專利名稱:富集干細胞骨修復材料及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學修復重建領域，具體涉及用作臨床上的骨修復材料的富集干細胞骨修復材料及其制備方法。該新型骨修復材料采用多孔支架材料通過聚賴氨酸等表面修飾劑采用冷凍干燥法修飾制得，使原材料獲得網(wǎng)孔結構和表面粘附性能優(yōu)化，能選擇性結合手術中抽取的紅骨髓中的干細胞和促成骨因子，從而提高骨修復材料的成骨活性，用作臨床上的骨修復材料。
背景技術：
嚴重創(chuàng)傷、腫瘤切除、骨關節(jié)結核及感染、先天性骨關節(jié)疾病和骨性關節(jié)炎等原因所致的各種骨缺損以十分常見，而脊柱融合、人工假體固定等手術對骨移植材料的需求量也十分巨大。
自體骨移植是目前臨床治療骨缺損較有效的方法，但來源有限且會造成供區(qū)新的骨缺損，對病人造成新的生理和心理創(chuàng)傷，是一種創(chuàng)傷性修復模式；異體骨、珊瑚及人工替代材料如三磷酸鈣(TCP)、生物陶瓷或高分子材料等成骨能力較差，應用受限。
干細胞富集技術的原理是通過基質(zhì)材料適當?shù)木W(wǎng)孔結構和良好的表面粘附性能，在骨髓流經(jīng)時選擇性的結合表達豐富粘附分子的干細胞，使其得以富集；而紅細胞和淋巴系細胞等成分則較少被保留，富集的骨髓基質(zhì)干細胞和其它干細胞協(xié)同促進成骨，如造血干細胞(HSC)能促進骨修復材料的血管化)。另一方面，骨髓流經(jīng)基質(zhì)材料時的凝固過程中會釋放出促成骨因子，如血小板在凝血時釋放的血小板衍生生長因子(PDGF)和轉化生長因子(TGF)，在體內(nèi)它們可以促進成骨前體細胞的增殖并向成骨細胞轉化。
總的說來，骨髓干細胞富集技術具有快速、簡單、有效的促成骨作用，根據(jù)此技術能開發(fā)出能隨取隨用、成本低廉、便于批量生產(chǎn)和儲存運輸?shù)墓切迯筒牧?，適合各類型骨缺損，尤其適合戰(zhàn)創(chuàng)傷及急診患者的救治。
發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種采用表面修飾劑用冷凍干燥法對多孔支架材料進行表面修飾后制得的富集干細胞骨修復材料，該材料能快速選擇性結合手術中抽取的紅骨髓中的干細胞和促成骨因子，從而改善支架材料的成骨活性。
本發(fā)明另一個目的是提供一種生產(chǎn)上述富集干細胞骨修復材料的方法。
實現(xiàn)本發(fā)明的目的之一而采用的技術方案是這樣的，即一種富集干細胞骨修復材料，由多孔支架材料與表面修飾劑復合構成。
上述表面修飾劑為聚合材料或蛋白質(zhì)成分時，當表面修飾劑為聚合材料時，在產(chǎn)品干重中的質(zhì)量百分比為0.01-2％，當表面修飾劑為蛋白質(zhì)成分時，在產(chǎn)品干重中的質(zhì)量百分比為0.1-20％。
上述多孔支架材料選自異體脫鈣骨基質(zhì)(DBM)、TCP、醫(yī)用珊瑚中的一種，采用冷凍干燥法與表面修飾劑進行表面修飾后制得。
上述聚合材料表面修飾劑選自聚賴氨酸、聚乳酸、聚乙二醇、聚硅氧烷、聚氧化乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸(酯)、聚氨酯、聚磷酸酯、聚羥基乙酸(酯)、聚羥基丁酸(酯)、聚(酸)酐、聚己內(nèi)酰胺、聚氨基酸、聚羥乙基甲基丙烯酸(酯)及上述多聚物間的共聚物。上述蛋白質(zhì)成分表面修飾劑選自纖維蛋白、骨膠原、醫(yī)用生物蛋白膠、明膠及上述材料表面修飾劑的混合物。
所述富集干細胞骨修復材料的制備方法步驟如下1、表面修飾劑的配制；2、支架材料與表面修飾劑的復合；3、支架材料的冷凍干燥；4、產(chǎn)品驗證(1)大體和組織學觀察外觀呈白色或淡黃色海綿狀外觀，無肉眼可見雜質(zhì)。顯微鏡下觀察材料為網(wǎng)孔樣結構，孔隙內(nèi)清潔或為蛛絲樣外觀。(2)干細胞富集效率檢測抽取健康志愿者新鮮紅骨髓100毫升，肝素抗凝，以10-200毫升/分鐘的速度均勻流經(jīng)5克干細胞富集支架材料(干重)，反復3次，比較開始前和最末次后骨髓中有核細胞密度和其中的CD44、CD105陽性細胞率及CD34、CD45陰性細胞率的變化比率。上述5項指標均應不低于30％。(3)體內(nèi)檢測抽取大動物新鮮紅骨髓100毫升，肝素抗凝，以10-200毫升/分鐘的速度均勻流經(jīng)5克干細胞富集支架材料(干重)，反復3次，最終產(chǎn)品用于修復大動物20％去骨膜大段骨缺損模型。
附圖1富集干細胞骨修復材料的大體觀察圖。A圖可見脫鈣骨基質(zhì)(DBM)支架材料表面覆蓋了多聚-L-賴氨酸層；B圖可見β-TCP富集基質(zhì)材料大小空隙散在分布。
附圖2富集干細胞骨修復材料的掃描電鏡圖。A圖可見脫鈣骨基質(zhì)(DBM)支架材料原有的網(wǎng)孔結構中形成了更細小的多聚-L-賴氨獺網(wǎng)孔。B圖可見網(wǎng)孔結構中散在的纖維蛋白網(wǎng)孔。
附圖3不同富集干細胞骨修復材料干細胞富集倍數(shù)統(tǒng)計表。如該統(tǒng)計表所示，不同支架材料和不同濃度的表面修飾劑配比后制成的富集干細胞骨修復材料對骨髓中的干細胞富集效率有顯著影響。
附圖4富集干細胞骨修復材料修復豬股骨X線片。A圖為對照組，術后當日圖片見豬股骨20％骨缺損模型及植入的TCP空白支架材料；術后1月見骨缺損區(qū)域X線密度略升高，術后3月骨缺損區(qū)域X線檢查見少量新骨形成，骨缺損區(qū)域仍為骨不連。B圖為實驗組，術后當日圖片見豬股骨20％骨缺損模型及植入的TCP富集干細胞骨修復材料；術后1月可見骨缺損區(qū)域X線密度升高，較對照組密度高；術后3月骨缺損區(qū)域X線檢查可見明顯新骨形成，已修復骨缺損區(qū)域。
具體實施方式實施例1聚賴氨酸修飾的脫鈣骨基質(zhì)(DBM)支架材料制備過程1、表面修飾劑溶液的配制將多聚-L-賴氨酸配成0.05％的水溶液。
2、支架材料與表面修飾劑的復合將脫鈣骨基質(zhì)(DBM)支架材料浸泡于步驟1的溶液中，置于4℃環(huán)境8～12小時。
3、支架材料的冷凍干燥取出步驟2中的支架材料在-60℃～-80℃，真空度80～100N，12～24小時，冷凍干燥，使終產(chǎn)品的水分含量≤6％。該步驟可使用Savant冷凍干燥機實現(xiàn)；4、產(chǎn)品驗證(1)大體和組織學觀察呈白色或淡黃色海綿狀外觀，無肉眼可見雜質(zhì)(見圖1)。顯微鏡下觀察材料為網(wǎng)孔樣結構，孔隙內(nèi)清潔或為蛛絲樣外觀(見圖2)。(2)干細胞富集效率檢測抽取健康志愿者新鮮紅骨髓100毫升，肝素抗凝，以100毫升/分鐘的速度均勻流經(jīng)5克干細胞富集支架材料(干重)，反復3次，骨髓中有核細胞密度由3.70×10E6減低到2.37×10E6，干細胞富集率為12.95倍(見圖3)，CD44陽性細胞率由94.6％降低到54.3％，CD105陽性細胞率由95.4％降低到56.7％，CD34陰性細胞率由97.6％降低到54.3％，CD45陰性細胞率由95.8％降低到59.3％。(3)體內(nèi)檢測抽取貴州小香豬新鮮紅骨髓100毫升，肝素抗凝，以100毫升/分鐘的速度均勻流經(jīng)5克干細胞富集支架材料(干重)，反復3次，最終產(chǎn)品用于修復貴州小香豬自體20％去骨膜大段骨缺損模型，剩余骨髓用過濾回收裝置處理后靜脈回輸給實驗動物，術后3個月骨缺損修復處X片可見明顯新骨形成。
實施例2生物蛋白膠修飾的三磷酸鈣(TCP)支架材料制備過程1、表面修飾劑溶液的配制將生物蛋白膠中的主體膠(纖維蛋白原濃縮液)與激化劑(凝血酶及鈣離子溶液)分別和雙蒸水配成20％的溶液。所述生物蛋白膠為市售產(chǎn)品。
2、支架材料與表面修飾劑的復合將磷酸三鈣(TCP)支架材料浸泡于步驟1中的主體膠稀釋液中，置于4℃環(huán)境半小時后撈起，瀝干5分鐘放入激化劑稀釋液中靜置半小時。
3、取出步驟2中的支架材料在-60℃～-80℃，真空度80～100N，12～24小時，冷凍干燥，使終產(chǎn)品的水分含量≤6％即得。
4、產(chǎn)品驗證大體觀察、組織學觀察和干細胞富集效率檢測方法見實施例一。體內(nèi)檢測抽取貴州小香豬新鮮紅骨髓100毫升，肝素抗凝，以100毫升/分鐘的速度均勻流經(jīng)5克干細胞富集支架材料(干重)，反復3次，最終產(chǎn)品用于修復貴州小香豬自體20％去骨膜大段骨缺損模型，剩余骨髓用過濾回收裝置處理后靜脈回輸給實驗動物，術后當天、1月、3月拍骨缺損修復處X片(見圖4)A圖為對照組，術后當日圖片見豬股骨20％骨缺損模型及植入的TCP空白支架材料；術后1月見骨缺損區(qū)域X線密度略升高，術后3月骨缺損區(qū)域X線檢查見少量新骨形成，骨缺損區(qū)域仍為骨不連。B圖為實驗組，術后當日圖片見豬股骨20％骨缺損模型及植入的TCP富集干細胞骨修復材料；術后1月可見骨缺損區(qū)域X線密度升高，較對照組密度高；術后3月骨缺損區(qū)域X線檢查可見明顯新骨形成，已修復骨缺損區(qū)域。
實施例3富集干細胞骨修復材料干細胞富集效果觀察采用DBM及TCP支架材料分別采用0.01％、0.05％、0.1％、0.15％和0.2％濃度的多聚-L-賴氨酸溶液修飾處理后在體外檢測干細胞富集效率(方法同實施例1)，結果表明不同支架材料和不同濃度的表面修飾劑配比后制成的富集干細胞骨修復材料對骨髓中的干細胞富集效率有顯著影響。DBM支架材料較TCP支架材料富集效率更高，經(jīng)0.01％-0.05％多聚-L-賴氨酸溶液修飾處理形成的富集干細胞骨修復材料富集濃度可為骨髓中干細胞濃度的20-23倍。
本發(fā)明的特點是采用聚賴氨酸、纖維蛋白或生物蛋白膠等材料對DBM等現(xiàn)有的骨支架材料進行表面修飾，制備成適當網(wǎng)孔結構和表面性能優(yōu)化的骨移植材料。采用該材料可在手術中穿刺抽取患者紅骨髓，與上述基質(zhì)材料即刻復合構建成具有高效成骨活性的骨缺損修復材料，避免了長時間體外培養(yǎng)過程。該骨修復材料具備高效的成骨活性和抗感染效能、隨取隨用、成本低廉、便于批量裝備、便于儲存運輸?shù)葍?yōu)點，較現(xiàn)有的生物衍生骨、組織工程骨有顯著不同的技術特點，可用于臨床各類骨缺損修復。
權利要求
1.一種富集干細胞骨修復材料，其特征是由多孔支架材料與表面修飾劑復合構成。
2.根據(jù)權利要求
1所述的富集干細胞骨修復材料，其特征是所述表面修飾劑為聚合材料或蛋白質(zhì)成分時；當表面修飾劑為聚合材料，時在產(chǎn)品干重中的質(zhì)量百分比為0.01-2％；當表面修飾劑為蛋白質(zhì)成分時，在產(chǎn)品干重中的質(zhì)量百分比為0.1-20％。
3.根據(jù)權利要求
1所述的富集干細胞骨修復材料，其特征是所述多孔支架材料選自異體脫鈣骨基質(zhì)、磷酸三鈣、醫(yī)用珊瑚中的一種。
4.根據(jù)權利要求
1所述的表面修飾劑，其特征是所述表面修飾劑選自聚賴氨酸、聚乳酸、聚乙二醇、聚硅氧烷、聚氧化乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸(酯)、聚氨酯、聚磷酸酯、聚羥基乙酸(酯)、聚羥基丁酸(酯)、聚(酸)酐、聚己內(nèi)酰胺、聚氨基酸、聚羥乙基甲基丙烯酸(酯)及上述多聚物間的共聚物；所述蛋白質(zhì)成分表面修飾劑選自纖維蛋白、骨膠原、醫(yī)用生物蛋白膠、明膠及所述材料表而修飾劑的混合物。
5.一種制備如根據(jù)權利要求
1所述的富集干細胞骨修復材料的方法，其特征是制備方法步驟如下(1)、表面修飾劑溶液的配制；(2)、支架材料與表面修飾劑的復合；將支架材料浸泡于步驟(1)的溶液中，置于4℃環(huán)境8～12小時；(3)、支架材料的干燥；取出步驟(2)中的支架材料在-60℃～-80℃，真空度80～100N，冷凍干燥12～24小時，使終產(chǎn)品的水分含量≤6％。
專利摘要
本發(fā)明涉及用作臨床上的骨修復材料的富集干細胞骨修復材料，由多孔支架材料與表面修飾劑復合構成；其中表面修飾劑為聚合材料時，在產(chǎn)品干重中的質(zhì)量百分比為0.01－2％，當表面修飾劑為蛋白質(zhì)成分時，在產(chǎn)品干重中的質(zhì)量百分比為0.1－20％。本發(fā)明使原材料獲得網(wǎng)孔結構和表面粘附性能優(yōu)化，能選擇性結合手術中抽取的紅骨髓中的干細胞和促成骨因子，從而提高骨修復材料的成骨活性，用作臨床上的骨修復材料。本發(fā)明還涉及制備所述富集干細胞骨修復材料的方法。
文檔編號A61L27/38GK1994479SQ200610095345
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月25日
發(fā)明者許建中, 王序全, 周強, 羅飛, 何清義 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan