專利名稱：制備HMG-CoA還原酶抑制劑及其中間體的酶促羥基化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備用作HMG-CoA還原酶抑制劑和/或在制備HMG-CoA還原酶抑制劑中用作中間體的化合物的酶促羥基化方法。
本發(fā)明提供了制備式Ⅰ化合物、其部分或完全氫化的類似物或者它們的一種鹽的方法， 其中R是烷基或芳基;
Z是開鏈部分
或內(nèi)酯 R2是氫、烷基、銨、烷基銨或堿金屬;
該方法包括如下步驟將式Ⅱ化合物、其部分或完全氫化的類似物或者它們的一種鹽，與一種能夠催化所說式Ⅱ化合物羥基化從而產(chǎn)生所說式Ⅰ化合物的微生物或者來源于所說微生物的酶或者具有來源于所說微生物的酶結(jié)構(gòu)的酶接觸，并實現(xiàn)所說的羥基化作用， 其中R、Z和R2的定義與通式Ⅰ中相同;
其中所說的微生物選自諾卡氏菌屬、Amycolata、Saccharopolyspora、鏈霉菌屬、Amycolatopsis、Saccharothrix、或吉爾霉屬，條件是當(dāng)式Ⅱ化合物是康帕克汀(Compactin)時，微生物不是Amycolata、諾卡氏菌屬或鏈霉菌屬。
本發(fā)明的酶促羥基化方法提供了獲得式Ⅰ化合物的有效手段，所述式Ⅰ化合物本身具有HMG-CoA還原酶抑制活性，和/或在制備其它HMG-CoA還原酶抑制劑中所述式Ⅰ化合物可用作中間體。本發(fā)明方法可在溫和的反應(yīng)條件下進(jìn)行，通過應(yīng)用本發(fā)明羥基化方法，可減小或消除副產(chǎn)物。
本發(fā)明方法進(jìn)一步描述如下本文中所用的術(shù)語“酶促過程”或“酶促方法”是指一種應(yīng)用酶或微生物的過程和方法。
本文中所用的術(shù)語“烷基”，不管單獨出現(xiàn)還是作為其它基團的一部分，是指在其正鏈上含有1至12個碳原子、優(yōu)選1至6個碳原子的直鏈和支鏈的、任意被取代的烴類，如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、叔丁基、異丁基、戊基、己基、異己基、庚基、4，4-二甲基戊基、辛基、2，2，4-三甲基戊基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、上述基團的各種支鏈異構(gòu)體等等。取代基的實例可包括一或多個選自下列的基團鹵素(尤其是氯)、三鹵甲基、烷氧基(例如其中的兩個烷氧基取代基形成縮醛)、芳基如未取代的芳基(例如苯基)、烷基芳基或鹵代芳基、環(huán)烷基如未取代的環(huán)烷基或烷基環(huán)烷基、羥基或被保護(hù)的羥基、羧基、烷氧羰基、烷氨基、二烷基氨基如二甲基氨基、烷酰氨基如乙酰氨基、氨基、芳酰氨基、硝基、氰基、巰基或烷硫基。優(yōu)選的烷基取代基是羥基。
本文中所用的術(shù)語“鏈烯基”，不管單獨出現(xiàn)還是作為其它基團的一部分，是指進(jìn)一步含有至少一個碳碳雙鍵的任意被取代的直鏈或支鏈的如上述對于烷基所述的烴基基團。
本文中所用的術(shù)語“環(huán)烷基”，不管單獨出現(xiàn)還是作為其它基團的一部分，是指優(yōu)選含有1至3個環(huán)并且每環(huán)含有3至12個碳原子(優(yōu)選3至8個碳原子)的任意被取代的飽和碳環(huán)體系，例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、環(huán)癸基、環(huán)十二烷基、金剛烷基。任意的取代基實例包括一或多個如上所述的烷基，或者一或多個作為烷基取代基的上述基團。
本文中所用的術(shù)語“芳基”是指在環(huán)部分含有6至12個碳原子的被取代或者未被取代的單環(huán)或雙環(huán)芳族基團，例如苯基、聯(lián)苯基、萘基、取代的苯基、取代的聯(lián)苯基或取代的萘基。取代基(優(yōu)選3個或更少)的實例包括一或多個下述基團烷基如未被取代的烷基、鹵代烷基或環(huán)烷基烷基、鹵素、烷氧基如未被取代的烷氧基或鹵代烷氧基、羥基、芳基如苯基或鹵代苯基、芳氧基如苯氧基、烷酰氧基或芳酰氧基、烯丙基、環(huán)烷基、烷氨基、二烷基氨基、酰氨基如烷酰氨基或芳酰氨基、氨基、硝基、氰基、鏈烯基、巰基、烷?；蚍减；⑵渲衼喖谆杀坏图壨榛?即有1至6個碳原子的如上所述的烷基)取代的亞甲二氧基、芳基鏈烯基、和/或烷硫基。
本文中所用的術(shù)語“鹵”或“鹵素”是指氯、氟、溴或碘。
本文中所用的術(shù)語“鹽”是指與無機和/或有機堿形成的酸性和/或堿性鹽。優(yōu)選的是無毒且藥學(xué)上可接受的鹽。藥學(xué)上可接受的鹽的實例包括由陽離子如鈉、鉀、鋁、鈣、鋰、鎂、鋅和四甲銨形成的那些鹽以及由胺例如氨、乙二胺、N-甲基葡糖胺、絲氨酸、精氨酸、鳥氨酸、膽堿、N，N＇-二芐基乙二胺、氯普魯卡因、二乙醇胺、普魯卡因、N-芐基苯乙胺、1-對氯苯基-2-吡咯烷-1＇-基-甲基苯并咪唑、二乙胺、哌嗪和三(羥甲基)-氨基甲烷形成的那些鹽。
術(shù)語“藥學(xué)上可接受的陽離子”是指形成藥學(xué)上可接受的鹽的陽性抗衡離子，例如上述的那些離子。
術(shù)語“ATCC”是指一個生物體保藏單位美國典型培養(yǎng)物保藏中心的代碼，該微生物保藏機構(gòu)位于美國的12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852。
按照本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的方法，可以獲得本發(fā)明羥基化方法中所采用的式Ⅱ化合物。例如，在美國專利第4450171號中，公布了這些化合物。
具有下述式Ⅰa的式Ⅰ化合物、其部分或完全氫化的類似物或者它們的堿金屬鹽是優(yōu)選的， 其中R是烷基，R2如式Ⅰ中所定義。
尤其是優(yōu)選的實例是甲基普伐他汀(Methyl Pravastatin)、其部分或完全氫化的類似物或者它們的堿金屬鹽
就用作起始原料而言，具有下述式Ⅱa的式Ⅱ化合物、其部分或完全氫化的類似物或者它們的堿金屬鹽是優(yōu)選的 其中R是烷基，R2如式Ⅱ中所定義。
尤其優(yōu)選的實例是甲基康帕克汀(Methyl Compactin)、其部分或完全氫化的類似物或者它們的堿金屬鹽
甲基康帕克汀其中不存在一或多個雙鍵的本文中所述的式Ⅰ化合物或者任何化合物，可以按照本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的方法，通過氫化其中存在所述雙鍵的相應(yīng)化合物而得到。
本發(fā)明方法的任何產(chǎn)物，可以通過公知的方法分離和純化，例如通過過濾除去細(xì)胞或細(xì)胞物質(zhì)(如果合適)、萃取法、結(jié)晶法、薄層色譜法、柱色譜法、高效液相色譜法等。
上述所示結(jié)構(gòu)的甲基康帕克汀和甲基普伐他汀，在文中是指這些化合物的酸形式;若這些化合物的羧基以堿金屬鹽形式存在，則這些化合物是指其鹽形式。
正如下文所討論的，在進(jìn)行本發(fā)明羥基化方法時，優(yōu)選使用水相介質(zhì)。因此，為制備或者用作起始原料，優(yōu)選其中Z為如上所定義的開鏈部分的那些化合物，因為這些化合物相對于其中Z為內(nèi)酯部分的相應(yīng)化合物而言，具有更大的水溶性。其中Z是內(nèi)酯部分的式Ⅱ化合物，在用于本發(fā)明方法中之前，例如可以先水解成開鏈形式。
本發(fā)明方法中所采用的酶或微生物，可以是任何能夠催化進(jìn)行本文所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)的酶或微生物，而不論其來源或純度。作為催化酶源的合適微生物菌屬包括諾卡氏菌屬、Amycolata、Saccharopolyspora、鏈霉菌屬、Amycolatopsis、Saccharothrix或吉爾霉屬。
適合用于本發(fā)明的菌種實例包括Amycolata autotrophica如ATCC 35204、加里福尼亞鏈霉菌如ATCC 15436、Amycolatopsis mediterranei如ATCC 21411、Saccharothrix australensis如ATCC 31497、桃吉爾霉如ATCC 38591、Saccharopolyspora hirsuta如ATCC 27875、27876或20501、Saccharopolyspora erythraea如ATCC 11635等。特別優(yōu)選的是Amycolata autotrophica如ATCC 35204和Saccharopolyspora hirsuta如ATCC 20501。
關(guān)于使用的微生物，可以使用任何能夠催化如本文所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)的微生物細(xì)胞物質(zhì)進(jìn)行本發(fā)明的方法。所使用的細(xì)胞可以是完整的濕細(xì)胞或干細(xì)胞例如經(jīng)冷凍干燥、噴霧干燥或熱干燥的細(xì)胞。也可以以經(jīng)處理的細(xì)胞物質(zhì)例如破裂的細(xì)胞或細(xì)胞提取物的形式使用細(xì)胞。細(xì)胞或細(xì)胞物質(zhì)，例如分離的真菌菌絲體，可以以游離狀態(tài)應(yīng)用，或者例如通過物理吸附或收集使之固定在支持物上而應(yīng)用。當(dāng)進(jìn)行本發(fā)明方法時，可以采用一或多種微生物菌種。
可以繼所采用的微生物生長之后進(jìn)行本發(fā)明方法，例如，在存在或不存在式Ⅱ化合物起始原料時使微生物生長，收集并且優(yōu)選的是洗滌(如用水洗)微生物物質(zhì)，然后使獲得的微生物物質(zhì)與式Ⅱ化合物起始原料接觸。本發(fā)明方法也可以通過就地發(fā)酵和反應(yīng)而進(jìn)行，即在存在正旺盛生長的微生物時反應(yīng)。
反應(yīng)可以在靜態(tài)下進(jìn)行，或者通過動態(tài)進(jìn)行。當(dāng)將式Ⅱ化合物起始原料加至正旺盛生長的培養(yǎng)物中時，所述動態(tài)優(yōu)選是例如經(jīng)瓶振搖培養(yǎng)物或通氣和攪拌。在此情形下，可以采用消泡劑。
可由本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員進(jìn)行微生物的生長，例如使用含有營養(yǎng)素如碳和氮源及微量元素的合適的培養(yǎng)基?？赏奶荚磳嵗ㄆ咸烟?、甘油、麥芽糖、糊精、淀粉、乳糖、蔗糖、糖蜜、大豆油、棉子油等。可同化的氮源實例包括大豆粉、花生粉、棉子粉、魚粉、玉米漿、胨、稻麩、肉膏、酵母、酵母提取物、硝酸鈉、硝酸銨、硫酸銨等?？上蚺囵B(yǎng)物培養(yǎng)基中加入無機鹽例如氯化鈉、磷酸鹽、碳酸鈣等。還可加入少量金屬鹽或重金屬。
微生物生長的不同階段中可采用相同或不同的培養(yǎng)基。本文中實施例部分描述的培養(yǎng)基是微生物生長的優(yōu)選培養(yǎng)基，本發(fā)明方法中所使用的任何微生物的生長均可采用這些培養(yǎng)基。
當(dāng)被使用時，酶優(yōu)選來自于上述微生物，或者可以經(jīng)合成或其它方法制備酶。例如，酶可從經(jīng)遺傳工程操作的宿主細(xì)胞中獲得。當(dāng)經(jīng)遺傳工程操作的宿主細(xì)胞本身或者其經(jīng)改性的細(xì)胞能夠產(chǎn)生具有源于上述微生物菌屬的酶結(jié)構(gòu)的酶時，也可以考慮使用這些細(xì)胞。
本發(fā)明方法可在水相介質(zhì)如緩沖的水相介質(zhì)中進(jìn)行。水相通常為水，優(yōu)選去離子水或合適的水緩沖溶液，尤其是磷酸鹽緩沖液。對于本發(fā)明羥基化方法，優(yōu)選使用水相介質(zhì)。
本發(fā)明中的反應(yīng)也可在有機介質(zhì)或在有機介質(zhì)和水相介質(zhì)混合物的介質(zhì)中進(jìn)行。有機或有機/水相介質(zhì)的使用可增加水溶性小的式Ⅱ化合物起始原料(例如其中Z是內(nèi)酯部分的式Ⅱ化合物)的溶解度。水溶性小的起始原料可以例如溶解在有機溶劑如甲醇或乙醇中，再將該溶液加到轉(zhuǎn)化反應(yīng)的水相介質(zhì)中。形成該有機介質(zhì)的液體在水中可以是不混溶的，或者優(yōu)選在水中可以是混溶的。有機介質(zhì)的實例包括甲苯、己烷、苯、丙酮、二甲亞砜、環(huán)己烷、二甲苯、三氯三氟乙烷、醇類如甲醇、乙醇或丁醇等等。
在加至反應(yīng)介質(zhì)之前，優(yōu)選將起始原料溶解在例如水或醇中。
反應(yīng)介質(zhì)中，每毫升液體介質(zhì)優(yōu)選含有約0.5～3mg式Ⅱ化合物起始原料。反應(yīng)介質(zhì)的pH優(yōu)選為約6.0～7.5之間。
為進(jìn)行本發(fā)明羥基化反應(yīng)，可以加入水或有機醇，例如鏈烷醇如甲醇或乙醇?；谑舰蚧衔锲鹗荚嫌?，上述物料的使用量優(yōu)選為1摩爾過量，更優(yōu)選更多摩爾過量。
當(dāng)在本發(fā)明方法中被采用時，所加入的微生物細(xì)胞的量對于每mg式Ⅱ化合物起始原料而言，優(yōu)選為約10～1000mg。當(dāng)在本發(fā)明方法中被采用時，所加入的酶的量對于每mg式Ⅱ化合物起始原料而言，優(yōu)選為約1～100mg。
反應(yīng)介質(zhì)優(yōu)選保持在約27～40℃的溫度，更優(yōu)選保持于約28～34℃。反應(yīng)時間依賴于微生物細(xì)胞所產(chǎn)生的酶的數(shù)量或者所用酶本身以及其比活性而變化。典型反應(yīng)時間一般在約2.5～72小時之間。通過升高反應(yīng)溫度和/或向反應(yīng)溶液中增加酶量，可以降低反應(yīng)時間。
HMG-CoA還原酶(3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶，EC1.1.1.34)是膽甾醇生物合成中的關(guān)鍵酶。該酶的抑制劑發(fā)現(xiàn)能用作抗膽甾醇藥劑，即可用于降低或維持血漿膽甾醇水平。HMG-CoA還原劑抑制劑除了可治療和預(yù)防血膽甾醇過多以外，還發(fā)現(xiàn)能用于治療和預(yù)防動脈粥樣硬化、血脂過多、和/或高脂血。
上述式Ⅱ化合物其本身可能具有HMG-CoA還原酶抑制活性(例如甲基康帕克汀)，以及/或者可以在制備其它具有HMG-CoA還原酶抑制活性的化合物時用作中間體。在后一種情形下，本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種方法，其中羥基化作用按照本發(fā)明上述方法進(jìn)行，并且隨后將如此形成的羥基化產(chǎn)物用于制備一種HMG-CoA還原酶抑制劑(例如保護(hù)、加成基團或在其上改性)。優(yōu)選地，相對于制備該抑制劑的羥基化產(chǎn)物可能具有的活性而言，如此制得的抑制劑具有增強了的HMG-CoA還原酶抑制活性。
按照本發(fā)明方法得到的HMG-CoA還原酶抑制劑，可以按照本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的方法，通過經(jīng)選擇的方式和以經(jīng)選擇的劑量，例如對哺乳動物尤其是人給藥。
對于制備HMG-CoA還原酶抑制劑，本發(fā)明特別優(yōu)選的方法包括下列步驟(A)用Amycolata autotrophica(ATCC 35204)或Saccharopolyspora hirsuta的kobensis亞種(ATCC 20501)羥基化其中R為 并且R2為H的式Ⅱa化合物或其鹽，得到具有下式結(jié)構(gòu)的甲基普伐他汀或其堿金屬(尤其是鈉或鋰)鹽
下面的實施例說明本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，而不是為了限制本發(fā)明權(quán)利要求的范圍或精神。實施例中所采用的培養(yǎng)基成分如下培養(yǎng)基 培養(yǎng)基組成成分F7 麥芽汁10g/L、酵母提取物10g/L、胨1g/L、葡萄糖20g/L、加蒸餾水至1升，在高壓滅菌之前調(diào)pH至7.0。
K28 Pharmamedia 25g/L、西瑞糖69g/L、CaCO39g/L、K2HPO40.1g/L、加自來水至1升，在高壓滅菌之前調(diào)pH至6.8～7.0。
F4 胰蛋白胨5g/L、麥芽汁3g/L、葡萄糖10g/L、酵母提取物3g/L、加蒸餾水至1升，高壓蒸汽滅菌。
F46 甘油10g/L、麥芽糖40g/L、烤過的Nutrisoy面粉30g/L、胨10g/L、噴霧干燥的玉米漿10g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、加自來水至1升，在高壓滅菌之前調(diào)pH至5.3。
M124 西瑞糖10g/L、NZ胺B 15g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L、CaCO3、1g/L、加自來水至1升，在高壓滅菌之前調(diào)pH至6.8～7.0。
Mueller-牛肉浸汁300g/L、酪蛋白水解物(technical)Minton液 17.5g/L、淀粉1.5g/L，懸浮于1升蒸餾水或去離子體培養(yǎng)基 水中并加熱至沸騰至完全溶解，最終pH為7.4。
(Difco brand)胰蛋白酶 胰蛋白酶解酪蛋白胨17g/L、phytone胨3g/L、NaCl解酪蛋白 5g/L、K2HPO42.5g/L、葡萄糖2.5g/L，加蒸餾水至大豆液體 1升，高壓蒸汽滅菌。
培養(yǎng)基，BBL brand(1)酵母氮源6.7g/L、葡萄糖50g/L、Sigma腺嘌呤HCl0.09/L、Sigmal-酪氨酸0.06g/L，熱至沸騰并混合Difco酪蛋白水解物2g/L、瓊脂20g/L，加蒸餾水至1升，高壓蒸汽滅菌。
實施例1將一瓶冷凍的Amycolata autotrophica(ATCC 35204)和一瓶冷凍的Saccharopolyspora hirsuta的kobensis亞種(ATCC 20501)解凍并用以接種至各個單獨各含100ml培養(yǎng)基F4的500ml燒瓶內(nèi)。將各燒瓶置于一搖床上以約280轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速于25℃振搖72小時。取該72小時A.autotrophica培養(yǎng)液一部分，分成2.5ml等分試樣，用于接種至六個含50ml培養(yǎng)基F7的250ml燒瓶內(nèi)和六個含50ml培養(yǎng)基K28的250ml燒瓶內(nèi)。相似地，一部分該72小時S.hirsuta培養(yǎng)液的2.5ml等分試樣用于接種至六個含50ml培養(yǎng)基F7的250ml燒瓶內(nèi)和六個含50ml培養(yǎng)基K28的250ml燒瓶內(nèi)。因此，總計有24瓶。將全部的24瓶置于搖床上并以約280轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速于25℃振搖。
振搖24小時后，取1ml經(jīng)過濾除菌的5mg/ml甲基康帕克汀鹽溶液，無菌條件下加至各培養(yǎng)物的三個F7燒瓶和三個K28燒瓶內(nèi)。(由內(nèi)酯制得該鹽溶液，方法是將內(nèi)酯溶解在最小體積的乙醇中，加入約15ml水[產(chǎn)生一些沉淀]，調(diào)pH至約11.8，在65℃水浴中保溫，直至沉淀溶解，再小心地將pH降至7.5。加蒸餾水沖稀至計算的濃度為5mg/ml。此時增加兩個新燒瓶，各培養(yǎng)基的未經(jīng)接種的一個燒瓶內(nèi)加有所述鹽，作為無生物改性的對照。此后，這些燒瓶與經(jīng)接種的燒瓶一樣處理。
相似地，將500+μg/ml劑量的無菌康帕克汀加至各種培養(yǎng)物的三個F7和三個K28燒瓶內(nèi)。增加兩個新燒瓶，各培養(yǎng)基的未經(jīng)接種的一個燒瓶內(nèi)也加有康帕克汀。(接種了康帕克汀的燒瓶其目的是用作陽性對照，表現(xiàn)康帕克汀羥基化作用的正常發(fā)生。未經(jīng)接種的燒瓶用作可能發(fā)生的底物無生物改變的對照)。
重新?lián)u另外的24小時。然后向全部的燒瓶中第二次加入上述相同鹽(這種鹽在先前已加入過)。再重新振搖24小時，接著收集(在T1時刻)八個培養(yǎng)燒瓶，其中包括一個用于各種培養(yǎng)物-培養(yǎng)基-底物混合培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶。分析從收集到的培養(yǎng)燒瓶中的培養(yǎng)液中的底物和羥基化了的產(chǎn)物。
在另外振蕩24小時后，收集其余的20個培養(yǎng)燒瓶(在T2時刻)，其中包括10個甲基康帕克汀鹽樣品和10個康帕克汀樣品。將這些培養(yǎng)液進(jìn)行適當(dāng)?shù)牡孜?產(chǎn)物分析。
分析結(jié)果顯示如下
實施例2將一冷凍小瓶的Saccharapolyspora hirsuta的kobensis亞種(ATCC 20501)解凍并將該菌種接種于含有100mlF4培養(yǎng)基的500ml燒瓶。將該燒瓶置于搖床中以約280rpm、25℃振蕩培養(yǎng)72小時。
將72小時培養(yǎng)液樣品用于接種至二個含有45ml K28培養(yǎng)基的250ml燒瓶。將這兩個燒瓶置于搖床中，于約280rpm，25℃振蕩培養(yǎng)。
在振蕩24小時后，將甲基康帕克汀鹽溶于水中并且制成經(jīng)過濾滅菌的溶液。將該溶液一部分加到其中一個K28燒瓶中。六小時之后，將相同的一部分溶液加到同一燒瓶。還向第二個K28燒瓶中加入一部分這種溶液，同時也向第三個未接種K28燒瓶中加入同樣一部分這種溶液。將所有這三個燒瓶都置于搖床中并且重新開始振蕩18小時。
然后向第一個燒瓶中加入第三次劑量。六小時之后，第一個燒瓶中加入第四次(最后)劑量;向第二個燒瓶加入第二次(最后)劑量;并且向未接種的燒瓶中加入第二次(最后)劑量。
在繼續(xù)振蕩培養(yǎng)42小時后，收集這三個燒瓶，并對所有培養(yǎng)液進(jìn)行甲基康帕克汀和甲基普伐他汀分析。結(jié)果顯示如下
實施例3將各一凍冷管的Amycolata autotrophica(ATCC 35204)，加利福尼亞鏈霉菌(ATCC 15436)，Amycolata hydrocarbonoxydans(ATCC 15104)，Amycolata mediterranei(ATCC 21411)，Amycolatopsis fastidiosa(ATCC 31181)和Saccharopolyspora hirsuta的kobensis亞種(ATCC 20501)解凍并用于接種至各含有100mlF7培養(yǎng)基的500ml種子發(fā)芽器燒瓶中。將所有的燒瓶置于搖床上，以約280rpm轉(zhuǎn)速，25℃振蕩72小時。
將來自每個發(fā)芽器燒瓶的各10ml樣品用于接種各含有120mlK28培養(yǎng)基的相分開的燒瓶中。然后將所有的燒瓶再放回到搖床上。
24小時后，向每個燒瓶中加入500μg/ml的過濾滅菌的康帕克汀(酸形式)。再將燒瓶放回到搖床上。
24小時后，從每個燒瓶中取出各15ml樣品，冷凍后用于后面的分析(T1)。向各個燒瓶中加入第二劑量500μg/ml的無菌酸形式的康帕克汀，將燒瓶放回?fù)u床。
24小時之后，第二次從每個燒瓶中各取出15ml的測試樣品，冷凍用于后面分析(T2);之后24小時，從各個燒瓶中各取出最后的15ml試樣，冷凍用于后面的分析(T3)。
將所有樣品解凍，以便用于分析。分析結(jié)果顯示于如下表中

實施例4將經(jīng)過46小時培養(yǎng)的Saccharopolyspora hirsata的kobensis亞種(ATCC 20501)(在28℃生長)和Amycolata autotrophica(ATCC 35204)(在25℃生長)用于接種含各種培養(yǎng)基的燒瓶(50ml培養(yǎng)基/250ml燒瓶)。每個燒瓶使用5ml的接種物。
將S.hirsuta接種到各含有下列培養(yǎng)基F7、F46、K28、M124、Mueller Hinton、胰酶解酪蛋白大豆液體培養(yǎng)基(TSB)和Y17的兩套相分離的燒瓶。將每種培養(yǎng)基的一個燒瓶置于轉(zhuǎn)速為約280rpm，25℃搖床中，再將每種培養(yǎng)基的另一個燒瓶置于轉(zhuǎn)速為約280rpm，28℃搖床上。將F7和K28培養(yǎng)基的各另外一個燒瓶接種并置于32℃水浴搖床上。
將A.autotrophica接種到各含F(xiàn)7和K28培養(yǎng)基的兩套相分離的燒瓶中。將每種培養(yǎng)基的各一套經(jīng)接種的燒瓶置于轉(zhuǎn)速約為280rpm，25℃的搖床上，并將每種培養(yǎng)基的各一個接種瓶置于轉(zhuǎn)速約為280rpm，28℃的搖床上。
24小時后，向各個燒瓶中加入500μg/g劑量的過濾滅菌的康泊克汀(酸形式)。再將燒瓶放回到同樣溫度的搖床上。
24小時之后，從各個燒瓶中分別取出10ml樣品，冷凍后用于以后的分析(T1)。向各個燒瓶中加入第二劑量500μg/g的無菌酸形式的康泊克汀，再將燒瓶放回同樣溫度的搖床上。
在另外48小時后，獲取第二個10ml樣品(T2)。將T1樣品解凍，并與T2樣品一起進(jìn)行分析。結(jié)果顯示于下面表中



實施例5將在F4培養(yǎng)基中生長67小時的各種微生物培養(yǎng)物用于接種各含50ml的F7培養(yǎng)基的250ml燒瓶以及各含50ml K28培養(yǎng)基的250ml燒瓶中。每個燒瓶用5ml接種物。所使用的生物體是Cellulomonas cellulans(ATCC 12830)、溶黃質(zhì)厄氏菌(ATCC 27402)、Promicromonospora citrea(ATCC 15908)、綠色糖單胞(ATCC 15736)、Saccharopolyspora hirsuta(ATCC 27875)，Saccharothrix australensis(ATCC 31497)和赫斯泰德氏鏈霉菌(ATCC 13449)。將綠色糖單胞和S.hirsuta(ATCC 27875)的轉(zhuǎn)化反應(yīng)燒瓶置于轉(zhuǎn)速為約280rpm，28℃的搖床上;其他的培養(yǎng)物置于轉(zhuǎn)速約為280rpm、25℃的搖床上。在25℃和28℃都以Saccnaropolysporoa hirsuta的kobensis亞種(ATCC 20501)作為對照。
24小時后，向各個燒瓶中加入500μg/g劑量的康帕克汀。
24小時后，向每個燒瓶中加入第二劑量500μg/g的康帕克汀。
96小時之后，從每個燒瓶中取15ml樣品，在-50℃冷凍用于后面的分析。
將樣品解凍并用于分析。結(jié)果顯示于下面的表中


實施例6八個ATCC毛霉菌目真菌和一個Staurophoma sp.ATCC 14288，取自于其生長良好的斜面，接種到含F(xiàn)4培養(yǎng)基的發(fā)芽器燒瓶(100ml F4/500ml燒瓶)，并置于25℃的慢速搖床(約200rpm)。八個毛霉菌目真菌是分枝犁頭霉(ATCC 11613)、家蠅卷霉(ATCC 16008)、刺孢小克銀漢霉的刺孢變種(ATCC 36190)、刺孢小克銀漢霉的美麗變種(ATCC 8688A)、桃吉爾霉(ATCC 38591)，Rhizomucor miehei(ATCC 26912)、寡孢根霉(ATCC 22959)和葡枝根霉(ATCC 14037)。
在振蕩培養(yǎng)72小時后，除刺孢小克銀漢霉的刺孢變種(它是一種大的固體真菌群)外所有發(fā)芽器燒瓶中生長物外觀良好。倒掉刺孢小克銀漢霉刺孢變種，將七個留下的毛霉菌目燒瓶和一個Staurophoma燒瓶分別接種到含F(xiàn)7培養(yǎng)基和K28培養(yǎng)基(每個250ml燒瓶含50ml培養(yǎng)基)的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)燒瓶內(nèi)。每個燒瓶使用2ml的接種物。將所有燒瓶置于25℃的均勻轉(zhuǎn)速(約280rpm)搖床上。
24小時后，向所有燒瓶中加入500μg/ml劑量的康帕克汀，其中包括兩個分別含有F7和K28培養(yǎng)基的未接種的燒瓶中。將所有燒瓶放回到280rpm轉(zhuǎn)速，25℃搖床上。
再培養(yǎng)24小時后，向所有燒瓶中加入第二個500μg/ml劑量的康帕克汀，然后放回到搖床上。
58小時之后，從各個燒瓶中獲取15-20ml樣品并進(jìn)行分析。結(jié)果如下桃吉爾霉F7-康帕克汀621μg/g;普伐他汀274μg/g;普伐他汀副產(chǎn)物比例為2.3∶1;和K28-康帕克汀822μg/g;普伐他汀54μg/g;普伐他汀副產(chǎn)物比例3.4∶1。
其他兩個培養(yǎng)物至多顯示良量的普伐他汀(梨頭霉和寡孢根霉)。所有其他培養(yǎng)物顯示普伐他汀陰性。
實施例7將在F4培養(yǎng)基(每個500ml燒瓶中加入100mlF4培養(yǎng)基，每個瓶都用冷凍小管接種)中培養(yǎng)2天、三天、4天的Saccharopolyspora hirsuta的kobensis亞種(ATCC 20501)用于接種K28培養(yǎng)基的生物轉(zhuǎn)化燒瓶(每個250ml燒瓶含50ml K28)。從每個發(fā)芽器燒瓶取5ml作為接種物接種K28培養(yǎng)基的三個燒瓶。另外，取三天齡的發(fā)芽瓶中的接種物，用不同體積的接種物一式三份接種到K28培養(yǎng)基中。具體地講，使用0.25ml、1.0ml、2.5ml、7.5ml和10ml體積。將所有燒瓶置于轉(zhuǎn)速約為280rpm，28℃的搖床上。
24小時后，向每個燒瓶中加500μg/ml劑量的康帕克汀鈉鹽。
培養(yǎng)另外24小時后，向每個燒瓶中加入1，000μg/ml劑量的康帕克汀鈉鹽。
58小時之后，收集25個燒瓶并用于分析。結(jié)果顯示如下
＊一個具有672μg/g康帕克汀的燒瓶與顯示痕量的兩個燒瓶的平均結(jié)果。
＊＊兩個燒瓶的平均值;可能污染的第三瓶忽略不計了。
權(quán)利要求
1.一種制備式Ⅰ化合物、其部分或完全氫化的類似物或它們的一種鹽的方法， 其中R是烷基或芳基；Z是開鏈部分 并且R2是氫、烷基、銨、烷基銨或堿金屬；該方法包括下列步驟將式Ⅱ化合物、其部分或完全氫化的類似物或它們的一種鹽，與一種能催化所述式Ⅱ的化合物或其鹽羥基化以產(chǎn)生所述式Ⅰ化合物或其鹽的微生物或者來源于所述微生物的酶或具有來源于所述微生物的酶結(jié)構(gòu)的酶相接觸，并且實現(xiàn)所述的羥基化作用； 其中R、Z和R2的定義相同于式Ⅰ，其中所述微生物選自于諾卡氏菌屬、Amycolata、Saccharopolyspora、鏈霉菌屬、Amycolatopsis、Saccharothrix或吉爾霉屬，條件是如果式Ⅱ化合物是康帕克汀，則微生物不是Amycolata、諾卡氏菌屬或鏈霉菌屬。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中Z是所述開鏈部分。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中R是烷基。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中制備具有下列通式的化合物 或其部分或完全氫化的類似物，或它們的一種堿金屬鹽。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中將式Ⅱ的化合物與一種微生物接觸。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述微生物是Amycolata autotrophica ATCC 35204，加里福尼亞鏈霉菌ATCC 15436，Amycolatopsis mediterranei ATCC 21411，Saccharothrix australensis ATCC 31497，桃吉爾霉ATCC 38591，Saccharopolyspora hirsuta ATCC 27875、27875、20501或Saccharopolyspora erythraea ATCC 11635。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述微生物是Amycolata autotrophica ATCC 35204或Saccharopolyspora hirsuta ATCC 20501。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其中在將式Ⅱ化合物與一種微生物或與一種酶接觸前，先將該化合物溶于水或醇中。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其中將式Ⅱ化合物與微生物或酶接觸的步驟是在水相介質(zhì)中進(jìn)行。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中在每ml的水相介質(zhì)中含有約0.5-約3mg的式Ⅱ化合物。
11.權(quán)利要求9所述的方法，其中水相介質(zhì)的pH為約6.0至約7.5之間。
12.權(quán)利要求9所述的方法，其中水相介質(zhì)溫度在約27℃至40℃之間。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中該水相介質(zhì)溫度為約28℃至34℃之間。
14.權(quán)利要求1所述的方法，其中將式Ⅱ化合物與一種微生物或與一種酶相接觸的步驟連續(xù)進(jìn)行約2.5至約72小時之間。
15.權(quán)利要求1所述的方法，其中Z是所述內(nèi)酯。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中式Ⅱ化合物在與一種微生物或與一種酶接觸之前先水解。
17.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述式Ⅰ化合物用于制備HMG-CoA還原酶抑制劑。
18.制備HMG-CoA還原酶抑制劑的方法，包括根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法將式Ⅱ化合物或其鹽羥基化以產(chǎn)生式Ⅰ化合物或其鹽。
19.降低或維持血漿膽甾醇水平的方法，包括給哺乳動物患者施用對于降低或維持血漿膽甾醇水平有效量的、按權(quán)利要求1所述方法制備的化合物。
20.治療動脈粥樣硬化的方法，包括給哺乳動物患者施用對于治療動脈粥樣硬化有效量的按權(quán)利要求1所述方法制備的化合物。
全文摘要
用作為HMG-CoA還原酶抑制劑和/或作為在制備HMG-CoA還原酶抑制劑中的中間體的化合物的酶促羥基化制備方法，使用一種微生物或來源于所述微生物的一種酶或具有來源于所述微生物的酶結(jié)構(gòu)的酶，所述微生物能夠催化所述羥基化過程。
文檔編號A61P3/06GK1106067SQ9411716
公開日1995年8月2日 申請日期1994年10月22日 優(yōu)先權(quán)日1993年10月22日
發(fā)明者B·L·戴維斯, P·M·切諾, L·施扎卡 申請人:布里斯托爾-邁爾斯斯奎布公司