專(zhuān)利名稱(chēng)：抗腫瘤生物制劑的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高效、譜廣的抗腫瘤生物制劑(簡(jiǎn)BC-369以下同)的制造方法。利用本發(fā)明方法制造的BC-369對(duì)肝癌、肺癌、惡性淋巴癌、宮頸癌、白血病、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌都有明顯的治療效果。
目前尚未發(fā)現(xiàn)抗腫瘤效果較高的生物制劑，因此也未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的制造方法?，F(xiàn)在國(guó)內(nèi)外承認(rèn)和使用的抗腫瘤生物制劑為“卡介菌”其制造方法是從結(jié)核菌培養(yǎng)、分離而得。用這種方法制造的“卡介菌”對(duì)腫瘤雖有抑制作用，但主要增強(qiáng)機(jī)體的免疫力、食欲和抵抗力，對(duì)腫瘤的治療作用很小。
本發(fā)明的目的在于提供一種抗腫瘤譜廣、治療作用顯著，既有免疫作用、又有對(duì)癌細(xì)胞有殺傷作用的生物制劑的制造方法。
本發(fā)明的制造方法是將雞新城病毒、神經(jīng)氨酸酶、唾液酸酶、核酸酶、生物素、磷脂、膽固醇、巖藻糖和附加劑糖蛋白G1，糖蛋白G2，尿嘧啶、維生素C、三磷酸腺戎(ATP)、氯化鉀、半乳糖、吐溫-80，硫酸鎂等配制而成。
本發(fā)明的制造方法包括下列步驟1、雞新城病毒的培養(yǎng)和選擇。
首先選擇出呼吸道紊亂，伴有羅音、氣喘和咳嗽、抑郁、虛脫和嚴(yán)重腹瀉、排出綠色稀糞的患雞瘟的病雞。然后，從病雞呼吸道分泌物或肺組織中分離出雞新城病毒。
選擇健康母雞孵育的雞胚，最好為9-11令的雞胚，將上述分離的雞新城病毒接種于雞胚的尿囊腔中。置于37-38℃下培養(yǎng)48-72小時(shí)。至胚內(nèi)含大量病毒，呈現(xiàn)較高血凝性。
從雞胚中抽出尿囊液，利用血凝集抑制試驗(yàn)方法，進(jìn)行病毒定性。
2、雞新城病毒的擴(kuò)大種植，培養(yǎng)和雞新城病毒尿囊液的收集先用抗菌素處理病料(即上述雞新城病毒尿囊液)，使病料中的抗菌素濃度分別為每毫升青霉素1000單位和鏈霉素1000毫克。也可以用靜脈滴注金霉素處理，濃度為每毫升1毫克，處理的病料置于4℃中感作1-2小時(shí)。
選擇10-12日令的雞胚，畫(huà)出氣室和胚位，在氣室接近胚位處涂3%的碘酒和75%的酒精消毒，用無(wú)菌鋼錐穿一小孔，隨后將注射器沿小孔插入0.5～1.0厘米處，注入0.1～0.2毫升接種物(即上述采用抗菌素處理過(guò)的雞新城病毒尿囊液)，用石蠟封口，在孵育箱中孵育48-72小時(shí)。
將孵育好的雞胚凍死，用碘酒和酒精消毒后，除去氣室端的卵殼或人工卵窗的封蓋物，除去卵殼、撕去內(nèi)層殼膜和絨毛尿囊膜，直接吸收尿囊液。
以上各項(xiàng)操作必須在無(wú)菌條件下進(jìn)行。
3、雞新城病毒尿囊液效價(jià)測(cè)定及效價(jià)調(diào)整。
利用紅細(xì)胞凝集法測(cè)定效價(jià)，然后將測(cè)定的雞新城病毒尿囊液的效價(jià)調(diào)整到1∶640。方法是取雞新城病毒尿囊液10毫升測(cè)定其效價(jià)，若效價(jià)低于1∶640，則滴加無(wú)菌高效價(jià)1∶1280雞新城病毒尿囊液，使抽樣10毫升的效價(jià)達(dá)1∶640為止，算出滴加無(wú)菌高效價(jià)的毫升數(shù)。
利用公式計(jì)算配制效價(jià)1∶640雞新城病毒尿囊液X毫升需加無(wú)菌高效價(jià)(1∶1280)雞新城病毒尿囊液的毫升數(shù)＝效價(jià)低于1∶640的雞新城病毒尿囊液X毫升× (滴加高效價(jià)毫升數(shù)(1∶1280))/(抽樣毫升數(shù)(10毫升))取雞新城病毒尿囊液10毫升測(cè)效價(jià)若高于1∶640則滴加生理鹽水(0.85%)，使取樣10毫升效價(jià)為1∶640為止，算出滴加無(wú)菌生理鹽水毫升數(shù)。
利用計(jì)算公式配制效價(jià)1∶640雞新城病毒尿囊液X毫升需加無(wú)菌高效價(jià)(1∶1280)雞新城病毒尿囊液的毫升數(shù)＝效價(jià)高于1∶640的雞新城病毒尿囊液X毫升× (生理鹽水毫升數(shù))/(抽樣毫升數(shù)(10毫升))4、對(duì)調(diào)整好效價(jià)的尿囊液進(jìn)行滅菌，滅菌方法可采用中速低溫離心法滅菌，也可以采用過(guò)濾法滅菌，即用0.2-0.5mμ濾膜過(guò)濾滅菌。還可以采用低溫滅菌即在-70℃以下或-196℃以下(液氮)中保存滅菌。
5、雞新城病毒尿囊液、酶、附加劑注射液的配制。
雞新城病毒尿囊液三酶及附加劑配制成BC-369注射液的具體方法。
A糖蛋白G10.72克糖蛋白G20.36克按順序溶于160毫升0.075NHCL溶液中，置水浴中半小時(shí)。
B生物素1.0毫克先溶于7.5毫升去離子水中，再加入0.1毫升1NHCL再加去離子水至10毫升。
C磷脂2.0毫克膽固醇4.0毫克將磷脂溶于4毫升95%酒精中，然后加入膽固醇，用力振蕩使之溶化，再加入5%吐溫-80水溶液10毫升。
D唾液酸酶2毫克，溶于10毫升去離子水中。
E尿嘧啶10毫克溶于100毫升去離子水中，予先在瓶?jī)?nèi)加0.35毫升的濃NH4OH。
F神經(jīng)氮酸酶2毫克溶于20毫升去離子水中，4℃冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?br> GVjt C5毫克溶于10毫升去離子水中。
H核酸酶2毫克。
溶于10毫升去離子水中，4℃冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?br> I95%ATP200毫克溶于10毫升去離子水中。
J雞新城病毒尿囊液1500毫升去菌備用。
K凝血素10毫克溶于去離子水中，室溫保存。
L各組溶液混合秩序1.先加160毫升A溶液。
2.加B溶液2毫升。
3.加F溶液20毫升。
4.加10%KCL22毫升。
5.加MgSO4·7H2O3.6克。
6.加半乳糖水溶液25毫升。
7.加巖藻糖水溶液10毫升。
8.加唾液酸酶水溶液10毫升。
9.加C溶液14毫升。
10.加H溶液10毫升。
11、加J200毫升。
12、加E溶液54毫升。
13、加G溶液10毫升。
14、加J溶液1500毫升。
15、加K溶液20毫升。
配制好的注射液進(jìn)行灌封，灌封必須在同一室內(nèi)進(jìn)行，間隔不能超過(guò)6小時(shí)，且要在嚴(yán)格的無(wú)菌操作條件下進(jìn)行，室溫4℃以下為宜。
本發(fā)明具有如下的優(yōu)點(diǎn)和效果利用本發(fā)明的方法所制備的生物制劑BC-369，對(duì)動(dòng)物試驗(yàn)和對(duì)人的臨床試驗(yàn)都顯示了較好的治療效果。
一、對(duì)動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果。
①BC369對(duì)昆明雜系小鼠EAC的影響B(tài)C369 24μg/kg48μg/kg腹腔注射給藥后12只小鼠長(zhǎng)期存活30天以上，4只死亡小鼠均為30天后意外死亡或處死。而非治療組則于接種后第16天內(nèi)全部死亡，平均生存時(shí)間為12.7天。
②BC369對(duì)S180、HAC和Lewis肺癌的抑制作用不同劑量的BC369經(jīng)腹腔給藥后對(duì)S180、HAC和LeWis肺癌有較強(qiáng)的抑制作用(P＜0.001)見(jiàn)表權(quán)利要求
1.一種抗腫瘤生物制劑(BC-369)的制造方法，其特征在于，該方法包括下列步驟(1)雞新城病毒的培養(yǎng)和選擇①選擇患雞瘟的病雞。②從病雞的呼吸道或肺組織中分離病毒。③將病毒接種于雞胚尿囊腔中。④將接種病毒的雞胚在37～38℃繼續(xù)培養(yǎng)48～72小時(shí)內(nèi)含大量病毒。⑤病毒定性。⑥選擇高效價(jià)病毒1∶1280或1∶2560為毒種、(2)雞新城病毒的種植、培養(yǎng)和雞新城尿囊液收集。①雞胚的培養(yǎng)。②將高效價(jià)病毒尿囊液用抗菌素處理后在4℃冰箱中放置1～2小時(shí)后，無(wú)菌操作下接種于雞胚尿囊腔中，并繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)，然后放入4℃冰箱中12小時(shí)使雞胚死亡。③將培養(yǎng)好的雞卵剖開(kāi)收獲尿囊液。④利用紅細(xì)胞凝聚法測(cè)定效價(jià)和滴定法調(diào)整效價(jià)至1∶640。⑤病毒尿囊液利用過(guò)濾法和冷凍法滅菌。(3)病毒尿囊液、酶、附加劑注射液配制。在效價(jià)為1∶640的雞新城病毒尿囊液1500毫升中順序加入下列滅菌后的成份①糖蛋白G0.36～0.72g濃度為0.075N的稀鹽酸溶液160毫升。②含生物素1.0毫克濃度為1NHCL的0.1毫升溶液。③神經(jīng)氮酸酶2毫克的無(wú)離子水溶液20毫升。④10%KCL水溶液22毫升。⑤MgSO4·7H2O3.6克。⑥半乳糖10克無(wú)離子水溶液25毫升。⑦巖藻糖5克無(wú)離子水溶液10毫升。⑧含唾液酸酶2.0毫克無(wú)離子水溶液10毫升。⑨含磷脂2.0毫克，膽固醇4.0毫克，95%酒精-吐溫80，水溶液14毫升。⑩核酸酶2毫克無(wú)離子水溶液10毫升。⑾95%ATP200毫克。⑿含尿嘧啶10毫克0.35毫升的濃NaOH。⒀含VitC5毫克無(wú)離子水溶液10毫升。⒁含凝血素10毫克無(wú)離子水溶液20毫升。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤生物制劑的制造方法，用其生產(chǎn)的制劑對(duì)多種小鼠移植性腫瘤。Ehrlich腹水癌、小鼠原發(fā)性肝癌、S180肉瘤、Lewis肺癌、L1210淋巴細(xì)胞白血病、LA-795肺腺癌、MA-737乳腺癌均有較好的抑制和殺傷作用。臨床試驗(yàn)中已證實(shí)對(duì)于人原發(fā)性肝癌、惡性淋巴瘤、子宮頸癌白血病等有顯著療效；對(duì)乳腺癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌等有效。瘤體生長(zhǎng)抑制率。生存時(shí)間，均優(yōu)于化療和其它治療。毒副作用小，生產(chǎn)工藝比較簡(jiǎn)單，社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益好的一種新型生物抗癌制劑。
文檔編號(hào)A61K39/17GK1052049SQ89108848
公開(kāi)日1991年6月12日 申請(qǐng)日期1989年11月24日 優(yōu)先權(quán)日1989年11月24日
發(fā)明者張炳團(tuán) 申請(qǐng)人:張炳團(tuán)