本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，具體涉及一種外泌體裝載白藜蘆醇及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、外泌體是有細胞分泌的外囊泡，直徑在30-150nm，由于其具有低免疫原性、低毒性、組織靶向性、可進行工程化改造等特點，成為了很具有潛力的藥物遞送載體。

2、對于外泌體載藥，目前已有大量相關(guān)研究。綜合看目前所有的載藥研究，可將外泌體的載藥方式分為外源性載藥（外泌體分離后）和內(nèi)源性載藥（在外泌體生物發(fā)生期間）。其中外源性外泌體裝載可分為主動裝載和被動裝載。被動裝載包括共孵育法，該方法快速簡便，對外泌體完整性無影響，但是效率低，對于疏水分子更有效一些；主動裝載包括電穿孔法、擠壓法、超聲法、循環(huán)凍融、膜穿透及透析。這些方法也同樣存在影響外泌體質(zhì)量、裝載效率低、外泌體易聚集等缺點。

3、綜上，目前各種外泌體載藥方法均存在一定的局限性，因此外泌體高效穩(wěn)定地裝載藥物也是外泌體作為載體能夠廣泛應(yīng)用于臨床的瓶頸之一。因此找到高效的外泌體載藥方法，將極大提高外泌體臨床應(yīng)用范圍，解決目前臨床應(yīng)用的困難。

4、白藜蘆醇是一種多酚類化合物，白藜蘆醇（res）是至少100種不同植物在真菌感染或病原體攻擊后分泌的天然多酚抗毒素，因為它可以有效清除自由基，調(diào)節(jié)抗氧化酶的表達和活性res已被用于治療多種疾病。在白藜蘆醇的這些多種生物效應(yīng)中，抗氧化特性最為突出。白藜蘆醇已被證明可以保護細胞免受過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激以及紫外線照射介導(dǎo)的細胞死亡。但是白藜蘆醇水溶性不佳導(dǎo)致其不容易被吸收利用，此外白藜蘆醇還容易被氧化降解。因此一種合適的包裹和遞送技術(shù)能極大促進白藜蘆醇的生物利用度。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種外泌體，通過使用特定的預(yù)處理方式，結(jié)合超聲和共孵育的工藝流程將白藜蘆醇裝載到外泌體中，提高了其裝載效率的同時也增加了白藜蘆醇的穩(wěn)定性及生物利用度。

2、一方面，本發(fā)明提供了一種用外泌體裝載白藜蘆醇的方法，包括以下步驟：

3、s1、預(yù)處理：將白藜蘆醇用有機溶劑溶解獲得白藜蘆醇溶液；向外泌體加入羧甲基纖維素鈉，獲得羧甲基纖維素鈉的外泌體溶液；

4、s2、混合：將上述的羧甲基纖維素鈉的外泌體溶液與白藜蘆醇溶液混合，獲得a；

5、s3、裝載：對上述的a進行超聲和孵育，獲得b。

6、s4、純化：將上述的b進行純化，即得純化后的外泌體裝載白藜蘆醇；

7、步驟s1所述羧甲基纖維素鈉的濃度為5%。

8、具體地，步驟s1所述機溶劑可以是乙醚、三氯甲烷、甲醇、乙醇、丙酮或乙酸乙酯中的一種或多種。

9、優(yōu)選地，步驟s1所述機溶劑可以是乙醇。

10、具體地，步驟s1所述白藜蘆醇溶液的濃度可以是5-15mg/ml。

11、優(yōu)選地，步驟s1所述白藜蘆醇溶液的濃度可以是10-15mg/ml。

12、進一步優(yōu)選地，步驟s1所述白藜蘆醇溶液的濃度可以是10-12mg/ml。

13、更進一步優(yōu)選地，步驟s1所述白藜蘆醇溶液的濃度可以是10mg/ml。

14、具體地，步驟s2所述羧甲基纖維素鈉的外泌體溶液與白藜蘆醇溶液的混合比例為10-20:1-3。

15、優(yōu)選地，步驟s2所述羧甲基纖維素鈉的外泌體溶液與白藜蘆醇溶液的混合比例為10-15:1-2。

16、進一步優(yōu)選地，步驟s2所述羧甲基纖維素鈉的外泌體溶液與白藜蘆醇溶液的混合比例為10:1。

17、具體地，步驟s2所述超聲為循環(huán)超聲；所述的循環(huán)超聲的設(shè)置為25-35s開，25-35s關(guān)，循環(huán)超聲2-5min為一個循環(huán)。

18、優(yōu)選地，具體地，步驟s2所述超聲為循環(huán)超聲；所述的循環(huán)超聲的設(shè)置為30-35s開，30-35s關(guān)，循環(huán)超聲2-3min為一個循環(huán)。

19、進一步優(yōu)選地，具體地，步驟s2所述超聲為循環(huán)超聲；所述的循環(huán)超聲的設(shè)置為30s開，30s關(guān)，循環(huán)超聲3min為一個循環(huán)。

20、進一步具體，所述循環(huán)超聲的次數(shù)為4。

21、具體地，步驟s2所述孵育為每個超聲循環(huán)在冰上孵育2-3min。

22、優(yōu)選地，步驟s2所述孵育為每個超聲循環(huán)在冰上孵育2min。

23、進一步具體地，所述孵育還包括轉(zhuǎn)載結(jié)束后在冰上孵育40-80min。

24、優(yōu)選地，所述孵育還包括轉(zhuǎn)載結(jié)束后在冰上孵育50-60min。

25、進一步優(yōu)選地，所述孵育還包括轉(zhuǎn)載結(jié)束后在冰上孵育60min。

26、又一方面，本發(fā)明提供了一種外泌體裝載白藜蘆醇，通過前述的方法獲得。

27、又一方面，本發(fā)明提供了前述的外泌體裝載白藜蘆醇在藥物、保健品和化妝品中的應(yīng)用。

28、又一方面，本發(fā)明提供了一種藥物，其特征在于，包括前述的外泌體裝載白藜蘆醇。

29、具體地，所述藥物還包括藥學上可接受的輔料。

30、進一步具體地，所述的藥學上可接受的輔料選自潤濕劑、乳化劑、防腐劑、抗氧化劑、緩沖劑、賦形劑、稀釋劑、潤滑劑、抑菌劑、懸浮劑、助懸劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、甜味劑以及香料中的一種或兩種以上的組合。

31、優(yōu)選地，所述藥學上可接受的輔料為選自乳糖、甘露糖、淀粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、明膠、硅酸鈣、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、硬脂酸鎂和礦物油中的至少一種。

32、具體地，所述藥物包括但不限于：滴劑、軟膏劑、乳劑、膜劑、涂抹劑、凝膠劑、糊劑、噴霧劑、氣霧劑或貼劑。

33、又一方面，本發(fā)明提供了一種保健品，其特征在于，包括前述的外泌體裝載白藜蘆醇。

34、具體地，所述保健品還包括保健品上可接受的輔料。

35、進一步具體地，所述的保健品上可接受的輔料選自潤濕劑、乳化劑、防腐劑、抗氧化劑、緩沖劑、賦形劑、稀釋劑、潤滑劑、抑菌劑、懸浮劑、助懸劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、甜味劑以及香料中的一種或兩種以上的組合。

36、優(yōu)選地，所述保健品上可接受的輔料為選自乳糖、甘露糖、淀粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、明膠、硅酸鈣、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、硬脂酸鎂和礦物油中的至少一種。

37、又一方面，本發(fā)明提供了一種化妝品，其特征在于，包括前述的外泌體裝載白藜蘆醇。

38、具體地，所述化妝品還包括化妝品上可接受的輔料。

39、進一步具體地，所述的妝品上可接受的輔料選自乳化劑、保濕劑、防曬劑、防腐劑、抗氧化劑、香精、色素、增稠劑和成膜劑的一種或兩種以上的組合。

40、具體地，所述化妝品包括但不限于：面膜、面霜、乳液、精華液或眼霜。

41、本發(fā)明所取得的技術(shù)效果：

42、（1）本發(fā)明提供的技術(shù)方案實現(xiàn)了外泌體對白藜蘆醇的有效裝載，裝載后的白藜蘆醇促進了細胞的吸收，在體外試驗中對比未裝載白藜蘆醇有更高的細胞活性。

43、（2）本發(fā)明提供的技術(shù)方案操作簡便，僅需簡單設(shè)備通過超聲，即可完成對白藜蘆醇的裝載，以及后續(xù)的純化。

44、（3）本發(fā)明提供的技術(shù)方案容易放大，該方法可以輕易的放大規(guī)模。以滿足后續(xù)的產(chǎn)量需求。

45、（4）本發(fā)明提供的外泌體裝載白藜蘆醇可顯著抑制ros效果。

46、（5）本發(fā)明提供的外泌體裝載白藜蘆醇可有效抑制細胞黑色素分泌。