專利名稱:乙型肝炎病毒表面抗原的生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)范圍本發(fā)明是有關乙型肝炎病毒表面抗原及其生產(chǎn)，更具體地說本發(fā)明涉及(1)對乙型肝炎病毒表面抗原P31的DNA重組體中的DNA密碼是插入3′的啟動子終端;(2)上述DNA重組體的生產(chǎn);(3)轉(zhuǎn)化株承載DNA重組體;(4)上述轉(zhuǎn)化株的生產(chǎn);(5)非糖基的乙型肝炎病毒表面抗原P31蛋白質(zhì)，和(6)乙型肝病毒表面抗原的生產(chǎn)。
工藝背景乙型肝炎是一種病毒性疾病，特別是熱帶的非洲、東南亞和遠東經(jīng)常遭遇和流行這種疾病。它暗示乙型肝炎可轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿窝?，肝硬變和進一步演變?yōu)樵缙诘母伟?。乙型肝炎病?下文均簡稱為HBV)屬類病毒，這是一種DNA病毒，它是以球狀顆粒存在，直徑為42nm，在發(fā)現(xiàn)者之后，稱為戴恩顆粒。上述顆粒的外層存在著HBV表面抗原(下文均簡稱為HBsAg)，根據(jù)不同的抗原性，HPsAg可分為adr、adw、ayr和ayw幾種附屬型，其中的adw和adr流行于日本。
把乙型肝炎病人的血液加到戴恩顆粒上可以檢測到微細的和管狀的顆粒。這些顆粒被視為在戴恩顆粒上發(fā)現(xiàn)的HBsAg屬同一類型。
眾所周知，帶有其他病的抗體對病毒的表面抗原可以予防感染，HBV的情況也是這樣。由此看來，以HBsAg作依據(jù)似乎有可能生產(chǎn)疫苗以對抗乙型肝炎。然而，唯有人類和黑猩猩能夠受HBV感染，所以到目前為止所有用培養(yǎng)細胞受HBV感染的嘗試均告失敗。所以暫時HBsAg的唯一可以得到的來源是從受感染的病人血液取得，而微細顆粒也能滿意的獲取，但這只作為檢定試劑使用，而無法滿足大規(guī)模的疫苗生產(chǎn)。
近期分子生物學的進展可以在非細菌的蛋白質(zhì)引入DNA密碼使其轉(zhuǎn)化為細菌。如果對細菌中的HBsAg結(jié)構(gòu)基團(下文均簡寫為HBsAg基因)的表達能成為運用DNA重組體技術(shù)的結(jié)果，那么，擺脫HBV感染危險而大量的生產(chǎn)HBsAg將可能實現(xiàn)，這將為乙型肝炎疫苗的實際應用開拓一條通路。
至于ayw型，那是在當前已知的adw、adr、ayw和ayr中最流行于歐洲和美洲的一種。HBsAg基因的位置和堿基順序已經(jīng)測定〔Galibert，F(xiàn).et al;Nature，281，646(1979);Charnay，P.et al;Nucleic Acids Res;7，335(1979)〕，而上述基因在《大腸桿菌》報告(Chanay，P.et al;Nature，286，893(1980);Edman，J.C.et al;Nature，291，503(1981)〕中則表達為雜種蛋白質(zhì)。
至于adw和adr則流行于日本。一些本發(fā)明者成功地創(chuàng)造了一種含有HBsAg的DNA，并在基因組中測定了上述基團的DNA堿基順序和位置，進一步開創(chuàng)了用栽培的轉(zhuǎn)化株承載DNA的方法大量生產(chǎn)HBsAg(Japanese published unexamined patent applications Nos.194897/1983，201796/1983 and 74985/1984)。
最近，Machida，A.et al.〔Gastroenterology，85，268(1983);ibid.，86，910(1984)〕證實以病人血漿中取得的HBsAg微細顆粒對乙型肝炎病毒抗原起正反應，HBsAg顆粒中有P31蛋白質(zhì)(分子重為31千道爾頓)和P35蛋白質(zhì)(是糖結(jié)合P31而形成的結(jié)合蛋白，其分子重為35千道爾頓)。另外，迄今為止，認為主要的肽為P-Ⅰ(分子重為22-24千道爾頓)和P-Ⅱ(分子重25-29.5千道爾頓)〔Peterson，D.L.et al;Proc.Natl.Aead.Sci.USA，74，1530(1977)〕。P31是由P-Ⅰ和前S期區(qū)中的氨基酸殘基所合成，當加入于P-Ⅰ的N末端時證實聚合的人的血清清蛋白(聚-HSA)受體也在上述區(qū)域中出現(xiàn)。而且，1984年的報告引證了上述P31蛋白質(zhì)有糖鏈的陳述。另一方面，可以這樣考慮，由于在肝細胞上也發(fā)現(xiàn)上述受體，所以通過聚-HSA增生取代了戴因顆粒的粘附力。因而，如果在P31上能以抗體掩蔽在戴因顆粒上的聚-HSA受體，那么可以期望能夠更有效的避免HVB感染，因為上述顆粒已不能再粘合肝細胞。
本發(fā)明涉及乙型肝炎疾毒表面抗原及其生產(chǎn)，更具體地說，本發(fā)明提供(1)在DNA重組體中對乙型肝炎病毒表面抗原P31的DNA密碼是插入啟動子3′終端;(2)DNA重組體的生產(chǎn);(3)轉(zhuǎn)化株承載上述DNA重組體;(4)上述轉(zhuǎn)化株的生產(chǎn);(5)非糖基的乙型肝炎病毒表面抗原P31蛋白質(zhì);(6)乙型肝炎病毒表面抗原P31的生產(chǎn)。而且本發(fā)明提供生產(chǎn)乙型肝炎病毒表面抗原P31蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法。方法包含培養(yǎng)轉(zhuǎn)化株以承載一種對乙型肝炎病毒表面抗原P31有堿基順序密碼的DNA，在培養(yǎng)中富集乙型肝炎病毒抗原P31，收集含有P31的溶液，并用提純法，包括親和色譜法處理含P31溶液。
本發(fā)明對于乙型肝炎表面抗原P31的DNA密碼的實際應用可以是任何類型(adr，adw，ayr或ayw)，同時用下述方法可以制備。所以日文版的Unexamined patent application(Ko Kai)No.194897/1983或Nucleic Acid Res;11，1747(1983)述及以堿的解離常數(shù)(kb)為3.2的adw HBv DNA插入于PBR 322-EcoRl/HBV 933質(zhì)粒(下文簡寫為PHBV 933)。這是根據(jù)Hpai和EcoRl限制酶的雙重消化作用而產(chǎn)生含有部分前-S區(qū)的961 bp DNA斷片，以聯(lián)結(jié)上述斷片的方法，可以構(gòu)成P31的DNA密碼，而適當?shù)慕雍象w所含順序為〔
〕另外，在日文版的Unexamined patent application No.74985/1984或Nucleic Acid Res.，11，1747(1983)述及另一選擇即以堿的解離常數(shù)(kb)為3.19的adr HBV DNA插入于pBR 322-BamHI/HBr 330質(zhì)粒(下文簡寫為pHBr 330)，借此可以獲得含部份前-S區(qū)的1398 bp DNA斷片，用聯(lián)結(jié)上述接合體于斷片的方法可以制取P31的DNA密碼。
對adw HBsAg P31的DNA密碼，例如圖1所示在DNA順序中含28至873號堿基對的DNA;而對adrHBsAg P31的密碼，如圖2所示在DNA順序中含10至855號堿基對的DNA。
編碼P31的DNA，它或是病毒的起點或是化學合成體。
對于ayr或ayw HBsAg P31的DNA密碼可以根據(jù)上述同樣的方法制取。
DNA重組體可以表達為編碼P31的構(gòu)成是由于啟動子區(qū)的3′末端插入編碼P31的DNA使每個受體都能起作用(例如大腸桿菌、精細桿菌、酵毋和動物細胞).啟動子區(qū)可以是任何含有RNA聚合酶結(jié)合部位或mRNA合成的起始部位。
大腸桿菌品系的使用，例如作為受體。DNA重組體可以表達為編碼P31 DNA的構(gòu)成是由于編碼P31 DNA插入于啟動子區(qū)3′末端而在大腸桿菌中起作用。舉例說，在日本版的Unexamined patent application NO.201796/1983，關于T4 DNA連接酶助劑中曾述及編碼P31 DNA可插入象pTRP601或pTRP771載體中。大腸桿菌(如菌株C600，294，W3110，RRI或PR13)用已知方法隨其混合物〔Cohen，S.N.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110(1972)〕或其變更而轉(zhuǎn)化。
啟動子的應用不限于trp啟動子(trp-p)，其他象reca啟動子(日文版的Unexamined patent application NO.65099/1984〕，lac啟動子和λPL啟動子也可以用。轉(zhuǎn)化株承載含編碼P31 DNA新的重組體DNA，而編碼P31 DNA可選用上述方法取得象安芐青霉素抗性和四環(huán)素抗性的表現(xiàn)型那樣。
為了找出承載含有由抗藥性轉(zhuǎn)化株中取得的編碼P31 DNA的新的重組體的質(zhì)粒的株菌，可用下述技術(shù)，例如上述5′AATTCCACTGCATTGTAT3′接合體的鏈之一是用γ-32P-ATP和T4聚核苷酸激酶標記放耐性同位素作用，用此作為探查物和用已知的菌落雜交方法〔Grunstein，M.and Hogness，D.S.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，72，3961(1975)〕，從已經(jīng)取得的抗藥性轉(zhuǎn)化株中必然地可以找出正反應的無性繁殖系(純系)。
這樣選擇的轉(zhuǎn)化株是在已知培養(yǎng)基中培養(yǎng)。作為培養(yǎng)基的如L液體培養(yǎng)基、Penassay液體培養(yǎng)基和M-9培養(yǎng)基并補充以葡萄糖和酪蛋白氨基酸〔Miller，J.，Experiments in Molecular Genetics，431-433(Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1972)〕。當有需要的時候，為了有效的啟動子功能可加入3β-吲哚丙烯酸。
上述轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)通常是在15°-43℃之間進行，而以28°-40℃之間較好，培養(yǎng)時間2-24小時之間，而以4-16小時之間較好。若需要可通氣和(或)攪拌。
當酵母用作受體，可以下列方法制備酵母轉(zhuǎn)化株。大腸桿菌-酵母往復載體YEp13〔Broach，J.R.et al.，Gene，8，121(1979)〕，pSH15或pSH19〔Harashima，S.et al.，Mol.Cell.Biol.，4，771(1984)〕，有插入的一個酵母啟動子區(qū)，如可阻遏的酸性磷酸酶基因啟動子區(qū)(Meyhack，B.et al.，EMBOJ.，6，675(1982)〕，甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動子區(qū)〔Holland，J.P.and Holland，M.J.，J.Biol.Chem.，255，2596(1980)〕或3-磷酸甘油酯激酶基因的啟動子區(qū)〔Dobson，M.J.et al.，Nucleic Acid Res.，10，2625(1982)〕，在T4DNA連接酶的作用下，編碼P31 DNA正聯(lián)接于上述區(qū)之后部。利用反應混合物，上述大腸桿菌受體系是用上面舉出的Cohen et al方法進行轉(zhuǎn)化。這樣產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化株承載含編碼P 31 DNA的新重組體DNA可以用安芐青霉素抗性作為表現(xiàn)型加以選擇。為了找出承載由抗性中取得編碼P31新的DNA重組體質(zhì)粒的品系，同樣的可用上述方法。
質(zhì)粒DNA是由轉(zhuǎn)化株分離出來的，而轉(zhuǎn)化株則以堿萃取方法加以選擇〔Birnboim，H.C.and Doly，J.，Nucleic Acid Res.，7，1513(1979)〕并應用于酵母的轉(zhuǎn)化，例如亮氨酸需要的酒酵母菌系象AH22R(leu2 his4 canl cir+pho80)〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80，1(1983)〕或AH22R--衍生的K33-7B(pho80-AH22，pho8-2)或K33-8D(pho80-AH22，pho8-2trpl)用已知方法〔Hinnen，A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1927(1978)〕或其變更。酵母作為受體并不限于這些，不過以酒酵母菌系為佳。
酵母是在本來知道的培養(yǎng)基中取得轉(zhuǎn)化。Burkholder在《minimum medium》中舉例說明培養(yǎng)基問題〔Bostian，K.L.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，4505(1980)〕。
培養(yǎng)的酵母菌轉(zhuǎn)化通常是在15°-40℃之間，而以24℃-37℃之間較好，時間為10-96小時，而以24-72小時較好，若需要可通氣和(或)攪拌。
對于精細桿菌的使用，例如作為受體是把編碼P31的DNA插入于啟動子區(qū)的3′末端，使其在精細桿菌或動物細胞中能有功能作用，同時受體是隨著生成物DNA重組體而轉(zhuǎn)化。P31可以用培養(yǎng)轉(zhuǎn)化株的方法生產(chǎn)。不過大腸桿菌和酵母是更適宜作受體。
P31的生產(chǎn)可以糖基的形式或非糖基形式。由大腸桿菌轉(zhuǎn)化獲得的P31是直實非糖基物，但糖酶的一個分子要聯(lián)接到一個P31分子上。
一般眾所周知的HBsAg DNA承載轉(zhuǎn)化株的生長是受到表面抗原基因產(chǎn)物的產(chǎn)生的抑制。不過，根據(jù)本發(fā)明移去生長的抑制作用則P31的產(chǎn)率增高，這和使用編碼P31 DNA的結(jié)果相同。
P31產(chǎn)物的活性可以用直接免疫測定方法測得〔Fujisawa，Y.et.al.，Nucleic Acid Res.，11，3581(1983)〕，這方法包含把樣品結(jié)合到溴化氰活性纖維素酶紙上隨著與AusriaⅡ-125(Dainabott)的125Ⅰ-反式-HBsAg抗體起反應。
細胞栽培后，以常規(guī)方法收集。就大腸桿菌的轉(zhuǎn)化株來說，其細胞可適當處理，這可以把細胞懸浮于含有如尿素或胍氯化物的蛋白質(zhì)性變劑中。而懸浮液置于涼處并加以攪拌，然后用離心方法分離出含P31上清液或讓細胞懸浮于緩沖劑中，然后以聲處理，溶菌酶使其破裂和(或)經(jīng)過凍結(jié)和解凍再用離心法分離出含P31的上清液。這是其他方法中最理想的施例，不過要懸浮細胞并采集于緩沖劑中，加溶菌酶，攪勻以引起溶胞作用。再加含尿素(3-10M)，攪拌混合物(在0-10℃，0.5-8小時)然后用離心法收集上清液。
就酵母轉(zhuǎn)化株來說，細胞是用裂合酶(Kirin Brewery CO.)或用玻璃珠的機械方法。上述方法可加入表面活化劑如Triton(表面活化劑商品名)X-100或脫氧膽酸鹽或加入象胍氫氯化物蛋白質(zhì)變性劑，由此，可以更有利地萃取P31。
上述方法萃取的P31蛋白質(zhì)的分離和提純是在提純方法包括親和色譜法處理的指導下進行。
親和色譜法可以說是用聚合的人的血清蛋白(聚-HSA)作為配體或抗體柱處理，用抗體于HBsAg，特別用單無性繁殖系抗體于HBsAg。
親和色譜法用聚-HSA作為配體對P31蛋白質(zhì)的提純最有利作為親和色譜法中的載體可用的如甲酰-Cellulofine(Seikagaku Kogyo)或Affi-膠凝15(Bio-Rad)，而甲酰-Cellulofine是理想的施例。
利用交聯(lián)劑(例如戊二醛)可由聚合的人的血清蛋白生產(chǎn)聚-HSA。利用還原制(例如NaCNBH3)可以把聚-HSA結(jié)合到上面的載體上，如偶聯(lián)產(chǎn)物聚-HSA載體的取得洗滌后，若需要，通常為方便其使用而擠入柱管中。
用聚-HSA作配體的親和色譜法提純P31蛋白質(zhì)，上述含P31溶液(細胞抽提物上清液)可以被吸收于上述的管柱中以平衡予置的緩沖劑〔例如磷酸鹽〕，然后再以緩沖劑洗脫。上面所說的緩沖劑含有適量的表面活化劑(例如特威恩20)或蛋白質(zhì)變性劑(尿素)。改變這些添加劑的組合及其濃度就可以用作適當?shù)南疵搫：琍31蛋白質(zhì)洗脫物收集后若需要可利用超濾作用加以濃縮，此是一例。
上述濃縮作用更理想的施例是以二硫蘇糖醇還原后進一步經(jīng)用疏水管柱的色譜處理如同高性能液相色譜利用反相管柱或疏水色譜法一樣。
在上述高性能液相色譜法中作為載體的，可能提到的有烷基化了的(C1至C18左右)(聚)硅氧烷型載體，例如AP-202 300
(C8)和AP-224 300
(C8)(YMC-Shimakyu)，超孔RPSC(Beckman)和高孔RP-34(Bio-Rad).其中AP-202 300
(C8)和AP-224 300
(C8)都是理想的，而AP-224 300
(C8)則更為理想。
在疏水色譜中提到的載體可能有丁基-Toyo真珠650M(Toyo蘇打生產(chǎn)的)和辛基瓊脂糖(凝膠)CL-4B(Pharmacia).利用反相管柱特別有利于高性觸液相的應用。
上述高性能液相色譜使用反相管柱、水、C1至C6低級鏈烷醇(例如乙醇、丙醇)、乙腈等等。用作洗脫液，理想的施例是用三氟乙酸調(diào)節(jié)PH為1.2-5.0之間，而流出速率以0.1-100毫升/分為理想0.5-30毫升/分則更理想。
由于要求產(chǎn)生的為白色粉末，這樣取得的含P31蛋白質(zhì)部份可能是凍干的。
這樣產(chǎn)出的P31蛋白質(zhì)，其純度(比活性)的檢驗可以用的方法如酶的免疫測定法，這方法包括使樣品與帶有塑料外殼的聚-HSA起反應和檢測聚-HSA結(jié)合P31蛋白質(zhì)。這檢測方法是用辣根的過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)反式HB2Ag單無性繁殖系抗體或放射免疫測定法，該方法包括用AusriaⅡ-125(Dainabbott，USA)的125Ⅰ-反式-HBsAg檢測聚HSA偶聯(lián)P31蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明使用生產(chǎn)方法能獲得高純的P31蛋白質(zhì)，適于作藥物用，此是實例。
舉例，用本發(fā)明的方法在大腸桿菌承載一個對HBsAg P31有堿基順序密碼的DNA里生產(chǎn)純化的P31可以獲得HBsAg P31蛋白質(zhì)，它是真實的純且具有下列特性(1)在SDS-聚丙烯酰胺切片的凝膠電泳中，它是純系的而用上述電泳(在還原的條件下)測得其分子重為32，000±1，000道爾噸。
(2)它含有蛋氨酸(或甲?；}蛋氨酸)。
(3)它含有異亮氨酸如羧基末端氨基酸。
(4)它使聚HSA堅固。
(5)它的比活性不少于1×106單位/毫克。
用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的真純P31蛋白質(zhì)與產(chǎn)自以感染HBV病人的血液作原料的已知HBsAg細顆粒有相同的生物效能如上述HBsAg細顆粒同一方法，可用作檢定，預防和(或)治療HBV感染。
在此所說的為測定蛋白質(zhì)純度而作的P31蛋白質(zhì)活性(比活性)的測定是由ELISA法完成。所以把試液(含P31蛋白質(zhì)溶液)分為若干分，每分100ml，使進入帶有HSA的免疫平皿Ⅱ(Nunc)的凹處，而其中聚HSA是參照例4-(1)在那里予作物理吸附。在4℃，反應過夜，平皿用含有5%牛血清和0.05%特威恩20的PBS洗滌，然后100μl的辣根過氧化物酶結(jié)合反式-HBsAg單無性繁殖系抗體溶液加入每個平皿的凹處。反應兩個小時以后，平皿再以上述的緩沖劑洗滌。接著加入100μl的檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(pH5.0)，其中含有苯二胺(4mg/10ml)和過氧化氫水溶液(4μl/10ml)。在室溫下反應30分鐘，加50μl 2N硫酸則酶的反應被終止，用Titertek Multiskan MC于492nm吸光率測定。此試驗的純凈樣品是由例7取得并用作標準，而測得結(jié)果以單位數(shù)目的術(shù)語表示即吸光率(0.05光出度)以標準的1ng表示為1單位。
本說明書的圖樣和規(guī)定，堿、氨基酸等當用縮寫表示時，該縮寫是根據(jù)IUPAC-IUB委員會關于生物化學命名法或在有關范圍的慣用縮寫。下面列的是這些縮寫的例子。這有可能牽涉氨基酸的旋光異構(gòu)現(xiàn)象，必須注意，除非有別的說明，否則上述氨基酸都是指L型。
DNA 脫氧核糖核酸RNA 核糖核酸mRNA 信使RNAA 腺嘌呤T 胸腺咄啶G 烏嘌呤C 胞嘧啶dATP 脫氧腺苷三磷酸dTTP 脫氧胸苷三磷酸dGTP 脫氧烏苷三磷酸dCTP 脫氧胞苷三磷酸ATP 腺苷三磷酸EDTA 乙二胺四乙酸SDS 十二烷磺酸鈉DTT 二硫荔糖醇Gly 甘氨酸Ala 丙氨酸Val 纈氨酸Leu 亮氨酸Ile 異亮氨酸Ser 絲氨酸Thr 蘇氨酸Cys 半胱氨酸
1/2Cys 半胱氨酸Met 甲硫氨酸，蛋氨酸Glu 谷氨酸Asp 天冬氨酸Lys 賴氨酸Arg 精氨酸His 組氨酸Phe 苯丙氨酸Tyr 酪氨酸Trp 色氨酸Pro 脯氨酸Asn 天冬酰酸Gln 谷氨酰胺Apr氨芐青霉素抗性基因Tcr四環(huán)素抗性基因PRλPR啟動子ars1 自發(fā)復即順序1IR 轉(zhuǎn)化重復附圖簡述圖1表示對adr HBsAg P31型的DNA順序密碼(上排)和相應氨基酸順序(下排)圖2表示對adw HBsAg P31型的DNA順序密碼(上排)和相應的氨基酸順序(下排)
圖3是質(zhì)粒pPHO17-1的圖解，而符號E，S，B，H和X分別代表EcoRⅠ，SalⅠ，BamHⅠ，HindⅢ和XhoⅠ圖4是質(zhì)粒pPKT700-1的圖解，而符號E，S，B，H和X分別代表EcoRⅠ，SalⅠ，BamHⅠ，HindⅢ和XhoⅠ圖5是質(zhì)粒pGLD906-1的圖解，而符號E，S，B，H和X分別代表EcoRⅠ，SalⅠ，BamHⅠ，HindⅢ和XhoⅠ圖6是質(zhì)粒pTRP P31-1提供附屬型adr HBsAg P31在大腸桿菌表現(xiàn)度的圖解，而符號E，B，C和P分別代表EcoRⅠ，BamHⅠ，ClaⅠ和PstⅠ圖7是質(zhì)粒pTRP P31-W2提供附屬型adw HBsAg P31在大腸桿菌的表現(xiàn)度的圖解，而符號E，B，C，和P分別代表EcoRⅠ，BamHⅠ，ClaⅠ和PstⅠ圖8是質(zhì)粒pGLD P31-R，pPHO P31-R和pPKT P31-R提供附屬型HBsAg P31在酵母中表現(xiàn)度的圖解，而符號E，B，S，H，X和C分別代表EcoRⅠ，BamHⅠ，SalⅠ，HindⅢ和ClaⅠ圖9和圖10每個均表示質(zhì)粒pPHO P31-W提供附屬型adw HBsAg P31在酵母中表現(xiàn)度的圖解而符號E，P，B，C，S和H分別代表EcoRⅠ，PstⅠ，BamHⅠ，ClaⅠ，SalⅠ和HindⅢ圖11表示在SDS-聚丙烯酰胺粘的膠凝電泳結(jié)果，如同第(1)和(2)段例7的末尾部分。
執(zhí)行本發(fā)明的最好方式參考例1制備含有酵母衍生的阻過酸磷酸酶啟動子(pHO5-P)的表現(xiàn)運載體。
大腸桿菌質(zhì)粒pJAl(50μg)含酒酵母S288 C和其衍生的阻過磷酸酶基因(PHO5)和組成酸磷酸酶和7.9kb DNA斷片〔Kramer，R.A.and Anderson，N.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，6541(1980)〕這樣進行處理，即以20單位的限制性內(nèi)切酶BamHⅠ〔Takara Shuzo〕和20單位的限制性內(nèi)切酶SalⅠ〔Takara Shuzo〕在100μl反應混合物(100mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH8.0)，7mM MgCl2，100mM NaCl，2mM2-巰基乙醇〕在37℃反應3小時，接著用1.0%瓊脂糖(Sigma)切片膠凝電泳于緩沖液〔100mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，100mM硼酸，2mM EDTA(pH8.3)〕在140V起反應2小時。此后，凝膠部份含有0.63kb的DNA斷片封接于滲析管，將管浸入緩沖液中電泳，而上述的DNA斷片從凝膠中電動地洗脫〔McDonell，M.W.et al.，J.Mol.Biol.，110，119(1977)〕。在滲析管里的液體用酚萃取，接著用乙醚苯取并補充NaCl至濃度為0.2M。然后加入2體積的冷的乙醇，在-20℃時DNA則產(chǎn)生沉淀。
質(zhì)粒pSH19(1μg)是送樣處理的，即以2單位的限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和2單位限制性內(nèi)切酶SalⅠ置于20μl的反應混合物〔10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH8.0)，7mM MgCl2，100mM NaCl，2mM2-巰基乙醇〕，于37℃時反應2小時。反應混合物是根據(jù)使用0.8%瓊脂糖切片的電泳在與上述相同的條件下可以產(chǎn)生電導。電泳后，8.0kb的DNA斷片用上述方法從凝膠中分離出來。接著與酚發(fā)生去蛋白作用，用冷的乙醇使DNA沉淀(參看圖3)。400ng上述8.0kb DNA斷片和0.63 kb DNA斷片在20μl反應混合物〔66mM三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸(pH7.6)，6.6mM MgCl2，10mM二硫蘇糖醇1mM ATP，2單位的T4 DNA連接酶(Takara Shuzo)〕中，在14℃時混合和連接在一起，經(jīng)過一夜反應后，以上述科恩等人的方法這反應混合物可用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌294。質(zhì)粒DNA以上述堿萃取方法從每一轉(zhuǎn)化株中分離出來。而轉(zhuǎn)化株的選擇是基于對氨芐青酶素的抗性而用作指示者，測定分子重量及限制性內(nèi)切酶卵裂型。這方法的pPHO12質(zhì)粒，其中0.63kb DNA斷片由pJAl中分離出來。而pJAl曾插入pSH19的BamHⅠ-SalⅠ部位而被分離(參看圖3)。
質(zhì)粒pPHO12 DNA的3-μg部份是這樣處理的，即以2單位的限制性內(nèi)切酶SalⅠ在20μl的反應混合物〔10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(PH7.5)，7mM MgCl2，175mM NaCl，0.2M EDTA，7mM2-巰基乙醇〕中在37℃時反應2小時，接著與酚發(fā)生去蛋白作用，用冷的乙醇使DNA沉淀。而這DNA的3μg部分是這樣處理的，以12單位的BAL 31核酸酶(Bethesda研究實驗室)在50μl的反應混合物〔20mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH8.1)，12mM CaCl2，12mM MgCl2，1mM EDTA〕中，在30℃時反應2分鐘，接著與酚發(fā)生去蛋白作用，再以冷的乙醇使DNA沉淀(參看圖3)。
這XhoⅠ衍接物d(CCTCGAGG)(200ng)〔新英格蘭生物實驗室〕是在50μl的反應混合物(50mM三羥甲基氨基烷-鹽酸(pH7.6)，10mM MgCl2，10mM2-巰基乙醇，100μM ATP〕在37℃時以彈位的T4多核苷酸激酶〔Takara Shuzo〕在銜接末端5′使其磷酸化1小時。
40ng末端5′磷酸化了的銜接物〔5′-P-d(CCTCGAGG)〕和400ng上述BAL31處理的pPHO12 DNA在與上述相同的條件在T4 DNA連接酶的作用下混合和連接在一起。利用這反應混合物以科恩等人的方法，大腸桿菌可被轉(zhuǎn)化。質(zhì)粒DNA以上述堿萃取方法從每一轉(zhuǎn)化株中分離出來。而轉(zhuǎn)化株的選擇是基于對氨芐青酶素的抗性而作為指示者和質(zhì)粒pPHO17在與已選擇的BamHⅠ和XhoⅠ進行雙消化作用下而給出0.55碎片，DNA堿基順序的分析是用雙脫氧核苷酸方法〔Sanger等人的Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，5463(1977)〕，此方法揭示BAL31核酸酶處理的結(jié)果從PHO5中的起始密碼子ATG消除逆流的20bp(參看圖3)。
2μg上述pPHO17質(zhì)粒是這樣的處理，即在20μl反應混合物〔6mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(PH7.9)，150mM MgCl2，5mM2-巰基乙醇〕在37℃時以4單位的限制性內(nèi)切酶XhoⅠ〔Takara Shuzo〕反應2小時，接著與酚起去蛋白作用并用冷的乙醇使DNA沉淀。
1μg DNA沉淀是這樣處理的，即30μl的反應混合物〔40mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)，6.6mM MgCl2，1mM2-巰基乙醇，33μM dATP，33μM dGTP，33μM dTTP，33μM dCTP〕中在12℃時以5單位的DNA聚合酶Ⅰ大碎片(新英格蘭實驗室)作用30分鐘使粘性末端轉(zhuǎn)化為園鈍，接著與酚起去蛋白作用并用冷的乙醇沉淀DNA。500ng上述DNA碎片和在上述〔5′-P-d(GGTCGACC)〕條件下磷酸了的銜接物SalⅠ，按上述條件，在T4 DNA逆接酶的作用下混合和連接在一起。利用反應混合物以科恩等人的方法使大腸桿菌轉(zhuǎn)化。從氨芐青霉素轉(zhuǎn)化株中pPHO17-1質(zhì)粒其pPHO17質(zhì)粒的XhOⅠ部位轉(zhuǎn)化為已選擇的SalⅠ部位。
參考例2制備含有酵母磷酸甘油酸激酶啟動子(PGK-P)。
(1)磷酸甘油酸激酶基因(PGK)的無性繁殖。
以Cryer，D.R.等人的方法〔Methods in Cell Biology，Vol.Ⅻ，Page 39-44(1975)〕制取的350μg酒酵母菌株Kyokai 3(可從IFO得到)的染色體DNA是這樣處理的即在1ml反應混合物〔10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH7.5)，7mM MgCl2，60mM NaCl〕在37℃時與200單位的限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ〔Takara Shuzo〕作用3小時，接著在參考例一所述的條件下進行1%瓊脂糖切片的凝膠電泳。電泳后，依DNA斷片的大小可分為1至10份。每份中的瓊脂糖凝膠塊封于滲析管，在參考例一的條件下，DNA從凝膠塊電動地洗脫出來。洗脫物以酚處理，并加入冷的乙醇將DNA沉淀。來自每一份的DNA 0.5μg在參考例一所述條件下進行電泳，即以1%瓊脂糖切片凝膠并用薩瑟恩方法〔Southern，E.M.，J.Mol.Biol.，98，503(1975)〕讓DNA吸收于硝化纖維過濾器上面(施來歇爾和舒爾)。從PKG的N末端給氨基酸以補充到低核苷酸密碼5′-TGAAGATAAAGACAT-3′〔Dobson，M.J.et al.，Nucleic Acid Res.，10，2625(1982)〕，用克雷R·等人的方法合成〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，5765(1978)〕而上述低核苷酸是在37℃時30μl的反應混合物〔50mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH7.6)，10mM MgCl2，10mM2-巰基乙醇〕以10μCi的γ-〔32P〕ATP(Amersham)和10單位的低核苷酸激酶作用30分鐘因而標記5′末端與32P結(jié)合在一起。以一個體積的酚與反應物中存在著的10μl 200mM EDTA(pH8.0)起去蛋白作用然后應用于瓊脂糖4B(Pharmacia)柱(0.25×25cm)并以TEN(總排泄氮)緩沖液〔10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH8.0)，200mM NaCl，1mM EDTA〕平衡之。標記低核苷酸洗出于空柱體積附近而被收集并用作對PGK基因篩選的探查物。以
瑟恩方法利用上述硝化纖維過濾器和探查物來完成吸除作用，因此，探查物與含2.6kb至2.9kb DNA斷片的第二部分樣品起強烈的雜交作用。
再者，10μg無性繁殖載體pTR262〔Roberts，T.M.et al.，Gene，12，123(1980)〕的處理是在37℃時在50μl的反應混合物〔10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH7.5)，7mM MgCl2，60mM NaCl〕中與10單位的限制性內(nèi)切酶HindⅢ作用2小時，接著與酚起去蛋白作用并以冷的乙醇(消化了的HindⅢ pTR262)沉淀DNA。在參考例一所述的條件下0.1μg消化了的HindⅢ pTR262與第三部分的DNA混合在T4聯(lián)接酶的作用下，它們聯(lián)接在一起。利用反應混合物，大腸桿菌DHl〔Maniatis，T.et al.，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，254-255(1982)〕可以被轉(zhuǎn)化并獲得顯示四環(huán)素抗性的1，300轉(zhuǎn)化株。在它們之中，利用上面說的標記32P合成探查物的群體雜交作用選擇了PGK基因承載轉(zhuǎn)化株?！睸uggs，S.V.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78，6613(1981)〕從轉(zhuǎn)化株給出的強烈的放射自顯影信號，說明質(zhì)粒pPKT3已被上述堿萃取方法所分離。與HindⅢ的消化作用導致2.95kb DNA插入的檢出并用薩瑟恩確認的與探查物的插入雜交的方法進行測試。
(2)PGK啟動子斷片的分離50μg pPKT3 DNA質(zhì)粒的處理是在37℃時，在100μl反應混合物〔10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH7.5)，7mM MgCl2，60mM NaCl〕與50單位的限制性內(nèi)切酶HindⅢ作用2小時，接著在參考例一所述的條件下以1%瓊脂糖切片凝膠電泳。電泳后，以參考例一所述方法從凝膠中分離出2.95kb DNA斷片(參看圖4)。
5μg上述2.95kb DNA斷片的處理是在37℃時，在20μl的反應混合物〔10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH7.5)，7mM MgCl2，175mM NaCl，7mM2-巰基乙醇〕與5單位的限制性內(nèi)切酶作用3小時，而消化混合物根據(jù)1.2%瓊脂糖切片凝膠電泳，在參考例一的條件下傳導。電泳后，以參考例一所述方法將2.1kb DNA斷片從凝膠中分離出來。0.5μg上述2.1kb DNA斷片和由質(zhì)粒pBR322與HindⅢ和SalⅠ起消化作用而得的0.5μg的3.74kb DNA按參考例一的條件在T4 DNA連接酶的作用下連接在一起。利用反應混合物，大腸桿菌DH1可被轉(zhuǎn)化，而所希望得到的質(zhì)粒pPKT101則可以氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化株中獲得。
接著，消除PGK基因的結(jié)構(gòu)基因區(qū)，即將10μg上述pPKT101 DNA質(zhì)粒在37℃時，在30μl反應混合物〔10mM三羥甲基氨基烷-鹽酸(pH7.5)7mM MgCl2，175mM NaCl，0.2M EDTA，7mM2-巰基乙醇〕先以10單位限制性內(nèi)切酶處理3小時，消化混合物與酚起去蛋白作用而冷的乙醇使DNA產(chǎn)生沉淀(SalⅠ-消化了的pPTK101)。1μg的SalⅠ-消化了的pPTK101，在室溫時，在20μl反應混合物〔20mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH8.1)，12mM CaCl2，12mM MgCl2，1mM EDTA〕中以10單位的BAL 31核酸酶處理5分鐘。此后，隨即加入1體積酚以終止反應，接著以冷乙醇沉淀DNA(BAL-消化了的-pPTK101)。50μg如參考例一所述磷酸化了的Xhol銜接物和0.2μg的BAL-消化了的pPTK101按參考例一的條件在T4連接酶的作用下混合和連接在一起。此后，利用反應混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH1而且是從氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化株中取得。而0.69kb pPKT567質(zhì)粒則以啟動子區(qū)pPKT101消除方向的SalⅠ部位取得。用雙脫氧核苷酸的方法分析DNA堿基順序證實pPKT567在BAL 31處理中已消除PGK結(jié)構(gòu)基因而且是在5′-鄰區(qū)-24內(nèi)(參看圖4)。
(3)表現(xiàn)載體的結(jié)構(gòu)5μg大腸桿菌-酵母往復機制載體pSH19的處理是在37℃時，在20μl的反應混合物〔10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH7.5)，7mM MgCl2，175mM NaCl，0.2mM EDTA，7mM2-巰基乙醇〕以限制性內(nèi)切酶SalⅠ處理2小時，接著與酚起去蛋白作用并與冷乙醇起沉淀作用。1μg DNA按參考例一所說混合和把粘性末端連接到園鈍末端的條件以DNA聚合酶Ⅰ大斷片處理。500ng DNA斷片和50ng磷酸化的XhoⅠ銜接物在參考例一所述條件下，利用T4 DNA連接酶使之混合和連接在一起。大腸桿菌DH1隨反應混合物轉(zhuǎn)化并從氨芐青霉素抗性中獲得，轉(zhuǎn)化株承載質(zhì)粒pSH19-1，其中pSH19的SalⅠ部位轉(zhuǎn)換為已獲得的XhoⅠ部位(參看圖4)。
15μg上述pSH19-1DNA在37℃時，在100μl的混合物〔10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH7.5)，7mM MgCl2，60mM NaCl〕中，以24單位限制性內(nèi)切酶HindⅢ處理10分鐘。隨后立即加入10μl 0.2M EDTA以終止反應。反應混合物按參考例1所述條件用0.7%瓊脂糖切片凝進行電泳，8.3kb DNA斷片在HindⅢ位置上裂開，按參考例1所述方法從凝膠中分離出來。3μg的上述8.3kb DNA斷片在37℃時，在30μl反應混合物〔10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH7.5)，7mM MgCl2，100mM NaCl，7mM2-巰基乙醇〕中以10單位的限制性內(nèi)切酶XhoⅠ〔Takara Shuzo〕處理2小時。在參考例一所述條件下，用0.7%瓊脂糖切片凝膠進行電泳。電泳后，以參考例一所述的方法從凝膠中分離出7.7kb DNA斷片(參看圖4)。
參考例2-(2)所述的pPKT567 DNA質(zhì)粒于37℃時，在50μl反應混合物(50mM三羥甲基氨基甲烷-鹽(pH7.6)，50mM NaCl，1mM二硫蘇糖酸〕中，以每種10單位的限制性內(nèi)切酶HindⅢ和XhoⅠ處理2小時。以后按參考例所述以1.2%瓊脂糖切片凝膠進行電泳，而1.4kb DNA斷片則從凝膠中分離出來(參看圖4)。
0.2μg的上述1.40kb DNA斷片和0.5μg的上述7.7kb DNA斷片依參考例1所述條件，在T4 DNA聯(lián)接酶的作用下混合和連接在一起。大腸桿菌DH1隨著反應混合物而轉(zhuǎn)化并在氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化株中取得，且曾獲得轉(zhuǎn)化株承載的理想pPKT 700質(zhì)粒。然后，上述pPKT700質(zhì)粒的XhoⅠ位置上的質(zhì)粒pPKT700-1以參考例1所述方法轉(zhuǎn)化為SalⅠ位置(參看圖4)。
參考例3表現(xiàn)載體的結(jié)構(gòu)包含酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GLD-P)(1)甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GLD)的無性繁殖將5′-AGCAACTCTAACCAT-3′補充到GLD的pgap491〔Holland，J.P.et al.，J.Biol.Chem.，258，5291(1983)〕的低核苷酸上，則此密碼可使氨基酸以克雷R等人的方法從N末端加以合成。以參考例2-(1)所述方法標記32P用作探查物。薩瑟恩吸除作用按參考例2-(1)所述用硝化纖維過濾器和上述探查物來完成。因此，探查物與含有2.0-2.3kb DNA斷片的第七部分樣品強烈的雜交。
在參考例1的條件下，參考例2-(1)所述的0.1μg Hind-消化了的pTR262與0.2μg第七部份樣品中的DNA利用T4 DNA連接酶而聯(lián)接在一起。利用反應混合物，以參考例2-(1)所述方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH1，并可從大約1，200四環(huán)素抗性轉(zhuǎn)化株中取得，轉(zhuǎn)化株與用菌落雜交作用分離出來的標記32P探查物有很強的雜交能力。用上述堿萃取法可以從轉(zhuǎn)化株中分離出質(zhì)粒pGLD9，當與HindⅢ記消化作用時，可以檢出2.2kb插入DNA，而用薩瑟恩方法測試顯示此插入DNA確與上述探查物雜交(參看圖5)。
(2)GLD啟動子斷片的分離100μg pGLD9 DNA質(zhì)粒于37℃時，在200μl反應混合物〔10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH7.5)，7mM MgCl2，60mM MaCl〕用50單位的限制性內(nèi)切酶HindⅢ處理3小時，接著用1.0%瓊脂糖切片凝膠在參考例1所述條件下電泳。電泳后，用參考例1所述方法從凝膠中分離出2.2kb DNA斷片。10μg的上述2.2kb DNA斷片于37℃時，在50μl反應混合物〔10mM三羥甲基氨基烷-鹽酸(pH7.5)，7mM MgCl2，100mM NaCl，7mM2-巰基乙醇〕中以10單位的限制性內(nèi)切酶HinfⅠ〔Takara Shuzo〕處理2小時然后以薩瑟恩利用GLD探查物的方法來完成雜交作用，因此，上述探查物被結(jié)合到0.5kb DNA斷片上(參看圖5)。
5μg的上述0.5kb DNA斷片于37℃時，在30μl反應混合物〔10mM三羥甲基氨基烷-鹽酸(pH7.5)，在50mM NaCl，10mM MgCl2，1mM二硫蘇糖醇〕中，以限制性內(nèi)切酶HhaⅠ〔Takara Shuzo〕和TaqⅠ(New England BioLabs)各10單位處理3小時。接著以1.5%瓊脂糖切片凝膠電泳，其在參考例1的條件下發(fā)生傳導使用。之后，以參考例1所述方法從凝膠中分離出0.36kb DNA斷片(參看圖5)。
1μg的上述0.36kb DNA斷片在參考例1所述條件下，以DNA聚合酶Ⅰ大斷片處理，從而使得TaqⅠ粘性末端園鈍。然后，1μg這種斷片和50ng參考例所說的磷酸化的XhoⅠ銜接物在參考例1所述的條件下利用T4 DNA連接酶而聯(lián)接在一起。反應后，加入過量的XhoⅠ，在溫度37℃反應4小時后，在參考例2-(1)所述的條件下，用Sepharose(瓊脂糖商品名)4B柱分離出結(jié)合0.36kb DNA斷片的銜接物。
10μg上述的2.2kb DNA斷片在參考例一的條件下用DNA聚合酶Ⅰ大斷片處理，使其粘性末端園鈍。在參考例1所述的條件下利用T4 DNA連接酶與參考例1所說的50ng的磷酸化的銜接物〔5′-P-d(CGCGGATCCGCG)(new England BioLabs)相連接。反應后，加入20單位的BamHⅠ，于37℃，反應3小時后，在參考例2-(1)所述條件下，利用Sepharose(瓊脂糖商品名)4B柱分離出結(jié)合2.2kb DNA斷片的銜接物。6μg的上述DNA斷片，于37℃，在50μl反應混合物〔10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH7.5)，50mM NaCl，10mM MgCl2，1mM二巰基乙醇〕中，以2單位的限制性內(nèi)切酶HhaⅠ處理2小時。此后，在參考例1條件下，用1.0%瓊脂糖切片凝膠電泳。電泳后，以參考例1所述方法，把0.75kb DNA從凝膠中分離出來(參看圖5)。
(3)表現(xiàn)載體的結(jié)構(gòu)10μg參考例2-(3)所說的pSH19-1質(zhì)粒，于37℃，在50μl反應混合物〔10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH7.5)，7mM MgCl2，100mM NaCl，7mM2-巰基乙醇〕中以限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ各10單位處理2小時。接著在參考例1所說的條件下以1.0%瓊脂糖切片凝膠電泳，以后用參考例1所說的方法，從凝膠中分離出8.0kb DNA斷片。
500ng上述的8.0kb DNA斷片，200ng例3-(2)所說的0.36kb DNA斷片和200ng例3-(2)所說的0.75kb DNA在參考例1的條件下利用T4 DNA聯(lián)接酶將它們聯(lián)接在一起。利用反應混合物，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH1并從氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化株中取得，轉(zhuǎn)化株承載由三種DNA斷片連接在一起而組成的pGLD906質(zhì)粒則被分離。接著轉(zhuǎn)換上述pGLD906質(zhì)粒的XhoⅠ部位為SalⅠ部位而構(gòu)成pGLD906-1質(zhì)粒(參看圖5)。
參考例4聚HSA-Ccllulofine柱的生產(chǎn)(1)聚合的人血清清蛋的生產(chǎn)于20ml的人血清清蛋白(Albumin-Nichiyaku;Nippon Seiyaku，Tokyo)溶液(含4g人血清清蛋白)加入180ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS;8.1mM NaH2PO4，1.5mM KH2PO4，2.7mM KCl，137mM NaCl，pH7.2)和60ml戊二醛水溶液。攪拌混合物至均勻，然后在室溫下靜置1小時。于5℃時，上面的混合溶液對10升蒸餾水的透析作用終止聚合反應。此后，更換三次透析流體，這樣，馀留的戊二醛便從反應混合物徹底的移除。由此而取得275ml聚合人血清清蛋白(聚HSA)溶液。
(2)聚HSA-Cellulofine柱的生產(chǎn)于上法取得的90ml聚HSA溶液，加入10ml 10倍濃度的PBS，接著再加入40ml甲酰-Cellulofine。攪拌后，反應可以在室溫下進行30分鐘。然后于混合物中加入1.6g NaCNBH3，蓋緊塞子后，整個混合物在室溫下振動18小時。將混合物轉(zhuǎn)移到玻璃過濾器上，凝膠則用PBS洗滌，從而移去仍未與甲酰-Cellulofine結(jié)合的聚HSA部份。上述方法中，聚-HSA粘合到Cellulofine的百分率約為73%并取得40ml聚-HSA-Cellulofine，其中約含24mg聚-HSA結(jié)合到每ml的Cellulofine。此凝膠懸浮于含有0.1M乙醇胺的PBS中，并加入NaCNBH3(200mg)，混合物在室溫下振動3小時，然后凝膠轉(zhuǎn)移到玻璃過濾上，按順序以PBS，3M尿素、6M胍氫氯化物和25mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)洗滌，再裝入直徑為5cm的柱而產(chǎn)生聚-HSA-Cellulofine柱。
例1重組體DNA分子供附屬型adr的乙型肝炎表面抗原P31基因表現(xiàn)，并使大腸桿菌進行轉(zhuǎn)化。
如1984年日文版的《未檢定的蛋白質(zhì)的應用》第74985號和1983年的《核酸研究第11，1747頁所述的pBR322-BamHⅠ/HBr330質(zhì)粒(也稱其簡寫為pHBr330)是用1983年日文版的《未檢定的蛋白質(zhì)的應用》第201796號其所舉參考例1所述方法制備。50μg的上述pHBr330質(zhì)粒，于37℃時，在100μl的反應混和物〔100mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH7.5)，7mM MgCl2，50mM NaCl，7mM2-巰基乙醇中用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ〔Takara Shuzo〕和BamHⅠ各20單位處理3小時，接著在參考例1所述條件下，以1.0%瓊脂糖切片凝膠進行電泳。電泳后，以參考例1所述方法從凝膠中分離出1.4kb DNA斷片(參看圖6)。
2μg的pBr322 DNA質(zhì)粒于37℃時，20μl反應混合物〔10mM三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸(pH8.0)，7mM MgCl2，100mM NaCl，2mM2-巰基乙醇〕中，以限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和ClaⅠ(New England BioLabs)各2單位處理2小時，接著以0.8%瓊脂糖切片凝膠進行電泳，其在參考例1所述條件下受傳導。此后，以參考例1所述方法從凝膠中分離出4.01kb DNA斷片。
500ng的上述4.01kb DNA斷片，500ng的上述1.4kbDNA斷片和50ng的在5′末端磷酸化的合成接合體d(
)以參考例1所述方法和條件下，利用T4 DNA連接酶連接在一起。上述接合體是用磷酸三酯方法〔Crea，R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，5765(1978)〕化學合成。利用上述反應混合物，大腸桿菌294被轉(zhuǎn)化并在氨芐青霉素抗原中獲得包含有上面三種DNAs連接在一起的pHBrP31 DNA質(zhì)粒(參看圖6)。
1μg的pHBrP31 DNA質(zhì)粒，于37℃時，在20μl的反應混合物〔10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH8.0)，7mM MgCl2，100mM NaCl，2mM2-巰基乙醇〕中以2單位限制性內(nèi)切酶BamHⅠ處理2小時，接著與酚起去蛋白作用，再加入冷乙醇沉淀DNA(BamHⅠ-消化的pHBrP31)。
500ng的BamHⅠ-消化的pHBrP31在參考例1所述條件下以DNA聚合酶Ⅰ大斷片處理，使粘性的末端園鈍，接著與酚起去蛋白作用而與冷乙醇起沉淀作用。取得的300ng DNA斷片和50ng以參考例1所說的在5′末端磷酸化的PstⅠ銜接物〔5′-P-d(GCTGCAGC)〕(New England BioLabs)在參考例1所述條件下利用T4 DNA連接酶而連接在一起。利用反應混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌294，而轉(zhuǎn)化株是用參考例所述方法篩選而得，而pHBrP31-17質(zhì)粒其pHBrP31質(zhì)粒的BamHⅠ部位已轉(zhuǎn)換為PstⅠ部位而被分離(參看圖6)。
50μg的上述pHBrP31-17于37℃時，在100μl反應混合物〔20mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH7.5)，10mM MgCl2，50mM(NH4)2SO4〕中，以限制性內(nèi)切酶ClaⅠ和PstⅠ〔Takara Shuzo〕各20單位處理3小時，接著在參考例1所述條件下以1.0%瓊脂糖切片凝膠進行電泳。電泳后，以參考例1所述方法從凝膠中分離出1.42kb DNA斷片。
50μg如1983年日文版的《未檢定的蛋白質(zhì)的應用》第201796號和1983年的《核致研究》第11，3581頁所說的pTRP771表現(xiàn)載體是在100μl上述反應混合物中以同樣的條件用限制性內(nèi)切酶處理，然后反應混合物在參考例1所述的條件下受1.0%瓊脂糖凝膠切片的電泳，電泳后，以參考例所述方法從凝膠中分離出3.3kb DNA斷片。
200ng的上述1.42kb DNA(給P31的DNA密碼)和3.3kb DNA在參考例1所述條件下，利用T4 DNA連接酶而連接在一起。上述反應混合物用作轉(zhuǎn)化大腸桿菌294并由大腸桿菌株(294/pTRP P31-R)承載pTRP P31-R質(zhì)粒，其中所說編碼P31的DNA已插入表現(xiàn)載體而以參考例1的方法分離出來(參看圖6)。
例2給以附屬型adw的乙型肝炎病毒表面抗原P31基因表現(xiàn)的重組體DNA分子結(jié)構(gòu)及以上述DNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
1983年在日文版的《未檢定蛋白質(zhì)的應用》第194897號和201796號和1983年的《核酸研究》第11，1747頁所說的pBR-EcoRⅠ/HBV933 DNA質(zhì)(簡稱為pHBV933)是以1983年日文版的《未檢定的蛋白質(zhì)的應用》第201796號參考例1所述方法制備。2μg的上述質(zhì)粒，于37℃時，在20μl反應混合物〔10mM三羥甲基氨基烷-鹽酸(pH7.5)，7mM MgCl2，100mM KCl，7mM2-巰基乙醇〕中，以2單位的限制性內(nèi)切酶HpaⅠ〔Takara Shuzo〕處理2小時，接著與酚起去蛋白作用并用冷的乙醇沉淀DNA。300ng的上述DNA和50ng的磷酸化的PstⅠ銜接物〔5′-P-(GCTGCAGC)〕在參考例1的條件下連接在一起。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化是用反應混合物，而轉(zhuǎn)化株是以參考例1所述方法篩選取得，而pHBV933-5質(zhì)粒中pHBV933的HPaⅠ部位已轉(zhuǎn)換為已獲得的PstⅠ部位(參看圖7)。
500μg的上述pHBV933-5DNA質(zhì)粒，于37℃時，在800μl的反應混合物〔20mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH7.5)，10mM MgCl2，50mM(NH4)2SO4〕中以500單位的限制性內(nèi)切酶PstⅠ處理20分鐘，隨即與酚起去蛋白作用。上述反應產(chǎn)物是以參考例1所述的條件下用0.1%瓊脂糖切片凝膠電膠為條件。此后，以參考例1所述方法從凝膠中分離出1.7kb DNA斷片一部分消化的PstⅠ(參看圖7)。
3μg的上述1.7kb DNA于37℃時，在20μl的反應混合物〔100mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH7.5)，7mM MgCl2，50mM NaCl，7mM2-巰基乙醇〕中，以6單位的限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ處理1小時，接著以1.0%瓊脂糖切片凝膠進行電泳，其在參考例1所述條件下可傳導。此后以參考例1所述方法從凝膠中分離出0.97kb DNA斷片(參看圖7)。
500ng的上述0.97kb DNA斷片，500ng例1所說的3.3kb DNA(pTRP771的消化ClaⅠ-PstⅠ)和50ng例一所說的磷酸化的接合體d(
)在參考例1所述的條件下利用T4DNA連接酶而連接在一起。反應混合物用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌294并從四環(huán)素抗性轉(zhuǎn)化株獲得由上面連接在一起的三種DNAs所組成的pTRP P31-W質(zhì)粒，它是用參考例一所述方法而被分離。用插入法在上述質(zhì)粒的ClaⅠ部位插入含有大約330bp斷片的啟動子，其中斷片是的取得如同1983年日文版的《未檢定的蛋白質(zhì)的應用》第201796號和ClaⅠ與HpaⅡ〔Takara Shuzo〕所說的以消化質(zhì)粒pTRP601而完成了pTRP P31-W2(參看圖7)。
例3給以附屬型adr的乙型肝炎病毒表面抗原P31基因在酵母中表現(xiàn)的重組體DNA分子的結(jié)構(gòu)及以上述DNA分子轉(zhuǎn)化酵母。
(1)50μg例一所說的pHBrP31 DNA質(zhì)粒于37℃時，在100μl的反應混合物〔100mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH8.0)，7mM MgCl2，100mM NaCl，2mM2-巰基乙醇〕中，以限制性內(nèi)切酶ClaⅠ和BamHⅠ各20單位，處理3小時。而反應混合物在參考例1所述條件下以1.0%瓊脂糖切片凝膠進行電泳。電泳后，以參考例一所述方法從凝膠中分離出1.42kb DNA斷片。
2μg的上述1.42kb DNA斷片按參考例1的條件以DNA聚合酶Ⅰ大斷片處理使粘性末端園鈍，接著與酚起去蛋白作用和以冷乙醇沉淀DNA。1.5μg的上述DNA和50ng參考例1所述的磷化的SalⅠ銜接物在參考例1所述條件下，利用T4 DNA連接酶而聯(lián)接在一起。將10單位的限制性內(nèi)切酶加入反應混合物中，于37℃進行反應3小時使得末端有粘性。反應使與酚起去蛋白作用，而樣品須在參考例2-(1)的條件下通過Sepharose(瓊脂糖的商品名)4B柱。1.43kb DNA斷片(附屬型adr編碼P31 DNA)包含收集洗脫于空柱體積附近的部分和以冷乙醇沉淀DNA(參看圖8)。
1μg在參例一所述的pPHO17-1DNA表現(xiàn)載體，于37℃時，在20μl反應混合物〔6mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH7.5)，6mM MgCl2，150mM NaCl，6mM2-巰基乙醇〕中，以2單位的限制性內(nèi)切酶SalⅠ處理2小時，然后接著加入0.1單位的堿性磷酸酶，使在65℃時繼續(xù)反應30分鐘。此后，與酚進行去蛋白作用并加冷乙醇沉淀DNA(SalⅠ-消化的pPHO17-1)。接著，200ng的上述的1.43kb DNA斷片和200ng的SalⅠ-消化的pPHO17-1在參考例1所述條件下利用T4 DNA連接酶而連接在一起。利用反應混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌294，以參考例1所述方法篩選而取得轉(zhuǎn)化株。而轉(zhuǎn)化株(大腸桿菌294/pPHO P31-R)承載pPHO P31-R質(zhì)粒，其中含附屬型adr編碼P31的DNA已被插入與被分離的PHO5啟動子同一方位，用堿萃取法從轉(zhuǎn)化株中分離出上述質(zhì)粒，此法用作轉(zhuǎn)化寄主酵母酒酵母AH22R-則用上面提到的欣納恩等人的方法，轉(zhuǎn)化株酵母(AH22R-/pPHO P31-R)，承接上述質(zhì)粒而被分離(參看圖8)。(2)1μg參考例2-(3)所述的表現(xiàn)載體pPKT700-1DNA，于37℃時，以2單位的限制性內(nèi)切酶SalⅠ處理2小時，然后進一步在例3-(1)所述條件下以0.1單位的堿性磷酸酶處理。此后，以冷的乙醇沉淀DNA(SalⅠ-消化的pPKT700-1)。
接著200ng例3-(1)所述的1.43kb DNA和200ng SalⅠ-消化的pPKT700-1在參考例1所述條件下利用T4 DNA連接酶而連接在一起。利用反應混合物和下列例3-(1)所述的步驟菌株(294/pPKT P31-R)承載帶有1.43kb DNA斷片的pPKT P31-R質(zhì)粒而斷片含有附屬型adr編碼P31 DNA插入的那點如同被分離的PGK啟動子同一方位。寄主酵母菌株隨上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化而酵母轉(zhuǎn)化株(K33-8D/pPKT P31-R)則被分離(參看圖8)。
(3)1μg參考例3-(3)所述的pGLD906-1表現(xiàn)載體在37℃時以2單位的限制性內(nèi)切酶處理2小時，然后以例3-(1)所述的條件用0.1單位的堿性磷酸酶進一步處理，隨后以冷的乙醇沉淀DNA(SalⅠ-消化的pGLD906-1)。
接著，200ng例3-(1)所述的1.43kb DNA斷片和SalⅠ-消化的pGLD906-1在參考例1所述條件下利用T4 DNA連接酶而連接在一起。以例3-(1)所述的方法利用反應混合物，菌株(294/pGLD P31-R)承載帶有1.43kb DNA斷片的pGLD P31R質(zhì)粒，其中的斷片含有附屬型adr編碼P31 DNA插入的那一點與被分離的GLD啟動子同一方位。寄主酵母K33-7B隨上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化并取得酵母轉(zhuǎn)化株(K33-7B/pGLD P31-R)(參看圖8)。
當這些轉(zhuǎn)化株用常規(guī)方法培養(yǎng)，可取得理想的P31。
例4重組體DNA分子的結(jié)構(gòu)給以附屬型adw的乙型肝炎病毒表面抗原P31基因在酵母中的表現(xiàn)及用上述DNA分子進行酵母的轉(zhuǎn)化。
(1)2μg例2所述的pBBV933 DNA質(zhì)粒于37℃時，在20μl反應混合物〔10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pB7.5)，7mM MgCl2，100mM KCl，7mM2-巰基乙醇〕中，以2單位的限制性內(nèi)切酶HpaⅠ處理2小時，接著與酚起去蛋白作用并以冷乙醇沉淀DNA。300ng的上述DNA和50ng參考例1所述的磷酸化的SalⅠ銜接物，在參考例1所述條件下利用T4 DNA連接酶而混合和連接在一起。反應混合物用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌294并從氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化株中獲得pHBV933-8質(zhì)粒，此質(zhì)粒具有SalⅠ部位以代替已取得的pHB933質(zhì)粒的HPaⅠ部位(參看圖9)。
100μg上述pHBV933-8質(zhì)粒于37℃時，在200μl反應混合物〔100mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH7.5)，7mM MgCl2，50mM NaCl，7mM2-巰基乙醇〕中以限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ各100單位處理2小時。而反應混合在參考例1所述條件下受到以1.2%瓊脂糖切片凝交的電泳。電泳后，以參考例1所述的方法從凝膠中分離出含有附屬型adw編碼P31 DNA斷片的0.96kb DNA斷片(參看圖9)。
20μg pBR322 DNA質(zhì)粒于37℃時，在100μl反應混合物〔6mM三羥甲基氨基甲烷-HCl(pH7.9)，150mM NaCl，6mM MgCl2，6mM2-巰基乙醇〕中以限制性內(nèi)切酶ClaⅠ和SalⅠ各20單位處理2小時，接著以1.0%瓊脂糖切片凝膠進行電泳，此步驟在參考例1所述條件下得以傳導。此后，以參考例1所述方法從凝膠中分離出3.74kb DNA斷片。
500ng的上述3.74kb DNA斷片，500ng的上述0.96kb DNA斷片和50ng例一所述的磷酸化的接合體d(
)在參考例1所述的條件下利用T4 DNA連接酶而連接在一起。反應混合物用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌294并從氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化株中取得由上述三種DNAs連接在一起組成的pHBV P31 DNA質(zhì)粒(參看圖9)。
50μg的上述pHBv P31質(zhì)粒于37℃時，在100μl的反應混合物〔10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH7.5)，7mM MgCl2，175mM NaCl，0.2mM EDTA，7mM2-巰基乙醇〕中，以限制性內(nèi)切酶SalⅠ和ClaⅠ各20單位處理3小時，而反應混合物受到用1.0%瓊脂糖切片凝膠在參考例一所述條件下能傳導的電泳。此后，以參考例一所述方法從凝膠中分離出0.98kb DNA斷片(參看圖9)。
2μg的上述0.98kb DNA斷片在參考例1所述條件下以DNA聚合酶Ⅰ大斷片處理使得粘性末端園鈍，接著與酚起去蛋白作用并以冷醇沉淀DNA。至于被連接于SalⅠ銜接物〔5′-P-d(CGTCGACG)，Bethesda研究〕的0.98kb DNA斷片接著以SalⅠ處理使得粘性的末端園鈍。利用Sepharose(瓊脂糖商品名)4B柱收集含有0.99kb DNA斷片(附屬型adw編碼P31 DNA)，而上述的DNA則以冷乙醇沉淀(參看圖9)。
200ng例3-(1)所述的SalⅠ-消化的pPHO17-1和200ng上面的0.99kb DNA斷片，在參考例1所述條件下利用T4 DNA連接酶連接在一起。利用反應混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌294而以參考例1所述方法篩選取得轉(zhuǎn)化株。菌株承載帶有0.99kb DNA的pPHO P31-W質(zhì)粒。此質(zhì)粒含有附屬型adw編碼P31 DNA，其插入方位與被分離的PHO5啟動子相同。用堿萃取法從轉(zhuǎn)化株中分離上述質(zhì)粒。用欣納恩等人的方法轉(zhuǎn)化寄主酵母AH22R-，而承載上述質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化株(酒酵母AH22R-/pPHO P31W)則被分離(參看圖9)。
上面含附屬型adw編碼P31 DNA的質(zhì)粒和PGK啟動子或GLD啟動子也可用上面的步驟建造。
例5重組體DNA的結(jié)構(gòu)給以附屬型adw的乙型肝炎病毒表面抗原31基因表現(xiàn)，而酵母則隨著上述DNA而轉(zhuǎn)化。
50μg的上述pTRP P31-W2質(zhì)粒于37℃時，在100μl反應混合物〔10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH7.5)，10mM MgCl2，50mM NaCl，1mM二硫蘇糖醇〕中，以20單位的限制性內(nèi)切酶處理20分鐘供部分的消化作用，而反應混合物受參考例1所述的條件下以0.8%瓊脂糖切片凝膠電泳。據(jù)此，4.6kb線狀DNA分子是PstⅠ卵裂的產(chǎn)物，以參考例一所述方法只是在一個部位從凝膠中分離出來(參看圖10)。
5μg的上述4.6kb DNA分子于37℃時，在30μl反應混合物〔10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH7.5)，7mM MgCl2，10mM NaCl〕中以5單位的限制性內(nèi)切酶ClaⅠ處理3小時，而反應混合物受參考例1所說條件下的1.0%瓊脂糖切片凝膠電泳。此后，以參考例1所述方法從凝膠中分離出0.98kb DNA斷片。
0.8μg的上述0.98kb DNA斷片于37℃時在20μl反應混合物〔33mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH7.9)，66mM醋酸鉀，10mM醋酸鎂，5mM二硫蘇糖醇〕中以2.5單位的T4 DNA聚合酶處理15分鐘使得粘性的末端園鈍，接著與酚起去蛋白作用并用冷乙醇沉淀DNA。利用例3-(1)所述方法，SalⅠ銜接物聯(lián)接到0.98kbDNA斷片，接著以SalⅠ處理使得粘性的末端園鈍。利用Sepharose(瓊脂糖的商品名)4B柱，把含有0.99kb DNA斷片(附屬型adw編碼P31 DNA)這部份加以收集而上述DNA則以冷乙醇沉淀。
200ng例3-(1)所述的SalⅠ-消化的pPHO17-1和200ng上面0.99kb DNA斷片在參考例1所述條件下利用T4 DNA連接酶而聯(lián)接在一起。利用反應混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌294，而轉(zhuǎn)化株是以參考例1所述方法篩選而取得。菌株(294/pPHO P31-W)承載帶有0.99kb DNA斷片的pPHO P31-W質(zhì)粒，此質(zhì)粒含有附屬型adw編碼P31 DNA，其插入部位與被分離的PHO 5啟動子相同。上述pPHO P31-W質(zhì)粒是以堿萃取法從轉(zhuǎn)化株中分離出來，以上述欣納恩等人的方法用作轉(zhuǎn)化寄主酵母AH22R-，而以酵母轉(zhuǎn)化株(AH22R-/pPHO P31-W)承載已被分離的上述質(zhì)粒(參看圖10)。
如果轉(zhuǎn)化株用常規(guī)方法培養(yǎng)便可取得理想的P31。
例6(1)P31基因在大腸桿菌的表現(xiàn)每一轉(zhuǎn)化株承載由例1或2所得的一個P31基團表現(xiàn)質(zhì)粒于37℃時，在含有1.0%葡萄糖和1.0%酪蛋白氨基酸的M-9培養(yǎng)基中培養(yǎng)6小時，然后細胞便可收獲并以緩沖液〔30mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH8.0)，50mM NaCl，5mM EDTA〕。洗滌細胞懸浮于含有10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH8.0)，5mM EDTA，1mM苯基甲基硫酰氟和5mg/ml溶菌酶的溶解溶液中，溶胞作用即生效。在上述溶胞產(chǎn)物中加胍氫氯化物至最后濃度為5M.在37℃保溫2小時后，溶胞產(chǎn)物于室溫下，用15，000rpm離心15分鐘至產(chǎn)生上清液。上清液的P31活性是用上文所述的直接免疫測定法測定。這樣測得的結(jié)果示于表2。P31每次獲得產(chǎn)量是按照每毫升液體培養(yǎng)基的產(chǎn)量(計算)。我們可以發(fā)現(xiàn)這樣計標的產(chǎn)量比1983年日文版《未檢定蛋白質(zhì)的應用》第201796所說表面抗原產(chǎn)量更高。
表2轉(zhuǎn)化株 HBsAg(單位/毫升 液體 培養(yǎng)基)大腸桿菌294/pTRP P31-R 220大腸桿菌294/pTRP P31-W2 300一個單位HBsAg相當于125Ⅰ-反-HBsAg抗體附著于AusriaⅡ-125Kit的數(shù)量，而AusriaⅡ-125是結(jié)合于1ng的HBsAg的小顆粒上。
例6(2)P31基因在酵母中的表現(xiàn)在例3或4獲得的每一酵母轉(zhuǎn)化株和承載P31基因表現(xiàn)質(zhì)粒于30℃時，在Burkholder培養(yǎng)基或其變更能級的低磷酸鹽中培養(yǎng)兩天，此后收集細胞并洗以生理鹽水。
按照Miyanohara，A.等人的方法，細胞以裂合酶〔Seikagaku Kogyo〕處理后轉(zhuǎn)變?yōu)樵|(zhì)球狀態(tài)。此外，加入0.1%Triton(表面活化劑商品名)X-100以萃取P31。溶胞產(chǎn)物于室溫下，用15，000rpm離心15分鐘以產(chǎn)生上清液，并用AuszymeⅡ(Abbott)測定上清液的P31活性，而取得的結(jié)果表示于表3。每次計標的P31的產(chǎn)量均按照每升液體培養(yǎng)基的產(chǎn)量(計標)。
表3P31(μg/l液體培養(yǎng)基)酒酵母AH22R-/pPHO P31-R 1200酒酵母AH22R-/pPHO P31-W 1100以HBsAg顆粒作標準，用AuszymeⅡ測定P31。
例7高純P31蛋白質(zhì)的生產(chǎn)(1)萃取自細胞100g以例6所述方法培養(yǎng)而得的大腸桿菌294/pTRP P31-R細胞在-20℃凍結(jié)并保存于冷凍狀態(tài)，而此冷凍狀態(tài)已均勻地懸浮于含有10mM EDTA和25mM磷酸鈉的200ml的緩沖液(pH7.5)中。在此懸浮液中加入696mg苯基甲基硫酰氟和100mg溶菌酶，此混合物于37℃時加熱15分鐘。再于混合物中加入200ml含有尿素的25mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)，整個混合物用全混合器(Servall)以4，000rpm處理30秒使之均勻。此后于勻漿中再加600ml含8M尿素的25mM磷酸鈉緩沖液，整個混合物于4℃攪拌4小時。于此溶胞產(chǎn)物再加3，000ml 25mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)，綜合混合物再攪拌1小時。然后用18，900rpm(原文可能誤寫為xg)離心70分鐘生成3，900ml上清液(9.7×103單位/毫升)。
(2)用聚-HSA-Cellulofine柱提純把上面獲得的上清液通過例4所得的聚-HSA-Cellulofine柱(5×2cm)并用25mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)平衡以便在它上面吸收P31蛋白質(zhì)。柱按順序用300ml含0.05%特威恩20的PBS，220ml含0.05%物威恩20和0.5M NaCl的PBS，80ml含0.05%特威恩20的PBS和300ml含4M尿素的25mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)洗滌，然后以300ml含有7.5M尿素的磷酸鈉緩沖液(pH7.5)洗出P31。將活性部份(250ml)用YM-5膜(Amicon，USA)濃縮為7.2ml(2.3×106單位/毫升)。于7毫升所得的濃縮物中加入140毫克DTT，于80℃還原15分鐘以后，濃縮物通過薄膜過濾器(ACRODISC;孔尺寸為0.2μm;Gelman)。
(3)用高性能液相色譜法以反相柱提純500μl上面獲得濾液可以被AP202 300
(C8)反相柱(YMC-Shimakyu)吸收，而高性能液相色譜則利用三氯乙酸-乙腈-正丙醇系統(tǒng)作為洗脫液系統(tǒng)而進行工作。
AP 202 300
(C8)(4.6×150mm);柱溫為30℃;洗脫劑A為0.1%三氟乙酸-99.9%水;洗脫劑B為0.1%三氟乙酸-49.95%乙腈-49.95%正丙醇;洗出程序分為0(45%A+55%B)-分為25(25%A+75%B)-分為47(25%A+75%B)-分為49(5%A+95%B)-分為50分(45%A+55%B);流速為1毫升/分;檢測波長為280nm。一個分數(shù)率顯示在這些條件(4.8毫升;3.1×104單位/毫升)下保留時間約為41分鐘。便可收集和凍干這樣取得的是含有149μg(1×106單位/毫克)高純P31蛋白質(zhì)(附屬型adr)的白色粉末。
用上述方法生產(chǎn)的高純P31蛋白質(zhì)(附屬型adr)有下列特性(1)均勻性
SDS-聚丙烯酰胺切片凝膠電泳是以Laemmli方法完成〔Nature，227，680(1970)〕，接著用銀染色試劑“Daiichi”(Daiichi Kagaku，Tokyo)染色并檢出P31蛋白質(zhì)是單帶(參看圖11)。
(2)分子重量以SDS-聚丙烯酰胺切片凝膠電泳的結(jié)果作為根據(jù)，計算出P31蛋白質(zhì)分子重約為32，000道爾頓(參看圖11)。
(3)氨基酸的成分在作為水解的玻璃管中置入20μg P31蛋白質(zhì)。在加入含4%基乙酸的恒沸點鹽酸后，玻璃管在減壓下密封，而水解作用是在110℃經(jīng)過24，48，72，或96小時完成。水解后，打開玻璃管，在減壓下移去鹽酸，殘跡溶于0.02N鹽酸中而氨基酸的分析是用日立牌835型氨基酸分析儀來完成。根據(jù)Hirs′方法〔Methods in Enzymol.，11，197(1967)〕當磺基丙氨酸在氨基酸分析儀里存在時，在過甲酸氧化P31蛋白質(zhì)后可以測得胱氨酸和半胱氨酸并在減壓下在恒沸點鹽酸中水解24小時。氨基酸的分析數(shù)據(jù)是取水解24，48和72小時結(jié)果的平均值。而對于異亮氨酸、亮氨酸和苯基丙氨酸則在使用水解96小時后取得數(shù)值;對于絲氨酸和蘇氨酸的數(shù)值是用外推算到水解時間為0(零)。這樣取得的結(jié)果表示表4。
表4氨基酸 分子%Asp/Asn 5.8Thr 7.8Ser 9.6Glu/Gln 5.3Pro 11.5Gly 7.0Ala 4.71/2Cys 3.9Val 5.2Met 2.5Ile 5.2Leu 12.7Tyr 2.4Phe 6.4Lys 1.5His 1.0Arg 3.8Trp 3.6
(4)N末端氨基酸順序N末端氨基酸順序的分析，自動的埃德曼降解法是利用氣相蛋白質(zhì)順序分析儀(應用生物體系470A型，美國)。乙內(nèi)酰苯硫脲-氨基酸(PTH-氨基酸)是以高性能液相色譜利用Micro Pak C18-3 SP-DS柱(Varian，USA)來鑒定。在各個步驟檢測的PTH-氨基酸表示于表5。
表5步驟 檢測的PTH-氨基酸1 甲硫氨基酸2 谷氨酰胺3 色氨酸4 天冬酰胺5 X1)6 蘇氨酸1)未能查明的氨基酸(5)C末端氨基酸將620μg上述的P31蛋白質(zhì)置于玻璃管中以肼降解并加入0.1毫升無水肼。在減壓下密封管子，并于100℃整個加熱6小時。取得的降解產(chǎn)物是凍干的并溶于蒸餾水中。在此溶液中加入苯甲醛形成的混合物在室溫下攪拌1小時然后進行離心至產(chǎn)生上清液。這上清液是凍干的并且氨基酸的分析要在使用日立牌835型氨基酸分析儀的條件下進行。從而檢測得47毫微摩爾異亮氨酸。
用例6所述方法培養(yǎng)上述菌株而取得大腸桿菌294/pTRP P31-W2細胞的應用而導致在上述同樣方法中產(chǎn)生高純型的P31蛋白質(zhì)(附屬型adw)。
例81μg參考例2-(3)所述的表現(xiàn)載體pPKT700-1DNA于37℃時，以2單位限制性內(nèi)切酶SalⅠ處理2小時，然后在例3-(1)所述條件下進一步以0.1單位的堿性磷酸酶處理。然后以冷乙醇沉淀DNA(SalⅠ-消化的pPKT700-1)。
接著，200ng例3-(1)所述的1.43kb DNA斷片和200ng SalⅠ-消化的pPKT700-1在參考例1所述條件下利用T4 DNA連接酶而連接在一起。利用反應混合物和按例3-(1)所述的方法，菌株(294/pPKT P31-R)承載含有附屬型adr編碼P31DNA，帶有1.43kb DNA斷片的pPKT P31-R質(zhì)粒其插入方位與被分離的PGK啟動子相同。上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化寄主酵母菌株AH22R-，而酵母轉(zhuǎn)化株(AH22R-/pPKT P31-R)則被分離(參看圖8)。
例91μg參考例3-(1)所述表現(xiàn)載體pGLD906-1 DNA在37℃時，以2單位限制性內(nèi)切酶SalⅠ處理2小時，然后在例3-(1)所述條件下以0.1單位堿性磷酸酶進一步處理。隨后，以冷乙醇沉淀DNA(SalⅠ-消化的-pGLD906-1)。
接著，200ng例3-(1)所述的1.43kb DNA和SalⅠ-消化的pGLD906-1在參考例1所述條件下，利用T4 DNA連接酶而連接在一起。以例3-(1)所述方法利用反應混合物菌株(294/pGLD P31-R)承載含有附屬型adr編碼P31 DNA，帶有1.43kb DNA的pGLD P31-R質(zhì)粒其插入方位與被分離的GLD啟動子相同。上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化寄主酵母AH22R-而獲得酵母轉(zhuǎn)化株(AH22R-/pGLD P31-R)(參看圖8)。
例10P31基因在酵母中的表現(xiàn)在例8或9獲得每一酵母轉(zhuǎn)化株和承載P31基因表現(xiàn)質(zhì)粒于30℃時在Burkholder培養(yǎng)基或其變更能級的低磷酸鹽中培養(yǎng)2天，此后收集細胞并洗以生理鹽水。
按照Miyanohara，A等人的方法，細胞以裂合酶〔Seikagaku Kogyp〕處理后轉(zhuǎn)變?yōu)樵|(zhì)球狀態(tài)。此后，加入0.1%Triton(表面活化劑商品名)X-100以萃取P31。溶胞產(chǎn)物于室溫下，用15，000rpm離心以產(chǎn)生上清液，并用AuszymeⅡ〔Abbott〕測定上清液的P31活性而取得結(jié)果表示于表6，每次計標的P31的產(chǎn)量均按照每升液體培養(yǎng)基的產(chǎn)量(計標)。
表6P31(μg/l液體培養(yǎng)基)酒酵母AH22R-/pGLD P31-R 2400酒酵母AH22R-/pPHO P31-W 350以HBsAg顆粒作標準，用AuszymeⅡ測定P31。
例11從例1和例2取得的承載表現(xiàn)P31基因表現(xiàn)質(zhì)粒的大腸桿菌294中萃取質(zhì)粒，以此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌C600取得大腸桿菌C600/pTRP p31-R和大腸桿菌C600/pTRP P31-W2。
例12大腸桿菌C600菌株承載從例11取得的P31基因表現(xiàn)質(zhì)粒于37℃時在含有2.0%葡萄糖和1.0%酪蛋白氨基酸的M-9培養(yǎng)基中培養(yǎng)8小時然后收集細胞并洗以緩沖液〔30mM三羥基甲氨基甲烷-鹽酸(pH8.0)，50mM NaCl，5mM EDTA〕。細胞懸浮于由10mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH8.0)，5mM EDTA，1mM苯基甲基硫酰氟和5mg/ml溶菌酶的溶液中，溶胞作用即生效。在上述溶胞產(chǎn)物中加胍氫氯化物至最后濃度為7M，在37℃保溫2小時后，溶胞產(chǎn)物在室溫下以15，000rpm離心15分鐘至產(chǎn)生上清液。上清液的P31活性是用上文所述的直接免疫法測定。這樣測得的結(jié)果表示于表7。P31每次獲得的產(chǎn)量是按照每毫升液體培養(yǎng)基的產(chǎn)量(計算)。
表7轉(zhuǎn)化株 HBsAg(單位/毫升 液體培養(yǎng)基)大腸桿菌C600/pTRP P31-R 1500大腸桿菌C600/pTRP P31-W2 1300一個單位HBsAg相當于125Ⅰ-反-HBsAg抗體附著于AusriaⅡ-125kit的數(shù)量，而AusriaⅡ-125是結(jié)合于1ng的HBsAg的小顆粒上。
例13高純P31蛋白質(zhì)的生產(chǎn)以例7所述方法用大腸桿菌C600/pTRP P31-R取得的從聚-HSA-Cellulofine柱洗出的濃縮物中加入6mg DTT，反還后在37℃時(靜置)1小時，混合物通過薄膜過濾器過濾。500μl濾液可以被AP224 300A(C8)反相柱(YMC-Shimakyu)吸收，而高性能液相色譜則利用三氟乙酸-乙腈-正丙醇系統(tǒng)作為洗脫液系統(tǒng)而進行工作。
AP 224 300
(C8)(1×30cm);柱溫為30℃;洗脫劑A為0.1%三氟乙酸-99.9%水;洗脫劑B為0.1%三氟乙酸-49.95%乙腈-49.95%正丙醇;洗脫程序，分為0(70%A+30%B)-分為10(28%A+72%B)-分為30(24%A+76%B)-分為50(14%A+86%B)分為55(5%A+95%B)-分為58(5%A+95%B)-分為59(70%A+30%B);流速為2.5毫升/分;檢測波長為280nm。一個分數(shù)率顯示在這些條件(20ml)1.7×104分/毫升)下保留時間約為42分鐘便可收集和保存于-20℃。
用上述方法生產(chǎn)的高純蛋白質(zhì)(附屬型adr)與例7所取得的P31蛋白質(zhì)(附屬型為adr)具有同樣的特性。
例14(1)1mg例13取得的P31蛋白質(zhì)置入玻璃管中并在減壓下移去溶劑。按照酚硫酸法(Analytical Chemistry 28，350(1956)〕以葡萄糖作為標準來完成碳水化合物的定量分析。結(jié)果是在樣品不大于0.3摩爾而檢出碳水化合物，P31蛋白質(zhì)分子重量的計算是以每摩爾P31蛋白質(zhì)為31，000道爾頓。所以獲得的蛋白質(zhì)似手沒有碳水化合物。
(2)在玻璃管中置入由例13獲得的30μg P31蛋白質(zhì)進行水解，接著移去溶劑。加入三氟乙酸/恒沸點鹽酸〔1∶2(V/V)〕后，在減壓下密封管子，在170℃下經(jīng)過25、50和180分鐘時間完成水解作用。水解后，管子啟封，移去三氟乙酸和鹽酸，殘跡溶于0.02N鹽酸中，用日立牌835型氨基酸分析儀完成氨基酸分析。根據(jù)Hir′s方法當磺基丙氨酸存在于氨基酸分析儀里時，在過甲酸氧化P31蛋白質(zhì)后可以測得胱氨酸和半胱氨酸并在減壓下在恒沸點鹽酸中水解24小時。蘇氨酸、絲氨酸和色氨酸的定量分析是P31蛋白質(zhì)在含有4%巰基乙酸的恒沸點鹽酸中水解后，在減壓情況下，分別以16、20、24和30小時進行的。氨基酸的分析數(shù)據(jù)是計算由水能25、50和180分鐘取得的每一個數(shù)值的平均值。對于色氨酸是采用其水解24小時后的數(shù)值而對于絲氨酸和蘇氨酸數(shù)值是用外推法推算至水能時為0(零)而測得的。這樣獲得的結(jié)果表于表8。
表8氨基酸 分子%Asp/Asn 5.5Thr 7.9Ser 10.3Glu/Gln 4.7Pro 11.9Gly 7.3Ala 4.41/2 Cys 3.8Val 4.7Met 2.5Ile 5.1Leu 13.5Tyr 2.3Phe 6.7Lys 1.2His 0.9Arg 3.4Trp 3.7
對這些微生物的研究已有了累積而其增長的數(shù)字表示于表9。
在表中，“IFO”和“FRI”各代表“對發(fā)酵作用的研究，Osaka”(日本)和“發(fā)酵研究院，工業(yè)科學和工藝代理，日本國際貿(mào)易和工業(yè)部”。E.Coli和S.cerevisiae分別代表大腸桿菌和酒酵母，“FERM BP”數(shù)字代表在布達佩斯協(xié)議下累積的增長數(shù)字而“FERM P”項在括弧里的數(shù)字代表在布達佩斯協(xié)議下未轉(zhuǎn)變成累積前的增長數(shù)字表9IFO FRI微生物 IFO No. FERM No.
E.coli 294 14171 -E.coli 294/pTRP P31-R 14355 BP-802(P-7709)E.coli 294/pTRP P31-W2 14356 BP-803(P-7710)S.cerevisiae AH22R-10134 BP-804(P-7824)S.cerevisiae AH22R-/pPHO P31-R 10135 BP-805(P-7825)S.cerevisiae AH22R-/pPHO P31-W 10136 BP-806(P-7826)E.coli C600/pTRP P31-R 14425 BP-807(P-8045)S.cerevisiae AH22R-/pGLD P31-R 10145 BP-800S.cerevisiae AH22R-/pPKT P31-R 10146 BP-801E.coli C600 14410 BP-808(P-8154)E.coli 294是眾所周知的菌株〔Backman，K.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，73，4174(1974)〕。
按照這項發(fā)明HBsAg P31是用作檢定和預防HBV感染的疫苗。
權(quán)利要求
1.DNA重組體其對乙型肝炎病毒表面抗原P31是插入啟動子區(qū)的3′末端。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1，重組體DNA其啟動子之一是色氨基酸啟動子。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1，重組體DNA其啟動子之一是阻遏酸性磷酸酶啟動子。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1，重組體DNA其啟動子之一是甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1，重組體DNA其啟動子之一是3-磷酸甘油酯激酶啟動子。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1，重組體DNA其乙型肝炎病毒表面抗原P31之一是adr乙型肝炎病毒表面抗原P31。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1，DNA重組體其乙型肝炎病毒表面抗原P31之一是adw乙型肝炎病毒表面抗原P31。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1，DNA重組體其乙型肝炎病毒表面抗原P31之一是adr乙型肝炎病毒表面抗原P31而其啟動子是色氨酸啟動子。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1，DNA重組體其乙型肝炎病毒表面抗原P31之一是adr乙型肝炎病毒表面抗原P31，而其啟動子是阻遏酸性磷酸酶啟動子。
10.根據(jù)權(quán)利要求
1，DNA重組體，其中之一為PTRP P31-R。
11.根據(jù)權(quán)利要求
1，DNA重組體，其中之一為pPHO P31-R。
12.根據(jù)權(quán)利要求
1，DNA重組體，其中之一為pTRP P31-W。
13.根據(jù)權(quán)利要求
1，DNA重組體，其中之一為pPHO P31-W。
14.根據(jù)權(quán)利要求
1，DNA重組體，其中之一為pGLD P31-R。
15.根據(jù)權(quán)利要求
1，DNA重組體，其中之一為pPKT P31-R。
16.轉(zhuǎn)化株承載具有對乙型肝炎病毒表面抗原P31的DNA密碼的重組體DNA，密碼插入于啟動子區(qū)的3′末端。
17.根據(jù)權(quán)利要求
16，轉(zhuǎn)化株其微生物之一屬于大腸桿菌。
18.根據(jù)權(quán)利要求
16，轉(zhuǎn)化株其微生物之一屬于酒酵母。
19.根據(jù)權(quán)利要求
16，轉(zhuǎn)化株其微生物之一屬于大腸桿菌294。
20.根據(jù)權(quán)利要求
16，轉(zhuǎn)化株其微生物之一屬于大腸桿菌C600。
21.根據(jù)權(quán)利要求
16，轉(zhuǎn)化株之一是大腸桿菌294/pTRP P31-R。
22.根據(jù)權(quán)利要求
16，轉(zhuǎn)化株之一是大腸桿菌294/pTRP P31-W2。
23.根據(jù)權(quán)利要求
16，轉(zhuǎn)化株之一是大腸桿菌C600/pTRP P31-R。
24.根據(jù)權(quán)利要求
16，轉(zhuǎn)化株之一是酒酵母AH22R-/pPHO P31-R。
25.根據(jù)權(quán)利要求
16，轉(zhuǎn)化株之一是酒酵母AH22R-/pPHO P31-W。
26.根據(jù)權(quán)利要求
16，轉(zhuǎn)化株之一是酒酵母AH22R-/pGLD P31-R。
27.根據(jù)權(quán)利要求
16，轉(zhuǎn)化株之一是酒酵母AH22R/pPKT P31-R。
28.生產(chǎn)DNA重組體方法中對乙型肝炎病毒表面抗原P31的DNA密碼是插入于某一個啟動子區(qū)的3′末端，包括上述密碼插入該啟動子區(qū)的3′末端。
29.生產(chǎn)承載重組體DNA的轉(zhuǎn)化株的方法，其對乙型肝炎病毒表面抗原P31的DNA密碼是插入于啟動子區(qū)的3′末端，如上文規(guī)定包括轉(zhuǎn)化帶有DNA重組體的寄主。
30.乙型肝炎病毒表面抗原P31的生產(chǎn)方法包括(a)培養(yǎng)承載DNA重組體的轉(zhuǎn)化株，而對乙型肝炎病毒表面抗原P31的DNA密碼是插入于某一個啟動子區(qū)的3′末端;(b)在培養(yǎng)中富集乙型肝炎病毒表面抗原P31;(c)回復同一(過程)。
31.乙型肝炎病毒表面抗原P31蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法包括(a)培養(yǎng)承載DNA轉(zhuǎn)化株，其DNA具有對乙型肝炎病毒表面抗原P31的堿基順序密碼。(b)在培養(yǎng)中富集乙型肝炎病毒表面抗原P31;(c)收集含P31溶液和(d)提純含P31溶液，包括親和色譜處理。
32.根據(jù)權(quán)利要求
33，其提純方法包括利用聚合的人的血清清蛋白作配體的親和色譜處理。
專利摘要
乙型肝炎病毒表面抗原P31可用培養(yǎng)承載DNA重組的轉(zhuǎn)化株來生產(chǎn)，其中對乙型肝炎病毒表面抗原P31的DNA密碼是插入于啟動子區(qū)的3′末端。
文檔編號C12R1/19GK85106190SQ85106190
公開日1986年6月10日 申請日期1985年7月12日
發(fā)明者菊池正和, 藤澤幸夫, 池山崇一, 西村紀 申請人:武田藥品工業(yè)株式會社導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan