本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)影像，具體涉及一種曲妥珠單抗修飾的aie熒光納米顆粒及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、乳腺癌的治療手段多種多樣，但目前最有效且根治性治療的方式依然是手術(shù)切除。腫瘤組織的徹底切除以避免復(fù)發(fā)，同時(shí)最大限度地保留腫瘤鄰近的健康組織以避免不必要的醫(yī)源性損傷，是腫瘤手術(shù)治療的根本目標(biāo)。因此，在乳腺癌腫瘤切除手術(shù)的過程中能夠?qū)崟r(shí)精準(zhǔn)識(shí)別腫瘤病灶及其邊緣至關(guān)重要。由于早期與進(jìn)展期腫瘤的微小病灶還不具備典型的形態(tài)結(jié)構(gòu)，因此腫瘤與健康組織之間的微小區(qū)別難以依靠醫(yī)生肉眼觀測(cè)和手部觸診的反饋進(jìn)行精準(zhǔn)識(shí)別。

2、基于熒光成像技術(shù)的手術(shù)導(dǎo)航系統(tǒng)可對(duì)腫瘤及其它病灶組織進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像，具有多角度、高通量和動(dòng)態(tài)連續(xù)獲取影像數(shù)據(jù)和結(jié)構(gòu)的功能優(yōu)勢(shì)，為外科手術(shù)提供了更為精準(zhǔn)、安全的解決方案。但是，目前能用于乳腺癌手術(shù)導(dǎo)航系統(tǒng)的熒光造影劑發(fā)展還不充分。這主要是源于乳腺癌本身的生物學(xué)特性及熒光成像技術(shù)的局限性：1、乳腺癌腫瘤具有高度異質(zhì)性，熒光探針難以對(duì)所有腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)識(shí)別和定位，導(dǎo)致成像結(jié)果存在一定的誤差和不確定性；2、乳腺癌腫瘤及活體組織具有自發(fā)熒光特性，在熒光成像過程中，與熒光探針的熒光信號(hào)重疊，會(huì)導(dǎo)致成像結(jié)果出現(xiàn)偽影和模糊現(xiàn)象，干擾熒光成像的準(zhǔn)確性；3、乳腺癌一般位于乳房深部，由于活體組織對(duì)光的吸收和散射作用，隨著成像深度的增加，熒光信號(hào)的強(qiáng)度會(huì)逐漸減弱，導(dǎo)致成像質(zhì)量下降，這使得乳腺癌熒光成像要求更深的穿透深度；4、乳腺癌腫瘤微環(huán)境復(fù)雜，活體腫瘤原位靶向熒光成像容易受到影響，可能導(dǎo)致熒光信號(hào)在腫瘤組織中的分布不均勻，影響靶向精準(zhǔn)度。

3、目前臨床使用的熒光造影劑主要為吲哚菁綠（icg），但是其在乳腺癌造影中存在一定的假陽(yáng)性/假陰性比率，在乳腺癌手術(shù)導(dǎo)航使用具有較大的局限性。故亟需開發(fā)一種能夠適用乳腺癌腫瘤活體熒光靶向技術(shù)的熒光造影劑，實(shí)現(xiàn)乳腺癌腫瘤的精準(zhǔn)識(shí)別，滿足乳腺癌手術(shù)導(dǎo)航使用需求，對(duì)于乳腺癌的早期診斷和有效治療具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種曲妥珠單抗修飾的aie熒光納米顆粒及其制備方法和應(yīng)用，在手術(shù)導(dǎo)航的過程中可實(shí)時(shí)精準(zhǔn)的指示乳腺癌的病灶及邊緣，降低手術(shù)難度，有效預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)。

2、本發(fā)明的目的至少通過以下技術(shù)方案之一實(shí)現(xiàn)。

3、一種曲妥珠單抗修飾的aie熒光納米顆粒，由aie熒光納米顆粒和曲妥珠單抗偶聯(lián)得到，所述aie熒光納米顆粒表面含有羧基和氨基中的至少一種，所述aie熒光納米顆粒內(nèi)部負(fù)載有aie分子；

4、所述曲妥珠單抗修飾的aie熒光納米顆粒的平均粒徑為50-300nm，分散系數(shù)為0.05-0.25。

5、優(yōu)選地，所述曲妥珠單抗修飾的aie熒光納米顆粒的平均粒徑為90-150nm；

6、優(yōu)選地，所述曲妥珠單抗修飾的aie熒光納米顆粒的分散系數(shù)為0.05-0.1；

7、優(yōu)選地，所述aie熒光納米顆粒是以兩親性高分子聚合物為載體包裹aie分子的具有球形結(jié)構(gòu)的aie熒光納米顆粒，所述兩親性高分子聚合物含有羧基和氨基中的至少一種。

8、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述兩親性高分子聚合物包括式ⅰ、式ⅱ中的至少一種：

9、

10、式ⅰ

11、

12、式ⅱ

13、式ⅰ、式ⅱ中，n各自獨(dú)立為≥45的整數(shù)。

14、優(yōu)選地，所述aie熒光納米顆粒的平均粒徑為90-150nm，變異系數(shù)為0.1-0.25；

15、優(yōu)選地，所述aie熒光納米顆粒表面的氨基、羧基的總密度為4-20mmol/ml，以2mg/mlaie熒光納米顆粒溶液計(jì)；

16、優(yōu)選地，所述aie分子的最大發(fā)射波長(zhǎng)大于700nm。

17、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述aie分子的最大發(fā)射波長(zhǎng)為700~1200nm。

18、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述aie分子選自aie-1分子到aie-15分子中的至少一種；

19、

20、?????????

21、

22、?????????

23、

24、?????????

25、

26、aie-7分子

27、

28、?????????

29、

30、?????????

31、

32、?????????

33、

34、?????????。

35、所述aie熒光納米顆?？赏ㄟ^市購(gòu)或自制獲得。

36、優(yōu)選地，所述aie熒光納米顆粒通過納米沉淀法制備得到。

37、優(yōu)選地，所述aie熒光納米顆粒的制備方法包括以下步驟：

38、（1）將aie分子和兩親性高分子聚合物溶于揮發(fā)性有機(jī)溶劑中，得到有機(jī)相溶液；

39、（2）將有機(jī)相溶液在超聲和混合攪拌條件下加至去離子水中；超聲結(jié)束后，攪拌下除去揮發(fā)性有機(jī)溶劑，過濾，得到aie熒光納米顆粒。

40、進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟（1）中，所述的aie分子和兩親性高分子聚合物的質(zhì)量用量比為1:(0.3-10)；更優(yōu)選為1:1。

41、進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟（1）中，所述的揮發(fā)性有機(jī)溶劑為四氫呋喃（thf）或二氯甲烷（dcm）；

42、進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟（1）中，所述aie分子的質(zhì)量和揮發(fā)性有機(jī)溶劑的體積比為1mg:(0.5-5)ml；

43、進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟（2）中，揮發(fā)性有機(jī)溶劑的體積用量為去離子水的2%-10%；進(jìn)一步優(yōu)選為2%-5%。

44、進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟（2）中，所述超聲的功率為60w-90w，超聲的時(shí)間為2min~5min，混合攪拌的的轉(zhuǎn)速為600rpm-800rpm；

45、進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟（2）中，所述攪拌的轉(zhuǎn)速為600rpm-800rpm，攪拌的時(shí)間為12h-24h；所述過濾為使用水相過濾器過濾，水相過濾器的濾膜孔徑為0.4~0.45μm；

46、進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟（1）和步驟（2）在室溫（20±5℃）下進(jìn)行。

47、上述的曲妥珠單抗修飾的aie熒光納米顆粒的制備方法，包括以下步驟：

48、將aie熒光納米顆粒加入緩沖液中，加入edc（1-?(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）和nhs（n-羥基琥珀酰亞胺）進(jìn)行活化，離心重懸后再加入曲妥珠單抗水溶液進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，得到粗產(chǎn)物，經(jīng)純化后得到曲妥珠單抗修飾的aie熒光納米顆粒；所述緩沖液（其中的緩沖對(duì)）不含nh2。

49、優(yōu)選地，所述緩沖液為mes（2-（n-嗎啡啉）乙磺酸）緩沖液，所述緩沖液的ph為6.0-6.5，所述緩沖液的濃度為0.020-0.050mm；

50、優(yōu)選地，所述aie熒光納米顆粒的質(zhì)量和緩沖液的體積的用量比為（0.007~0.010）g：10ml；

51、優(yōu)選地，所述edc和nhs的質(zhì)量比為1：（1-15）；進(jìn)一步優(yōu)選為1：（3-5）；

52、優(yōu)選地，所述aie熒光納米顆粒和edc的質(zhì)量比為0.007：（0.00015~0.0225）；

53、優(yōu)選地，所述edc在活化體系中的濃度為1-150mg/ml；所述nhs在活化體系中的濃度為1-650mg/ml；

54、優(yōu)選地，所述aie熒光納米顆粒為aie熒光納米顆粒溶液，濃度為2-10mg/ml；

55、優(yōu)選地，所述aie熒光納米顆粒和曲妥珠單抗的質(zhì)量比為1：（0.01-0.08）；進(jìn)一步優(yōu)選為1：（0.02-0.04）。

56、優(yōu)選地，所述活化的時(shí)間為0.5~1h；

57、優(yōu)選地，所述反應(yīng)的時(shí)間為2~4h；

58、優(yōu)選地，所述制備方法在室溫（20±5℃）下進(jìn)行。

59、優(yōu)選地，所述純化采用差速離心法純化；

60、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述差速離心法為：將粗產(chǎn)物先于真空條件下4000-5000rpm離心5-10min，去掉沉淀留上清；再于真空條件下10000-12000rpm離心10-20min，去掉上清留沉淀后加超純水復(fù)溶；之后在真空條件下5000-6000rpm離心5-10min，去掉沉淀留上清，得到曲妥珠單抗修飾的aie熒光納米顆粒。

61、一種aie熒光造影劑，包括上述的曲妥珠單抗修飾的aie熒光納米顆粒。

62、上述的曲妥珠單抗修飾的aie熒光納米顆?；蛏鲜龅腶ie熒光造影劑在非疾病診斷和/或治療目的的乳腺癌腫瘤熒光靶向的應(yīng)用。

63、本發(fā)明的aie熒光造影劑適用于乳腺癌腫瘤活體熒光靶向技術(shù)，在乳腺癌手術(shù)導(dǎo)航的過程中能夠?qū)崟r(shí)精準(zhǔn)指示乳腺癌的病灶及邊緣，降低手術(shù)難度，有效預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)。

64、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)勢(shì)：

65、（1）本發(fā)明的曲妥珠單抗修飾的aie熒光納米顆粒適用于乳腺癌腫瘤活體熒光靶向技術(shù),在乳腺癌手術(shù)導(dǎo)航的過程中能夠有效靶向乳腺癌腫瘤，實(shí)時(shí)成像，獲得高信噪比和分辨率的圖像，精準(zhǔn)指示乳腺癌的病灶及邊緣，幫助醫(yī)生對(duì)病灶進(jìn)行更加準(zhǔn)確的判斷和治療，降低手術(shù)難度，有效預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)。

66、（2）本發(fā)明的曲妥珠單抗修飾的aie熒光納米顆粒具有長(zhǎng)循環(huán)、生物相容性好的特點(diǎn)，注入體內(nèi)后在血液中的循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)，有效增加造影劑與乳腺癌細(xì)胞的接觸時(shí)間和機(jī)會(huì)，從而能夠精準(zhǔn)靶向乳腺癌細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對(duì)乳腺癌腫瘤病灶及其邊緣的精準(zhǔn)識(shí)別。

67、（3）本發(fā)明的曲妥珠單抗修飾的aie熒光納米顆粒具有高熒光強(qiáng)度、優(yōu)異的光穩(wěn)定性和更深的組織穿透深度，能夠在活體中精準(zhǔn)靶向乳腺癌腫瘤細(xì)胞，有利于進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的體內(nèi)深層實(shí)時(shí)成像。