專利名稱:加壓素拮抗劑的制作方法
本發(fā)明涉及某些新的、具有強(qiáng)加壓素拮抗劑活性的環(huán)狀八肽。這些八肽的結(jié)構(gòu)的特征在于，它具有由兩個(gè)堿性氨基酸殘基，組成的二肽尾端，并直接聯(lián)接于加壓素樣環(huán)的半胱氨酸殘基位上。
M.Manning等人(見Nature，308，652(1984)和美國(guó)專利4469679號(hào))已經(jīng)公開了一些加壓素樣拮抗物的9位末端甘氨酸殘基可被除去或用L或D-丙氨酸、絲氨酸或精氨酸置換而不影響它與加壓素受體的結(jié)合。
美國(guó)專利4481194號(hào)和4481193號(hào)則公開了，從加壓素拮抗物結(jié)構(gòu)的7位上除去脯氨酸，或從7位和9位上除去脯氨酸及甘氨酸，所得化合物仍可保留有基本的、但稍為降低了的拮抗物活性。
本發(fā)明的加壓素樣化合物具有不同于先有技術(shù)的結(jié)構(gòu)，其特征在于它有兩個(gè)堿性氨基酸殘基-如精氨酸和賴氨酸-直接聯(lián)接于二硫VSP環(huán)上。這類化合物是效力很強(qiáng)的加壓拮抗物。
在本申請(qǐng)的說明書和權(quán)利要求
中，均使用肽和加壓素化學(xué)領(lǐng)域中通用的術(shù)語。如未特別指明構(gòu)型，所有氨基酸殘基均為L(zhǎng)型，或天然存在的構(gòu)型。為清楚起見，在某些結(jié)構(gòu)式中，加注了含硫成員Cap、Mpa和Cys殘基。
本文所用的某些肽的縮寫符號(hào)如下Cap，β-巰基-β，β-環(huán)亞烷基丙酸;pmp，β-巰基-β，β-環(huán)亞戊基丙酸;Mpr，β-巰基丙酸;dpen，β-巰基-β，β-二甲基丙酸或脫氨青霉胺;Tyr(Alk)，鄰位-烷基酪氨酸;Abu，α-氨基-正丁酸;Chg，環(huán)己基甘氨酸;Cha，環(huán)己基丙氨酸;Pba，α-氨基苯丁酸;Gln，谷氨酸酰胺或谷氨酰胺;Gly，甘氨酸;Tyr，酪氨酸;Phe，苯丙氨酸;Phe(4′-Alk)，4′-烷基苯丙氨酸;MeAla，N-甲基丙氨酸;Val，纈氨酸;Ile，異亮氨酸;Nle，正亮氨酸;Leu，亮氨酸;Ala，丙氨酸;Lys，賴氨酸;Arg，精氨酸;HArg，高精氨酸;MeArg，N-甲基精氨酸;MeHArg，N-甲基高精氨酸;MeLys，N-甲基賴氨酸;Met，蛋氨酸;Asn，天冬酰胺;Sar，肌氨酸;Tos，甲苯磺酸酯;BHA，二苯甲基胺;DMAP，4-二甲胺基吡啶;DIEA，二異丙基乙胺;HF，氟化氫;4-MeBzl，4-甲芐基;TFA，三氟乙酸;DCC，二環(huán)己基碳二亞胺;Boc，叔丁氧基羰基;z，芐氧基羰基;VSP，加壓素;HBT，羥基苯并三唑;ACM，乙酰氨基甲基;Mpa，非環(huán)β-巰基丙酸。上述例如MeArg的定義中，Me表示該甲基位于與之有關(guān)的肽殘基之酰氨基的氮上。
“Alk”代表1-4個(gè)碳原子的低級(jí)烷基。例如，這些烷基可連接到2位的酪氨酸殘基的氧取代基上，或接到尾端的N末端氮上，或者接到在3位的Phe殘基的4′位上。這樣的烷基取代基包括甲基、乙基、正丙基、異丙基或丁基，其中較好的是乙基。文中所用的“加壓素”這一術(shù)語，除經(jīng)修飾者外，是指L-精氨酸加壓素(AVP)，1位上的1-(β-巰基環(huán)亞烷基)-丙酸(Cap)本文中常常為方便計(jì)記作Pmp，因含1，5-亞戊基的殘基位是較常選用的。所有的β-巰基丙酸本文中常常記作Mpr。
本發(fā)明之基本的加壓素拮抗劑化合物可用下列結(jié)構(gòu)式闡明
其中P是Arg、Lys、HArg、MeArg、MeLys或MeHArg的D-或L型異構(gòu)體;
A是Arg、Lys、HArg、MeArg、MeLys或MeHArg的D或L型異構(gòu)體;
B是OH、NH2或NHAlk;
Z是Phe、phe(4′-Alk)、Tyr(Alk)、Ile或Tyr;
X是Phe、Phe(4′-Alk)、Val、Nva、Leu、Ile、Pba、Nle、Cha、Abu、Met、Chg、Tyr或Tyr(Alk)的D或L型異構(gòu)體;
Y是Val、Ile、Abu、Ala、Chg、Gln、Lys、Cha、Nle、Thr、Phe、Leu或Gly;且R1和R2各是氫、甲基，或者一起并與他們相連結(jié)的β碳一道形成4-6元亞烷基環(huán)。
本發(fā)明化合物的一個(gè)亞群包括有其中P是Arg、A是Arg及B是NH2的式Ⅰ之化合物。式Ⅰ中R1和R2最好是環(huán)亞戊基。
本發(fā)明還包括加成鹽、復(fù)合物或前體藥物，如本發(fā)明之化合物的酯(當(dāng)B是OH)，特別是無毒的、醫(yī)藥上可接受的酸的加成鹽。酸加成鹽是用標(biāo)準(zhǔn)方法在合適溶劑中用母體化合物和過量的酸制備的，所用的酸如有鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、馬來酸、琥珀酸、乙磺酸或甲磺酸。式Ⅰ的終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)上具有兩個(gè)強(qiáng)堿性基團(tuán)，所以很容制得其酸加成鹽衍生物。終產(chǎn)物之酸形式的酯衍生物，如甲酯、乙酯或苯甲酯，是按已知的方法制備的。
本發(fā)明的終產(chǎn)物(Ⅰ)是通過氧化下述線性七肽制得的
其中X、Z、Y、P、A、B、R1和R2的定義如式Ⅰ所述。巰基是在1和6位上的氨基酸殘基Q各是氫或是可被除去的保護(hù)基，例如乙酰氨甲基(ACM)。結(jié)構(gòu)式(Ⅱ)的二硫醇基也可在當(dāng)8位的殘基是酯或酰胺衍生物的形式被氧化。例如，酰胺可以是其中B是-NHAlk或-NH2的結(jié)構(gòu)式(Ⅱ)的那些肽。酯的B則可為OAlk或OBzl。
所說的氧化作用是用過量的堿金屬鐵氰化物(如鐵氰化鉀或鐵氰化鈉)與線性中間體(Ⅱ)反應(yīng)進(jìn)行的。反應(yīng)過程使用的是一種合適的惰性溶劑-最好是與水混溶的溶劑，并于中性PH(約7-7.5)條件下完成。反應(yīng)在常溫或較低溫度下進(jìn)行，直至反應(yīng)基本完成。線性肽二硫醇和氧化劑的濃度最好要低，例如，在幾升水溶液中有0.01-0.1摩爾濃度的氧化劑即可環(huán)化1-5克二硫醇。
亦可將氧化能力大致相等于鐵氰化物的其它溫和的氧化劑用于閉環(huán)反應(yīng)。這些替代的方法有例如將氧通過反應(yīng)溶液數(shù)天、溶于甲醇的碘、過氧化氫或于二價(jià)銅鹽存在下氧化等。當(dāng)可被取代的硫醇保護(hù)基，例如Pmp殘基上的硫醇基上的硫醇保護(hù)基被分子內(nèi)取代時(shí)，亦可發(fā)生環(huán)化作用。
一種特別有用的硫基保護(hù)基是乙酰氨基甲基(ACM)。用碘/乙醇可有接進(jìn)行雙-ACM-S線性肽的-勺燴氧化。
當(dāng)然，本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員會(huì)理解到，如果在結(jié)構(gòu)式Ⅱ的起始原料結(jié)構(gòu)中存在有干擾反應(yīng)的部位，則某些環(huán)化方法是不適用的。線性硫醇原料可在各種線性殘基上暫時(shí)存在有共同的保護(hù)基。
線性肽的肽鏈通常是逐步組構(gòu)的，由A單位朝著Mpa或Pmp單元進(jìn)行。按肽合成技術(shù)中已知的和下述的方法對(duì)每個(gè)殘基作適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)。該分步反應(yīng)的順序可方便地在Beckman 99OB型肽合成儀或與它相當(dāng)?shù)难b置中不用分離各中間體肽來進(jìn)行的。有關(guān)詳細(xì)程序?qū)⒃谙率鰧?shí)施例中介紹。
按已知方法對(duì)各種逐一接到樹脂支持鏈上的氨基酸(AA)進(jìn)行保護(hù)。例如，Boc保護(hù)基可用于保持氨基基團(tuán)，特別是在α位上;Pmp、Mpa或Cys殘基上的巰基亦可選用取代的芐基保護(hù);甲苯磺?；糜诒Ｗo(hù)Arg、HArg或MeArg殘基;而Tyr或Lys殘基位則可選用芐氧羰基(Z)保護(hù)。最方便的保護(hù)基應(yīng)是那些不容易被溫和的酸處理除去的(如除去Boc基)的保護(hù)基。人們寧可使用HF或鈉-液氨，對(duì)芐基或芐氧羰基則用催化氫化。
用過量的無水氟化氫與一種適當(dāng)?shù)那宄齽?如苯甲醚)來處理接在樹脂上的肽，即可得到高產(chǎn)率的結(jié)構(gòu)式Ⅱ之線性肽中間體。
亦可用任何一種標(biāo)準(zhǔn)的肽合成法，通過將Arg酸與A的被保護(hù)形式(作為酸或酰胺)反應(yīng)，制備結(jié)構(gòu)式Ⅰ的化合物。起始原料7-精氨酸如當(dāng)結(jié)構(gòu)式Ⅰ中P是上述定義的精氨酸樣殘基，A是羥基時(shí)即可按上述方法，用樹脂固定相的或溶液反應(yīng)順序來制備。
本發(fā)明的最終產(chǎn)物具有V2和/或V2加壓素拮抗劑活性。已知加壓素在腎臟內(nèi)參與抗利尿的作用機(jī)制。當(dāng)這些化合物起拮抗天然抗利尿激素(ADH)的作用時(shí)，機(jī)體即由于增加了腎小管末端部分的通透性而排泄水分。作用的機(jī)制是發(fā)生在位于某些腎上皮細(xì)胞之漿膜上的加壓素受體上。本發(fā)明之ADH拮抗劑的最顯著的藥理作用在于它是一種排水利尿劑，而不是象雙氫氯噻嗪這樣的排鈉利尿劑。
任何患有不適當(dāng)?shù)目估蚣に胤置诰C合癥(SIADH)或患具有致水腫病因的患者，都是本權(quán)利要求
之化合物的治療對(duì)象。本發(fā)明之化合物臨床應(yīng)用的適應(yīng)征包括高血壓、肝硬化、低血鈉、充血性心力衰竭或由嚴(yán)重?fù)p傷或疾病導(dǎo)致的任何創(chuàng)傷狀態(tài)。其中R1和R2形成5或6元環(huán)的結(jié)構(gòu)式1之化合物是特別強(qiáng)的V2拮抗劑。
第二類加壓素受體的位置是在心血管系統(tǒng)本身內(nèi)的血管加壓位點(diǎn)(V1受體)。這些受體亦可受到本發(fā)明之化合物的拮抗。其中R1和R2是氫或甲基的結(jié)構(gòu)式1之同源物是強(qiáng)的V1拮抗劑。這些化合物也具有實(shí)質(zhì)上的抗催產(chǎn)活性。
因此，本發(fā)明之化合物特別適用于需要進(jìn)行抗高血壓、抗催產(chǎn)或利尿治療的病人。治療包括經(jīng)胃腸道、胃腸道外、口含或吸入法服用非中毒量但為有效量的、經(jīng)選擇的、最好是分散于藥物載體中的本發(fā)明之化合物。對(duì)于一個(gè)70公斤體重的病人，活性成分的劑量單位可從每公斤體重0.01至10毫克范圍中選擇，最好是每公斤體重0.1至1毫克病人或患病動(dòng)物每天服用這一劑量單位1至5次。
含有結(jié)構(gòu)式Ⅰ之活性拮抗劑成分的醫(yī)藥組合物包括一個(gè)劑量單位的溶解式懸浮于某種標(biāo)準(zhǔn)液體載體(如等張鹽水)中的制劑，并分裝在適于胃腸道外給藥(如靜脈內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)注射)的安瓿或多劑量小瓶?jī)?nèi)。供吸入用的組合物可以是相似的，但通常是用有刻度的劑量給藥器或吸入器給藥的。經(jīng)研磨的粉末組合物也可與油性制劑、凝膠、用于等張制劑的緩沖液、口含片、皮膚穿透藥膏以及乳劑或氣霧劑等一道使用。
對(duì)抗天然抗利尿激素的V2拮抗劑的活性(抗ADH活性)在體外是用豬或人腎的髓質(zhì)，在體內(nèi)是用缺水大鼠進(jìn)行測(cè)定的。F.Stassen等人〔J.Pharmacology and Experimental Therapeutics，223，50-54(1982)〕描述了加壓素刺激的腺苷酸環(huán)代酶激活或加壓素結(jié)合活性的體外分析法。V1拮抗劑的活性是用大鼠胸主動(dòng)脈組織和大鼠肝細(xì)胞漿膜，按Stassen的文章及第一屆國(guó)際利尿會(huì)議(Miami，F(xiàn)lorida，1983/3)的出版物中所介紹的方法測(cè)定的。催產(chǎn)素的拮抗作用是按W.Sawyer等人〔Endocvinology，106，81(1979)〕所述的方法測(cè)定的。
體內(nèi)測(cè)定對(duì)抗ADH的活性是用缺水大鼠按下述方法進(jìn)行。
缺水大鼠篩選試驗(yàn)前對(duì)雄性大鼠停食停水約18小時(shí)。每個(gè)代謝籠內(nèi)分放4只動(dòng)物。0小時(shí)后，對(duì)試驗(yàn)組動(dòng)物腹腔內(nèi)注射試驗(yàn)化合物，兩組對(duì)照組(禁食或未禁食的)則只給等體積的賦形劑。每小時(shí)測(cè)定尿體積和滲透性，共測(cè)四小時(shí)。試驗(yàn)值按排尿毫升數(shù)(累計(jì)量)、每只大鼠排泄電解質(zhì)的毫克當(dāng)量數(shù)、排尿的毫克數(shù)以及以每公斤H2O的毫滲透摩爾表示的滲透性記錄。用耐受試驗(yàn)確定差異顯著性。ED300定義為降低尿滲透性至300毫滲透摩爾/公斤時(shí)所需的化合物劑量(微克/公斤)。
表1中的化合物是一系列具有同樣的環(huán)數(shù)的化合物。比較是在本發(fā)明的化合物(A)和三種較早報(bào)導(dǎo)的化合物(B、C和D)之間進(jìn)行的。這些數(shù)據(jù)表明，化合物A仍是VSP樣化合物去脯氨酸(des Pro)系列中報(bào)導(dǎo)的最強(qiáng)的加壓素拮抗劑。在體內(nèi)大鼠試驗(yàn)中，化合物A的活性是化合物B的8倍，是化合物D的3倍?！皀”是試驗(yàn)次數(shù)。
下列實(shí)施例在于說明本發(fā)明之化合物的制備和應(yīng)用。所有溫度均用攝氏度。
實(shí)施例1Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-Arg-Arg(NH2)被保護(hù)的肽中間體樹脂，Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-BHA是使用固相法在二苯甲基胺樹脂(BHA)上合成的。在一振蕩器上，使用1.0毫摩爾的BHA樹脂。所有的氨基酸的氮用叔丁氧基羰基(Boc)保護(hù)，之后，相繼用DCC/HBT偶聯(lián)。Pmp(4-MeBzl)用DMAP偶聯(lián)。在苯甲醚(3.0毫升)存在下，用無水HF(30毫升)于0℃處理60分鐘，將肽從樹脂上裂解出來并同時(shí)脫去側(cè)鏈的保護(hù)基，真空蒸發(fā)至干后，用無水乙醚洗殘留物。用二甲基甲酰胺(100毫升)和溶于3.5升水中的40%乙酸(100毫升)(預(yù)先調(diào)至pH4.5)提取粗肽產(chǎn)物。用75毫升0.01摩爾鐵氰化鉀(pH7.2)氧化環(huán)合用水稀釋的二巰基八肽混合物。用冰乙酸將溶液的pH調(diào)至4.5。然后通過弱酸性丙烯酸樹脂(Bio-Rex70)柱。用吡啶-乙酸鹽緩沖液(吡啶/冰乙酸/水＝30∶4∶66，V/V)洗脫。真空蒸餾除去吡啶乙酸鹽。由稀乙酸中凍干殘留物，得到284.19毫克部分純化的粗品肽。
純化1)逆流分配層析(CCD)樣品284.19毫克，正丁醇/乙酸/水(n-BuOH/HOAc/H2O)4∶1∶5;240次轉(zhuǎn)移(transfers)(a)餾份116-144 112.48毫克(b)餾份112-115和145-166 34.42毫克2)凝膠過濾葡聚糖G-15，0.2摩爾HOAc，使用(1a)112.48毫克得到(2a)19.28毫克;(2b)50.08毫克和(2c)7.99毫克。
將純度為96%的樣品2a用作試驗(yàn)。
物理學(xué)數(shù)據(jù)分子式C52H79N15O10S2;分子量1137.543快原子轟擊(M+H)+1138;(M-H)1136氨基酸分析Asp(1.00)，Cys(0.51)，Val(1.07)，Tyr(0.78)，Phe(0.95)，Arg(2.17)。
肽含量93.2%層析數(shù)據(jù)1)薄層層析(TLC)(a)正丁醇/乙酸/水/乙酸乙酯(B/A/W/E)(1∶1∶1∶1)，Rf0.5正丁醇/乙酸/水/吡啶(B/A/W/P)
(15∶3∶3∶10)，Rf0.62)高壓液相層析(HPLC)，Altex Ultrasphere ODS柱，5微米，4.5毫米×25厘米a 0.1%TFA/b CH3CN(a)梯度75a∶25b至45∶55K′＝11.46(b)恒溶劑60a/40bK′＝4.85實(shí)施例2
-D-Arg-Arg(NH2)按實(shí)施例1的方法，在0.1毫摩爾二苯甲基胺樹脂上合成保護(hù)了的肽中間體樹脂-Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl)-D-Arg(Tos)-Arg(Tos)-BHA。按實(shí)施例1的方法進(jìn)行HF裂解并用0.01摩爾鐵氰化鉀氧化，得到371.09毫克(35.2%)部分純化的肽。
純化1)逆流分配層析樣品371毫克，n-BuOH/HOAc/H2O，4∶1∶5，v/v，240次轉(zhuǎn)移(a)餾份143-159 105.59毫克(b)餾份124-134和160-170 64.3毫克(c)餾份135-142 36.22毫克2)將(1a)的105.95毫克樣品重新溶解于1%乙酸中，并通過一微孔濾器(0.45μ)過濾。將濾液凍干，得到51.06毫克產(chǎn)物。
3)HPLC制備(2)的樣品25毫克，Altex ODS，10毫米×25厘米、5微米，流速5毫升/分，0.1%三氟乙酸(TFA)∶乙腈(CH3CN)(60∶40)，恒溶劑，229毫微米(2.0AUFS)，得到15.37毫克純度為96-97%的樣品。
物理學(xué)數(shù)據(jù)分子式C52H79N15O10S2分子量1137.543層析數(shù)據(jù)1)TLCa)B/A/W/E(1∶1∶1∶1，V/V)，Rf0.025B/A/W/P(15∶3∶3∶10)，Rf0.4382)HPLC，Altex Ultrasphere ODS柱，5微米，0.45毫米×25厘米。
a 0.1%TFA/bCH3CNa 梯度 80∶20至50∶50，K′＝10.16b 恒溶劑55∶45 K′＝3.0恒溶劑60∶40 K′＝5.67實(shí)施例3
按實(shí)施例1所述方法，在1.0毫摩爾二苯甲基胺樹脂上合成被保護(hù)的肽中間體樹脂-Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl)-D-Arg(Tos)-D-Arg(Tos)-BHA。按上述相似方法進(jìn)行HF裂解和用0.01摩爾鐵氰化鉀氧化，得到＞1.0克油狀物質(zhì)。
純化1)逆流分配層析油狀樣品(由Bio-Rex-70柱洗脫的粗制品)，BuOH/HOAc/H2O，4∶1∶5;240次轉(zhuǎn)移。
(a)餾份 114-154 858毫克(b)餾份 155-200 60毫克2)凝膠過濾;
葡聚糖G-15，0.2摩爾HOAc，自1a123毫克樣品得到(2a)74.40毫克，2b 12.75毫克，2c 0.61毫克。
3)HPLC制備2b樣品50毫克，Altex ODS柱，10毫米×25厘米，5微米，流速5.0毫升/分，0.1%TFA/CH3CN(60∶40)，恒溶劑，229毫微米(2.0AUFS)，得到11.56毫克(6.5毫克純度98%)5.06毫克純度＜98%)。
物理學(xué)數(shù)據(jù)分子式C52H79N15O10S2，分子量1137.543快原子轟擊(M+H)+1138氨基酸分析Asp(1.00)，Cys(0.49)，Val(1.01)，Tyr(0.30)，Phe(1.04)，Arg(1.76)。
肽含量63.4%
層析數(shù)據(jù)1)TLCa)B/A/W/(1∶1∶1∶1)，Rf0.46b)B/A/W/P(15∶3∶3∶10)，Rf0.3932)HPLC，a 0.1%TFA;b CH3CNa梯度 80∶20至50∶50 K′＝7.83;
b恒溶劑55∶45 K′＝2.63實(shí)施例4
-Arg-D-Arg(NH2)按實(shí)施例1中所述的方法在1.0毫摩爾二苯甲基胺樹脂柱上合成被保護(hù)的肽中間體樹脂Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)-D-Arg(Tos)-BHA。被實(shí)施例1所述方法進(jìn)行HF裂解并用0.01摩爾鐵氰化鉀氧化，得到252.46毫克肽。
純化1)逆流分配層析樣品252.46毫克(粗品)，BuOH/HOAc/H2O，4∶1∶5;240次轉(zhuǎn)移。
(a)餾份 82-102 111.47毫克(b)餾份 76-81和103-152 65-87毫克2)凝膠過濾葡聚糖G15，0.2摩爾HOAc，由1a的114.47毫克樣品得到(2a)39.85毫克，(2b)29.83毫克;將(2a)部分(純度98%)用來作生物活性試驗(yàn)。
物理學(xué)數(shù)據(jù)分子式C52H79N15O10S2;分子量1137.543。
快原子轟擊(M+H)+1138、(M-H)-1136。
氨基酸分析Asp(1.00)，Cys(0.56)，Val(0.90)、Tyr(0.55)、Phe(0.93)、Arg(1.87)。
肽含量80.4%;85.16%(N2分析)。
層析數(shù)據(jù)1)TLCa B/A/W/E(1∶1∶1∶1)，Rf0.57b B/A/W/P(15∶3∶3∶10)，Rf0.392)HPLCa 0.1TFA/b CH3CN1)梯度 80a20b到50∶55 K′＝9.592)恒溶劑55a∶45b K′＝3.05實(shí)施例5
-Arg-Arg(OH)在1.0毫摩爾Boc-Arg(Tos)-O-Bzl-樹脂(購自Peninsula實(shí)驗(yàn)室)上合成所用的被保護(hù)的肽中間體-Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OCH2C6H4樹脂。按上述方法進(jìn)行HF裂解并用0.01摩爾鐵氰化物氧化之。通過反相硅膠C-18柱純化該稀釋溶液，用含0.1%TFA的50%CH3CN水溶液洗脫，得到549.62毫克(46.7%)肽。
純化1)分配柱層析，G25葡聚糖，樣品120毫克，nBuOH/HOAc/H2O，4∶1∶5，V/V。
a 56.0毫克b 20.68毫克2)HPLC1a25毫克，Altex ODS，10毫米×25厘米，5微米，流速500毫升/分，0.1%TFA∶CH3CN(58∶42)，恒溶劑，229毫微米(2.0AUFS)，得到10.65毫克(6.16毫克-96.5%，4.49毫克-＜96%)。
物理學(xué)數(shù)據(jù)分子式C52H78N14O11S2;分子量1138.527;
FAB(M+H)+1139;(M-H)-1137;
氨基酸分析Asp(1.07);Cys(0.53);Val(0.97);Tyr(0.3);Phe(0.92);Arg(1.71);
肽含量79.8%。
層析數(shù)據(jù)1)TLCa B/A/W/E(1∶1∶1∶1)，Rf0.53b B/A/W/P(15∶3∶3∶10)，Rf0.252)HPLCa 0.1%TFA/b CH3CN;
1.梯度 80a∶20b至50∶50;K′＝8.0;
2.恒溶劑58a∶42b，K′＝4.27。
實(shí)施例6
-Lys-Arg(NH2)按上述方法在1.0毫摩爾二苯甲基胺樹脂上合成被保護(hù)的肽中間體樹脂Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl)-Lys(CIZ)-Arg(Tos)-BHA。按所述方法完成HF裂解并用0.1摩爾鐵氰化物氧化，得到710.17毫克部分純化的肽。
純化1)逆流分配層析;樣品710.17毫克;(B/A/W，4∶1∶5，V/V)，250次轉(zhuǎn)移。
a)106-130 327.19毫克b)131-156 100.1毫克c)64-100 61.95毫克d)50-63+157-180 41.38毫克2)凝膠過濾葡聚糖G15，0.2摩爾HOAc，自1a樣品100毫克得2a)70.21毫克2b)22.98毫克;
組份2a純度98-99%。
物理數(shù)據(jù)分子式C52H79N13O10S2;分子量1109.53;
FAB(M+H)+1110，(M-H)-1108;
層析數(shù)據(jù)1.TLCa)B/A/W/E，1∶1∶1∶1(V/V)，Rf0.5;
b)B/A/W/P，15∶3∶3∶10，(V/V)，Rf0.19;
c)B/A/W，4∶1∶5，上部(V/V)，Rf0.27;
2.HPLC1)梯度80∶20至50∶50-0.1%TFA/CH3CN，K′＝11.322)恒溶劑60∶40-0.1%TFA/CH3CN，K′＝6.6實(shí)施例7
-Arg-Lys(NH2)在1.0毫摩二苯甲基胺樹脂上合成被保護(hù)的肽中間體樹脂Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)-Lys(CIZ)-BHA。用前述相似的方法進(jìn)行HF裂解并用0.01摩爾鐵氰化物氧化之，得到702.5毫克肽。
純化1)CCD樣品702.5毫克(B/A/W，4∶1∶5V/V)，240次轉(zhuǎn)移a)101-144 468.82毫克;
b)96-100+145-160 36.19毫克;
c)55-95 55.19毫克;
2)凝膠過濾
葡聚糖G15，0.2摩爾HOAc，1a的樣品100毫克，2a)67.27毫克;
2b)30.2毫克;
2a的純度為96-97%。
層析數(shù)據(jù)1.TLCa B/A/W/E，1∶1∶1∶1V/V，Rf0.54;
b B/W/A/P，15∶3∶3∶10V/V，Rf0.42;
2.HPLC1)梯度 0.1%TFA/CH3CN80∶20至50∶50，K′＝12.11;
2)恒溶劑0.1%TFA/CH3CN55∶45，K′＝3.69。
實(shí)施例8
-Arg-Arg(NHC3H7)將按實(shí)施例5制備的0.1毫摩爾的酸性末端和溶于20毫升二甲基甲酰胺的0.1毫摩爾正丙胺的混合物，用23毫克(0.11毫摩爾)DCC和14毫克(0.11毫摩爾)HBT于室溫下反應(yīng)四小時(shí)。蒸發(fā)除去揮發(fā)物得到殘留產(chǎn)物，按上述方法純化之。
實(shí)施例9用片段組合法制備
-Arg(OH)的制備在振蕩器上人工合成被保護(hù)的肽中間體樹脂，即Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)-OCH2-C6H4樹脂。由市場(chǎng)上購得的Boc-Arg(Tos)-OCH2C6H4樹脂，每克樹脂取代容量為0.35毫克當(dāng)量。用1∶1TFA∶CH2Cl2脫去BOC保護(hù)基，并用DCC/HBT活化和催化與繼后的氨基酸偶聯(lián)，分步合成被保護(hù)的肽-樹脂中間體1.0毫摩爾，得到3.15克Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)-OCH2-C6H4-樹脂。用30毫升HF在3.0毫升苯甲醚存在下于0°處理60分鐘，使側(cè)鏈保護(hù)基脫保護(hù)，并由此從樹脂上裂解得到標(biāo)題肽，真空蒸發(fā)至干后，用無水乙醚洗所得殘留物。用脫氣的二甲基甲酰胺、1當(dāng)量氫氧化銨、之后用溶于3.5升經(jīng)除氣的水中40%乙酸萃取肽。用60毫升0.01摩爾鐵氰化鉀(pH7.2)氧化環(huán)合用水稀釋的二巰基七肽，直至顏色持續(xù)30分鐘。氧化反應(yīng)完成后，用冰醋酸將pH調(diào)至4.5。過濾該溶液，并將濾液通過C-18硅膠層析柱進(jìn)行閃式柱層析。用1∶10.1%TFA/CH3CN洗脫肽，得到分成三部分的245毫克(25%)中間體肽，純度約90%。
純化將22.0毫克最純部分的樣品進(jìn)行高壓液相層析;Altex ODS，10毫米×25厘米，5微米，流速5毫升/分，0.1%TFA/CH3CN(60∶40)恒溶劑，220毫微米(0.5AVIS)，10.10毫克。
物理學(xué)數(shù)據(jù)分子式C46H66N10O10S2;分子量982.5;
快原子轟擊(M+H)+983，(M-H)-981;
氨基酸分析Asp(1.00)，Cys(0.27)，Val(0.95)，Tyr(0.50)，Phe(0.99)，Arg(1.07);
肽含量74.93%;
層析數(shù)據(jù)1.TLCa B/A/W/E(1∶1∶1∶1)，Rf＝0.6b B/A/W(4∶1∶5上限)，Rf＝0.32.HPLCa)梯度 K′＝14.6;
b)恒溶劑 K′＝5.97。
的制備將4.87克(15毫摩爾)的BocCys(4-MeBzl)溶解于30毫升乙醇中并加入10毫升水。之后用碳酸氫銫水溶液將pH調(diào)至7.1。
濃縮該混合物并將殘留物從50毫升甲苯中蒸發(fā)三次。于高真空和常溫下，將該殘留物放置過夜。
將該鹽溶解于35毫升二甲基甲酰胺中并加入5克商品氯甲基苯基樹脂。將混合物于氬氣下于50℃攪拌過夜。
過濾混合物，并用二甲基甲酰胺(5×60毫升)、DMF/水，9∶1(5×60毫升)、DMF(5×60毫升)和乙醇(6×60毫升)洗滌樹脂。之后于高真空和常溫下干燥過兩夜。
按上述方法，在Backman合成儀中在0.5毫摩爾BocCys(4-MeBzl)樹脂上，用Asn、Val、Phe、D-Tyr(Et)的Boc衍生物和S-(4-MeBzl)Pmp衍生物組構(gòu)肽鏈。除去樹脂，洗滌并于真空中干燥之。
用1.5毫升苯甲醚處理0.86克肽樹脂，并于0℃在15毫升氟化氫中攪拌60分鐘。之后，于0℃減壓除去氟化氫。
用3×25毫升乙醚洗殘留物并將醚層棄去用二甲基甲酰胺和30%乙酸(4×10毫升)洗脫肽。將該溶液加到2升經(jīng)脫氣的水中并用氫氧化銨將其pH調(diào)至7.0。緩慢加入0.01鐵氰化鉀溶液(35毫升)。
之后用乙酸將pH調(diào)到4.5并將25克(濕重)弱堿性離子交換樹脂(ag-3×4 IR-4S)與混合物攪拌30分鐘。過濾混懸液并用2×400毫升30%乙酸洗滌樹脂。
將濾液通過-C18閃式柱(7×16毫米)。之后用水(3×400毫升)洗柱并用乙腈/水/TFA(50∶50∶0.25)洗脫肽。合并第30-36組份，濃縮并凍干，得到80毫克標(biāo)題的游離Cys(OH)環(huán)狀中間體。
在甘油中作FAB質(zhì)譜分析827(M+H)+，825(M-H)-。
C.縮合以上述B中所得到的6-Cys酸(20毫克)，在DCC、HBT和一當(dāng)量的溶于二甲基甲酸胺之三乙胺存在下，與一當(dāng)量Arg-Arg(NH2)·3HCl反應(yīng)，生成實(shí)施例1的化合物。相似地，以由A得到的7-Arg酸與Arg(2HCl)(OMe)反應(yīng)，在經(jīng)酯的溫和水解后，生成實(shí)施例5的酸性母體化合物。如果需要，亦可將該化合物離析成鉀鹽。用DCC/HBT使一當(dāng)量Arg(NH2)2HCl與上述A中得到的7-Arg酸偶聯(lián)即得到所要的產(chǎn)物。
實(shí)施例10
-MeArgArgNH2用固相法在二苯甲基胺樹脂上制備被保護(hù)的肽中間體樹脂，即Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl)-N-MeArg(Tos)-Arg(Tos)-BHA。在振蕩器上使用0.5毫摩爾BHA樹脂，所有氨基酸的氮上均用叔丁氧羰基保護(hù)然后用DCC/HBT逐一偶聯(lián)。制備BOC-N-CH3Arg(Tos)。用DMAP偶聯(lián)Pmp(4-MeBzl)。使用無水HF(20毫升)和苯甲醚(2毫升)于0℃處理60分鐘，使側(cè)鏈保護(hù)基脫保護(hù)，并由樹脂上裂解出肽。真空蒸發(fā)至干后，用無水乙醚洗殘留物。用脫氣的50%乙酸(100毫升)和溶于2升除氣水的脫氣的DMF(60毫升)在pH4.5時(shí)萃取粗制肽。用50毫升0.01摩爾鐵氰化物在pH7.2時(shí)氧化環(huán)合用水稀釋的二巰基八肽。用冰乙酸將溶液的pH調(diào)到4.5。經(jīng)過弱酸性離子交換柱(Bio-Rex70)純化之，得到375毫克部分純化的肽。
純化CCD，375毫克在B/A/W(4∶1∶5V/V)中，240次轉(zhuǎn)移得到a 122-146，106.42毫克;
b 147-156+110-121，131.86毫克;
c 157-200+100-109，32.80毫克;
將純度為97-98%的樣品a用來進(jìn)行生物學(xué)活性評(píng)價(jià)。
層析數(shù)據(jù)
1.TLCa B/A/W/E，1∶1∶1∶1，V/V，Rf＝0.68;
b B/A/W，4∶1∶5，V/V，上部Rf＝0.39;
2.HPLCa 梯度0.1%TFA/CH3CN為80∶20至50∶50，K′＝11.93;
b 恒溶劑0.1%TFA/CH3CN為55∶45，K′＝4.29。
實(shí)施例11以化學(xué)計(jì)算量的Boc-L-Tyr(Et)取代實(shí)施例1之合成肽的2位殘基上的Boc-D-Tyr(Et)，得到環(huán)化的Pmp-L-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-Arg-Arg(NH2)。
以Boc-D-Ile取代實(shí)施例1中2位殘基上的Boc-D-Tyr(Et)，得到Pmp-D-Ile-phe-Val-Asn-Cys-Arg-Arg(NH2)。
以Boc-L-Phe(4-Me)取代實(shí)施例1合成系列反應(yīng)中3位殘基上的氨基酸，以Boc-Nle取代4位殘基上的氨基酸，得到Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-(4-Me)-Nle-Asn-Cys-Arg-Arg(NH2)。
以Boc-Cha取代4位殘基，得到Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Cha-Asn-Cys-Arg-Arg(NH2)。
用HBT取代4位上未保護(hù)的Gln，得到Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Gln-Asn-Cys-Arg-Arg(NH2)。
分別以Boc-D-Pba和Boc-Chg取代實(shí)施例1中詳述之反應(yīng)系列的2位殘基和4位殘基，得到Pmp-D-Pba-Phe-Chg-Asn-Cys-Arg-Arg(NH2)。
實(shí)施例12在上述合成序列中取代適當(dāng)保護(hù)的環(huán)殘基，分別得到的八肽和其鹽如下a、〔1-脫氨基青霉胺-2(鄰-乙基)-D-酪氨酸-3-(4′-甲基苯丙氨酸)-7-精氨酸-8-精氨酸-9-脫甘氨酸〕-加壓素乙酸鹽;
b、〔1-(β-巰基丙酸)-2-(鄰-乙基)-D-酪氨酸-4-(α-氨基丁酸)-7-精氨酸-8-精氨酸-9-脫甘氨酸〕-加壓素c，〔1-(β-巰基丙酸)-2-纈氨酸-4-環(huán)己基甘氨酸-7-精氨酸-8-精氨酸-9-脫甘氨酸〕-加壓素鹽酸鹽;
d，〔1-(β-巰基丙酸)-4-谷氨酰胺-7-精氨酸-8-高精氨酸-9-脫甘氨酸〕-加壓素;
e，〔1-脫氨基青霉胺-2-苯丙氨酸-7-高精氨酸-8-高精氨酸-9-脫甘氨酸〕-加壓素;
f，〔1-脫氨基青霉胺-2-D-α-氨基苯丁酸-4-異亮氨酸-7-L-精氨酸-8-L-精氨酸-9-脫甘氨酰胺〕-加壓素;
g，〔1-脫氨基青霉胺-2-色氨酸-4-谷氨酰胺-7-D-精氨酸-8-D-精氨酸-9-脫甘氨酸〕-加壓素;
h，〔1-(β-巰基-β，β-環(huán)亞戊基丙酸)-2-L-酪氨酸-3-(4′-甲基苯丙氨酸)-7-精氨酸-8-精氨酸-9-脫甘氨酸〕-加壓素;
i，〔1-(β-巰基丙酸)-2-(鄰-乙基)-D-酪氨酸-3-異亮氨酸-4-蘇氨酸-7-精氨酸-8-精氨酸-9-脫甘氨酸〕-加壓素乙酸鹽。
實(shí)施例13胃腸道外劑量單位組合物將含0.10毫克實(shí)施例1的肽的滅菌干粉制劑用作胃腸道外注射用，其制備方法如下將0.5毫克肽溶解于20毫克甘露糖醇的1毫升水溶液中。于無菌條件下過濾溶液，裝入2毫升安瓿并凍干。重新配制的溶液可供需要用加壓素拮抗劑治療的病人使用，按需要可每天注射1-5次，或者用相等量供連續(xù)靜脈滴注。
鼻吸入劑量單位組合物將2.5毫克經(jīng)過精細(xì)研磨的本發(fā)明的肽(如實(shí)施例2的產(chǎn)物)懸浮于75毫克苯甲醇與1.395克懸浮劑(如一種半合成的高級(jí)脂肪酸甘油酯的商品混合物)的混合物中。將懸浮液裝入一10毫升氣霧劑容器內(nèi)，封以計(jì)量閥并配有氣霧發(fā)射劑。容器內(nèi)含有100個(gè)單位劑量，可以每天按需要對(duì)病人鼻內(nèi)給藥1-6次。
勘誤表
權(quán)利要求
1.具有下列結(jié)構(gòu)式的化合物或其藥物上可接受的鹽或前體藥物，
其中P是Arg、Lys、HArg、MeArg、MeLys或MeArg的D或L型異構(gòu)體；A是Arg、Lys、HArg、MeArg、MeLys或MeArg的D或L型異構(gòu)體；B是OH、NH2或NHAlK；Z是Phe、Phe(4′-AlK)、Tyr、(Alk)、Ile或Tyr；X是Phe、Phe(4′-AlK)、Val、NVa、Leu、Ile、pba、Nle、Cha、Abu、Met、Chg、Tyr或Tyr(AlK)的D或L型異構(gòu)體；Y是Val、Ile、Abu、Ala、Chg、Gln、Lys、Cha、Thr、Nle、Phe、Leu或Gly；且R1和R2各是氫、甲基，或當(dāng)兩者一起，并與相接的β碳一道形成一個(gè)4-6元環(huán)亞烷基環(huán)，且Alk是C1-4烷基。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的化合物，其中R1和R2一起形成螺亞戊基環(huán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1的化合物，其中P-A-B是Arg-Arg(NH2)。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1的化合物，其中化合物是〔1-(β-巰基-β，β-環(huán)亞戊基丙酸)-2-(鄰-乙基)-D-酪氨酸-4-纈氨酸-7-精氨酸-8-精氨酸-9-脫甘氨酸〕-加壓素或其藥物學(xué)上可接受的酸加成鹽。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1的化合物，其中化合物是〔1-(β-巰基-β，β-環(huán)亞戊基丙酸)-2-(鄰-乙基)-D-酪氨酸-4-纈氨酸-7-D-精氨酸-8-D-精氨酸-9-脫甘氨酸〕-加壓素或其藥物學(xué)上可接受的酸加成鹽。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1的化合物，其中化合物是〔1-(β-巰基-β，β-環(huán)亞戊基丙酸)-2-(鄰-甲基)-L-酪氨酸-4-纈氨酸-7-精氨酸-8-D-精氨酸-9-脫甘氨酸〕-加壓素或其藥物學(xué)上可接受的酸加成鹽。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1的化合物，其中化合物是〔1-(β-巰基丙酸)-2-(鄰-乙基)-D-酪氨酸-3-異亮氨酸-4-蘇氨酸-7-精氨酸-8-精氨酸-9-脫甘氨酸〕-加壓素或其藥物學(xué)上可接受的酸加成鹽。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1的化合物，其中化合物是〔1-(β-巰基-β，β-環(huán)亞戊基丙酸)-2-(鄰-乙基)-D-酪氨酸-4-纈氨酸-7-精氨酸-8-精氨酸-9-脫甘氨酰胺〕-加壓素或其藥物學(xué)上可接受的酸加成鹽。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1的化合物，其中化合物是1-(β-巰基-β，β-環(huán)亞戊基丙酸-2-(鄰-乙基)-D-酪氨酸-4-纈氨酸-8-精氨酸-7-賴氨酸-9-脫甘氨酸〕-加壓素或其藥物學(xué)上可接受的酸加成鹽。
10.根據(jù)權(quán)利要求
1的化合物，其中化合物是〔1-(β-巰基丙酸)-2-(鄰-乙基)-D-酪氨酸-4-纈氨酸-7-N-甲基精氨酸-8-精氨酸-9-脫甘氨酸〕-加壓素或其藥物學(xué)上可接受的酸加成鹽。
11.根據(jù)權(quán)利要求
1-10中任一項(xiàng)的化合物供作藥用。
12.根據(jù)權(quán)利要求
1-10中任一項(xiàng)的化合物，用作抗高血壓。
13.根據(jù)權(quán)利要求
1-10中任一項(xiàng)的化合物，用作加壓素拮抗劑。
14.一種藥物組合物，其中含有根據(jù)權(quán)利要求
1-10中任一項(xiàng)的化合物和藥物學(xué)上可接受的載體。
15.制備下列結(jié)構(gòu)式之化合物或其藥物學(xué)上可接受的鹽或前藥的方法
其中P是Arg、Lys、HArg、MeArg、MeLys或MeHArg的D或L型異構(gòu)體;A是Arg、Lys、HArg、MeArg、MeLys或MeHArg的D或L型異構(gòu)體;B是OH，NH2或NHALK;Z是Phe、Phe(4′-Alk)、Tyr(Alk)、Ile或Tyr;X是Phe、Phe(4′-Alk)、Val、Nva、Leu、Ile、Pba、Nle、Cha、Abu、Met、Chg、Tyr或Tyr(Alk)的D或L型異構(gòu)體;Y是Val、Ile、Abu、Ala、Chg、Gln、Lys、Cha、Thr、Nle、Phe、Leu或Gly;且R1和R2各是氫、甲基，或當(dāng)兩者一起并與相接的β碳構(gòu)成4-6元環(huán)亞烷基環(huán);且Alk是C1-4烷基;方法包括環(huán)化可任意被保護(hù)的下列結(jié)構(gòu)式的化合物-
其中X、Z、Y、P、A、B、R1和R2的定義如前;Q是氫或可置換的基團(tuán);-其后可以進(jìn)行下列任一順序，(a)除去任何保護(hù)基;(b)如有Arg(OH)7化合物存在-則與A(定義如前)，以其酸被保護(hù)的形式或酰胺形式-進(jìn)行反應(yīng);(c)形成藥物學(xué)上可接受的鹽或其前藥，當(dāng)B是OH時(shí)，則為其酯。
16.根據(jù)權(quán)利要求
15的方法，其中Q是氫。
17.根據(jù)權(quán)利要求
15的方法，其中Q是乙酰氨甲基。
18.根據(jù)權(quán)利要求
15-17的方法，它包括氧化環(huán)化作用。
19.根據(jù)權(quán)利要求
18的方法，它是在碘和甲醇存在下進(jìn)行的。
20.根據(jù)權(quán)利要求
18的方法，它是在堿金屬鐵氰化物存在下進(jìn)行的。
21.根據(jù)權(quán)利要求
20的方法，其中堿金屬鐵氰化物是鐵氰化鉀或鐵氰化鈉。
專利摘要
具有一個(gè)含有兩個(gè)堿性氨基酸之二肽側(cè)鏈的加壓素拮抗劑，顯示出強(qiáng)的V
文檔編號(hào)C07K7/06GK86104835SQ86104835
公開日1986年12月17日 申請(qǐng)日期1986年6月18日
發(fā)明者法迪亞·埃爾費(fèi)海爾·阿里 申請(qǐng)人:史密絲克萊恩貝克曼公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan