專(zhuān)利名稱(chēng)：復(fù)合的活的皮膚等同物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及活的皮膚等同物，特別是涉及復(fù)合的活的皮膚等同物，該等同物是由培養(yǎng)的角化細(xì)胞的表皮層、非常純化的無(wú)孔膠原蛋白層和在多孔的交叉連接的膠原海綿內(nèi)的培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞真皮層組成。本發(fā)明還涉及該復(fù)合的活的皮膚等同物的制備方法。
皮膚等同物有許多種用途，不僅在植皮時(shí)作為人或動(dòng)物皮膚的替代物，也可以作為試驗(yàn)性皮膚用來(lái)測(cè)定藥物及化妝品對(duì)皮膚的影響。
藥理學(xué)的、化學(xué)的和化妝品的試驗(yàn)中主要的困難是難于確定這些產(chǎn)品對(duì)皮膚的效用及安全性。本發(fā)明皮膚等同物的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可用于通過(guò)體外試驗(yàn)，在試驗(yàn)皮膚上顯示出這些物質(zhì)所產(chǎn)生的影響。
雖然皮膚移植術(shù)有了進(jìn)展，但被剝露部分、長(zhǎng)出肉芽的創(chuàng)傷面及燒傷的皮膚移植存在的主要問(wèn)題仍然是愈合問(wèn)題。裂厚自身移植及表皮自身移植(培養(yǎng)的自生角化細(xì)胞)已取得不同程度的成功，但這兩種治療方法有許多缺點(diǎn)例如裂厚自身移植通常無(wú)法用于大面積燒傷(BSA)，並會(huì)引起患者進(jìn)一步損傷，而且對(duì)營(yíng)養(yǎng)障礙性表皮水皰癥(DEB)患者的治療有局限性，還顯示出有限的組織膨脹，並需反復(fù)進(jìn)行外科手術(shù)和延長(zhǎng)住院時(shí)間，以及產(chǎn)生不希望有的外貌后果。表皮自身移植需要生產(chǎn)時(shí)間，成功率低(30～50%)，常常形成自發(fā)性水皰，這種移植術(shù)是脆弱的，難以掌握，而且縮小到原來(lái)的大小的60～70%，在植皮后的大約前15天非常脆弱，對(duì)真皮和表皮都受損傷的深度燒傷，這種治療實(shí)際是無(wú)用的。
另一種治療方法是表皮異體移植(培養(yǎng)性異體同種角化細(xì)胞)。美國(guó)研究者用移植性表皮異體移植術(shù)治療二度燒傷的患者的創(chuàng)傷獲得一些成功。這種異體移植的益處包括有能夠經(jīng)常備有已準(zhǔn)備好的此種移植的供給者，致使患者可以用一種可以產(chǎn)生永久性痊愈的材料，以簡(jiǎn)便的方法加以復(fù)蓋;可以排除因自身移植造成的創(chuàng)面增大和供皮部位的疼痛及感染的危險(xiǎn);用培養(yǎng)性異體移植復(fù)蓋燒傷面，愈合的速度與用自身移植復(fù)蓋燒傷面一樣地快;還可以處理DEB患者。
然而表皮異體移植仍然有表皮自身移植術(shù)的許多局限性。
使全厚皮膚受到損傷的燒傷，毀壞了表皮和真皮，在用培養(yǎng)性皮膚處理時(shí)需要把這兩部分都換掉。
Hansborough，J.F和Boyce，S.T(JAMA 1989，2125-2130)報(bào)導(dǎo)將自身表皮細(xì)胞應(yīng)用于皮膚等同物，然后再移植到傷面上。該方法的主要缺點(diǎn)是要制備皮膚等同物。
而且，該法還要使用6-硫酸酯軟骨素(GAG)，后者在PH中性條件下與膠原有弱鍵結(jié)合，因而可能被釋放到創(chuàng)面區(qū)域，對(duì)人體造成預(yù)料不到的長(zhǎng)期作用。已有報(bào)導(dǎo)GAG會(huì)增進(jìn)傷面瘢痕的形成，這在移植術(shù)中是應(yīng)該避免的。而含有膠原海綿的GAG的另一種作用是可降低膠原血凝的能力，此點(diǎn)被認(rèn)為對(duì)于出血性創(chuàng)傷相當(dāng)?shù)牟焕?。血纖維蛋白凝塊有助于將移植物粘連到傷面上。
而且在這個(gè)方法中，膠原海綿也經(jīng)與0.25%戊二醛(GTA)的交聯(lián)而穩(wěn)定化。這種交聯(lián)膠原被再吸收的速率較慢，並對(duì)細(xì)菌和真菌感染是有耐受性的。在細(xì)胞內(nèi)向生長(zhǎng)的同時(shí)，GAG交聯(lián)的膠原基質(zhì)的浸潤(rùn)變少。與GAG交聯(lián)的膠原可以高分子量的聚合物形式保持這種試劑，並不斷地水解，釋放出GTA，在6周以后還可檢測(cè)出。GTA對(duì)組織培養(yǎng)中的成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒作用提示GTA不是皮膚等同物中理想的交聯(lián)劑，該皮膚等同物被宿主細(xì)胞浸潤(rùn)，且該皮膚等同物中的牛膠原基質(zhì)被迅速地降解，並將GTA釋放到體液中。
最近Bell等(Journal Investigative Dermatology，1983;812S-10S)把由大鼠成纖維細(xì)胞置于溶解的膠原的真皮層和培養(yǎng)的大鼠角化細(xì)胞的表皮層組成的皮膚等同移植物作為異體移植物成功地移植到Sprague Dawley大鼠身上。移植后的組織學(xué)檢查表明，表皮層分化完全，生成橋粒，張力絲、角質(zhì)透明蛋白和基底板。然而用人的成纖維細(xì)胞和角化細(xì)胞試圖再生成活的皮膚等同物卻成功有限。角化細(xì)胞不能完全分化，生成基底板，真皮-表皮關(guān)系是條直線。
上述皮膚等同物的表面的表皮化問(wèn)題使Bell改進(jìn)了他的方法，他用皮膚活組織作為角化細(xì)胞的來(lái)源，如于《國(guó)際PCT應(yīng)用》中所述，公布于WO86/02273。這個(gè)方法的問(wèn)題是，這樣制成的皮膚代用品的整個(gè)表面不均勻，因?yàn)樵摶铙w組織，包括真皮部分，仍然植入在該皮膚代用品中。而且，得到的皮膚代用品的表面積，受能夠從單個(gè)人體上取材的活體組織數(shù)目的限制，取活體組織涉及醫(yī)學(xué)的手段，具有引起感染和瘢痕形成的潛在問(wèn)題。皮膚等同物的鉆孔活體取材是擴(kuò)大生產(chǎn)另一皮膚等同物的方法，是個(gè)費(fèi)時(shí)間的過(guò)程。因而這種皮膚等同物未于臨床應(yīng)用。1988年Colounb等在《燒傷》雜志上發(fā)表文章，報(bào)導(dǎo)用Bell方法失敗率達(dá)100%。
澳大利亞專(zhuān)利申請(qǐng)AU-A-13743/88的發(fā)明者Bernard等利用毛囊鞘中得到的角化細(xì)胞的培養(yǎng)能力，試圖避免上述的問(wèn)題。皮膚活體組織用封閉于根鞘中的毛囊代替，后者垂直位置植入于形成的皮膚代用品的游離表面上。對(duì)上述發(fā)明的主要批評(píng)意見(jiàn)是這種皮膚的性質(zhì)以及表皮生長(zhǎng)時(shí)間會(huì)需數(shù)月之久。
因此，需要發(fā)展活的皮膚等同移植物，此種移植物包括有表皮層和真皮層，能容易制備和保存足夠數(shù)量，以便對(duì)皮膚創(chuàng)傷作簡(jiǎn)便的處理。
在發(fā)展活的皮膚等同物時(shí)，希望它能包含以下數(shù)個(gè)或全部特征它應(yīng)可迅速和持久的粘附在傷面上;應(yīng)可與組織兼容;在與傷面接觸時(shí)應(yīng)有內(nèi)表面，以加速纖維血管組織的內(nèi)向生長(zhǎng);和(或)應(yīng)保護(hù)創(chuàng)面不受感染並防止體液損失。
因此，本發(fā)明的目的是提供至少有這些特征的某幾項(xiàng)的培養(yǎng)的活的皮膚等同物，基本上克服了或改善了前述的一個(gè)或多個(gè)問(wèn)題。
本發(fā)明的一個(gè)內(nèi)容是關(guān)于復(fù)合的活的皮膚等同物，它是由一層培養(yǎng)的角化細(xì)胞的表皮層、非常純凈的無(wú)孔性的膠原層和在多孔的交聯(lián)膠原海綿內(nèi)培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞真皮層所組成。
本發(fā)明的另一內(nèi)容是制備復(fù)合的活的皮膚等同物的方法，包括有獲得皮膚材料;用酶法處理皮膚材料以分開(kāi)表皮和真皮;用酶法處理表皮以游離出角化細(xì)胞;培養(yǎng)該表皮角化細(xì)胞直到產(chǎn)生融合;與此平行或分別地用酶法處理真皮，以游離出成纖維細(xì)胞;培養(yǎng)該成纖維細(xì)胞直到產(chǎn)生亞融合;將培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞接種于多孔的交聯(lián)膠原海綿膜;將接種膠原海綿在其表面上溫孵，使成纖維細(xì)胞在整個(gè)膠原海綿上生長(zhǎng);翻轉(zhuǎn)膠原海綿，將另一表面用一高純的、最好用胃蛋白酶處理過(guò)的無(wú)孔膠原薄層覆蓋以形成層狀的海綿復(fù)合物;溫孵該復(fù)合物使該無(wú)孔膠原發(fā)生聚合;然后接種培養(yǎng)的角化細(xì)胞;溫孵該復(fù)合的皮膚等同物復(fù)合物，以加速細(xì)胞生長(zhǎng)。
成纖維細(xì)胞的初始培養(yǎng)物最好是這樣制備獲取皮膚材料;將皮膚材料混懸于膠原酶溶液中以游離出成纖維細(xì)胞;溫孵該培養(yǎng)物;離心，得到成纖維細(xì)胞的細(xì)胞球;除掉培養(yǎng)基;洗滌細(xì)胞球以除掉殘留的培養(yǎng)基;測(cè)定細(xì)胞數(shù)目和活力;將細(xì)胞接種在培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)成亞融合狀態(tài)。
無(wú)孔的非常純化的膠原最好是選自1型、3型或1、3型混合的膠原。例如由Sigma公司得到的適宜的牛皮膠原。
膠原用胃蛋白酶處理純化比較理想，以除去抗原性物質(zhì)。
所用的膠原海綿任何一種膠原海綿都是適宜的，例如由Mitaplast公司得到的產(chǎn)品。
本發(fā)明所用的角化細(xì)胞最好是用“滴降”法制備。角化細(xì)胞自表皮游離出，得到單個(gè)細(xì)胞的混懸液。該混懸液的分散滴均勻地鋪點(diǎn)在培養(yǎng)基上並溫孵，以便細(xì)胞展開(kāi)並最后融合。
現(xiàn)對(duì)本發(fā)明加以說(shuō)明，但並不只限于這些實(shí)例;關(guān)于附圖的說(shuō)明如下

圖1是本發(fā)明的復(fù)合的活的皮膚等同物生產(chǎn)過(guò)程的表示圖;
圖2a)是該復(fù)合的活的皮膚等同物移植2周后的組織學(xué)形狀;
圖2b)是正常皮膚的組織形狀;
圖3是用本發(fā)明的皮膚等同物后從移植處取皮膚活體組織的組織學(xué);
圖4是本發(fā)明的復(fù)合的皮膚等同物圖;
圖5是人的皮膚移植中皮膚等同物的活體組織檢查。
圖1是用圖解方式表示復(fù)合的活的皮膚等同物的制備過(guò)程。
圖1中，皮膚樣本分離成作為成纖維細(xì)胞(10)源的真皮和作為角化細(xì)胞(11)源的表皮。培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞(10)接種到膠原海綿(12)上，成纖維細(xì)胞在海綿上克隆后，把胃蛋白酶處理過(guò)的無(wú)孔膠原接種到海綿的另一面。再溫孵后，將角化培養(yǎng)物最好用“滴降”法接種到無(wú)孔膠原上，培養(yǎng)后生成皮膚等同物(13)。
適于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的任何種皮膚樣本都可用于本發(fā)明。該皮膚樣品可以是自生的或是同種異體的。
皮膚樣品用胰蛋白酶處理，以將表皮同真皮分開(kāi)(Eisinger。M。皮膚研究方法，D.Skerrow編，(1985)，pp193)。表皮切碎后用胃蛋白酶處理，游離出角化細(xì)胞。用標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)該角化細(xì)胞直到融合。優(yōu)選的情況是角化細(xì)胞以單個(gè)細(xì)胞的懸浮狀態(tài)培養(yǎng)直至融合。
用于本發(fā)明的成纖維細(xì)胞的原始培養(yǎng)物的制備可用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，例如在“在單層培養(yǎng)中家兔成纖維細(xì)胞的特異的膠原酶”一文中所述的方法(Jounal of Brochemistry(1974)137，373-385)。成纖維細(xì)胞的原始培養(yǎng)物最好按如下方法進(jìn)行制備。
皮膚樣本切成1mm見(jiàn)方，懸浮于用Tris-Hcl PH7.4緩沖的膠原酶溶液中。該皮膚樣本可以是自生的或是同種異體的。適宜的膠原酶是溶組織梭菌的膠原酶。皮膚樣本最好以1μg/ml的濃度懸浮于溶液中。懸浮液溫孵后于1500轉(zhuǎn)/秒速度下離心將細(xì)胞自溶液中分出。懸浮液溫孵最好是30分鐘。細(xì)胞球用DMEM洗滌，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定成纖維細(xì)胞的數(shù)目。成纖維細(xì)胞的活力用錐蟲(chóng)藍(lán)染料排斥試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定。成纖維細(xì)胞可直接注射到膠原海綿中或用于接種到培養(yǎng)瓶中，以標(biāo)準(zhǔn)方法使其生長(zhǎng)成亞融合狀態(tài)。意外的是這個(gè)方法比其它已知的方法縮短了2周的時(shí)間，這些已知方法制備成纖維細(xì)胞的原始培養(yǎng)物需3周。
上述培養(yǎng)方法也意外地產(chǎn)生其它的上皮細(xì)胞，這類(lèi)細(xì)胞具有能發(fā)展成汗腺細(xì)胞或其它皮膚細(xì)胞類(lèi)型的潛力。
交聯(lián)的牛膠原海綿膜可以買(mǎi)到，冷凍貯存。使用之前，用滅菌水洗滌海綿，于37℃脫水使膜密致。
將培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞接種于膠原海綿上。有一種實(shí)例是把亞融合細(xì)胞培養(yǎng)物接種到海綿上。該成纖維細(xì)胞接種物的密度最好是大約4×105細(xì)胞/ml。
已接種的海綿用標(biāo)準(zhǔn)方法溫孵以使成纖維細(xì)胞遍布生長(zhǎng)于膠原基質(zhì)上。一種實(shí)例是，海綿在37℃、含5%CO2和飽和溫度下于DMEM和條件培養(yǎng)基中保溫溫孵10天。DMEM和條件培養(yǎng)基最好是每隔一天更換。條件培養(yǎng)基是已在人角化細(xì)胞培養(yǎng)中使用超過(guò)兩天的DMEM。它含有角化細(xì)胞分泌的各種大分子，這些大分子已知可以刺激成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。條件培養(yǎng)基使用之前冷凍貯存，使用時(shí)與新鮮的DMEM以1∶2比例混合之。
然后將海綿翻轉(zhuǎn)，上表面以胃蛋白酶處理的、無(wú)孔的膠原覆蓋。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例是，該覆蓋層是(純制的)胃蛋白酶處理的、無(wú)孔的、無(wú)菌的1型牛膠原，或是1型和3型牛膠原的混合物。牛膠原可以買(mǎi)到，為基本純制的膠原。用Drake，M.P.，Davison，P.F.和Bump，S(1966)Biochemistry 5∶301-312所述的方法經(jīng)胃蛋白酶處理以除去冬孢子肽(teliopeptides)。膠原溶液調(diào)節(jié)PH到中性，用r-射線滅菌。膠原溶液的適宜濃度為2mg/ml。該膠原以薄膜形式涂層于海綿上，37℃溫孵60分鐘使膠原完全聚合。
然后將培養(yǎng)的角化細(xì)胞接種到覆蓋層上。接種的細(xì)胞最好是用含有細(xì)胞的培養(yǎng)基的懸滴接種，細(xì)胞密度為1×105細(xì)胞/滴。海綿于DMEM中補(bǔ)以2%胎牛血清、10mg/ml人表皮生長(zhǎng)因子、0.4mg/ml氫化可替松和10-9M霍亂毒素，在PH7.2，35℃溫孵10天。
在整個(gè)溫孵期間，該皮膚等同物仍浸漬于上述培養(yǎng)基中。
在臨床或離體應(yīng)用該復(fù)合的活的皮膚等同物之前，將無(wú)牛垂體提取液的介質(zhì)加入該培養(yǎng)基中。
在臨床應(yīng)用中，本發(fā)明的復(fù)合的活的皮膚等同物能意外地使愈合的移植物的表皮和真皮間的界面迅速地正?；?。本發(fā)明的皮膚等同物離體培養(yǎng)2周后的組織學(xué)檢查表明，多層化的表皮生長(zhǎng)在均質(zhì)的膜上。本發(fā)明的皮膚等同物在移植2周后活體組織樣本的組織學(xué)檢查證明，在被非炎性結(jié)締組織細(xì)胞所群殖的真皮上形成了完全角化的表皮的角質(zhì)層(見(jiàn)圖2a)。用光學(xué)和電子顯微鏡觀察，明顯地看到一種波形的、形態(tài)學(xué)上成熟的表皮-真皮連接，存在有網(wǎng)狀脊和真皮乳頭的犬牙交錯(cuò)，這是當(dāng)表皮和真皮之間的介面正常化后正常皮膚的特征，並且是非常重要的。
如果皮膚等同物培養(yǎng)時(shí)先浸漬于DMEM培養(yǎng)基中加上0.05×10-3M濃度的Ca++，培養(yǎng)4天，然后將表皮暴露(空氣-液體界面)于含有增高的Ca++濃度0.05×10-3M的DMEM培養(yǎng)其中培養(yǎng)10天，則可以檢查出多層化的分化了的表皮，它是由發(fā)育很好的基板上的基細(xì)胞層和數(shù)層超基細(xì)胞組成，該超基細(xì)胞呈現(xiàn)有早期角化。
上述離體系統(tǒng)非常類(lèi)似于人體皮膚的無(wú)結(jié)構(gòu)性排列和生物合成的產(chǎn)物，可適用于化學(xué)物農(nóng)藥的安全性試驗(yàn)和化妝品的皮膚刺激試驗(yàn)。受試物質(zhì)用于本系統(tǒng)的表面上，可引起細(xì)胞的刺激作用並啟動(dòng)了炎癥反應(yīng)的調(diào)控劑的釋放，該調(diào)控劑可在培養(yǎng)液中測(cè)量。該系統(tǒng)可適用于離體的細(xì)胞毒試驗(yàn)總細(xì)胞-蛋白測(cè)定和中性紅攝入測(cè)定，這些是細(xì)胞中蛋白質(zhì)濃度的量度，提供了存在的活細(xì)胞和死細(xì)胞的定量測(cè)定。
皮膚等同物可在玻璃瓶或器中培養(yǎng)，各種待試化合物應(yīng)用于該培養(yǎng)的皮膚上。經(jīng)不斷地供給適宜的培養(yǎng)基，皮膚會(huì)繼續(xù)生長(zhǎng)，直到試驗(yàn)完成。
膠原海綿提供了一個(gè)暫時(shí)性基質(zhì)，它可將復(fù)合的活的皮膚等同物迅速而持久的粘合于人或動(dòng)物的創(chuàng)傷面上，膠原海綿提供了一個(gè)與傷面接觸的表面，可使纖維血管在傷面處內(nèi)向生長(zhǎng)，并且新皮結(jié)構(gòu)得以發(fā)育。隨著成纖維細(xì)胞與膠原基質(zhì)物理上的相互作用並在生物合成上成纖維細(xì)胞貢獻(xiàn)于膠原基質(zhì)，膠原基質(zhì)發(fā)生變化，逐漸破壞並被內(nèi)源性膠原取代。然而，由于膠原海綿是交聯(lián)性膠原，它們不會(huì)收縮，故可以貯存一段時(shí)間，當(dāng)移植于傷面時(shí)不會(huì)收縮。
置于膠原海綿上表面的胃蛋白酶處理的無(wú)孔膠原可以防止培養(yǎng)的角化細(xì)胞向膠原海綿中侵入，因此可以保障本皮膚等同物的表皮層和真皮層的定區(qū)域化。該覆蓋層也逐漸破壞，以形成真皮和表皮間正常的介面。
本發(fā)明的復(fù)合的活的皮膚等同物大約0.8mm厚，因而比表皮移植要牢固些，在移植時(shí)較容易處理。本發(fā)明的皮膚等同物的應(yīng)用成功率大約為90%，這可歸因于真皮層的存在，它可促進(jìn)移植的血管化作用的發(fā)展。最后，本發(fā)明的復(fù)合的活的皮膚等同物使移植術(shù)一步進(jìn)行，因而只需要單一的移植接受過(guò)程。凡士林紗布可以放到培養(yǎng)的移植物上，以使容易運(yùn)輸和使用該復(fù)合的活的皮膚等同物。
按照本發(fā)明所用的成纖維細(xì)胞和角化細(xì)胞或可以是自生的，或可以是同種異體的。用同種異體細(xì)胞可以使本發(fā)明的活的細(xì)胞等同物容易生產(chǎn)和貯存，因而在處理傷面時(shí)避免了為獲取移植物引起的耽誤。角化細(xì)胞和成纖維細(xì)胞這兩種類(lèi)型的細(xì)胞可按已發(fā)表的方法以單個(gè)細(xì)胞懸浮物的形式冷凍貯存數(shù)月。解凍后，這些細(xì)胞就活了，培養(yǎng)時(shí)可迅速生長(zhǎng)，因而適于生產(chǎn)皮膚等同物。該皮膚等同物已成功地移植于志愿者身上，由于冷卻可抑制皮膚移植的免疫原性(Baldwin，WM等。Transplantation 1973;15∶419-422)，同種異體細(xì)胞的冷凍保存減弱了某些不希望有的抗原。復(fù)合的活的皮膚等同物用于治療創(chuàng)傷表面的可利用性可以提供實(shí)際上是無(wú)限量的可移植性皮膚，作為永久性的傷面敷蓋物的來(lái)源。
現(xiàn)用人的同種異體皮膚細(xì)胞為例，對(duì)本發(fā)明加以說(shuō)明。
實(shí)施例1復(fù)合的移植物是由同種異體的人角化細(xì)胞(HK)和人成纖維細(xì)胞(HF)及細(xì)胞的牛膠原膜經(jīng)分開(kāi)的或平行的培養(yǎng)制得的。皮膚膜經(jīng)用1型牛膠原改良后，得到用以培養(yǎng)HK的平表面。
人體皮膚取自外科手術(shù)標(biāo)本，即新生兒包皮環(huán)切術(shù)(包皮)，切除后，將皮膚放到有Dulbecc′s改良Eagle培養(yǎng)液(DMEM)的無(wú)菌容器內(nèi)。在短時(shí)間內(nèi)將標(biāo)本送到組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，按M.Eisinger的方法(皮膚研究方法，D.Skerow編，1985，P193)用酶法將表皮與真皮分開(kāi)。
角化細(xì)胞以單個(gè)細(xì)胞懸浮物按Eisinger法進(jìn)行培養(yǎng)，該法改良如下HK在DMEM中附加以2%胎牛血清、表皮生長(zhǎng)因子、胰島素和氫化可替松，在PH7.2條件下培養(yǎng)。12-14天后融合的培養(yǎng)物加以采集，或用作傳代培養(yǎng)或接種到膠原膜上。
真皮部分用溶組織梭菌膠原酶消化，以釋離出成纖維細(xì)胞。HF然后用標(biāo)準(zhǔn)方法在DMEM中生長(zhǎng)。
膠原海綿膜(直徑6Cm)冷凍貯存于佩特里培養(yǎng)皿中。為使該膜密致，用無(wú)菌水洗滌，于37℃溫孵器中脫水。然后將海綿于DMEM附加條件培養(yǎng)基中溫孵過(guò)夜，HF的亞融合培養(yǎng)物以4×105細(xì)胞/ml的密度接種到海綿表面上。將海綿置于DMEM中，37℃、5%CO2和飽和溫度下于溫孵器中保溫10天。
每隔一天更換一次培養(yǎng)基，到期后將海綿翻轉(zhuǎn)，以準(zhǔn)備成無(wú)孔表面，為培養(yǎng)的HK提供平面。
疊層采用胃蛋白酶處理的、無(wú)孔的、無(wú)菌的1型牛膠原薄膜。薄膜是由市售的純化的1型膠原經(jīng)胃蛋白酶消化除去冬孢子肽(teliopeptides)和用r-射線滅菌而制成的。膠原溶液PH調(diào)到中性，以薄膜形式用于膠原海綿的表面上，37℃溫孵60分鐘。
培養(yǎng)的HK然后以懸滴方式按1×105細(xì)胞/滴的密度接種到海綿的無(wú)孔表面上，于DMEM附加上述的補(bǔ)充物中溫孵10天。臨床應(yīng)用前，將沒(méi)有牛垂體提取液的培養(yǎng)基加到培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)的移植物上敷蓋上凡士林棉紗，以便容易將移植物轉(zhuǎn)移並固定在創(chuàng)傷面上。
在5個(gè)兒童身上用本發(fā)明的活的皮膚等同物進(jìn)行了8個(gè)手術(shù)，成功率為90%。
在RDEB兒童身上進(jìn)行的上述8個(gè)移植手術(shù)，臨床和組織學(xué)表象提示無(wú)排異反應(yīng)。
然而為了確定培養(yǎng)的同種異體移植物長(zhǎng)期存留的直接證據(jù)和它們對(duì)永久性上皮組織的貢獻(xiàn)，在健康成年志愿者身上進(jìn)行了如下實(shí)例所述的臨床試驗(yàn)。
實(shí)施例2復(fù)合的移植物及同種異體移植物按實(shí)施例1所述方法制出。為培養(yǎng)的角化細(xì)胞準(zhǔn)備好平面后，人的角化細(xì)胞連接到交聯(lián)化的牛膠原底物的表面上，這種“皮膚培養(yǎng)夾心物”成簇的移植到病人的傷床上，此處的膠原基質(zhì)作為構(gòu)架，得以使纖維血管的內(nèi)向生長(zhǎng)從下面的傷床上長(zhǎng)出，因而人的角化細(xì)胞可以存活，並形成了新的皮膚結(jié)構(gòu)。
臨床研究是在4個(gè)志愿者身上為除掉裝飾性紋身而進(jìn)行的，每個(gè)志愿者的臂上切除4塊皮膚，兩塊皮膚切到脂肪處，另外兩塊切除時(shí)留下真皮。全深切除和部分厚度切除部用培養(yǎng)的皮膚和裂厚自身移植皮(作為對(duì)照)進(jìn)行皮膚移植。每個(gè)星期換敷料，直至完全愈合。傷處照相，取活體組織進(jìn)行組織學(xué)檢查以及DNA圖譜法檢查。
志愿者1，兩塊用培養(yǎng)的皮膚植皮，另兩塊用自身移植術(shù)植皮，移植術(shù)2周后無(wú)移植物收縮作用。移植的中央?yún)^(qū)域進(jìn)行活體組織檢查，表明分化良好，表皮多層化，真皮含有許多成纖維細(xì)胞，並且在疏松排列的膠原基質(zhì)中有非炎性細(xì)胞。圖3和5表示術(shù)后2周的培養(yǎng)的移植皮膚進(jìn)行活組織檢查的組織學(xué)，圖4是移植前的皮膚等同物，DNA圖譜表明，給入細(xì)胞和接受細(xì)胞都呈混合的群體，說(shuō)明某些真皮細(xì)胞來(lái)自患者，因?yàn)橛忻黠@的真皮細(xì)胞構(gòu)成的證據(jù)。
志愿者2.任何一塊都沒(méi)有進(jìn)行移植術(shù)，3周后組織學(xué)證明傷處有肉芽生長(zhǎng)。
志愿者3.移植術(shù)4周后愈合無(wú)任何收縮，組織學(xué)檢查證明表皮分化完全，並有細(xì)胞過(guò)多的真皮，DNA圖譜表明有混合的給入細(xì)胞和給入細(xì)胞和接受細(xì)胞的群體。
志愿者4。移植術(shù)8周后，該患者移植的中央?yún)^(qū)域有一些收縮(約15～20%)，表皮分化完全，成熟的真皮沒(méi)有附屬物。
對(duì)本領(lǐng)域熟悉的人顯然可以對(duì)上述本發(fā)明作多種變換和改進(jìn)，而不會(huì)越出本發(fā)明的范圍和真諦。
權(quán)利要求
1.一種復(fù)合的活的皮膚等同物，是由培養(yǎng)的角化細(xì)胞的表皮層、高純的、無(wú)孔的膠原層和在有孔的、交聯(lián)化的膠原海綿內(nèi)的培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的真皮層所組成。
2.按照權(quán)利要求1的復(fù)合的活的皮膚等同物，其特征是，該無(wú)孔的膠原是選自1型膠原、3型膠原或它們的混合物。
3.按照權(quán)利要求1的復(fù)合的活的皮膚等同物，其特征是，該無(wú)孔膠原經(jīng)胃蛋白酶預(yù)處理而高度純凈化。
4.按照權(quán)利要求1的復(fù)合的活的皮膚等同物，其特征是，該成纖維細(xì)胞是由膠原酶處理皮膚樣本而得到的。
5.按照權(quán)利要求1的復(fù)合的活的皮膚等同物，其特征是，角化細(xì)胞層的制備是得到單個(gè)角化細(xì)胞的懸浮液，均勻而斷續(xù)地將懸浮液懸滴分布至無(wú)孔膠原層上，然后溫孵。
6.測(cè)定一種物質(zhì)對(duì)皮膚影響的試驗(yàn)盒，其特征是，按照權(quán)利要求1的復(fù)合的活的皮膚等同物在一種適宜的培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)，並把該物質(zhì)用于該皮膚上。
7.一種制備復(fù)合的活的皮膚等同物的方法，其特征是，(a)獲得皮膚樣本，酶法處理該樣本以將表皮和真皮分開(kāi);(b)用酶法處理表皮，使角化細(xì)胞游離，培養(yǎng)該表皮角化細(xì)胞直到融合;(c)用酶法處理真皮，使成纖維細(xì)胞游離，培養(yǎng)該成纖維細(xì)胞，直到亞融合;(d)將多孔的、交聯(lián)化的膠原海綿膜的一面，接種上(c)步的培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞，溫孵該接種過(guò)的海綿，使成纖維細(xì)胞遍布生長(zhǎng)于膠原海綿上。(e)在多孔膠原的交聯(lián)化的膠原海綿的另一面形成一層無(wú)孔膠原，溫孵，使其聚合成無(wú)孔膠原層;(f)(e)步的聚合層接種(b)步的培養(yǎng)的角化細(xì)胞，這樣得到的復(fù)合的皮膚等同物進(jìn)行溫孵，使其進(jìn)一步細(xì)胞生長(zhǎng)。
8.按照權(quán)利要求7的方法，其特征是，無(wú)孔膠原是選自1型膠原、3型膠原或它們的混合物。
9.按照權(quán)利要求7的方法，其特征是，無(wú)孔膠原經(jīng)用胃蛋白酶預(yù)處理而進(jìn)一步純化。
10.按照權(quán)利要求7的方法，其特征是，用膠原酶處理真皮，使成纖維細(xì)胞游離。
11.按照權(quán)利要求7的方法，其特征是，第(f)步的接種是將角化細(xì)胞的單個(gè)細(xì)胞懸浮液的懸滴，均勻而斷續(xù)地分布到聚合了的無(wú)孔膠原層上。
12.為測(cè)定物質(zhì)對(duì)皮膚影響的試驗(yàn)盒的制備方法，其特征是，按照權(quán)利要求7制備復(fù)合的活的皮膚等同物，然后在空氣中在適宜的培養(yǎng)基中對(duì)此皮膚等同物進(jìn)一步培養(yǎng)。
13.測(cè)定一物質(zhì)對(duì)皮膚影響的一種方法，其特征是，將受試物質(zhì)施于權(quán)利要求1的皮膚等同物上，再于空氣和適宜的培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)，然后觀察或測(cè)定該皮膚等同物的任何變化。
全文摘要
本說(shuō)明書(shū)說(shuō)明了一種復(fù)合的活的皮膚等同物，它是由培養(yǎng)的角化細(xì)胞的表皮層，無(wú)孔膠原層和在多孔的、交聯(lián)化的膠原海綿基質(zhì)上有培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的真皮層所組成。無(wú)孔膠原最好是1型、3型或1和3型混合的牛膠原，并經(jīng)胃蛋白酶處理，敘述了制備該皮膚等同物的方法，以及進(jìn)行離體試驗(yàn)的皮膚等同物試驗(yàn)盒。該皮膚等同物用于皮膚移植并用于離體試驗(yàn)各種物質(zhì)對(duì)皮膚的影響。
文檔編號(hào)A61F2/10GK1071568SQ9110993
公開(kāi)日1993年5月5日 申請(qǐng)日期1991年10月18日 優(yōu)先權(quán)日1990年4月24日
發(fā)明者馬克·艾森泊格 申請(qǐng)人:馬克·艾森泊格