；Showell，H.J.等，J.Exper.Med.1431154-1169(1976)；Schiffmann，E.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 721059-1062(1975))。這些受體既存在于多形核細胞上也存在于單核吞噬細胞上。雖然許多體外結構-活性研究已證明這些小的N-甲酰-甲硫氨酰肽的許多合成類似物結合中性白細胞和巨噬細胞，與此天然肽相比親和力相等或更強(Niedel.J.等，J.Biol.Chem.2557063-7066(1980)；O’Flaherty，J.J.等，J.Immunol.1201326-1332(1978)；Rot，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 847967-7971(1987)；Iqbal，M.等，FEBS 165171-174(1984))，但體內生物分布和生物活性研究相當有限。因為粒細胞與化學引誘物梯度應答；隨著額外的受體被表達，受體的親和力下降，直到細胞到達炎癥位點，在那里化學引誘物的濃度最高(Snyderman，R.等，RevInfect.Dis.9S 562-S569(1987)；Fletcher，M.P.，J.Immunol.128941-948(1988)；Niedel，J.，等，J.Biol.Chem.10700-710(1979))。由于For-MLF(MW 437)非常小，其分子結構易于掌握以設計最佳的造影劑。
許多種類的的細菌可產生一類或多類趨化分子，可以是小肽、較大的蛋白，也可以是脂質(Klein，I.，ImmunologyThe Science ofSelf-Nonself Discrimination，Wiley Interscience，New York(1982))。例如，已知大腸桿菌產生強趨化分子，這些分子含有帶封閉氨基的異源性小肽作為其活性成分。已合成了這種肽并顯示為多形核白細胞的強化學引誘物。這些趨化肽中最熟知的是For-MLE和一些相關的四肽(Schiffman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 721059-1062(1975)；Schiffman等，美國專利4,427,660(1984))。這些肽的結構功能研究揭示在靶細胞表面存在立體特異性受體(Becker，E.L.Am.J.Pathol.85385-394(1976))；然后用放射標記甲酰肽作為配體檢測這種受體(Williams等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 741204-1208(1977))。
隨后，合成了結構為N-甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys的趨化肽，并顯示與人中性白細胞上的受體結合力強，該肽可在Tyr殘基上用125I以高比放射活性標記(Niedel等，J.Biol.Chem.25410700-10706(1979))。
細菌細胞也可誘導宿主細胞產生趨化因子，例如通過激活宿主補體系統(tǒng)的成分，造成局部產生趨化分子，C5a和C5b67。一旦宿主中發(fā)生了免疫應答，IgG抗體分子也可作為趨化因子，因為被激活的T淋巴細胞產生的分子可以作為趨化因子?；谘装Y細胞類型上存在的適當受體，不同的趨化分子對各種多形核細胞(如，嗜中性白細胞、嗜堿細胞、嗜曙紅細胞)、肥大細胞、單核細胞/巨噬細胞或淋巴細胞具有選擇性。
趨化肽是許多結構-活性研究的焦點，以確定分子負責受體結合和激活的特異特征(Deuel，T.F.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1)4584-4587(1981)；O’Flaherty，J.T.等，J.Immunol.1201326-1332(1978)；Rot，A等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA847967-7971(1987)；Iqbal，M.，等，FEBS 165171-174(1984))。這些研究大部分集中在For-MLF序列中天然氨基酸的取代；但已有關于受體結合和激活EC50值小于或等于天然肽的加長肽和高負電肽的報道(Fischman，A.J，J.Nucl.Med.32483-491(1991)；Toniolo，C.等，Biochem，23698-704(1984))。總的看來，這些結構-活性研究的結果得出雖然N-末端的修飾對受體結合和激活有很大的不利影響，但在C-末端的修飾影響很小(Spisani，S.等，Inflammation 10363-369(1986))。另外，受體結合與生物活性高度相關(Deuel.T.F等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78(1)4584-4587(1981)；Schiffmann，E.等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 721059-1062(1975))?；谶@些資料，已有人提出了一種受體-肽復合物結構模型，其中只有N-末端的4個氨基酸與受體相作用(Freer，R.J.，等，Biochem.21257-263(1982))。
已證明在C-末端修飾的合成For-MLF類似物與中性白細胞和巨噬細胞結合，與天然肽相比親和力相等或較高(Deuel，T.F.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1)4584-4587(1981)；Schiffmann，E.，等，Proc.Natl Acad Sci.USA 721059-1062(1975)；Niedel.J.等，J.Biol.Chem.2557063-7066(1980))。這樣在C-末端包含標記片移使含得制備了保留受體結合特性的放射標記類似物。
這種感染造影的方法比現用的放射藥物有幾個理論上的優(yōu)勢。這些小分子與循環(huán)粒細胞以及已存在于炎癥位點的白細胞結合的能力，可顯著減少從注射到損傷檢測之間的間隔時間。這種肽的分子量小(＜1000D)，使得與標記蛋白和白細胞相比能更快地擴散到感染和炎癥區(qū)域。另外，粒細胞的就地放射標記避免了細胞功能的改變(傳統(tǒng)標記方法常如此)和血液操作(其對工作人員和病人的固有危險)。
Zoghbi等人(J.Nuc.Med.2232(1981))用運鐵蛋白與肽偶聯用111In標記For-MLF，并提示該試劑在選擇性標記人中性白細胞上是肯定的。雖然此方法提供了解決標記特異性問題的一種潛在方案，但它沒有提出一種克服從個體采取細胞、體外處理它們、然后重輸回個體這一復雜狀況的方案。
有一篇報導描述了在兔中直接注入125I標記的N-甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys體內定位無菌膿腫的嘗試(Jiang等，Nucl.Med.21110-113(1982))。雖然達到了有效標記率(膿腫與肌肉之比)，但使用該試劑會導致暫時性中性白細胞減少，然后返彈性中性白細胞增多。作者承認需要進一步開發(fā)以避免中性白細胞減少/中性白細胞增多的付作用并使該方法可用于臨床。另外，125I不能很好地造影，而且該文獻也沒有披露或提示較好的造影同位素，如123I、111In或99mTc。
Morgen等人在美國專利4,986,979中公開了一種提高炎癥組織位點上標記物集累量的方法。該方法利用了白細胞激活時表面抗原標志的正調節(jié)。描述了一種利用含親和標記物的趨化肽和與白細胞結合的放射核素的造影方法，以及這種提高的造影應用。這些作者沒有公開合成拮抗劑的任何合成方法，或公開這種拮抗劑可用于避免中性白細胞減少反應。
雖然上述技術可能提供了有用的信息，它們仍可能造成不可接受的高頻假陽性和假陰性結果，需要過多的操作和加工，或伴有不可接受的付作用。因此，本領域中一直公認需要一種更直接、更靈敏、更特異的檢測和定位感染或炎癥位點的方法，特別是可連續(xù)進行以測評治療的時間響應的技術。
發(fā)明簡述基于可檢測標記的趨化肽全身性注射到動物體內后在局部感染位點積累這一發(fā)現，本發(fā)明涉及一種基本非侵入性的感染或炎癥位點造影方法。
更具體地講，本發(fā)明涉及一種檢測個體中感染或炎癥位點的方法，其包括a.給予該個體診斷有效量的可檢測標記的趨化肽X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W其中X為氨基保護基，Y為氨基酸殘基，Z為間隔序列，n為0或1，和W為下式結構的標記或連接取代基-[K]v-M1其中K為中間功能團，v為0或1，及M1是診斷學上可檢測的標記物；及其中趨化肽在感染或炎癥位點顯著積累，而在無感染或炎癥的位點不顯著積累；和b.檢測該趨化肽。
在一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及一種檢測個體中感染或炎癥位點的方法，其包括a.給予該個體診斷有效量的可檢測標記的趨化肽X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W其中
X為氨基保護基，Y為 其中，R1為芐基，烷基或-CH2-CH2-R2-CH3，和R2為-S- 或-O-Z為間隔序列，n為0或1，和W為下式結構的標記或連接取代基-[K]v-M1其中K為中間功能團v為0或1M1是診斷學上可檢測的標記物；及其中趨化肽在感染或炎癥位點顯著積累，而在無感染或炎癥的位點不顯著積累；和b.檢測該趨化肽。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及一種可檢測標記的趨化肽X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W其中
X為下式結構的氨基保護基 其中R3選自氫、烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基、芳烷氧基和氨基，R4為氧或硫Y為氨基酸殘基，Z為選自1-6個碳原子的脂肪二胺、[R6]m和其混合物的間隔序列，其中R6為氨基酸殘基，m為大于或等于1的整數，n為0或1，及W是下式結構的標記或連接取代基-[K]v-M1其中K為DTPA、EDTA或HYNIC，v為1，及M1是111In或99mTc；且其中趨化肽在感染或炎癥位點顯著積累，而在無感染或炎癥的位點不顯著積累。
本發(fā)明范圍內還包括含有這種趨化肽的治療組合物，盡管對這種組合物來說并不總是要求包含可檢測片段。更具體地講，本發(fā)明涉及含有下式趨化肽的治療組合物X-Y-Leu-Phe-[Z]n-[T]α其中X為下式結構的氨基保護基
其中R3選自氫、烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基、芳烷氧基和氨基，R4為氧或硫Y為氨基酸殘基，Z為選自1-6個碳原子的脂肪二胺、[R6]m和其混合物的間隔序列，其中R6為氨基酸殘基，m為大于或等于1的整數，n為0或1，T是治療劑，α為0或1；其中趨化肽在感染或炎癥位點顯著積累，而在無感染或炎癥的位點不顯著積累。
本發(fā)明從而涉及一種檢測個體中感染或炎癥位點的體內方法。該方法包括給予該個體可檢測標記的趨化肽，這種肽在感染或炎癥位點顯著積累但不在無感染或無炎癥位點積累。
本發(fā)明還包括其上已連有適當的螯合分子或可檢測標記物的各種趨化肽。
附圖的簡要說明

圖1是表示4種與DTPA偶聯的趨化肽與人中性白細胞結合試驗結果的圖。該試驗是一種競爭性結合試驗，其中[3H]For-MLF被遞增濃度的未標記肽所置換。
圖2是表示4種與DTPA偶聯的趨化肽刺激人中性白細胞產生超氧化物試驗結果的圖。該試驗中包括MLF用于比較。
圖3趨化肽類似物刺激的超氧化物產生。人多形核細胞僅與HBSS或與所示濃度的肽37℃保溫10分鐘，然后測定高鐵細胞色素的還原。
超氧化物最大產量的百分數＝E/M×100其中E是在所示濃度肽存在下所產生的超氧化物的量，M是這種肽所產生的超氧化物的最大量。
For-NleLFK-HYNICHP1；For-MLFK-HYNICHP2；For-MLFNH(CH2)6NH-HYNICHP3；For-MLF-(D)K-HYNICHP4.
圖4趨化肽類似物對For-ML[3H]F與人多形核細胞結合的作用。完整的人多形核細胞(8×105)與培養(yǎng)緩沖液或所示濃度的肽在15 nM For-ML[3H]F存在下24℃保溫45分鐘，然后測定特異性For-ML[3H]F結合。
最大For-ML[3H]F結合的百分數＝E/C×100其中E是所示濃度的未標記肽存在下的特異性cpm，C是只有緩沖液存在下For-ML[3H]F的特異性cpm。For-NleLFK-HYNICHP1；For-MLFK-HYNICHP2；For-MLFNH(CH2)6NH-HYNICHP3；For-MLF-(D)K-HYNICHP4.
圖5肽濃度對放射化學產率(％)和比活性(mCi/Mole)的影響。顯示了對于For-MLF-(D)K-HYNIC的數據。用所有受試肽得到了相似的結果。
圖6大腸桿菌感染的大鼠中99mTc標記肽的靶標-本底比(T/B)。感染肌肉中％ID/g除以對側正常肌肉中的相應值計算得到數據。均在注射前24小時建立感染。每個數據點是5-6只動物的均值±均值的標準誤(SEM)。
圖7注射99mTc-標記趨化肽類似物后，大腸桿菌股部感染兔的代表性γ照相圖象。該圖象是在注射大約1mCi的99mTc-標記HP2 17小時后得到的，在注射前24小時產生感染。
圖8注射99mTc-標記HP2 17小時后大腸桿菌股部感染的兔中的生物分布。數據用平均百分注射劑量/g組織表示。誤差棒是指SEM。注射99mTc-標記HP2前24小時產生感染。
圖9大腸桿菌感染的兔中注射99mTc標記HP4 17小時后的靶標-本底比(T/B)。感染肌肉或膿中％ID/g除以對側正常肌肉中的相應值計算得到數據。均在注射前24小時建立感染。對于感染肌肉，數據中包括6只動物的28個標本。對于膿，數據中包括6只動物的6個標本。
圖10表示了4個HP3制劑注射后4個時間點上血液、肺、肝、脾、腎和消化道中百分注射劑量/克。
圖11這是下文實施例85中試驗方法的流程示意圖。在-15和-5分鐘及注射后0.25、0.5、1、3、5、10和20分鐘采取用于血液學測定的血樣。
圖12ForNle LFNleYK-DTPA對猴外周白血細胞水平的影響?？偟耐庵馨籽毎嫈狄曰€水平的百分數表示。使用4個劑量的肽(ng/kg)。P注射肽；V注射載體。
圖13注射99mTc-標記的For-Met-Leu-Phe-NH-(CH2)6-NH-HYNIC 3和12小時后股部感染的雌性Rhesus猴的γ照相圖象。所有的圖象均對最亮的照片(pixel)標準化。
圖1499mTc-HP和111In標記的白細胞共同注射后6和18小時大腸桿菌股部深處感染兔的γ照相圖象。99mTc圖像對99mTc窗中的111In光子矯正。所有的圖像都對早期99mTc-HP圖像中的總計數標準化。注射前24小時建立感染。
圖15注射后3、6和18小時閃爍照相的ROI分析所得99mTc-HP和111In-白血細胞的靶標-本底比。每個數據點是6只動物的均值±SEM。所有動物均在注射放射示蹤劑之前24小時被感染。
圖16注射后18小時在切出的組織標本上通過直接放射活性測定法測得的99mTc-HP和111In-白血細胞的靶標-本底比。小圈代表99mTc-HP的所有值(6只動物的30個標本)，大圈表示均值±SEM。小方塊代表111In-白血細胞的所有值(6只動物的30標個)，大方塊表示均值±SEM。所有動物均在注射前24小時感染。
圖17注射后18小時在切出的組織標本上通過直接放射活性測定法測得的99mTc-HP和111In-白血細胞的膿與正常肌肉之比。每個數據點是6只動物的均值±SEM。所有動物均在注射前24小時感染。
優(yōu)選實施方案的描述“炎癥”和“炎癥位點”用于指個體中由于組織損傷(無論其原因或病因)所發(fā)生的狀況和其位置。這種組織損傷可以是由微生物侵入、自體免疫過程、組織或器官同種移植排斥、或傷害性外部影響因素如熱、冷、放射能量、電或化學刺激、或機械創(chuàng)傷所造成的。無論其起因和身體位點，隨后的炎癥反應是相當相似的。由一系列復雜的功能和細胞調節(jié)所組成，包括微循環(huán)、液體運動的改變以及炎癥細胞(白細胞)的流出和激活。
“感染”一詞指細菌、病毒、真菌、原生動物和其他微生物的侵入。
“個體”一詞包括動物如哺乳動物，尤其是人。
“激動劑”一詞這里指與一種受體結合并刺激該受體功能的趨化肽。
“拮抗劑”一詞這里指阻止對受體刺激的趨化肽。作為拮抗劑的趨化肽對細胞受體具有親和力，并通過與之結合阻止細胞的應答。
“診斷有效”一詞用于描述劑量，是指所給予的可檢測標記趨化肽的量足以使得能夠檢測感染或炎癥位點，即高于背景信號。
一般說來，可檢測標記趨化肽的診斷劑量將根據如患者年齡、狀態(tài)、性別和患病程度、禁忌癥和其他變量而變化，將由有關醫(yī)生來調節(jié)。劑量可在約0.01微克/公斤到約2000微克/公斤之間變化，優(yōu)選為約0.1微克/公斤到1000微克/公斤。
“末端修飾的趨化肽”一詞是指包括擔不限于具有以下通式結構的分子X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W其中X為氨基保護基，Y為氨基酸殘基，Z為間隔序列，n為0或1，和W為標記或連接取代基。
在上述通式結構中，X是氨基保護基，即保護氨基的基團，可以是本領域技術人員已知可用于此目的的許多基團中的任何一個。下述流程圖說明幾種向趨化肽上加入氨基保護基的有用的合成路線。Met-Leu-Phe的N-末端衍生化 a.1.RNCO，Et3N，DMF；2H3O+b.1.ROCOCl，Et3N，DMF；2H3O+c.1.RCOCl，Et3N，DMF；2H3O+d.1.RSO2Cl.Et3N，DMF；2H3O+e.鹽酸1，1-吡唑-1-甲酰胺Et3N，DMF；2H3O+f.RNCS，Et3N，DMF；2H3O+g.1.(RO)2POCl.Et3N，DMF；2H3O+h.2，5-二甲氧基四氫呋喃NaOAc，AcOH一般而言，但考慮趨化肽(CP)上的氨基保護基即N-末端保護基時，將此片段看作一個單一的單元更準確，而不是看作一個被“隔離基團”與CP分隔開的“龐大”的基團。保護基團的這兩個部分可能都與受體通過立體、靜電和疏水作用而作用。因此保護基的組成作為一個整體將最終決定CP的活性。這一概念例如被以下事實所支持，觀察到氨基甲酸正丁基酯保護的CP比相應的正丁基脲保護的CP活性低近10倍。這兩個保護基具有相同的脂肪側鏈，但是鍵角、旋轉度和靜電特征不同。
當將CP的N一保護從氨基甲酸酯(尿烷)換成脲時，N-末端的整體形狀可能就會改變，脲的鍵角不同，旋轉自由度明顯小(羰基-N鍵比羰基-O鍵旋轉度小)。這些因素可能對CP-受體的總體匹配性有些影響。
引入脲將改變CP N-末端的靜電特征。這些靜電差異可導致受體中氫鍵作用的改變。
脲的整體大小與氨基甲酸酯的大小沒有明顯區(qū)別。但可能存在的例外是脲的受阻旋轉可能將其鎖定到一種特異的構象，這種構象對其與受體的匹配有顯著影響。這更多的涉及形態(tài)而不是整體大小。
也許在CP N-末端裝配脲保護基的最合理的原因是脲在較寬范圍的條件下比氨基甲酸酯更穩(wěn)定。因此其在高酸性條件下的穩(wěn)定性允許在C-末端連接片段上進行更寬范圍的化學轉化。
本發(fā)明范圍內還包括其他相關的氨基保護基，如含有雜原子的脲-硫脲、磺酰胺、膦酰胺、胍和磺酰脲。
文獻中公開了許多其他氨基保護基，如叔丁氧羰基、乙?；?、芐氧羰基、甲?；?、硫代甲?；⑶杌吆图籽豸驶?。
用異丁氧羰基和烷基(C3-C6支鏈和環(huán)狀)氨基甲?；Ｗo氨基末端也可產生有效的趨化肽(它們可以是激動劑或拮抗劑)。
以下列出了適用于趨化肽的一些氨基保護基。這些保護基的合成方法參見“Protecting Groups In Organic synthesis”JohnWiley&SonsNew York，1981；第6章。
a.氨基甲酸酯氨基甲酸環(huán)丙基甲基酯氨基甲酸1-甲基-1-環(huán)丙基甲基酯氨基甲酸二異丙基甲基酯氨基甲酸2-甲硫基乙基酯氨基甲酸1，1-二甲基丙炔基酯氨基甲酸叔戊基酯氨基甲酸環(huán)戊基酯氨基甲酸環(huán)己基酯氨基甲酸9-芴基甲基酯氨基甲酸1-金剛烷基酯氨基甲酸1，1-二甲基-2-2-三氯乙基酯氨基甲酸2，2，2-三氯乙基酯氨基甲酸1-甲基-1-苯乙基酯氨基甲酸2，4-二氨芐基酯b.羧酰胺及其相應的硫代羧酰胺噻吩甲酰胺金剛烷基甲酰胺4-溴丁酰基甲酰胺肉桂基甲酰胺煙?；柞０穋.脲、其相應的硫脲和氰基胍衍生物芐基脲2，4-二氟苯基脲
1-萘基脲苯基脲二苯基脲丙基脲雜合脲d.磺酰胺苯磺酰胺二甲氧苯磺酰胺甲苯磺酰胺芐磺酰胺三氟甲磺酰胺e.膦酰胺苯膦酰胺二甲氧苯膦酰胺甲苯膦酰胺芐膦酰胺三氟甲膦酰胺在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，X是 其中R3選自氫、烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基、芳烷氧基和氨基，R4是硫屬原子，優(yōu)選氧或硫。
當R3是烷基時，優(yōu)選1-6個碳原子的烷基，更優(yōu)選3-6個碳原子的烷基，即甲基、乙基、丙基、丁基、戊基及己基或其異構體，如異丙基、異丁基、仲丁基、叔丁基、新戊基、2-乙基丁基等。最優(yōu)選異丁基和叔丁基。
當R3是鏈烯基時，優(yōu)選2-6個碳原子的鏈烯基，更優(yōu)選2-4個碳原子的鏈烯基，即乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基及己烯基或其異構體，如異丙烯基、異丁烯基、仲丁烯基、叔丁烯基、新戊烯基、2-乙基丁烯基等。
當R3是炔基時，優(yōu)選2-6個碳原子的炔基，更優(yōu)選2-4個碳原子的炔基，即乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基及己炔基或其異構體，如異丙炔基、異丁炔基、仲丁炔基、叔丁炔基、新戊炔基、2-乙基丁炔基等。
當R3是烷氧基時，優(yōu)選1-6個碳原子的烷氧基，更優(yōu)選3-6個碳原子的烷氧基，即甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基及己氧基或其異構體。
當R3是芳烷氧基時，優(yōu)選芐氧基，即Φ-CH2-O-，其中苯基(Φ)可被取代或不取代。
當R3是氨基時，優(yōu)選-N(H)R5，其中R5選自氫、烷基、環(huán)烷基和芳基。
當R5是烷基時，優(yōu)選1-4個碳原子的烷基，更優(yōu)選3-4個碳原子的烷基，即甲基、乙基、丙基、丁基或其異構體，如異丙基、異丁基、仲丁基、叔丁基。
當R5是環(huán)烷基或芳基時，優(yōu)選環(huán)戊基、環(huán)己基、金剛烷基、苯基或聯苯基，更優(yōu)選環(huán)己基或苯基，其可以被取代或不取代。
在上述通式中Y是氨基酸殘基，可以是可用于該目的的任何這種殘基。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中，Y是 其中R1是芐基、烷基或-CH2-CH2-R2-CH3，及R2為-S-， 或-O-當R1是烷基時，優(yōu)選1-6個碳原子的烷基，即甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基或其異構體，如異丙基、異丁基、仲丁基、叔丁基、新戊基、2-乙基丁基等。R1是烷基時更優(yōu)選3-4個碳原子的烷基。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，Y是4-氨基四氫吡喃-4-羧酸(Thp)。用Thp產生的類似物是對人中性白細胞的化學引誘劑，但不刺激超氧化物的產生。合成并測試的肽是甲?；?Thp-Leu-Phe-OMe。
在上述通式中Z是任何有用長度的間隔序列。根據n是0或1，它可以存在也可以不存在。當n是1時，Z存在并優(yōu)選為脂肪二胺或[R6]m，其中R6是氨基酸殘基。m是大于或等于1的整數，優(yōu)選1-3的整數。Z還可以是脂肪二胺和[R6]m的結合。
當Z是脂肪二胺時，優(yōu)選1-6個碳原子的脂肪二胺，如甲二胺、乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺和己二胺。當Z是脂肪二胺時，更優(yōu)選4-6個碳原子的脂肪二胺，如丁二胺(也稱cadaverine)、戊二胺(也稱putrescine，以下稱為Pu)和己二胺。
當Z為[R6]m時，根據m的值不同，可有一個或多個氨基酸殘基。當存在兩個或多個殘基時，它們可相同或不同。組成間隔序列的氨基酸可以是本領域技術人員所熟知的任何氨基酸，可以是必須的或非必須的。例如，R6可為下列氨基酸之一或其組合精氨酸、谷氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸。在實施本發(fā)明中用作間隔序列的優(yōu)選氨基酸殘基是下列氨基酸或其組合正亮氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。
如上所述，W是標記或連接取代基。W代表用于對本發(fā)明的實施中所用趨化肽進行可檢測標記的片段?！翱蓹z測標記”一詞指在趨化肽上連接上診斷學上可檢測的標記物。
本領域中已知許多不同的標記物和標記方法?？捎糜诒景l(fā)明的標記物類別的實例包括放射性同位素、順磁性同位素、和可通過正電子發(fā)射體層成象(PET)造影的化合物。本領域技術人員將明了可與本發(fā)明趨化肽結合的其他適宜標記物，或利用常規(guī)試驗能夠確定這種標記物。而且，這些標記物與趨化肽的結合可利用本領域技術人員公知的標準技術來進行。
對進行體內診斷造影，可利用的檢測儀器類型是選擇給定放射核素的主要因素。所選擇的放射核素必須具有可被給定類型的儀器檢測的衰變類型。一般講，用于診斷造影的任何常規(guī)顯影方法都可用于本發(fā)明。
選擇體內診斷放射核素的另一重要因素是其半衰期要足夠長使得靶組織達最大吸收時仍可被檢測，但又要足夠短使宿主的有害幅射達到最小。在一優(yōu)選實施方案中，用于體內造影的放射核素不發(fā)射顆粒，但產生大量的140-200KeV范圍的光子，這容易被常規(guī)的γ照相機檢測。
為了進行體內診斷，放射核素可直接與起化肽連接，或通過一中間功能團間接連接。常用于將金屬離子放射同位素與趨化肽連接的中間功能團是螯合劑，二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)(Hnatowich，D.J.，Int.J.Appl.Radiat.Isot.，33327-332，(1982))和乙二胺四乙酸(EDTA)。用于連接Tc與肽的其他常用螯合基團包括(1)二肪配體，(2)官能化cyclams，(3)N2S2配件，和(4)N3S配件。
或者，可將反應活性硫醇通過(5)亞氨基硫雜戊環(huán)與賴氨酸殘基結合，或可將硫醇殘基用含一個或多個Cys殘基的氨基酸序列與肽結合 可與趨化肽結合的金屬離子的實例為99mTc、123I、131I、97Ru、67Cu、67Ga、125I、68Ga、72As、89Zr和201Tl。優(yōu)選99mTc和111In。
111In標記的趨化肽是用于大鼠中感染病灶位點外部造影的有效試劑(Fischman，A.J.，J.Nucl.Med.32483-491(1991))。但肽的生物半衰期短，降低了111In(t1/267.9h)造影的實用性。由于其物理半衰期短、比活性高、造影性能極佳、造價低及有廣泛供應，99mTc是標記趨化肽的理想放射核素。雖然已有許多技術用于99mTc標記，但肼基煙酰胺基團(HYNIC)的效果尤其肯定。肼基煙酸的活性琥珀酰亞胺酯(SHNH)已成功地用于衍生蛋白質中賴氨酸殘基的ε-氨基。這些結合物與具有Tc(V)氧代核的簡單配合物如99mTc-葡庚酸鹽一起保溫就可造成定量標記(Abrams，M.J.等，J.Nucl.Med.312022-2028(1990))。
用99mTc對大分子的標記方法可分成三大類直接標記、雙功能團螯合物、和預成螯合物。現今優(yōu)選的利用HYNIC(SHNH)接頭的標記方法是利用輔助配體，例如高锝酸根離子在螯合前體存在下還原以形成易變的99mTc-前體配合物(這里稱為“輔助配體”)，后者再與雙官能修飾CP的金屬結合基團反應形成99mTc-CP結合物。如上所述，99mTc-葡庚糖酸鹽輔助配體可用于已用SHNH基團修飾的蛋白的放射標記(Schwartz，D.A.，等，Bioconjugate Chem.2333-336(1991))。但這要求60分鐘保溫及比活性大于25mCi/mg，以使放射標記率大于90％。多羥基氨基酸t(yī)ricine可用作99mTc標記SHNH修飾的多肽和蛋白的更有效和易得的標記前體。
Tricine，即三(羥甲基)甲基甘氨酸，和其類似物可與氯化亞錫還原劑一起配制成PH6-8的水溶液，以自發(fā)形成99mTc前體。在ITLC-SG條上進行“Tc-tricine”輔助配體的形成分析，與99mTc-葡庚糖酸鹽的分析相似，用鹽水在原點進行TcSn膠體定量，用甲基乙基酮在溶劑前沿進行高锝酸根的定量。在與99mTc-葡庚糖酸鹽的相似條件下，“Tc-tricine”溶液(36mg/ml前體，50μg/ml氯化亞錫，PH6.0)在室溫數分鐘內放射標記SHNH修飾的IgG達90％以上。另外，與Tc-葡庚糖酸鹽相比，“Tc-tricine”溶液可以大于150mCi/mg蛋白的比活性達到＞90％的IgG-SHNH放射標記。在SHNH修飾的小分子如CP的標記中，應用高比活性的定量放射標記更加重要。
可按以下總步驟標記HYNIC修飾的肽拌攪下向新制備的Sn/tricine溶液(72mg/ml tricine，PH7.0-7.2，100μg/ml SnCl2·2H2O)中加入等體積的發(fā)生劑洗出的99mTcO4-(30mCi/ml)。用1×8cm的ITLC-SG檢測條測定99mTc-tricine的產生，用鹽水或甲基乙基酮洗脫劑分別測定膠體或高锝酸根。將99mTc-tricine立即加入肽溶液中。通過將1mg肽溶解在600μL乙酸并加入400μL微酸性水，靜量30分鐘使腙脫保護，用PH5.2乙酸緩沖液將肽按1∶10稀釋，可制得1mg/ml的肽溶液，如iboc MLF-HYNIC腙。通過100μL99mTc-tricine與15μL溶液混合制備99mTc-肽結合物。保溫1小時后，用1×8cmITLC-SG檢測條以25％w/w NaCl溶液作為洗脫劑測定99mTc-肽的生成百分率，其中99mTc-肽留在原點，而所有其他成分被洗脫至溶劑前沿。
適合的趨化肽的實例包括但不限于N-For-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys-DTPA
N-For-Met-Leu-Phe-Pu-DTPAN-For-Nle-Leu-Phe-Lys-DTPAN-For-Nle-Leu-Phe-Lys(NH2)-DTPAN-For-Met-Leu-Phe-Lys-DTPAN-For-Met-Leu-Phe-D-Lys(NH2)-DTPAN-Ac-Nle-Leu-Phe-Lys(NH2)-DTPAN-芐氧羰基-Met-Leu-Phe-甲酯IBOC-L-甲硫氨酰(亞砜)-L-Leu-L-Phe-L-賴氨酰胺IBOC-正亮氨酰-L-Leu-L-Phe-L-賴氨酰胺N-For-L-甲硫氨酰(亞砜)-L-Leu-L-Phe-DTPA-L-LysN-For-L-甲硫氨酰(砜)-L-Leu-L-Phe-DTPA-L-LysN-異丁基脲-Met-Leu-Phe-羧酸異丁氧羰基-Met-Leu-Phe-N-DTPA-LysN-For-(D)-Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物t-BOC-Nle-Leu-Phe-Lys溶劑化物N-For-甲硫氨酰-亞砜-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物N-For-甲硫氨酰-砜-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物N-氨基甲酰-Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物N-三甲基乙?；?Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物異丁氧羰基-Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物N-For-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Nε-DTPA-Lys異丙基脲-Met-Leu-Phe-Lys-SHNH-BOC異丙基脲-Met-Leu-Phe-正丙基二胺-Asp-SHNH HBr異丙基脲-Met-Leu-Phe-Lys-Asp-SHNH HBr
異丙基脲-Met-Leu-Phe-Lys-SHNH HBrN-苯基脲-Met-Leu-Phe異丙基脲-Met-Leu-Phe-丙二胺-SHNHN-正丁基硫脲-Met-Leu-PheN-正丁基脲-Phe-Leu-Phe-Leu-PheN-異丙基脲-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe-COOHiBOC-Met-Leu-Phe-COOHiBOC-Met-Leu-Phe[酰氨基(丙基酰氨基)羧基[(丙基)羧基)]-(酰氨基丙醇SPNH)酯N-異丁基脲-Met-Leu-Phe-羧酸N-正丙基脲-Met-Leu-PheN-叔丁基脲-Met-Leu-PheN-正丁基脲-Met-Leu-PheiBOC-Met-Leu-Phe-(酰氨基乙氧基乙基[3-酰氨基]-6-丙烯醛腙)-吡啶N-iBOC-Met-Leu-Phe-SPNH-硫代酯N-異丙基脲-Met-Leu-PheN-iBOC-Met-Leu-Phe-丙二胺-SPNH環(huán)己基脲-Met-Leu-Phe-COOHN-正丁基氨基甲酸-Met-Leu-Phe-甲酯N-iBOC-Met-Leu-Phe-甲酯N-甲基氨基甲酸-Met-Leu-Phe-甲酯N-金剛烷基脲-Met-Leu-PheN-肉桂酰基-Met-Leu-Phe
對甲苯基脲-Met-Leu-Phe間甲苯基脲-Met-Leu-PheN-肉桂?；?Phe-Leu-Phe-Leu-Phe。
除確定和鑒定病灶性感染和炎癥位點外，本發(fā)明的方法可用于監(jiān)視個體中的炎癥過程。例如，通過測量炎癥位點大小或數目的增大或減小，可能確定旨在改善感染或炎癥過程的其他起因的、或針對炎癥過程自身的具體治療方案是否有效。
在另一實施方案中，本發(fā)明用于診斷該位點炎癥的特異根本原因。在此方法中，首先給予懷疑有炎癥點的個體以診斷有效量的趨化肽(如前所述)，然后進行放射照相造影，以確定該位點的存在和其位置。
用于實施本發(fā)明的趨化肽可為激動劑或拮抗劑。在某些情況下，根據其所用濃度所給予的肽可是這兩者。
肽iBOC-MLFK和iBOC-MLFK-DTPA拮抗ForMLF刺激的中性白細胞釋放自由基，以及被激活的中性白細胞體內與血管內皮細胞的粘附。用111In接頭DTPA對C-末端的修飾仍保留了拮抗活性。這些肽不表現任何激動活性。
通過比較激動肽甲酰-正亮氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-正亮氨酰-酷氨酰-賴氨酸-DTPA(For-Nle FNle YK-DTPA)和拮抗肽iBoc-MLFK-DTPA進行體內造影研究。111In標的肽迅速定位在感染位點。γ照相圖象和組織生物分布都證實了這種定位。這兩種肽的主要區(qū)別在于激動肽定位于諸如肺、脾和骨髓的區(qū)域中、指示細胞活化和著邊，而拮抗肽卻并非如此。激動肽引起白血細胞計數的暫時性下降(中性白細胞減少)，而拮抗肽沒有顯著影響。這些結果是激動劑-拮抗劑的合理結果。激動肽顯示在5小時內靶標-本底比一直增加，而拮抗肽在1小時時最有效。這提示較高的結合親和力(如與激動肽)可造成靶標-本底比提高，并在治療學上有利。這些結果很有用，還因為以前不清楚拮抗劑是否能顯示造影能力。這種能力對本領域技術人員不是顯而易見的，因為結合和造影有可能要求借助激動劑來激活。結果發(fā)現并非如此。
拮抗肽t-Boc-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe抑制中性白細胞介導的溶酶體酶釋放。另外，其他的尿烷N-末端封閉基團并不能將肽轉化為拮抗劑，反而轉化為激動劑(甲氧羰基和芐氧羰基)。N-末端iBoc保護基也適于拮抗肽，在C-末端賴氨酸處被DTPA修飾的iBoc肽保持適當的生物活性。
本發(fā)明通過顯示拮抗劑iBoc-MLFK抑制與疾病相關的中性白細胞與內皮粘附和釋放自由基的功能發(fā)展了本領域。該肽還在體內定位患病位點。另外，它在發(fā)揮這些作用時并不改變白血細胞的數目。這些結果與粘附反應封閉性拮抗肽和其他潛在拮抗劑的應用相一致，即作為感染/炎癥疾病的治療和診斷劑。
肽骨架的修飾用其他化合物替代上述通式結構中的一個Leu或Phe殘基也在本發(fā)明范圍之內。
a.亮氨酸用二丙基甘氨酸(Dpg)替代亮氨酸殘基，生成的類似物是對人中性白細胞的化學引誘物。所制備并測試的肽是甲酰-Met-Dpg-Phe-OH。
用1-氨基環(huán)己烷羧酸(Acc6)替代亮氨酸殘基，生成的類似物是兔中性白細胞中溶菌酶釋放的強誘導劑。所合成并測試的肽是甲酰-Met-Acc6-Phe-OH。
b.苯丙氨酸用z-脫氫苯丙氨酸替代苯丙氨酸殘基，生成的類似物刺激兔中性白細胞產生超氧化物。所合成并測試的化合物是甲酰-Met-Leu-z-Phe-OMe。
以下列出了制備用于骨架修飾的替代氨基酸的參考文獻a)4-氨基四氫硫代吡喃-4-羧酸(替代甲硫氨酸)公開于Torrini等，Indian Journal of Peptide Protoin Research 38495-504(1991)；b)二丙基甘氨酸和1-氨基環(huán)己烷羧酸(替代亮氨酸)公開于Dentino等，The Journal of Biological Chemistry 2818460-18468(1991)；c)z-脫氫苯丙氨酸(替代苯丙氨酸)用Chauhan等，Tetrahedron 442359-2366(1985)中描述的方法制備；d)2-氨基二氫茚酮-2-羧酸(替代苯丙氨酸)公開于Gavuzzo等，Indian Journal of Peptide Protein Research 37268-276(1991)；和e)苯胺基甘氨酸(替代苯丙氨酸)按Krahs等，EuropeanJournal of Medicinal Chemistry 2719-26(1992)中描述的方法制備。
在本發(fā)明的另一方案中，趨化肽可被“治療學結合”并用于輸送治療劑至感染或炎癥位點?！爸委煂W結合”一詞指趨化肽與治療劑結合。以此方式使用的治療劑針對炎癥的根本病因，如感染生物或腫瘤，或針對炎癥過程自身的成分。用于治療炎癥的藥劑實例有甾類和非甾類抗炎藥。許多非甾類抗炎藥抑制前列腺素的合成。
可用于按本發(fā)明方法與趨化肽偶聯的其他治療劑有藥物、放射性同位素、植物血凝素、毒素、和抗微生物藥。服用的治療劑量是治療有效的量，本領域技術人員容易確定。該劑量還取決于受體的年齡、健康和體重、共同治療(如果有的話)的種類、治療頻率、目標效應的性質，如抗炎效應或抗菌效應。
植物血凝素是常源自植物的與碳水化合物結合的蛋白質。許多植物血凝素還能使細胞凝集并刺激-些淋巴細胞。蓖麻蛋白是已用于治療學的一種毒性植物血凝素，通過將負責毒性的α-鏈與抗體分子結合，以達到位點特異性運送毒性效應。在本發(fā)明的一種實施方案中，蓖麻蛋白α-鏈與趨化肽結合。
毒素是由植物、動物和微生物產生的有毒物質，在足夠劑量下可能是致命的。白喉毒素是由白喉棒狀桿菌產生的一種蛋白，由可分離的α-和β-亞單位組成。該毒性成分可與趨化肽結合，用于向感染或炎癥反應位點上特異性輸送。
為治療目的可與趨化肽結合的按本發(fā)明方法使用的放射性同位素的例子有125I、131I、90Y、67Cu、217Bi、211At、212Pb、47Sc、186Re、188Re、105Rh、153Sm和109Pd。
可用于實施本發(fā)明的抗微生物藥是能抑制感染性微生物如細菌、病毒、真菌和寄生蟲的物質(Goodman，A.G.等，1985，同上)，可以是本領域技術人員已知的任何這種物質。
能與按本發(fā)明方法使用的趨化肽或特異抗體偶聯的其他治療劑也是已知的，或本領域技術人員易于確定。
用于胃腸外給藥的造影趨化肽的或治療學上結合的趨化肽的制劑，包括無菌水或非水溶液、懸液和乳液。非水溶劑的例子有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油、可注射有機酯如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水溶液、乳液或懸液(包括鹽水和緩沖液)，包括氯化鈉、Ringer葡萄糖、葡萄糖加氯化鈉、乳酸化Ringer液、或固定油的胃腸外載體。靜脈內載體包括液體和營養(yǎng)補充物、電解質補充物，如基于Ringer葡萄糖的那些，等等。還可以存在防腐劑和其他添加劑，如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體?？傮w上，見Remington’s Pharmaceutical Science，16th ed.，Mac Eds.1980.
本發(fā)明的造影趨化肽或治療學上結合的趨化肽的制劑，可用能達到其預期目的的任何方法給藥。例如，可經胃腸外給藥，包括皮下、靜脈內、肌內、腹膜內、經皮或頰內途徑?？梢蕴娲鼗蛲瑫r使用口服給藥。用于造影的可檢測標記趨化肽的優(yōu)選給藥途徑是靜脈途徑。該趨化肽可一次全部給藥，或逐漸灌注(優(yōu)選靜脈內)，使用蠕動工具以完成該逐漸灌注。
本發(fā)明可用于檢測軀體廣泛部位的感染或炎癥，包括但不限于肌肉、血管壁、腹部、骨盆、骨、關節(jié)或肺。
本發(fā)明可用于診斷任何數量的微生物感染，或診斷由這種感染或由創(chuàng)傷、自體免疫過程或腫瘤引起的炎癥。
本發(fā)明還可用作提高感染或炎癥治療的效力和其響應的工具。
以上公開內容一般性地描述了本發(fā)明。參照以下具體實施例可獲得更全面的理解，本文提供這些實施例只用于說明目的，而無意于限制本發(fā)明，除非特別說明。
實施例1試驗性細菌感染的病灶點造影用本領域熟知的標準固相方法合成了趨化肽N-甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(Merrifield，R.B.，J.Am.Chem.Soc.152149-2154(1963))；Stewart，J.M.，和Young，J.D.，Solid PhasePaptide Synthesis，W.H.Freeman&Company，San Francisco，CA(1969))。利用環(huán)形酸酐，用DTPA修飾C-末端賴氨酸的ε-氨基。原肽和DTPA衍生物的EC50幾乎相同，約為10-9M，表明用DTPA衍生化不影響肽的生物活性。(所有受試肽都得到了類似結果)。這一結果是非常令人驚異的，因為人們預期引入高負電DTPA基團將會明顯改變這種小肽的性質。這種肽易于用111In放射標記。六只Sprague-Dawley大鼠通過在左側股部注射108活大腸桿菌進行試驗感染。感染后24小時注射約100μCi的標記肽(5-10μg)。連續(xù)的γ照相圖象表明1小時時放射活性的分布在感染位點發(fā)生峰積(靶標-本底比約為4.0)。2小時時，活性水平的強度已下降，24小時時幾乎分辨不出損傷部位。
這些結果確立了這種新試劑在感染動物模型中對炎癥位點造影的實用性。
實施例2白細胞結合的生物分布和趨化肽的生物活性白細胞結合通過競爭性結合試驗測試4種與DTPA偶聯的趨化肽與人中性白細胞的結合，其中〔3H〕For-MLF被遞增濃度的未標記肽所置換(Babior，B.M.等，J.Clin.Invest.52741(1973))。結果示于圖1中。試驗中包括3種未DTPA衍生化的肽作為對比。
產生SOD試驗4種與DTPA偶聯的趨化肽刺激人中性白細胞產生超氧化物(Pike，M.C.等，Methods in Enzymol.162236(1988))。這些結果示于圖2中。為比較目的，試驗中還包括MLF。
體內中性白細胞減少以大于標準造影劑量大約10倍的劑量，將兩種DTPA偶聯趨化肽給予大鼠。在注射前5分鐘和注射后1，2，5，10，15和30分鐘(通過尾靜脈)采集外周血。在所有實驗動物中，沒有顯著誘發(fā)中性白細胞減少。
實施例3-5下列實施例3-5說明異丁氧羰基-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-N-二亞乙基三胺五乙酰-賴氨酸(iBoc-MLFK-DTPA)是定位于體內感染病灶點的ForMLF激活中性白細胞的拮抗劑。發(fā)生定位而不改變白血細胞數量。
實施例3分離的人中性白細胞(2.5×105)與1μMiBoc-MLFK-DTPA預培養(yǎng)10分鐘，然后在2.8μM氨基苯二酰肼(luminol)存在下用10nM For MLF刺激，氨基苯二酰肼作為自由基依賴性化學發(fā)光的增敏劑。在這些試驗條件下反應被完全抑制。隨后的研究表明這些抑制是劑量依賴性的，IC50為0.2μM。
實施例4在病灶性感染的兔模型中比較了肽拮抗劑iBoc-MLFK-DTPA與肽激動劑甲酰-正亮氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-正亮氨酰-酪氨酰-賴氨酸-DTPA(ForNleLFNleYK-DTPA)。在每只兔(2-3kg)的后肢用大腸桿菌誘發(fā)病灶性感染，其步驟見實施例100B。24小時后，一組兔(n＝3)接受拮抗肽iBoc-MLFK-DTPA，而第二組接受激動肽For Nle LFNle-YK-DTPA。這些肽均用111In放射標記達比活性為約400μCi/μg肽。每只兔用氯氨酮-Xylazine麻醉，并經邊緣耳靜脈注射100μCi或0.25μg肽。在5，15，30和60分鐘時測定下列參數白細胞數、整體圖像，及在60分鐘時處死動物以確定組織生物分布。激動肽誘發(fā)暫性白細胞數降低，而拮抗肽沒有。在注射激動劑或拮抗劑10分鐘時就可檢測到病灶性感染位點。生物分布顯示與拮抗肽相比，激動肽較多聚積在脾和肝中。兩種肽都迅速在腎中積累。拮抗劑的血濃度略高些，這可能提示這種肽的生物半衰期較長。感染肌肉比率范圍為4∶1到7∶1，表明在感染肌肉部位顯著的吸收。激動肽的靶-本底比在5小時內升高，而拮抗肽比率在1小時時最高。以上表明拮抗性趨化肽能夠迅速定位于病灶性感染位點，從而具有感染或炎癥位點診斷造影的實用性。另外，這些資料提示拮抗肽在涉及這種特異受體的疾病治療中的潛在用途。
實施例5在中性白細胞-內皮細胞粘附試驗中測評未偶聯的肽iBoc-MLFK。在此試驗中，用5-羧基熒光素二乙酸鹽標記的中性白細胞(5×105)加至含匯合的人臍靜脈內皮細胞的48孔板上。以10μM的濃度加入iBoc-MLFK肽，10分鐘后用30μM ForMLF刺激中性白細胞。溫育25分鐘后洗去未結合的中性白細胞，測定粘附百分比。這種肽在此濃度下抑制粘附達66％。隨后測試了0.1-3.0μM間的濃度。這種肽劑量依賴性地抑制中性白細胞與內皮細胞的粘附，IC50約為14μM。對粘附的抑制將減少白細胞如中性白細胞向患病點的侵潤，從而限制與炎癥有關的組織損害。這些資料提供了支持用肽拮抗劑治療活化白細胞有關疾病的進一步證據。
實施例6-98用本發(fā)明范圍內的其他趨化肽重復實施例5的步驟。結果示于表I中。在此表中，MPO是髓超氧化物酶試驗，“-”指在30μM時無作用，“+”指在30μM時有陽性作用，“N.T.”指未測定。
表I細胞生物活性數據

表I(續(xù))細胞生物活性數據

溶解度問題表I(續(xù))細胞生物活性數據

表I(續(xù))細胞生物活性數據

溶解度問題表I(續(xù))細胞生物活性數據

表I(續(xù))細胞生物活性數據

表I(續(xù))細胞生物活性數據

實施例99在以下實施例中，按常規(guī)液相方法(Bodansky，M.和Bodansky，A.，1984，“The Practice of Peptide Synthesis”，SpringerVerlag，New York)合成了Met-Leu-Phe鹽酸鹽。異氰酸酯有供應時從Aldrich獲得。沒有供應的異氰酸酯通過適宜的胺與從Aldrich獲得的triphos(二(2-聯苯基膦基乙基)苯基膦)的標準反應而制得。所有的1HNMR譜在Bruker 30 MHz儀上在DMSOd6中測得，并相對TMS內標報告。
游離氨基肽與適當的異氰酸酯反應易于制得良好收率的N-末端脲保護的肽。以下描述N-正丁基-N’-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸-脲的合成舉例。將1.0g Met-Leu-Phe鹽酸鹽(2.2mMol)懸浮在10ml無水DMF中，并加入2.2當量(0.70ml，5.0mMol)無水三乙胺，然后加入1.25當量(0.31ml，2.8m Mol)異氰酸正丁酯。室溫攪拌反應混合物16小時，然后在旋轉蒸發(fā)器上除去DMF。將殘余物溶解在1ml甲醇中，快速攪拌下加入15ml 1NHCl。過濾生成的白色固體(0.81g，71％)，用水洗，真空干燥過夜。FABMS；C25H40N4O5S，測定值509(M＋1)。
1H NMR(MeOH，d6)δ8.12(d，J＝8Hz.，1H)，8.01(d，J＝8Hz.，1H)，7.21(m，5H)，4.62(m，1H)，4.30(m，1H)，4.25(m，1H)，3.17(m，4H)，2.45(t，J＝7Hz，2H)，1.95(m，1H)，1.77(m，2H)，1.40(m，6H)，92(m，9H)。
實施例100該實施例證明99mTc標記的趨化肽類似物是用于感染病灶點外部造影的有效試劑。
合成了4種肼基煙酰胺(HYNIC)衍生化的趨化肽類似物，For-Nle LFK-HYNIC(HP1)，For-MLFK-HYNIC(HP2)、For-MLFNH(CH2)6NH-HYNIC(HP3)和For-MLF-(D)K-HYNIC(HP4)，并評價其體外生物活性和受體結合。
材料和方法肽合成和鑒定按Fischman，A.J.，J.Nucl.Med.32483-491(1991)中所述的標準固相技術(Merrifield，R.B.，J.Am.Chem.Soc.152149-2154(1963)；Stewart，J.M.，和Youg.J.D.，Solid Phase PeptideSynthesis，W.H.Freeman&Company，San Francisco，CA(1969))合成并純化了N-甲酰(For)-正亮氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-賴氨酸-NH2，N-For-甲硫氨酸-亮氨酰一苯丙氨酰-賴氨酸，N-For-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-二氨基己基酰胺，和N-For-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-D-賴氨酸-NH2。所有試劑均為從商業(yè)渠道得到的最高級別。如以下對HP3所描述的方法，對這些化合物進行煙酰肼偶聯。
向186mg N-For-Met-Leu-Phe-二氨基己基酰胺中加入2ml二甲基甲酰胺(DMF)和60μl二異丙基乙基胺，然后加入1ml DMF中的154mg琥珀酰亞胺基-6-t-Boc-肼基吡啶-3-羧酸(Abrams，M.J.，等，J.Nucl.Med.312022-2028(1990)?；旌衔镒凕S，肽在短時間內溶解。2小時后向反應混合物中加入乙醚-石油醚，并棄去上層。向油狀殘條物中加入水使得形成固體。用5％碳酸氫鈉、水和乙酸乙酯洗滌固體，得重183mg的產物。將粗產物與含0.1ml對甲苯酚的5ml三氟乙酸(TFA)一起于20℃攪拌15分鐘，除去t-Boc保護基。用TFA處理時間延長則形成的付產物增加。經旋轉器發(fā)除去TFA，向殘余物中加入乙醚使脫保護肽沉淀。在2.5×50cm Whatman ODS-3柱上用0.1％TFA中乙腈梯度洗膜進行反相HPLC純化產物。合并含主成分的流份，除去溶劑產生目標產物。用UV和質譜以及氨基酸分析來鑒定肽。
細胞制備在3％葡聚糖(Pharmacia，Nutley，NJ)中沉降，然后經Lymphoprep(Organon Teknika，Durham，NC)梯度離心分離人外周血多形核白細胞(PMN)。用Wright染色標本的光學顯微鏡法估測，細胞制劑含有＞95％PMN。
For-MLF受體結合試驗N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(For-MLF)、N-甲酰-正亮氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(For-NleLF)和N-甲酰-正亮氨酰-亮氨酰-苯丙酰-正亮氨酰-酪氨酰-賴氨酸(For-Nle LF Nle YK)從Sigma(St.Louls，MO)獲得。For-ML[3H]F(60 Ci/mmol)從Hew England Nuclear(Boston，MA)獲得。以總體積0.15ml及在各種濃度的衍生化肽和15nM ForML[3H]F(Deuel，T.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1)4584-4587(1981)；Fischman，A.J.等，J.Nucl.Med.32483-491(1991)；Pike M.C.，等，Methods Enzymol.162236-245(1988))存在和不存在下，8×105分離的人PMN(從健康自愿者獲得)在含1.7mMKH2PO4、8.0mM Na2HPO4、0.117M NaCl、0.15mM CaCl2、0.5mM MgCl2和1.0mM PMSF PH7.4的磷酸鹽緩沖的鹽水(培養(yǎng)緩沖液)中于24℃45培養(yǎng)分鐘。培養(yǎng)后將細胞濾至玻璃纖維盤(Whatman GF/C；Whatman，Inc.，Clifton，NJ)上，然后用20ml冰冷培養(yǎng)緩沖液洗滌。將此濾膜置于含10ml Safety-Solve(Research Products International Corp.，Mt.Prospect，IC)的閃爍管中，并用液體閃爍光度法測定放射活性。特異結合定義為總結合減去非特異性結合。非特異結合是在10μM未標記For-MLF存在下殘余結合的放射活性量。非特異性結合為總結合的約10％。
為了確定99mTc放射標記對結合親合力的影響，以0.15ml總體積在各種濃度的For-Nle LF Nle YK或相應的未標記肽和固定量的99mTc標記肽存在或不存在下，將分離的人PMN(2×106細胞)在HBS/BSA中于40℃培養(yǎng)60分鐘。培養(yǎng)后，混合好的等份(0.1ml)細胞懸液在0.4ml微量離心管中用0.2ml HBSS/BSA∶Lymphoprep(1∶1)覆蓋，并于15000rpm將內容物離心4分鐘(Microfhge E，Beckman，Columbia，MD)。在液氮中冷凍各管并分離細胞層。通過γ計數測定放射活性。非特異性結合是在5μM未標記For-NleLFNleYK或相應的未標記肽存在下的殘余結合放射活性。非特異結合為總結合的約10％。
超氧化物產生的試驗佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)和細胞松馳素B從Sigma(St，Louis，MO)獲得。通過用消光系數29.5/mmol/L/cm監(jiān)視高鐵細胞色素C的超氧化物歧化酶可抑制性還原來測定超氧化物的釋放。簡言之，分離的人中性白細胞用Hank氏平衡鹽溶液(HBSS)(GIBCO，Grand Island，NY)培養(yǎng)。在10μM細胞松馳素B+/-超氧化物歧化酶(50μg/ml)存在下，只用HBSS或含有l(wèi)nM到1μM遞增濃度的肽(HP1，HP2，HP3，HP4，For-NleLF，For-MLF或For-NleLFNleYK)時于37℃培養(yǎng)10分鐘。用分光光度法測定高鋏細胞色素C的還原。
HYNIC衍生的趨化肽的99mTc標記99mTc高锝酸鹽(99Mo/99mTc發(fā)生劑和葡庚糖酸亞錫(Glucoscan)從New England Nuclear(Boston，MA)獲得。99mTc-葡庚糖酸鹽用于提供放射標記肼基煙酰胺結合肽所必需的Tc(V)氧代。向此冷干試劑盒中加入約2.5ml 0.9％NaCl中的99mTc高锝酸鹽。最終放射活性濃度為5-10mCi/ml，產物的放化純度通過即時薄層硅膠層析(ITLC-sg)來測定，用丙酮和0.9％NaCl作為流動相溶劑。
使用下列步驟用99mTc放射標記趨化肽。將約0.2mg肽溶于50μl二甲基亞砜中；用0.1M PH5.2的乙酸鹽稀釋至終濃度0.1mg/ml。將0.5ml肽溶液置于一清潔的玻璃瓶中，加入0.5ml99mTc-葡庚糖酸鹽。將此混合物快速渦旋，室溫下靜置1小時。在三種溶劑系統(tǒng)中進行ITLC-sg測定放化純度丙酮，0.9NaCl和丙酮∶水(9∶1)。
還用兩種系統(tǒng)進行反相HPLC分析了99mTc標記的肽類似物。系統(tǒng)A使用Beckman C18反相柱(5μ，4.5×46mm，Beckman，Columbia，MD)，洗脫條件溶劑A50mH乙酸鹽中5％乙腈，PH5.2；溶劑B50mM乙酸鹽中50％乙腈，PH5.2；梯度20分鐘內由0％B到100％B；流速2mL/分。系統(tǒng)B使用VydacC18反相柱)300A，5μ，4.5mm×25cm，Vydac)，洗脫條件溶劑A水中0.1％三氟乙酸；溶劑B丙酮中0.1％三氟乙酸；梯度10分鐘內由0％B到100％B；流速2mL/分。用Milton-Roy/LDC流過式分光光度計監(jiān)測紫外吸收，用Beckman170(Backman，Columbia MD)監(jiān)測放射活性。用一種雙通道積分儀(Waters Model 746 Data Module，Waters，Marlboro，M4)記錄并分析了來自兩種檢測器的輸出信號。
比活性的最大化為了避免與藥理劑量趨化肽類似物相關的中性白細胞減少，將99mTc標記趨化肽的比活性最大化，以使99mTc的造影劑量即最終所服用的肽明顯低于已知的活化EC50濃度(～20nM)。
在前次洗出后5小時洗脫99mTc發(fā)生劑以使99mTc的比例減至最小而保持99mTc洗出液＞300mCi。用發(fā)生劑動力學方程結合所用99Mo/99mTc發(fā)生劑的已知歷史計算Tc的質量和99Tc與99mTc的相對比例。如上所述制備99mTc-葡庚糖酸鹽(Tc-GH)。將180μg趨化肽(MW720)溶解在50μl DMSO中，用0.1M乙酸鹽緩沖液(PH5.2)稀釋至終濃度100μg/ml。肽溶液等份用乙酸鹽緩沖液進行系列稀釋，得到2-80μg/ml范圍的濃度。將0.5ml99mTc-GH加入等體積的肽/乙酸鹽緩沖液中開始肽標記。快速渦旋此溶液，室溫下保溫1小時。用三種獨立溶劑系統(tǒng)進行ITLC-sg測定肽標記的程度丙酮，0.9％NaCl，和丙酮∶水(9∶1)。用下述關系計算放射標記肽的比活性(％RCY×存在的mCi)/(肽的μMol數×100)。
體內研究在動物體內進行了三種研究A)為了確定放射標記肽類似物在健康動物中的體內分布，對每種類似物進行了生物分布研究；B)為了測定放射標記肽類似物定位于炎癥病灶位點的能力，在大腸桿菌感染的大鼠中進行了組織放射活性測定；及C)為評價放射標記肽的感染造影特性，對大腸桿感染的兔進行了γ照相。
A.正常大鼠中的生物分布給由24只重約150g的正常雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River Breeding Laboratories，Burlington MA)組成的各組動物注射約5μCi每種99mTc標記的肽，在5，30，60和120分鐘時測定生物分布(同一時間點上在6只動物中測評每種肽)。將血液、心臟、肺、肝、、脾、胃、腎、胃腸道、骨骼肌、睪丸和骨標本稱重，并用一種井型γ計數器(LKB model#1282，Wallac Oy，芬蘭)測定放射活性。為了校正放射衰變，所注射劑量的等份樣品也同時計數。結果以每克中所注射劑量的百分數表示。
B.對感染大鼠的研究一種大腸桿菌的單一臨床分離物用于產生病灶性感染。細菌在胰胨大豆瓊脂板上37℃培養(yǎng)過夜，單一菌落用無菌0.9％NaCl稀釋以產生含約2×109細菌/ml的渾濁懸液。重約150g的雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River Breeding Laboratories，Burlington MA)用氯氨酮麻醉，并在其左后股部肌肉注射0.1ml含約2×108細菌的懸液。
接種細菌24小時后，給經注射股部腫大的動物通過側尾靜脈注射約5μCi(3pMol)的99mTc標記肽。注射后30和120分鐘，將5只動物的各組斷頸處死。如上所述取組織標本，測定放射活性并計算結果。
C.感染兔的造影為了確定使用放射標記趨化肽在對這些試劑的中性白細胞減少效應敏感的動物中進行感染定位的可行性，在大腸桿菌病灶性感染的兔中進行了造影研究。重2-3kg的6只雄性新西蘭白兔用氯氨酮和xylazine(15.0和1.5mg/kg)麻醉，并且在后股肌肉中注射1.0ml約2×109大腸桿菌的懸液。接種后24小時，給經注射股部腫大的兔通過側耳靜脈注射600-1000μCi HPLC純化的99mTc標記HP2(比活性＞10000mCi/μMol，如上所述經HPLC與未標記肽分離)。用氯氨酮和xylazine(15.0和1.5mg/kg)麻醉動物，并在注射后0到3小時和16-17小時用大視野γ照相機(TechnicareOmega 500，Solon，Ohio)獲取系列閃爍圖象，所述照相機裝有高分辨平行孔準直儀并與專用計算機聯機(Technicare 560，Solon，Ohio)。在預置的5分鐘/視域(View)內記錄圖象，集中15％的窗以包括99mTc的140KeV光峰。為了表征標記肽的定位，進行有義區(qū)(region-of-interest，ROI)分析，以時間的函數比較感染股與對側正常股的肌肉。
在獲得最后的圖象以后，注射過量戊巴比妥處死動物，將血液、心臟、肺、肝、脾、腎、胃、腸、丸、骨、骨髓、正常骨骼肌、感染骨骼肌和膿標本稱重，并按如上所述測定放射活性。為了校正放射衰變，所注射劑量的等份也同時計數。結果以每克中所注射劑量的百分數表示。為了測定循環(huán)中與細胞結合的活性量，離心血液并分離細胞和血液。用0.9％NaCl清洗細胞，測定細胞和上清中的殘余活性。為了測定在感染位點與細胞結合的活性量。用0.9％NaCl洗膿兩次，測定細胞中和可溶部分中的殘留放射活性。
統(tǒng)計方法通過利用線性模型的方差分析(ANOVA)評價造影和生物分布研究的結果，其中器官和時間作為分類變量；％ID/g或％ID/器官＝器官＋時間＋器官×時間。用Duncan的新復極差法(Duncan，D.B.，Biometrics 111-42(1955))進行post-hoc肽濃度比較。每個F值的第一個下標是第一分類變量的自由度數(n－1)、第二個分類變量的自由度數(m－1)、或其交互作用的自由度數(n－1)×(m－1)。第二個下標是剩余自由度的數目(觀察總數－n×m)。所有結果以均值±SEM表示。
結果肽合成均以良好收率和純度制備了4種HYNIC衍生化的趨化肽類似物。紫外分析顯示所有4種肽在268nm和315nm處有最大吸收，這是HYNIC基團的特征。質譜和氨基酸分析結果與預期偶聯肽產物一致。
趨化肽類似物的生物活性超氧化物產生試驗的結果于示圖3中。表II中給出了產生50％最大響應的肽濃度(EC50)。肽HP2，HP3和HP4具有與For-MLF相同的效力(100nM)或更高的效力。HP1的效力至少低一個數量級。因此，對產生超氧化物的效力順序是HP2＞HP3＞HP4＞＞HP1。
表II趨化肽類似物的超氧化物產生和結合EC50肽 超氧化物 結合親產生和力nM nMHP1 500 40HP212 0.18HP340 0.12HP460 0.35For-MLF 100 20For-NleLF 320 300For-NleLFNleYK100 1定義為所產生超氧化物陰離子(O2-)的最大量的肽效力，所有受試肽都相似，在2.07-3.80mol O2-/106細胞/10分鐘范圍內。所有肽的效力均低于佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)(一種PMN氧化性爆發(fā)的無關激活劑)效力，它在0.1μM濃度時產生22.9nmol O2-/106細胞/10分鐘的響應。
趨化肽類似物與化學引誘物受體的結合圖4顯示HYNIC衍生化趨化肽類似物抑制For-ML[3H]F與完整人PMN的結合，其效力水平與對產生超氧化物陰離子的效力水平相似。表II中給出了對For-ML[3H]F與人PMN結合產生50％抑制所需要的肽濃度(EC50)。肽HP2，HP3和HP4的EC50值與六肽For-MeLFNleYK的相似。雖然HP1與化學引誘物受體的親和力比此系列中其他HYNLC衍生化肽的低約100倍，但僅低于For-MLF的效力1倍。三肽For-NleLF的效力比六肽和For-MLF低100倍以上。因此，與化學引誘物受體的親和力順序為HP3＞HP2＞HP4＞＞HP1。99mTc-HP2的EC50＜10nM。
為了確定99mTc標記對受體結合的影響，用上文描述的試驗條件測定未標記HYNIC-肽置換99mTc標記肽的能力。這些試驗的結果證明取代50％99mTc肽與中性白細胞的結合所要求的未標記肽濃度比用For-ML[3H]F作為示蹤劑時大大約10倍。如果放射標記物中每個Tc-葡庚糖酸鹽含有一個以上肽單位并且結合是協(xié)作性的，則這種結合親和力的提高可得到解釋。
用99mTc放射標記在用于監(jiān)測放射標記的溶劑系統(tǒng)中，99mTc標記肽和99mTc-葡庚糖酸鹽在即時薄層層析-硅膠條上的Rf值為0.9％NaCl-99mTc-肽＝0.0，99mTc-葡庚糖酸鹽＝1.0；丙酮-99mTc-肽＝1.0，99mTc-葡庚糖酸鹽＝0.0；丙酮∶水(9∶1)-99mTc-肽＝1.0，99mTc-葡庚糖酸鹽＝0.0。與僅用丙酮時相比，第三種系統(tǒng)峰尾最小，得到99mTc-肽的窄帶。所有99mTc-肽制備物的ITLC證明保溫1小時后90％以上的放射活性與肽相連。用HPLC系統(tǒng)A分析標記肽，顯示99mTc-葡庚糖酸鹽、99mTc-HP1、99mTc-HP2、99mTc-HP3和99mTc-HP4的主要放射性峰的保留時間分別為0.3-0.5、14.37、11.25、15.11、和12.96分鐘。比活性的最大化99Mo/99mTc發(fā)生劑洗脫得總活性456mCi。Tc總量為3.4mMol，99Tc與99mTc之比為1.53∶1，計算99mTc的比活為134000mCi/μmol。如上所述制備99mTc-葡庚糖酸鹽(Tc-GH)；制備時最終放射濃度＞150mCi/ml。用丙酮和0.9％NaCl進行即時薄層層析測得99mTc-GH的放化純度為＞95％。
趨化肽激動劑類似物的藥理效力要求高比活放射標記，以減少存在于注射液中的肽的絕對量。理想的情況是不需要純化即可達到這種比活水平。圖5綜合了肽濃度對標記產率的影響。從這些數據可清楚地看出反應混合物的最終肽濃度對放化產率有顯著影響；肽濃度低于10μg/ml時得到的標記產率差。當結果相對于反應混合物中肽-Tc摩爾比表示時，顯然當該比率升高時，放化產率(％)升高而比活下降。
用此方法可能達到＞10,000mCi/mol的比活，但放化產率降至顯著低于10μg/ml的肽濃度。當肽濃度＜10μg/ml時需要純化步驟除去來結合的99mTc?？捎梅聪郤ep-Paks去除未反應的99mTc葡庚糖酸鹽和99mTcO4-。經HPLC(用系統(tǒng)B)除去未反應肽可使比活性進一步提高。因為相應于99mTc-肽、未標記肽和99mTc-葡庚糖酸鹽的峰在此HPLC系統(tǒng)中分辨良好，可分離無載體放射標記肽。在此情形下，放射標記肽的比活僅受99mTc發(fā)生劑洗脫液比活的限制。99mTc趨化肽在正常大鼠中的生物分布4種99mTc標記趨化肽類似物的生物分布示于表III中。在所有體內試驗中，所有動物耐受了放射標記趨化肽類似物的靜脈給藥，而無明顯的不良影響。除腎、胃和胃腸道以外，所有肽的組織濃度隨時間而下降。
表III99mTc標記的趨化肽類似物的生物分布％L.D./g(均值±SEM)器官時間 HP1 HP2 HP3 HP4(分)血液51.17±0.070 1.18±0.056 1.01±0.056 0.78±0.04630 0.82±0.019 0.67±0.036 0.55±0.017 0.48±0.05260 0.67±0.016 0.57±0.033 0.47±0.035 0.36±0.012120 0.52±0.010 0.48±0.015 0.39±0.015 0.31±0.010心 50.75±0.045 0.50±0.019 0.72±0.089 0.42±0.02730 0.50±0.010 0.32±0.016 0.27±0.021 0.22±0.02460 0.40±0.012 0.28±0.018 0.29±0.026 0.20±0.013120 0.37±0.028 0.26±0.013 0.25±0.024 0.16±0.012肺 51.54±0.122 0.85±0.043 10.65±1.473 1.11±0.09930 0.63±0.043 0.78±0.032 8.45±0.818 0.61±0.07160 0.64±0.039 0.46±0.030 5.10±0.449 0.49±0.026120 0.46±0.026 0.50±0.025 2.44±0.435 0.37±0.027肝 50.76±0.056 0.99±0.023 5.72±0.467 0.74±0.09130 0.53±0.012 0.62±0.019 4.81±0.205 0.52±0.02260 0.45±0.012 0.50±0.022 4.60±0.101 0.51±0.010120 0.43±0.016 0.58±0.026 4.75±0.175 0.46±0.016脾 50.34±0.014 0.35±0.023 2.27±0.281 0.35±0.04130 0.30±0.012 0.39±0.045 2.28±0.231 0.27±0.01760 0.26±0.006 0.25±0.013 3.11±0.191 0.32±0.017120 0.25±0.007 0.29±0.020 3.01±0.220 0.27±0.009
表III(續(xù))器官時間 HP1 HP2HP3 HP4(分)腎 5 3.08±0.092 3.30±0.1731.90±0.199 3.67±0.436305.13±0.282 4.82±0.2461.68±0.064 5.22±0.139605.16±0.115 4.36±0.2131.63±0.057 5.36±0.178120 5.68±0.143 4.17±0.1211.60±0.030 4.74±0.201胃 5 0.17±0.024 0.10±0.0040.38±0.053 0.19±0.011300.12±0.012 0.15±0.0100.56±0.029 0.09±0.023600.15±0.013 0.10±0.0050.51±0.034 0.15±0.017120 0.16±0.015 0.11±0.0110.39±0.008 0.15±0.012胃腸道 5 0.20±0.013 0.25±0.0120.33±0.038 0.16±0.005300.32±0.026 0.64±0.0740.64±0.046 0.32±0.039600.23±0.020 0.64±0.0890.70±0.050 0.39±0.030120 0.32±0.028 0.72±0.0550.81±0.047 0.41±0.035睪為5 0.15±0.010 0.12±0.0080.12±0.011 0.19±0.006300.14±0.005 0.11±0.0030.11±0.006 0.14±0.015600.13±0.005 0.10±0.0060.11±0.004 0.13±0.008120 0.14±0.003 0.10±0.0030.10±0.005 0.11±0.004肌肉5 0.32±0.013 0.25±0.0200.23±0.015 0.27±0.017300.22±0.004 0.17±0.0180.10±0.005 0.17±0.013600.19±0.008 0.14±0.0160.12±0.012 0.15±0.009120 0.20±0.012 0.15±0.0140.10±0.007 0.12±0.006骨 5 0.55±0.026 0.39±0.0110.39±0.023 0.37±0.038300.41±0.009 0.32±0.0130.26±0.017 0.37±0.019600.33±0.007 0.30±0.0200.28±0.023 0.34±0.009120 0.32±0.011 0.28±0.0120.24±0.017 0.28±0.009
在血液中，方差分析顯示肽(F3，70＝56.79，p＜0.0001)和時間(F3，70＝252.01，p＜0.0001)的顯著性主要影響；但肽與時間的交互作用不顯著。血中肽濃度的順序為HP1＞HP2＞HP3＞HP4(p＜0.01)。在心組織中，方差分析顯示肽(F3，64＝44.36，p＜0.0001)和時間(F3，64＝98.06，p＜0.0001)的顯著性主要影響，及顯著的肽與時間交互作用(F9，64＝36.9，p＜0.001)。在肺中，方差分析顯示肽(F3,6570＝183.25，p＜0.0001)和時間(F3，65＝24.56，p＜0.0001)的顯著性主要影響，及顯著的肽與時間交互作用(F9，13.80，p＜0.0001)。肽濃度的順序為HP3＞＞HP1＝HP4＝HP2(p＜0.01)。在肝中，方差分析顯示肽(F3，65＝1000,00，p＜0.0001)和時間(F3，65＝12.80，p＜0.0001)的顯著性主要影響；但肽與時間的交互作用不顯著。在肝中，肽濃度的順序為HP3＞＞HP1＝HP4＞HP2(p＜0.01)。在脾中，方差分析顯示肽(F，633＝431.00，p＜0.0001)的顯著性主要影響，及顯著的肽與時間的交互作用(F9，63＝4.64，p＜0.0001)。在此器官中，時間的主要影響不顯著。肽濃度的順序為HP3＞＞HP2＝HP4＝HP1(p＜0.01)。在腎中，方差分析顯示肽(F3，69＝291.58，p＜0.0001)和時間(F3，69＝40.14，p＜0.0001)的顯著性主要影響，及顯著性肽與時間的交互作用(F9，69＝10.94，p＜0.0001)。肽濃度的順序是HP4＝HP1＞HP2＞HP3(p＜0.01)。在胃中，方差分析顯示肽(F3，53＝202.98，p＜0.0001)和時間(F3，53＝5.56，p＜0.005)的顯著性主要影響，及顯著的肽與時間的交互作用(F9，53＝5.56，p＜0.0001)。肽濃度的順序是HP3＞HP4＝HP2(p＜0.01)。在胃腸道中，方差分析顯示肽(F3，62＝66.30，p＜0.0001)和時間(F3，62＝36.32，p＜0.0001)的顯著性主要影響，及顯著的肽與時間交互作用(F9，67＝477，p＜0.001)。肽濃度的順序為HP4＝HP1＞HP3＝HP2(p＜0.01)。在骨骼肌中，方差分析顯示肽(F3，59＝48.70，p＜0.0001)和時間(F3，59＝97.69，p＜0.0001)的顯著主要影響；但肽與時間交互作用不顯著。肽濃度的順序為HP1＞HP2＝HP4＞HP3(p＜0.01)。在骨中，方差分析顯示肽(F3，68＝30.15，p＜0.0001)和時間(F3，68＝52.84，p＜0.0001)的顯著性主要影響，及顯著的肽與時間交互作用(F3，68＝5.15，p＜0.0001)。肽濃度的順序為HP1＞HP4＝HP2＝HP3(p＜0.01)。99mTc趨化肽在感染大鼠肌肉中的定位99mTc標記肽類似物在正常和感染股部肌肉中的組織濃度(％ID/g)示于表IV中。
表IV99mTc標記的趨化肽在正常和感染的大鼠肌肉中的組織濃度(％ID/克組織±SEM)時間 肽組織 (分) HP1 HP2 HP3 HP4正常 30 0.16±0.009 0.11±0.003 0.05±0.009 0.13±0.007120 0.10±0.006 0.07±0.004 0.05±0.005 0.13±01025感染 30 0.39±0.013 0.28±0.013 0.11±0.007 0.42±0.049120 0.21±0.008 0.16±0.007 0.10±0.004 0.32±0.019
方差分析顯示肽(F3，25＝56.51，p＜0.0001)和時間(F3，25＝59.45，p＜0.0001)的顯著性主要影響，及顯著的肽與時間交互作用(F3，25＝6.74，p＜0.005)。在正常肌肉中，HP1(p＜0.01)和HP2(p＜0.05)的濃度隨著時間降低，而HP3和HP4的濃度保持不變。在注射后30分鐘，正常肌肉中HP1的濃度大于(p＜0.01)其他肽，HP2的濃度大于(p＜0.01)其他肽，HP2的濃度大于(p＜0.01)HP3。在120分鐘時，正常組織中HP4的濃度大于(p＜0.01)HP2和HP3；HP1的濃度大于(p＜0.01)HP3。
在感染的肌肉中，HP1(p＜0.01)、HP2(p＜0.01)和HP4(p＜0.05)的濃度隨時間降低，HP3的濃度(其在兩個時間點時的積累水平都是最低的)保持不變。在注射后30分鐘，HP1和HP4的濃度大于(p＜0.01)HP2和HP3的濃度；HP2的濃度大于(p＜0.01)HP3。在120分鐘時，HP4的濃度大于(p＜0.01)HP1、HP2和HP3；HP1的濃度大于(p＜0.01)HP3。
靶標-本底比(T/B)(每克感染肌肉的％ID/每克正常肌肉的％ID)示于圖6中。方差分析顯示肽的顯著性主要影響(F3，22＝5.87，p＜0.005)。但時間的主要影響和肽與時間交互作用無顯著性。HP4的T/B比顯著大于HP2(p＜0.05)，HP1(p＜0.01)、和HP3(p＜0.01)。因此，證明在注射后的兩個時間點上，HP4不但在感染組織中絕對濃度最高，而且T/B比也最高。相反，HP3在感染組織中絕對濃度最低，而且T/B比最低。兔中感染病灶位點的造影在兔體內，注射后立即在肺、肝和脾中檢測到高水平的99mTc-HP4。肺活性隨時間降低，注射后1-3小時在感染股中觀察到放射活性的病灶集累。注射后4小時，T/B比為約4∶1。注射后16小時(圖7)，整體損傷的平均T/B比增至10∶1，病灶區(qū)＞20∶1。另外在隨后(＞4小時)的時間點注意到一些腸部積累。注射后16小時，測得與細胞結合的殘余循環(huán)放射活性百分比為約25％。相反，對膿的分級分離表明約90％的放射活性與白細胞結合。
通過直接組織計數測得，注射后17小時的組織濃度(％ID/g)綜合在圖8中。最高濃度為脾＞肺＞肝＝腎(p＜0.01)。T/B比率(每克感染肌肉或膿的％ID/每克對側正常肌肉的％ID)示于圖9中。膿和感染肌肉的平均T/B比率分別為25.78∶1(最大48.54∶1，最小8.84∶1)和14.17∶1(最大25.64∶1，最小4.78∶1)。
討論以上表明用99mTc-葡庚顥酸鹽作為Tc-(V)氧代核來源，HYNIC衍生化趨化肽類似物容易以高活性被99mTc標記。而且，99mTc標記肽是用于股深部感染的試驗模型中感染病灶點外部造影的有效試劑。
合成的4種HYNIC肽中，三種(HP2，HP3和HP4)與受體結合的EC50與六肽For-NleLFNleYK的相似，而HP1為For-MLF的約2倍。所有HYNlC偶聯肽與For-MLF相比，與化學引誘物受體的親和力增強。受體結合效力的順序為HP3＞HP2＞HP4＞For-NleLFNleYK＞For-MLF＞HP1＞For-NleLF。用Nle代替For-MLF中的Met造成受體結合親和力下降10-15倍。但在C-末端進一步用-Lys-HYNlC衍生化使受體結合增強。
HP2、HP3和HP4的產超氧化物EC50比六肽和For-MLF提高2-8倍。For-NleLF顯示比For-MLF的效力低3倍。與HP1較For-NleLF對受體結合提高的效應不同，與For-MLF和For-NleLFNle YK相比，它的產超氧化物EC50值提高了5倍。
當按照所建議的肽受體相互作用模型解釋時，這些資料提示在第4個氨基酸殘基上的HYNlC衍生化造成構象紊亂，從而影響受體結合和超氧化物的產生。最令人驚異的發(fā)現是在2位Nle取代Met的效應，它造成受體結合EC50比For-MLF提高15倍以上，比六肽提高300倍，而活化的EC50提高10倍以上。這一結果特別重要，因為以前報道的趨化肽類似物中這一取代的影響很小。4位由D-Lys取代L-Lys造成受體結合EC50提高2倍、活化EC50提高5倍也支持這一假說。在這一位置用1，6-二氨基己烷代替L-Lys只造成結合EC50的微小增加和活化EC50的3-4倍升高。用99mTc標記HYNIC偶聯的肽造成親和力明顯提高。99mTc-HYNIC-肽結合分析試驗的結果證明置換99mTc肽與中性白細胞結合的50％所需要的未標記肽濃度比使用For ML[3H]F作為示蹤劑時的高大約210倍。如果放射標記物中每個Tc-葡庚糖酸鹽含有一個以上肽單位并且結合有協(xié)同性，則可解釋這種結合親和力的提高。據報導四聚趨化肽類似物中也有類似的結合增強作用(Krau，J.L.，等，Biochem.Biophys.Res.Comm.124945-949(1984))。這些結果還證明C-末端對于衍生化的堅定性。
這些觀察提示，除作為極好的感染造影放射藥物，HYNIC肽還可作為進一步闡明伴有For-MLF與其受體結合的分子作用的模型化合物。
在獲得HYNIC衍生化趨化肽類似物的最大比活性時，主要集中在放射核素源中的操作上，即99Mo/99mTc放射核素發(fā)生劑的洗出。獲得高比活性99mTcO4-的一個潛在問題是長壽99Tc(基態(tài)，t1/2～105年)的建立。因為99Tc是87％的99Mo衰變和100％99mTc蛻變的結果而直接產生的，總是存在一定量的載體在標記反應中參與競爭。比活性＞10000mCi/μmol的99mTc標記趨化肽類似物易于制備，但需要用Sep-Pak分離標記肽與其他99mTc種類。如果除優(yōu)化99mTc源以外還優(yōu)化了放射標記肽的層析純化條件，則可達到更高的比活性。在HPLC系統(tǒng)中，相應于99mTc標記肽、未標記肽和99mTc葡庚糖酸鹽的峰分辨良好，可分離無載體放射標記肽。在這些情形下，放射標記肽的比活僅限于99mTc發(fā)生劑的比活。因此，基于99mTc的理論比活，99mTc標記HYNIC衍生化的趨化肽類似物的最大比活為約500,000mCi/μmol。雖然按常規(guī)方法達到這一比活水平是不可能的，但制備具有與用于標記的99mTc-葡庚糖酸鹽相似比活的放射標記肽應該是可能的。因為基于常規(guī)方法可以制得比活＞10,000mCi/μMol的99mTc-葡庚糖酸鹽，如果應用HPLC純化，這一比活水平的肽是可能的。
因為HYNIC葡庚糖酸鹽配體只能占領锝配位區(qū)的兩個點，標記產物很可能含有另外的基團。據信葡庚簋酸鹽作為“共同配體”而發(fā)揮這種作用。由于趨化肽的分子量小，用于锝標記的共同配體可能對這些分子的生物分布產生重要影響。為了評價這些可能性，測定了用不同的共同配體-葡糖二酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘露糖和葡糖胺-標記的99mTc標記HP2和HP3的生物分布。以不同配體放射標記的步驟與使用葡庚糖酸鹽的方法相同。HPLC分析放射標記肽，均顯示等一峰。
圖10顯示了注射后4個時間點這4種HP3制劑在血、肺、肝、脾、腎和胃腸道中的注射劑量百分數/克。雖然在大部分組織中檢測到了生物分布的小差異，最顯著的差異見于肺(葡糖二酸鹽，葡庚糖酸鹽＞甘露醇＞＞葡糖胺)；肝(葡糖二酸鹽，葡庚糖酸鹽，甘露醇＞＞葡糖胺)；腎(甘露醇＞葡糖二酸鹽，葡庚糖酸鹽，葡糖胺)；脾(葡糖二酸鹽＞＞葡庚糖酸鹽，甘露醇＞＞葡糖胺)；及胃腸道中(葡糖二酸鹽，葡糖胺＞＞葡庚糖酸鹽＞＞甘露醇)。用HP2得到了相似結果。
已有幾種用放射標記趨化肽進行感染造影的努力(Fischman，A.J.，J.Nucl.Med.32483-491(1991)；McAfee，J.G.等，Semin.Nucl.Med.1483-106(1984)；Thakur，M.L.等，Semin，Nucl.Med.14107-117(1984)，Zogbhi，S.S.，等，J.Nucl.Med.22P32(1981))。但進行這些研究時存在的放射標記方法產生低比活的試劑，造影需要藥理量的肽。已顯示這些肽劑量在兔中產生嚴重的暫時性中性白細胞減少癥(O’Flaherty，J.T.等，J.Immunol.1181586-1589(1977))。利用本發(fā)明的標記技術，可完全消除這些潛在的不利影響。在兔這種對趨化肽的中性白細胞減少效應高度敏感的物種中，HPLC純化的99mTc HP4在注射后1小時內定位于大腸桿菌感染的病灶位點，并在15小時達到最大T/B比。
HYNIC放射標記方法提供了一種制備極高比活99mTc標記肽和蛋白的獨特而有效的工具。
達到這樣的高比活后，應該可以在顯著低于中性白細胞減少反應EC50的肽濃度下進行造影試驗。例如利用SEP-PAK純化肽(～10,000mCi/μmol)，注射20mCi的試量，其含約2nMol肽。對于70kg的對象而言，這代表注射劑量低于30pMol/kg。基于Rhesus猴中的研究，這一肽量遠低于誘發(fā)顯著中性白細胞減少的劑量。利用HPLC純化物，安全系數應提高約10倍。
實施例101本實施例證明放射標記的激動趨化肽類似物可作為猴中炎癥位點造影的有效試劑。利用高比活的放射標記可避免這些試劑的中性白細胞減少效應。
在非人靈長類動物中測評了趨化肽類似物的體內生物活性、生物分布和炎癥造影特性。在正常Rhesus猴中測定了劑量依賴性中性白細胞減少反應。99mTc標記的肼基煙酰胺(HYNIC)衍生化趨化肽類似物用于在猴中研究生物分布和炎癥造影。
在正常動物中的研究表明肽在動物中誘發(fā)明顯的劑量依賴性中性白細胞減少。注射后幾乎立即發(fā)生中性白細胞數減少，然后迅速返回基線。檢測到了對區(qū)別WBC計數、血壓、脈頻、或呼吸頻率的顯著影響。在最低測試肽劑量下，中性白細胞的減少很小。以良好的收率和純度制備了HYNIC衍生化肽，生物活性與原肽相似，以20000mCi/μmol的比活方便地標記。當將約0.5mCi(＜2.0ng/kg)的放射標記肽注入帶有無菌炎癥病灶點的猴中時，觀察到其生物分布模式與放射標記WBC相似，未檢測到中性白細胞減少。注射后3小時時，炎癥位點很明顯，T/B比為約3∶1。材料N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰(For-MLF)、N-甲酰-正亮氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-正亮氨酰-酪氨酰-賴氨酸(ForNleLFNleYK)、佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)和細胞松馳素B得自Sigma(St.Louis.Mo)。ForML[3H]F(60Ci/mmol)和99mTc(99Mo/99mTc-發(fā)生劑)得自NeW England Nuclear-(Boston，MA)。Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)得自GIBCO(Grand Island，NY)。肽合成和鑒定如以前的描述(Fischman，A.J.等，J.Nucl.Med.32483-491(1991)，用標準固相技術(Merrifield，R.B.JAm.Chem.Soc.152149-2154(1963)；Stewart，J.M等，Solid Phase PeptideSynthesis，W.H.Freeman&Company，San Francisco，CA(1969))，合成并純化了N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-賴氨酸和N-甲酰-正亮氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-正亮氨酰-酪氨酰-賴氨酰-DTPA。煙酰基腫衍生化趨化肽類似物N-甲酰-met-leu-phe-lys-HYNIC按如下方法制備。
將含60μl二異丙基乙基胺的1.0ml二甲基甲酰胺(DMF)中的琥珀酰亞胺基-6-t-Boc-肼基吡啶-3-羧酸(154mg，mMol)，加至2ml DMF中的N-For-Mer-Leu-Phe-Lys(186mg，mMol)中。肽迅速溶解，2小時后加入乙醚-石油醚。棄去上層，向殘余物中加水形成固體。用5％碳酸氫鈉、水和乙酸乙酯洗滌該固體。得183mg粗產品。將粗產品與5ml含0.1ml對甲苯酚的三氟乙酸(TFA)于20℃攪拌15分鐘，除去保護基。旋轉蒸發(fā)除去TFA，加入乙醚沉淀脫保護的肽。在2.5×50cm WhatmanODS-3柱上用乙腈對0.1％TFA的梯度洗脫，反相HPLC純化產物。合并含主成分的流份，除去溶劑得目標產物。
用TLC、HPLC、UV光度法、質譜法和氨基酸分析測定終產物的化學純度。如Pike，M.C.和Snyderman，R.，MethodsEnzymol，162236-245(1988)；Pike，M.C.等，Blood 67909-913(1986)；和Fischman，A.J.等，J.Nucl.Med.32483-491(1991)中描述的方法，測定與人PMN上化學引誘物受體結合的EC50和產超氧化物的EC50。99mTc放射標記為了避免施用藥理劑量趨化肽類似物帶來的中性白細胞減少效應，在產生最大比活的條件下用99mTcyt放射標記HYNIC衍生物。通過獲得高比活造影劑量的99mTc，肽的注射量大大低于EC50(～20nM)。
在前一次洗出后5小時對99Mo/99mTc發(fā)生劑洗出，以產生約500mCi的總活性。按Lamson等人J.Nucl.Med.7639-641(1975)的方法計算Tc的量和99Tc與99mTc的相對比例。在典型的洗出中，Tc的總量為約3nMol，99Tc與99mTc比為約1.5∶1，99mTc的比活性＞100,000mCi/μmol。從葡庚糖酸亞錫(Glucoscan，DuPont)制備99mTc-葡庚糖酸鹽(Tc-GH)，以提供用于放射標記肼基煙酰胺偶聯肽的Tc(V)氧代(Pike，M.C.等人，Blood 67909-913(1986))。將約2.5ml鹽水中的99mTc-高锝酸根加入冷干試劑盒中，在制備時的放射活性終濃度為150mCi/ml。以丙酮和鹽水作為流動相溶劑通過即時薄層硅酸層析(ITLC-sg)測得產物的放化純度大于95％。
將約180μg趨化肽For-Met-Leu-Phe-NH-(CH2)6-NH-HYNIC(MW720)溶解在50μl DMSO中，用PH5.2的0.1N乙酸鹽緩沖液稀釋至終濃度為10μg/ml。將1.5ml肽溶液置于一干凈玻璃小瓶中，再加入0.5ml99mTc-葡庚糖酸鹽。快速渦旋混合物，室溫靜置1小時。以三種獨立的溶劑系統(tǒng)通過ITLC-sg監(jiān)視肽標記的程度丙酮、鹽水和丙酮∶水(9∶1)。在一C18柱(5μ，4.5×46mm，Beckman，Columbia，MD)上的線性梯度洗脫進行反相HPLC純化99mTc標記的肽。洗脫條件為溶劑A-50mM乙酸鹽中5％乙腈，PH5.2；溶劑B-50mM乙酸鹽中50％乙腈，PH5.2；梯度20分鐘內0％到100％B；流速2mL/分。用下述關系計算放射標記肽的比活(回收百分率×存在的mCi)/(肽的mMol數×100)。動物模型以4種劑量的溶于0.2ml無熱原鹽水中的ForNleLFNleYK-DTPA(10000；1000；100和10ng/kg)在每只重10kg的4只雄性Rhesus猴中進行實驗。用所有4種肽劑量處理每只動物，每個劑量水平間休息期為一周。用氯氨酮/xylazine麻醉動物，80分鐘內采集一系列0.5ml靜脈血樣。每個試驗包括4次注射載體、肽、肽、載體。在第一次注射前15和5分鐘和注射后0.25、0.5、1、3、5、10和20分鐘抽取基線血樣。收集20分鐘的血樣后馬上進行下次注射。在整個試驗過程中監(jiān)視血壓、脈博、和呼吸頻率。測定每一樣品中白血細胞計數(CBC)、區(qū)別白血細胞計數、紅血細胞計數、和疊積細胞體積。另外，監(jiān)視動物的活動和表情、攝食和體重。該試驗方法的圖解式概要示于圖11中。
兩只重約10kg的成年雌性Rhesus猴用于造影試驗。因為這些動物以前已用于其他放射藥物的造影試驗，它們在誘導麻醉當中已在右后股部經受了許多次肌肉注射。這些注射造成顯著程度的無菌炎癥。造影在輕度氨氨酮麻醉下(5.5mg/kg)，通過一腿靜脈給動物注射約0.5mCi99mTc標記肽(＜2.0ng/kg)。在注射放射標記肽后5分鐘、30分鐘、1小時和19小時，用氯氨酮/xylaxine(15.0和1.5mg/kg)麻醉動物，用大提野γ照相機獲取全身閃爍照相圖象，所述照相機裝有平行孔高分辨低能準直儀，并與專用計算機系統(tǒng)聯機(Technicare Gemini 700，Technicare 560，Solon，OH)。所有的圖象是15％的窗集中在140KeV的99mTc光峰條件下以10cm/分的掃描速度獲得的。注射前5分鐘和注射后1、3，5和15分鐘采集0.5ml血樣，測定CBC。
拉近有義區(qū)(ROI)整個動物、心血池、肺、肝、脾、腎、腸、骨、正常肌肉和發(fā)炎肌肉；計算計數密度(CPM/片)。結果以組織-血池比、注射劑量百分數/克(％ID/g)和靶標-本底比(致炎股/對側股之比)表示。統(tǒng)計方法按Duncan的新復極差法(Duncan，D.B.，Biometrics 111-42(1955))進行方差分析，統(tǒng)計評價造影研究的結果。
結果制備的HNIC衍生化肽有極好的收率和化學純度。終產物在TLC和HYPLC上顯示單一帶(峰)。紫外分析顯示在268和315nm處有最大吸收。質譜給出m/z671的峰。氨基酸分析與預期產物一(Met-1.00，Leu-1.00，Phe-0.97，Lys-1.00)。HPLC純化后放射標記肽的比活性＞20000mCi/μmol。與人PMN上化學引誘物受體結合及超氧化物產生的體外分析，得出EC50分別為2.0和20nM。
圖12顯示For NleLFNleYK-DTPA在猴中誘發(fā)明顯的劑量依賴性中性白細胞減少反應。在兩個最高肽劑量(10000和1000ng/kg)下，注射后白細胞計數幾乎馬上降至對照的約40％，在第二次注射肽時返回到對照的60-80％。第二次注射肽以后，白細胞計數降至對照的40-50％。在最高劑量下，在第二次注射載體時白細胞計數返回到對照的80％，在研究結束時(第一次注射載體后80分鐘)達到對照的90％。在1000ng/kg劑量下，第二次注射載體時白細胞計數返回到對照的90％，在實驗結束時返回到基線。在100ng/kg劑量下，白細胞計數在注射后幾乎立即降至對照的約70％，在第二次注射肽時回到基線。在第二次注射載體時白細胞水平返回到基線。在最低肽劑量下(10ng/kg)，白細胞減少程度小，每次注射肽后3分鐘內返回基線。
在注射任何劑量的肽以后沒有動物顯出明顯的病態(tài)。檢測對區(qū)別WBC計數、血壓、脈頻、或呼吸頻率的顯著影響。
圖13表示注射約1.0mCi99mTc標記肽后3小時和15小時猴的代表性正前位(Ant)和正后位(Post)圖象在較早的圖象中，在肺、肝、脾和骨中有高放射性濃度，與同白細胞的結合相一致。高水平放射活性還集中在腎和膀胱中。在肌肉和胃腸道中檢測到較低的濃度。另外，在此時炎癥位點已清楚可辨(T/B～3∶1)。在此肽劑量下對WBC水平沒有顯著影響。
在較晚的造影時間下，肺活性下降，但在其他器官中的放射活性分布還保持相對恒定。注射后15小時，放射活性在炎癥位點的集累明顯減少。在其他動物中在兩個造影時間下也觀察到了相似的生物分布模式。討論本實施例證實如在兔中一樣(O’Flaherty，J.T.等，J.Immunol.1181586-1589(1977))，激動趨化肽在猴中誘發(fā)顯著性暫時中性白細胞減少。但在低于10ng/kg肽劑量下，此效應不明顯。如通過肺活性隨時間降低而注意到的那樣，在開始時可能發(fā)生少量的中性白細胞激活。當向帶有輕度無菌炎癥損傷的猴注入標記的HYNIC衍生化趨化肽時，生物分布模式與放射標記白細胞的分布嚴格平行，注射后三小時易檢測到炎癥病灶，靶標-本底比為約3∶1。以很高的比活(＞20,000mCi/μmol)放射標記，放射藥物造影劑量中肽的總量可降至中性白細胞減少的閾值；比活為20,000mCi/μmol時，在10kg動物中注射0.5mCi相當于肽劑量小于2ng/kg。假設血液體積為體重的8％、血細胞比容為50％，該肽劑量相當于起始循環(huán)濃度為60pM，這低于受體激活的EC502個數量級。正如所料，這一肽劑量對外周白細胞水平沒有影響。
本實施例證實放射標記趨化肽類似物是對中性白細胞減少效應敏感的動物中炎癥造影的有效試劑。當在兔中研究這些肽的感染造影特征時得到了相似的結果(Babich，J.W.等，(送交出版))。
雖然在注射后3小時無菌感染位點是很明顯的，但在注射后12小時靶標-本底比大大降低。這明顯不同于帶有大腸桿菌感染病灶位點的兔中的結果，后者為注射后3小時T/B比為約3∶1，在12小時時增至20∶1。這種差異的可能解釋包括損傷強度的差異和細菌感染和無菌炎癥的差別。如果進一步研究證實損傷動力學中的這種差異，可大大提高這些試劑的實用性，因為可能區(qū)別感染和無菌炎癥。實施例102本實施例中，對99mTc-標記激動趨化肽的感染定位特征與傳統(tǒng)的111In標記白細胞在急性細菌感染動物模型中進行比較和對比。選擇兔是因為已知它們對趨化肽的中性白細胞減少效應敏感。
在大腸桿菌感染的兔中比較了99mTc標記的甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-賴氨酰-肼煙酰胺(99mTc-HP)與111In標白細胞(111In-WBC)的生物分布和感染造影特性。給6只動物的各組注射1mCi99mTc-HP＋0.05mCi111In-WBC，在注射后3-6小時和18小時進行系列閃爍照相。在獲得最后的圖象后，處死動物并測定生物分布。
在所有造影時間，99mTc-HP和111In-WBC的生物分布相似，用兩種放射藥物都清楚顯現了感染位點。注射后3、6和18小時的靶標(感染肌肉)與本底(對側正常肌肉)之比(T/B)分別為對99mTc-HP3.38±0.46，3.80±0.37及10.875±1.44；對111In-WBC1.71±0.04，1.81±0.26，及3.79±0.83。T/B的平均比率(99mTc-HP與111In-WBC之比)為2.99±1.88，沒有小于1的值。從直接組織采樣計算的T/B，99mTc-HP的顯著高于111In-WBC的(33.6∶1對8.1∶1，p＜0.01)。這些差異主要是由于99mTc-HP在感染肌肉中絕對積累增加(0.102％I.D./g對0.021％ID./g，p＜0.01)，而不是由于在正常骨骼肌中的積累差異。
這些結果提示很可能由于在感染位點絕對積累增高的結果，99mTc-HP產生的靶標-本底比大于或等于111In-WBC所能達到的。
材料和方法所有無機鹽來自Fisher Scientific Co.。ITLC-硅膠層析條得自Gelman Laboratories(Ann Arbor，MI)。111In-喔星得自Amersham Inc.(Arling ton Heights，IL)。葡庚糖酸亞錫試劑盒(Glucoscan)和99Mo/99mTc發(fā)生劑得自杜邦放射藥物分部(Billerica，MA)。所有其他試劑是可從商業(yè)途徑得到的最高級別的。肽合成用標準固相技術合成并純化N-For-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-賴氨酸。按Babich，J.W.等人在J.Nucl.Med.33910(1990)中描述的方法制備該肽與煙酰肼的偶聯物N-For-Met-Leu-Phe-(N-ε-HYNIC)Lys(HP)。在一2.5×50cm Whatman OBS-3柱上用0.1％TFA中乙腈梯度洗脫，經反相HPLC純化產物。合并含主成分的流份，除去溶劑得到目標產物。用UV、質譜和氨基酸分析鑒定此肽。HYNIC衍生化趨化肽的99mTc標記99mTc-葡庚糖酸鹽用于提供放射標記肼基煙酰胺(Abrams，M.J.等，J.Nucl.Med.312022-2028(1990))結合肽所必需的Tc(V)氧代。向此冷干試劑盒中加入約2.5ml 0.9％NaCl中的99mTc高锝酸鹽。最終放射活性濃度為100mCi/ml，產物的放化純度通過即時薄層硅酸層析(ITLC-sg)來測定，用丙酮和0.9％NaCl作為流動相溶劑。
使用下列步驟用99mTc放射標記趨化肽。將5μl 1mg/ml肽溶液轉至一清潔的玻璃瓶中。向此肽溶液中加入500μl PH5.2的0.1M乙酸鹽緩沖液，再加入500μl99mTc-葡庚糖酸鹽。將此混合物快速渦旋，室溫下靜置1小時。用C18反相柱(300，5μ，45mm×25cm，Vydac)和下列洗脫條件下的HPLC測定放化純度溶劑A水中0.1％三氟乙酸；溶劑B乙腈中0.1％三氟乙酸；梯度10分鐘內由0％B到100％B；流速2ml/分。用Milton-Roy/LDC(Boca Raton，FL)流過式分光光度計監(jiān)測紫外吸收，用Beckman 170(Backman，Columbia MD)監(jiān)測放射活性。用一種雙通道積分儀(Waters Model 746 Data Module，Waters，Marlboro M4)記錄并分析了來自兩種檢測器的輸出信號。
用如上所述用HPLC系統(tǒng)分離99mTc-HP和未標記HP，制備99mTc-HP注射溶液。溫和加熱肽溶液并在N2流下干燥。將殘余物溶解在等滲注射用鹽水中。HPLC分析注射液樣品。111In標記的白細胞從按如下所述進行了感染的供體兔采血，50ml肝素化全血用hetastarch(Hespan，DuPont，Wilmington，DE)1∶1稀釋。按McAfee.J.G.等在J.Nucl.Med.211059-1068 (1980)和McAfee.J.G等人在Semin.Nucl.Med.1483-106(1984)中描述的方法制備111In標記白細胞，但做如下改變。沉降兔血液45分鐘分離富白細胞血漿(LRP)。將LRP以450×g離心5分鐘，將WBC層重懸于10ml鹽水中，靜置60分鐘。吸出上清液，將細胞重懸于5ml鹽水中。攪拌下滴加500μCi111In-喔星，將混合物于37℃保溫60分鐘，間歇攪拌。沉降細胞，將沉積物重懸于貧血小板血漿(PPP)中，450×g離心5分鐘，重懸于注射用PPP中。從標記介質中分離并用PPP洗一次后，以仍保持與細胞結合的活性占開始加入細胞層的111In-喔星活性的百分比計算細胞標記效率。感染模型在所有研究中使用重2.2-3.0kg的雄性新西蘭大白兔。來自單一臨床分離物的大腸桿菌在胰胨大豆瓊脂板上生長過夜，單個菌落用無菌標準鹽水稀釋以產生約1×1011菌體/0.5ml(用分光光度計測定)的渾濁懸液。將0.5ml細菌懸液接種物注入兔左股肌肉深部。
接種后24小時，給因感染股部腫大的兔通過邊緣耳靜脈注射放射藥物。給六只動物注射1mCi99mTc-HP(＞5000mCi/μMol)和0.05mCi111In標記白細胞的混合物。造影注射放射試劑后3、6和18小時，用氯氨酮/xylazine(15.0和1.5mg/kg)麻醉動物，用裝有平行孔中等能量準直儀并與專用計算機系統(tǒng)聯機的大視野γ照相機(Technicare Gemini 700，Technicare 560，Solon，Ohio)進行正前位整體閃爍照相。用雙光子模式，15％窗集中在140KeV光峰(99mTc)和247KeV光峰(111In)，同時獲得111In和99mTc圖象。注射后3和6小時，以預置時間5分鐘/視域獲得2套圖象。注射后18小時，每視域的造影時間延長至10分鐘。將有義區(qū)(ROI)拉向感染區(qū)和對側正常肌肉(本底)。結果以靶標-本底比表示(感染股/對側股)。直接組織采樣法獲得最后的圖象后，注射過量戊巴比妥鈉處死動物，測定生物分布。將血液、心、肺、肝、脾、腎、腎上腺、胃、胃腸道、睪丸、骨、骨髓、正常肌肉、感染肌肉和膿標本稱重，并用井型γ計數器(LKB modle#1282，Wallac Oy，芬蘭)測定放射活性。為了校正放射衰變并能計算每個器官中以占所給劑量的份數表示的放射活性濃度，對注射劑量的等份同時計數。結果以每克中注射劑量的百分數(％I.D./g)、感染與正常肌肉之比和膿與正常肌肉之比表示。
為了確定循環(huán)和感染位點上放射活性的性質，將血液和膿樣品在Lymphoprep中梯度離心分級分離。血漿在一G-100柱(1.0×25cm)上用PH7.4 PBS洗脫進一步分級分離。用111In-IgG、111In-F(ab’)2、125I-人白蛋白及99mTc-DTPA在此柱上做標準曲線。
Phantom研究進行Phantom研究是為了計算111In的174KeV光子在99mTc窗中的交叉量和99mTc的140KeV光子在111In窗中的交叉量。簡言之，給動物注射時，作為注射物的111In和99mTc樣品以相同的比率與250ml鹽水在標準輸液袋中充分混合。將Phantom置于離造影臺5cm處，并在兩個窗中獲得圖像。從拉至每個袋周圍的有義區(qū)(ROI)中計算交叉因子并用于校正99mTc和111In圖象。統(tǒng)計方法按Duncan的新復極差法(Duncan，D.B.，Biometrics.111-42(1955))進行方差分析(ANOVA)，評價造影和生物分布研究的結果。對于造影數據，使用線性模型的雙因素方差分析，其中“注射后時間”和“放射藥物”(99mTc-HP或111In-WBC)是分類變量，T/B＝時間＋放射藥物＋時間×放射藥物。對于生物分布數據，使用線性模型雙因素方差分析，其中器官和放射藥物是分類變量％I.D./g＝器官＋放射藥物＋器官×放射藥物。另外，用線性回歸法比較了111In-WBC和99mTc-HP的靶標-本底比。所有結果以均值±SEM表示。
結果肽合成制備肼基煙酰胺衍生化趨化肽的收率和純度良好。UV分析顯示在268和315nm處有最大吸收。質譜和氨基酸分析(Met-1.00，Leu-1.00，Phe-0.97，Lys-1.00)與預期偶聯肽產物一致。放射藥物ITLC和HPLC分析證明保溫1小時后大于90％的放射活性與肽結合。未純化99mTc-HP的比活經計算大于3000mCi/μMol。利用上文描述的純化步驟，比活性提高到＞10,000mCi/μMol。
用于這些試驗的111In-白細胞標記方法造成純化前標記效率約為70％，最終放化純度＞95％。Phantom研究Phantom研究表明注射放射藥物后3小時，在99mTc窗中檢測到的光子5％歸因于111In。注射后18小時，在99mTc窗中檢測到的光子17％歸因于111In。在這兩個造影時間下，在111In窗中檢測到的光子2％歸因于99mTc。所有造影數據均對這些掠奪(pillover)效應做了校正。造影圖14顯示共同注射99mTc-HP和111In-WBC后6和18小時，有代表性的交叉校正的兔正前位造影圖象。在這兩個造影時間點，兩種放射藥物的總體生物分布幾乎相同。在肺、肝、脾和腎中檢到兩種試劑濃度都高。而在肌肉和胃腸道中兩種示蹤劑的濃度都低。
從造影數據可明顯看出，注射后6和18小時兩點上99mTc-HP以顯著程度定位于感染位點。兩種試劑的T/B比隨時間顯著增加(p＜0.01)。在兩個造影時間點上，99mTc-HP的T/B比顯著大于(p＜0.01)111In-WBC的。兩種放射藥物的靶標-本底比列于圖15中。注射后6小時，99mTc-HP的T/B與111In-WBC注射后18小時的相當。兩種T/B值(99mTc-HP與111In-WBC之比)的平均比率為2.99±1.88，沒有低于1的值。直接組織采樣注射后18小時，用直接組織放射活性測定法測定的99mTc-HP和111In-標記WBC(％I.D./g)的生物分布示于表V中。
表V99mTc和111In-WBC在兔體內的生物分布(％I.D./g，均值±SEM)器官99mTc-HP111In-WBC’s血 0.037/±0.003 0.127±0.0290.043±0.005 0.024±0.004肺 0.192±0.037 0.120±0.007肝 0.207±0.013 0.148±0.020脾 0.601±0.025 2.080±0.237腎 0.136±0.021 0.086±0.016腎上腺 0.103±0.018 0.139±0.026胃 0.050±0.008 0.013±0.003胃腸道 0.047±0.005 0.018±0.004睪丸0.018±0.001 0.028±0.003肌肉0.003±0.001 0.004±0.001骨髓0.159±0.013 0.358±0.107骨 0.033±0.004 0.039±0.007感染肌肉0.101±0.008 0.024±0.002膿 0.188±0.034 0.035±0.008在此時，在幾種組織中發(fā)現這兩種示蹤劑濃度的顯著性差異。99mTc-HP在感染肌肉(p＜0.01)、膿(p＜0.01)、心臟(p＜0.05)、肝(p＜0.05)、胃(p＜0.01)和胃腸道(p＜0.01)中積累較多。而發(fā)現111In-WBC在血液(p＜0.05)、脾(p＜0.01)和睪丸(p＜0.01)中有較高水平。在正常骨骼肌、骨、骨髓、肺、腎上腺或腎中沒有顯著差異。
血液的分級分離結果顯示在兩個時間點，只有25％的循環(huán)99mTc放射活性與白細胞結合，而85％以上的111In放射活性與白細胞結合。兩種放射粒素與紅血細胞的結合均很小(＜2％)。相反，膿的分級分離證明對99mTc和111In兩種者都有約90％的放射活性與WBC結合。血漿柱層析表明未與WBC結合的95％以上99mTc放射活性以150000的表現子分量(IgG部分)被洗脫；在游離肽洗脫位置上沒有檢測到放射活性。柱上放射活性大于90％。
圖16顯示在注射后18小時切下的組織樣品上以直接放射活性測定法測得的，99mTc-HP和111In-WBC的感染肌肉與正常肌肉之比的圖。99mTc-HP的感染肌肉與正常肌肉平均比率顯著高于111In-WBC的(33.0∶1對8.1∶1，p＜0.01)。這一差異是由于99mTc-HP(0.102％I.D./g)與111In-WBC(0.024％I.D./g)相比在感染肌肉中絕對積累的增加造成的，而不定由在正常骨骼肌中的積累差所致(99mTc-HP和111In-WBC分別為0.003％I.D./g對0.004％I.D./g)。線性回歸沒有顯示99mTc-HP和111In-WBC積累間顯著相關(r2＝0.076)。
注射后18小時以直接放射活性測定法測得的、膿與對側正常肌肉的比率綜合在圖17中。膿與正常肌肉平均比率，對99mTc-HP為61.8±11.05，而對111In-WBC為9.32±2.50(p＜0.01)。99mTc-HP(0.188±0.034％I.D./g)與111In-WBC(0.035±0.008％I.D./g)相比在膿中積累較多，這是99mTc-HP的T/B較高的主要原因。
討論本實施例證明對兔中細菌感染造影，99mTc標記趨化肽比111In-WBC優(yōu)越。99mTc標記趨化肽在感染肌肉和膿中的絕對積累水平(％I.D./g)比111In-WBC的高。另外，99mTc-HP的靶標-本底比在所有造影時間點都較大。99mTc-HP注射后6小時的T/B比與111In-WBC注射后18小時的相當，這表明99mTc-標記趨化肽提供了一種用于感染造影的迅速的替代方法。因為在正常肌肉中的積累不顯著，99mTc-HP比111In-WBC的T/B比提高主要是由于99mTc-HP在感染位點的濃度更高。
在對本發(fā)明進行了全面描述后，本領域技術人員將認識到可用許多等價參數、濃度和條件實施本發(fā)明，而不脫離本發(fā)明的精神，也不需要過多的試驗。
雖然已結合其具體實施方案描述了本發(fā)明，但應認識到它還可以進一步變化。本申請意在包括總體上采用了本發(fā)明的原則而且包含了在與本發(fā)明相關的領域中已知或常規(guī)實施的可應用于如下所附權利要求范圍內列出的以上必要特征的本公開內容以外內容的本發(fā)明任何變化、應用或改寫。
權利要求
1.一種檢測個體中感染或炎癥位點的方法，其包括a.給予該個體診斷有效量的可檢測標記的趨化肽X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W其中X為氨基保護基，Y為氨基酸殘基，Z為間隔序列，n為0或1，和W為下式結構的標記或連接取代基-[K]v-M1其中K為中間功能團，v為0或1，M1是診斷學上可檢測的標記；及其中趨化肽在感染或炎癥位點顯著積累，而在無感染或炎癥的位點不顯著積累；和b.檢測該趨化肽。
2.一種檢測個體中感染或炎癥位點的方法，其包括a.給予該個體診斷有效量的可檢測標記的趨化肽X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W其中X為氨基保護基，Y為 其中，R1為芐基，烷基或-CH2-CH2-R2-CH3，和R2為 或-O-Z為間隔序列，n為0或1，和W為下式結構的標記或連接取代基-[K]v-M1其中K為中間功能團，v為0或1，M1是診斷學上可檢測的標記；及其中趨化肽在感染或炎癥位點顯著積累，而在無感染或炎癥的位點不顯著積累；和b.檢測該趨化肽。
3.權利要求1的方法，其中X是選自氨基甲酸酯、羧酰胺、硫代羧酰胺、脲、硫脲和它們相應的氰基胍衍生物、磺酰胺和膦酰胺的氨基保護基。
4.權利要求1的方法，其中X是 其中R3選自氫、烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基、芳烷氧基和氨基，R4是硫屬原子。
5.權利要求4的方法，其中R4是氧或硫。
6.權利要求2的方法，其中R1是-CH2-CH2-R2-CH3。
7.權利要求6的方法，其中可檢測標記的趨化肽是X-Met-Leu-Phe-[Z]n-W。
8.權利要求7的方法，其中甲硫氨酸殘基被4-氨基四氫硫代吡喃-4-羧酸取代。
9.權利要求7的方法，其中亮氨酸殘基被二丙基甘氨酸取代。
10.權利要求7的方法，其中亮氨酸殘基被1-氨基環(huán)己基羧酸取代。
11.權利要求7的方法，其中苯丙氨酸殘基被z-脫氫苯丙羧酸取代。
12.權利要求7的方法，其中苯丙氨酸殘基被2-氨基茚酮-2-羧酸取代。
13.權利要求7的方法，其中苯丙氨酸殘基被苯胺基丙氨酸取代。
14.權利要求1的方法，其中n是1，Z是[R6]m，其中R6是氨基酸殘基，m是大于或等于1的整數。
15.權利要求14的方法，其中m為1，R6選自正亮氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。
16.權利要求14的方法，其中m等于或大于2，每個R6獨立地選自正亮氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。
17.權利要求1的方法，其中可檢測標記的趨化肽選自下組N-For-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys-DTPAN-For-Met-Leu-Phe-Pu-DTPAN-For-Nle-Leu-Phe-Lys-DTPAN-For-Nle-Leu-Phe-Lys(NH2)-DTPAN-For-Met-Leu-Phe-Lys-DTPAN-For-Met-Leu-Phe-D-Lys(NH2)-DTPAN-Ac-Nle-Leu-Phe-Lys(NH2)-DTPAN-芐氧羰基-Met-Leu-Phe-甲酯IBOC-L-甲硫氨酰(亞砜)-L-Leu-L-Phe-L-賴氨酰胺IBOC-正亮氨酰-L-Leu-L-Phe-L-賴氨酰胺N-For-L-甲硫氨酰(亞砜)-L-Leu-L-Phe-DTPA-L-LysN-For-L-甲硫氨酰(砜)-L-Leu-L-Phe-DTPA-L-LysN-異丁基脲-Met-Leu-Phe-羧酸異丁氧羰基-Met-Leu-Phe-N-DTPA-LysN-For-(D)-Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物t-BOC-Nle-Leu-Phe-Lys溶劑化物N-For-甲硫氨酰-亞砜-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物N-For-甲硫氨酰-砜-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物N-氨基甲酰-Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物N-三甲基乙?；?Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物異丁氧羰基-Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物N-For-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Nε-DTPA-Lys異丙基脲-Met-Leu-Phe-Lys-SHNH-BOC異丙基脲-Met-Leu-Phe-正丙基二胺-Asp-SHNH HBr異丙基脲-Met-Leu-Phe-Lys-Asp-SHNH HBr異丙基脲-Met-Leu-Phe-Lys-SHNH HBrN-苯基脲-Met-Leu-Phe異丙基脲-Met-Leu-Phe-丙二胺-SHNHN-正丁基硫脲-Met-Leu-PheN-正丁基脲-Phe-Leu-Phe-Leu-PheN-異丙基脲-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe-COOHiBOC-Met-Leu-Phe-COOHiBOC-Met-Leu-Phe[酰氨基(丙基酰氨基)羧基[(丙基)羧基)]-(酰氨基丙醇SPNH)酯N-異丁基脲-Met-Leu-Phe-羧酸N-正丙基脲-Met-Leu-PheN-叔丁基脲-Met-Leu-PheN-正丁基脲-Met-Leu-PheiBOC-Met-Leu-Phe-(酰氨基乙氧基乙基[3-酰氨基]-6-丙烯醛腙)-吡啶N-iBOC-Met-Leu-Phe-SPNH-硫代酯N-異丙基脲-Met-Leu-PheN-iBOC-Met-Leu-Phe-丙二胺-SPNH環(huán)己基脲-Met-Leu-Phe-COOHN-正丁基氨基甲酸-Met-Leu-Phe-甲酯N-iBOC-Met-Leu-Phe-甲酯N-甲基氨基甲酸-Met-Leu-Phe-甲酯N-金剛烷基脲-Met-Leu-PheN-肉桂?；?Met-Leu-Phe對甲苯基脲-Met-Leu-Phe間甲苯基脲-Met-Leu-PheN-肉桂?；?Phe-Leu-Phe-Leu-Phe。
18.權利要求1的方法，其中M1包括放射性同位素。
19.權利要求18的方法，其中M1是111In或99mTc。
20.權利要求1的方法，其中M1包括順磁性同位素或可通過PET造影的化合物。
21.權利要求18的方法，其中經胃腸外給藥。
22.權利要求20的方法，其中經胃腸外給藥。
23.權利要求21的方法，其中胃腸外給藥途徑包括真皮內、皮下、肌內、腹膜內或靜脈注射。
24.權利要求22的方法，其中胃腸外給藥途徑包括真皮內、皮下、肌內、腹膜內或靜脈注射。
25.權利要求23的方法，其中給藥方法是逐漸灌注。
26.權利要求24的方法，其中給藥方法是逐漸灌注。
27.權利要求25的方法，其中逐漸灌注是利用蠕動工具通過靜脈途徑進行。
28.權利要求26的方法，其中逐漸灌注是利用蠕動工具通過靜脈途徑進行。
29.權利要求29的方法，其中個體是人。
30.權利要求1的方法，其中v是1，K是DTPA、EDTA或HYNIC。
31.權利要求30的方法，其中M1包括放射性同位素。
32.權利要求31的方法，其中M1是111In或99mTc。
33.權利要求30的方法，其中M1包括順磁性同位素或可通過PET造影的化合物。
34.權利要求30的方法，其中K是HYNIC。
35.權利要求34的方法，其中W還包括L，其中L是輔助配體。
36.權利要求35的方法，其中輔助配體包括葡庚糖酸鹽、tricine或另一個肽單元。
37.權利要求36的方法，其中另一個肽單元是X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W，其中W是下式結構的標記或連接取代基。-[K]v-M1，其中K是HYNIC，v是1，M1是診斷學上可檢測的標記物。
38.一種檢測個體中感染或炎癥位點的方法，其包括a..給予所述個體診斷有效量的下式可檢測標記的趨化肽X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W其中X為下式結構的氨基保護基 其中R3選自氫、烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基、芳烷氧基和氨基，R4為氧或硫Y為Met、Phe或Nle，Z為選自1-6個碳原子的脂肪二胺、[R6]m和其混合物的間隔序列，其中R6為氨基酸殘基，m為1-3的整數，n為0或1，及W是下式結構的標記或連接取代基-[K]v-M1其中K為DTPA、EDTA或HYNIC，v為1，及M1是111In或99mTc；且其中趨化肽在感染或炎癥位點顯著積累，而在無感染或炎癥的位點不顯著積累；和b.檢測所述趨化肽。
39.權利要求38的方法，其中Y是Met。
40.權利要求39的方法，其中甲硫氨酸殘基被4-氨基四氫硫代吡喃-4-羧酸取代。
41.權利要求39的方法，其中亮氨酸殘基被二丙基甘氨酸取代。
42.權利要求39的方法，其中亮氨酸殘基被1-氨基環(huán)己基羧酸取代。
43.權利要求39的方法，其中苯丙氨酸殘基被z-脫氫苯丙羧酸取代。
44.權利要求39的方法，其中苯丙氨酸殘基被2-氨基茚酮-2-羧酸取代。
45.權利要求39的方法，其中苯丙胺酸殘基被苯胺基丙氨酸取代。
46.權利要求38的方法，其中n是1，Z是[R6]m。
47.權利要求46的方法，其中m為1，R6選自正亮氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。
48.權利要求46的方法，其中m為2，每個R6獨立地選自正亮氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。
49.權利要求46的方法，其中m為3，每個R6獨立地選自正亮氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。
50.權利要求49的方法，其中K是HYNIC。
51.權利要求50的方法，其中W還包括L，其中L是輔助配體。
52.權利要求51的方法，其中輔助配體包括葡庚糖酸鹽、tricine或另一個肽單元。
53.權利要求52的方法，其中另一個肽單元是X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W，其中W是下式結構的標記或連接取代基。-[K]v-M1，其中K是HYNIC，v是1，M1是診斷學上可檢測的標記物。
54.權利要求38的方法，其中經胃腸外給藥。
55.權利要求54的方法，其中胃腸外給藥途徑包括真皮內、皮下、肌內、腹膜內或靜脈注射。
56.權利要求55的方法，其中給藥方法是逐漸灌注。
57.權利要求56的方法，其中逐漸灌注是利用蠕動工具通過靜脈途徑進行。
58.權利要求38的方法，其中個體是人。
59.一種可檢測標記的趨化肽X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W其中X為下式結構的氨基保護基 其中R3選自氫、烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基、芳烷氧基和氨基，R4為氧或硫Y為氨基酸殘基，Z為選自1-6個碳原子的脂肪二胺、[R6]m和其混合物的間隔序列，其中R6為氨基酸殘基，m為大于或等于1的整數，n為0或1，及W是下式結構的標記或連接取代基-[K]v-M1其中K為DTPA、EDTA或HYNIC，v為1，及M1是111In或99mTc；且其中該趨化肽在感染或炎癥位點顯著積累，而在無感染或炎癥的位點不顯著積累。
60.權利要求59的肽，其中Y是Met、Phe或Nle。
61.權利要求60的方法，其中K是HYNIC。
62.權利要求61的方法，其中W還包括L，其中L是輔助配體。
63.權利要求62的方法，其中輔助配體包括葡庚糖酸鹽、tricine或另一個肽單元。
64.權利要求63的方法，其中另一個肽單元是X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W，其中W是下式結構的標記或連接取代基。-[K]v-M1，其中K是HYNIC，v是1，M1是診斷學上可檢測的標記物。
65.一種適于胃腸外給藥的權利要求59趨化肽的藥物制劑。
66.選自下組的趨化肽N-For-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys-DTPA，N-For-Met-Leu-Phe-Pu-DTPA，N-For-Nle-Leu-Phe-Lys-DTPA，N-For-Nle-Leu-Phe-Lys(NH2)-DTPA，N-For-Met-Leu-Phe-Lys-DTPA，N-For-Met-Leu-Phe-D-Lys(NH2)-DTPA，N-Ac-Nle-Leu-Phe-Lys(NH2)-DTPA，IBOC-L-甲硫氨酰(亞砜)-L-Leu-L-Phe-L-賴氨酰胺，IBOC-正亮氨酰-L-Leu-L-Phe-L-賴氨酰胺，N-For-L-甲硫氨酰(亞砜)-L-Leu-L-Phe-DTPA-L-Lys，N-For-L-甲硫氨酰(砜)-L-Leu-L-Phe-DTPA-L-Lys，N-異丁基脲-Met-leu-Phe-羧酸，異丁氧羰基-Met-Leu-Phe-N-DTPA-Lys，N-For-(D)-Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物，t-BOC-Nle-Leu-Phe-Lys溶劑化物，N-For-甲硫氨酰-亞砜-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物，N-For-甲硫氨酰-砜-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物，N-氨基甲酰-Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物，N-三甲基乙?；?Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物，異丁氧羰基-Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶劑化物，N-For-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Nε-DTPA-Lys，N-金剛烷基脲-Met-Leu-PheN-肉桂?；?Met-Leu-Phe對甲苯基脲-Met-Leu-Phe間甲苯基脲-Met-Leu-PheN-肉桂酰基-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe其中所述趨化肽用診斷學上可檢測的標記物標記，而且所述趨化肽能夠在個體的感染或炎癥位點積累，而在無感染或炎癥的所述位點不顯著積累。
67.權利要求66的方法，其中可檢測標記物是放射性同位素。
68.權利要求67的方法，其中放射性同位素是111In或99mTc。
69.權利要求66的方法，其中可檢測標記物是順磁性同位素或可通過PET造影的化合物。
70.含有下式趨化肽的治療組合物X-Y-Leu-Phe-[Z]n-[T]α其中X為下式結構的氨基保護基 其中R3選自氫、烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基、芳烷氧基和氨基，R4為氧或硫Y為氨基酸殘基，Z為選自1-6個碳原子的脂肪二胺、[R6]m和其混合物的間隔序列，其中R6為氨基酸殘基，m為大于或等于1的整數，n為0或1，T是治療劑，α為0或1；其中趨化肽在感染或炎癥位點顯著積累，而在無感染或炎癥的位點不顯著積累。
71.權利要求70的治療組合物，其中α為1，T選自藥物、植物血凝素、毒素、抗微生物和下式結構的片段-[K]v-[M2]μ其中K為中間功能團，v為0或1M2是治療性放射同位素，及μ是0或1
72.權利要求71的治療組合物，其中v為0。
73.權利要求72的治療組合物，其中M2選自125I、131I、90Y、67Cu、217Bi、211At、212Pb、47Sc、186Re、188Re、105Rh、153Sm和109Pd。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測個體中感染或炎癥位點的方法和治療這種感染或炎癥的方法，其中給予該個體診斷或治療有效量的、在感染或炎癥位點顯著積累的、可檢測標記和治療學上偶聯的趨化肽，所述趨化肽具有通式X-Y-Leu-Phe-[Z]
文檔編號A61K38/06GK1141002SQ94194352
公開日1997年1月22日 申請日期1994年10月24日 優(yōu)先權日1993年10月22日
發(fā)明者A·J·菲什曼, H·F·所羅門, C·K·德里安, G·J·布里杰, J·D·希金斯, S·K·拉森, P·E·赫南德茲, R·H·魯賓, H·W·斯特拉斯, A·J·福瑟洛, D·J·克龍, D·里爾辛格 申請人:綜合醫(yī)院有限公司, 奧瑟藥物有限公司, 約翰遜·馬思公司