專利名稱：抗真菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及式Ⅰ的新化合物(以下稱作黃褐霉素(Xanthofulvin))或其鹽。
黃褐霉素也以式Ⅰa的互變形式存在。
外觀黃色結(jié)晶熔點249～251℃(分解)分子式C28H18O14＊HRFAB-MS(m/z)(M+H)+計算值579.0775實測值579.0786UV λmaxnm(ε)在甲醇中239(33,600),317(20,400),400(17,800)在甲醇H/1N HCl(100:1)中240(30,900),313(25,000),365(17,900)在甲醇 /1N NaOH(100:1)中233(35,400),383(31,000)IR Vmax(KBr) cm-1: 3430, 1700, 1600, 1480, 1360,1280溶解性:溶于二甲亞砜、甲醇微溶于水不溶于正己烷1H NMR (400 MHz, 2.37 (3H,s), 2.72 (3H,s),CD3OD/CDCl3/DMSO-d64.67 (2H,br s), 6.43 (1H,s),(2:1:1)6.97(1H,s),8.03(1H,s)用TMS作內(nèi)標(biāo))δ:
13C NMR (100 MHz, 16.8, 32.4, 66.6, 102.9, 103.5,CD3OD/CDCl3/DMSO-d6104.9, 110.3, 110.8, 119.2, 120.2,(2:1:1)121.1,126.6,130.0,132.6,139.1,用TMS作內(nèi)標(biāo))δ:139.3,141.6,151.0,152.4,154.1,154.7,156.5,168.6,168.8,171.1,173.6,184.4,202.5＊HRFAB-MS高分辨快原子轟擊質(zhì)譜按照本發(fā)明所提供的方法，黃褐霉素是如下生產(chǎn)的在需氧條件下，于含水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一種屬于正青霉屬(Eupenicillium)的能產(chǎn)生黃褐霉素的微生物，并從培養(yǎng)物中分離出黃褐霉素。
用于上述方法中的微生物可以是屬于能產(chǎn)生黃褐霉素的正青霉屬的任何菌株(包括變種)。特別優(yōu)選的菌株是正青霉NR7125及其變種。正青霉NR7125直接分離自采自日本東京八丈島的小皮傘屬(Marasmius)的子實體，且被鑒定為屬于正青霉屬。
定名為正青霉NR7125的菌株已于1991年9月30日按照《布達(dá)佩斯條約》保藏在日本工業(yè)科技局發(fā)酵研究所，保藏號為FERM-BP3588。正青霉NR7125(FERM-BP3588)的培養(yǎng)特征和形態(tài)特征如下培養(yǎng)特征在查氏酵母提取物瓊脂培養(yǎng)基(CYA)上，菌落快速生長，在25℃下7天內(nèi)達(dá)到直徑為42-45毫米，顯示出絮狀外觀并起輻射狀皺紋。菌絲體是白色的。分生孢子發(fā)生和子囊果形成不顯著，以致不能影響菌落的顏色。不產(chǎn)生滲出物或可溶性色素。反面呈淡黃色(乳黃，芒塞爾顏色體系，2.5Y9/4)。
在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(MEA)上，菌落快速生長，7天后達(dá)到直徑為37-40毫米，顯示絮狀外觀，菌絲體是白色的。分生孢子發(fā)生顯著，特別是在菌落的中心區(qū)域，顯示柔和的藍(lán)綠色(芒塞爾顏色體系，2.5BG7/4)。在瓊脂的表面，有豐富的子囊果形成。沒有滲出物或可溶性色素。反面呈淺黃色(乳黃，芒塞爾顏色體系，5Y9/2)。
在25%甘油-硝酸鹽瓊脂(G-25N)上。菌落生長緩慢，呈致密絨狀，在25℃下7天內(nèi)達(dá)到直徑為16-17.5毫米。分生孢子的生成不顯著。菌絲體是白色的。反面呈乳黃色。瓊脂內(nèi)不存在色素。
在37℃于CYA上，菌落快速生長，達(dá)到直徑為29-33毫米。
形態(tài)特征分生孢子梗自表面菌絲或氣生菌絲長出，平滑且薄壁，一般為細(xì)長形，長度為100-250微米。通常它們終止于有3-5個瓶梗的一輪孢子上(單輪生的)，但有時帶一或兩個，少數(shù)為3個?；?雙輪生的)，?；蟛糠质情L形和分叉的，10-20×2-3微米。瓶梗呈安瓿狀，8-12×2-3.5微米，到帶頂端分生孢子的部分陡然尖削。分生孢子最常見的是近球形，2.9-3.6×2.7-3.3微米，帶有粗糙的疣狀壁，且長成短鏈。子囊果是假薄壁組織的閉囊殼，直徑為100-250微米，變成白色至乳色的，具有菌核狀但柔軟的質(zhì)地，在三周內(nèi)成熟。子囊單個生長，橢圓形，直徑8.4-11.7×6.8-7.2微米。子囊孢子是透明的，近球形至寬橢圓形，直徑2.9-3.5×2.6-3.1微米，帶有具小刺但無翼的壁。
子囊果是菌核狀的，被假薄壁組織的壁所包圍。在CYA和MEA上容易觀察到青霉變形。這些特征清楚地表明，該菌株NR7125(FERM-BP3588)包括在正青霉屬之內(nèi)。因此，該菌株被鑒定為正青霉NR7125。
按照本發(fā)明提供的方法，培養(yǎng)可以在培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行，該培養(yǎng)基含有可被所培養(yǎng)的微生物利用的常見營養(yǎng)物?？梢蕴岬降奶荚从校缙咸烟?、蔗糖、淀粉、甘油、糖蜜、糊精及其混合物。氮源有，例如大豆粉、棉子粉、肉汁、蛋白胨、干酵母、酵母提取物、玉米浸液、硫酸銨、硝酸鈉及其混合物。此外，可以向培養(yǎng)基內(nèi)加進(jìn)其他有機或無機物質(zhì)，以促進(jìn)微生物的生長，并增加黃褐霉素的產(chǎn)量，
此處所用的術(shù)語黃褐霉素指的是烯醇式及二酮式互變體。
本發(fā)明也涉及生產(chǎn)黃褐霉素的方法、能生產(chǎn)黃褐霉素的微生物以及幾丁質(zhì)合酶2的抑制組合物。
幾丁質(zhì)系一線性的N-乙酰葡萄糖胺均聚物，通常在真菌細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)，且廣泛分布于幾乎所有的真菌屬中。幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞壁的次要但必需的成分，它并不存在于哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，所以它已被認(rèn)為是抗真菌劑的最具有吸引力的靶子之一，盡管迄今沒有發(fā)現(xiàn)幾種抑制劑。多氧霉素和煙霧素作為幾丁質(zhì)合酶抑制劑是公知的，但尚未發(fā)現(xiàn)其臨床應(yīng)用。然而，這些化合物仍引起很大關(guān)注，因為它對幾丁質(zhì)合酶的抑制活性特異而強烈。最近鑒定出三種釀酒酵母的幾丁質(zhì)合酶(幾丁質(zhì)合酶1、2和3)，其中幾丁質(zhì)合酶2(Chs2)被證明是三者中間最關(guān)鍵的(N.H.Valdivieso，P.C.Mol，J.A.Shaw，E.CabibandA.Duran.J.CellBiol.，114，101-109(1991);J.W.Shaw，P.C.Mol，B.Bowers，S.J.Silverman，M.H.Valdivieso，A.DuranandE.Cabib.J.CellBiol.，114，111-123(1991))。發(fā)現(xiàn)多氧霉素D和煙霉素X能抑制幾丁質(zhì)合酶1(Chs1)，而不抑制Chs2(E.Cabib.Antimicrob.AgentsChemother.，35，170-173(1991))。
按照本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)某些特定微生物能產(chǎn)生具有高度Chs-2抑制活性的新化合物(此處稱之為黃褐霉素)。按下文所給出的實例所述得到的黃褐霉素的物化性質(zhì)如下
這類物質(zhì)的實例是無機鹽，例如碳酸鈣、氯化鈉、磷酸鹽等等。
培養(yǎng)在需氧條件下于含水培養(yǎng)基中進(jìn)行，優(yōu)選深層發(fā)酵。培養(yǎng)適宜在20°-35℃的溫度進(jìn)行，最佳溫度為27℃。最好在pH為3-9時進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)時間隨培養(yǎng)進(jìn)行時的條件而定。通常進(jìn)行50-200小時培養(yǎng)就足夠了。
可以按照本來已知的方法，將黃褐霉素從發(fā)酵液內(nèi)分離出來。例如，通過離心或過濾，可將菌絲體從發(fā)酵液內(nèi)分離出來，可用與水不相混溶的有機溶劑，例如鏈烷醇(如正丁醇)及酯類(如乙酸乙酯、乙酸丁酯等)，從濾液中提取黃褐霉素。另一方面，可以獲得在分離出的菌絲體內(nèi)所含有的黃褐霉素，例如，用含水丙酮或含水甲醇之類的溶劑提取菌絲體，然后除去溶劑，進(jìn)一步用與水不相混溶的有機溶劑提取殘渣。如此得到的溶劑相用諸如硫酸鈉等干燥劑干燥，而后減壓濃縮。生成的黃褐霉素粗品可用提取法、分配法、沉淀法、柱層析法(用硅膠、氧化鋁等作吸附劑)或用分子篩法純化。
黃褐霉素是作為游離酸被分離出來的，但如有需要，能通過常規(guī)方法將其轉(zhuǎn)變?yōu)榭伤幱玫柠}類，例如鈉鹽、鉀鹽和鈣鹽。
分別測定黃褐霉素對釀酒酵母Chs1和Chs2的抑制活性。
(1)對Chs1的抑制活性用于生產(chǎn)Chs 1的過量生產(chǎn)細(xì)胞是攜有質(zhì)粒(CHS1，URA3)的釀酒酵母(ura 3)。用0.5%洋地黃皂苷在30℃下處理15分鐘使細(xì)胞具有滲透性，接著用終濃度為100微克/毫升的胰蛋白酶于30℃下處理15分鐘。加入大豆胰蛋白酶抑制劑后，取50微升2.5×107個細(xì)胞/毫升，與40微升測定溶液和10微升樣品溶液一起于30℃下保溫1小時，測定溶液中含有50mM MES(pH 6.5)、5mM Mg(OAc)2、32mM N-乙?；咸前泛?.1mM[14C]-UDP-N-乙酰基葡糖胺。加入TCA使反應(yīng)終止，在濾器上收集細(xì)胞，用含有0.3M乙酸的70%乙醇水溶液洗滌。用液體閃爍計數(shù)器對細(xì)胞的放射性計數(shù)。根據(jù)結(jié)合到細(xì)胞上的放射性，測定所形成的幾丁質(zhì)的量(S.J.Silverman，A.Sburlati，M.J.Slater和E.Cabib.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，4735-4739(1988))。黃褐霉素對Chs 1的抑制活性示于表1。
(2)黃褐霉素對Chs2的抑制活性用于生產(chǎn)Chs 2的過量生產(chǎn)細(xì)胞是帶有質(zhì)粒(CHS 1，LEU 2)的破裂Chs 1基因(chs 1∶∶URA 3，ura 3，Leu 2)的釀酒酵母菌株。除測定溶液外，測定方法與上述用于Chs 1的方法相同。用于Chs 2的測定溶液含有30mM Tris(pH7.5)、2.5mM Co(OAc)2、32mM N-乙?；咸前泛?.1mM[14C]-UDP-N-乙?；咸前?見Silverman等人，同上)。黃褐霉素的抑制活性示于表1。
表 1IC50(μM)Chs1Chs2黃褐霉素>2002.2多氧霉素D0.2610.3如以上表1所示，黃褐霉素具有高度的Chs2抑制活性。這樣，黃褐霉素能用作抗真菌劑，例如，用來治療念珠菌感染(念珠菌病)。
未觀察到黃褐霉素的急性毒性。
本發(fā)明所提供的新的黃褐霉素及其鹽能用作藥物，例如制成含有這類化合物及其鹽類的藥物制劑的形式，藥物制劑中混合有適于經(jīng)腸給藥的有機或無機惰性載體物質(zhì)，例如水、明膠、阿拉伯樹膠、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、滑石、植物油、聚亞烷基二醇等。藥物制劑可以固態(tài)形式存在，例如片劑、糖衣丸或膠囊;或以液態(tài)形式存在，例如溶液或懸浮液。
每一劑量單位可以含10-200毫克活性成分。成人日劑量可在10-400毫克范圍內(nèi)，并且可按個體要求加以改變。
以下實例進(jìn)一步闡明本發(fā)明。
實例瓶發(fā)酵從生長良好的正青霉NR7125(FERM-BP3588)斜面上取孢子懸浮液，接種到500毫升錐形瓶內(nèi)，該錐形瓶內(nèi)裝有100毫升由2%葡萄糖、3%甘油、0.5%聚蛋白胨(日本制藥)、0.2%酵母提取物(日本制藥)、0.3%氯化鈉和1%碳酸鈣組成的培養(yǎng)基。將此錐形瓶在27℃下以200rpm振搖3天。將每份2毫升的所得培養(yǎng)物分別轉(zhuǎn)移到50個裝有上述同樣培養(yǎng)基的500毫升錐形瓶內(nèi)。在220rpm的旋轉(zhuǎn)搖床上在27℃下進(jìn)行發(fā)酵。培養(yǎng)5天后，將培養(yǎng)液按下述步驟進(jìn)行分離。
分離步驟用離心法將5升培養(yǎng)液分離成濾液和菌絲體。培養(yǎng)濾液(3.2升)用2升正丁醇在pH9.0條件下提取，并將有機層棄去。而后將水層(3.1升)用5升正丁醇在pH2.0條件下提取，并將有機層減壓濃縮。將濃縮物(24.1克)溶于1升甲醇中，用2升正己烷分配。然后將甲醇層減壓濃縮至干，殘渣(24克)用50毫升甲醇研制。過濾除去沉淀后，將濾液在10.5升SephadexLH-20(Pharmacia)上進(jìn)行柱色譜，用甲醇作洗脫劑。合并活性部分，減壓濃縮，得到淡黃色粉末，用甲醇結(jié)晶，得到32毫克黃褐霉素黃色結(jié)晶。
下列實例闡明含有本發(fā)明提供的黃褐霉素的藥物制劑實例用常規(guī)方法生產(chǎn)每片含有如下成分的片劑黃褐霉素100毫克淀粉26毫克羧甲基纖維素鈣15毫克結(jié)晶纖維素20毫克硬脂酸鎂4毫克165毫克
權(quán)利要求
1.制備式Ⅰ化合物黃褐霉素、其互變體或其鹽的方法，
該方法包括，在需氧條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生黃褐霉素的屬于正青霉屬的微生物，并從培養(yǎng)物中分離出黃褐霉素。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中微生物是正青霉NR 7125(FERM-BP 3588)。
3.制備含有如權(quán)利要求1所定義的黃褐霉素的藥物組合物的方法，該方法包括，用通常的藥用助劑與黃褐霉素、其互變體或其鹽配合。
4.藥物組合物，該組合物含有如權(quán)利要求1所定義的黃褐霉素、其互變體或其鹽，以及通常的藥用助劑。
5.如權(quán)利要求1所定義的黃褐霉素、其互變體或其鹽在制備治療真菌感染的藥物組合物中的應(yīng)用。
6.用權(quán)利要求1或2的方法制備的如權(quán)利要求1所定義的黃褐霉素、其互變體或其鹽。
7.基本上如上所述的黃褐霉素、其制備方法、以及含有黃褐霉素的藥物組合物。
全文摘要
具有上式的黃褐霉素得自正青霉屬的培養(yǎng)物。該化合物具有抗真菌活性。
文檔編號A61P31/04GK1071952SQ9211133
公開日1993年5月12日 申請日期1992年10月8日 優(yōu)先權(quán)日1991年10月9日
發(fā)明者增淵美也子, 奧田徹, 田壽男 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司