本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，具體涉及一種基于卡介苗bcg的omvs訓(xùn)練免疫誘導(dǎo)劑在制備膿毒癥免疫治療藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、膿毒癥（sepsis）是由宿主對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)從而引起的多器官功能障礙的臨床綜合征，膿毒癥發(fā)生和發(fā)病過程中伴隨著嚴(yán)重的免疫失調(diào)，促炎與抑炎機(jī)制失衡所導(dǎo)致的機(jī)體穩(wěn)態(tài)的破壞是膿毒癥患者疾病進(jìn)展甚至死亡的主要原因。膿毒癥已嚴(yán)重威脅人類的生命健康，但是目前缺乏有效的治療手段，除了針對(duì)病原微生物的抗感染治療，其它治療多為非特異性的對(duì)癥支持治療。且抗生素的過度使用導(dǎo)致多重耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)，在臨床上呈上升趨勢(shì)，甚至出現(xiàn)了對(duì)現(xiàn)有抗生素完全耐藥的超級(jí)細(xì)菌，這對(duì)全球公共衛(wèi)生安全造成了巨大威脅。因此，開發(fā)一款安全有效的新型藥物以用于膿毒癥的治療至關(guān)重要。

2、訓(xùn)練免疫（trained?immunity，ti）是一種免疫調(diào)節(jié)策略，以單核-巨噬細(xì)胞、nk細(xì)胞以及ilc細(xì)胞等為代表的固有免疫細(xì)胞通過模式識(shí)別受體（pattern?recognitionreceptors,?prrs）與病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated?molecular?patterns,pamps）相互作用，從而引起固有免疫細(xì)胞表觀遺傳和代謝組學(xué)的重編程，當(dāng)再次受到不特定刺激后產(chǎn)生更快速或更強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，從而消除刺激使機(jī)體恢復(fù)穩(wěn)態(tài)，這種固有免疫的記憶作用稱之為訓(xùn)練免疫。ti具有強(qiáng)大的抵抗病毒、細(xì)菌以及真菌等病原微生物的能力，可以使機(jī)體快速恢復(fù)穩(wěn)態(tài)，因此ti在膿毒癥的預(yù)防和治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。研究表明，通過誘導(dǎo)小鼠ti，可以增強(qiáng)其在膿毒癥造模后的促炎反應(yīng)與細(xì)菌清除功能，從而快速消滅病原微生物，改善膿毒癥預(yù)后。

3、減毒牛結(jié)核分支桿菌（卡介苗，bacillus?calmette–guérin,?bcg)可以通過誘導(dǎo)ti在感染性疾病和腫瘤中具有良好的保護(hù)作用。但由于bcg是減毒活疫苗，本身具有免疫原性，會(huì)引起卡介苗病，嚴(yán)重者甚至?xí)霈F(xiàn)全身播散性結(jié)核，這些因素進(jìn)一步限制了bcg誘導(dǎo)ti的臨床應(yīng)用。

4、細(xì)菌外膜囊泡（outer?membrane?vesicles，omvs）是細(xì)菌通過向外出芽自然分泌的納米顆粒，具有與細(xì)菌外膜相似的結(jié)構(gòu)和組成，含有豐富的pamps，能與免疫細(xì)胞相互作用進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。然而，革蘭氏陰性菌來源的omvs富含內(nèi)毒素，會(huì)對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的調(diào)節(jié)反應(yīng)，甚至在某些情況下，可以輔助細(xì)菌的感染過程，觸發(fā)膿毒癥的發(fā)生。鑒于此，將革蘭氏陰性菌衍生的omvs應(yīng)用于臨床治療之前，必須對(duì)其進(jìn)行減毒處理，以確保其安全性。盡管目前采用了多種減毒技術(shù)，如礦化處理和基因工程調(diào)控，但這些方法仍難以徹底去除omvs中的內(nèi)毒素成分。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種基于卡介苗bcg的omvs訓(xùn)練免疫誘導(dǎo)劑在制備膿毒癥免疫治療藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明旨在融合bcg和omvs兩者的優(yōu)點(diǎn)，降低其毒性，更加安全、有效地誘導(dǎo)訓(xùn)練免疫，從而改善膿毒癥預(yù)后。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種基于卡介苗bcg的omvs訓(xùn)練免疫誘導(dǎo)劑，其制備方法如下：

4、s1、將bcg菌種加入到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，收集菌液，隨后將菌液進(jìn)行離心，取上清液，過濾以去除細(xì)菌和細(xì)菌碎片，得到濾液；

5、s2、將濾液進(jìn)行超濾，去除小分子蛋白，隨后進(jìn)行濃縮，再將濃縮后的液體進(jìn)行離心，去除細(xì)菌碎片，取上清液再次離心，得到無菌上清液；

6、s3、將無菌上清液超速離心，去除上清液，得到的沉淀以pbs緩沖液重懸，隨后離心清洗，即得到基于卡介苗bcg的omvs訓(xùn)練免疫誘導(dǎo)劑。

7、作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟s1中，液體培養(yǎng)基選自m7h9液體培養(yǎng)基。

8、作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟s1中，培養(yǎng)的溫度為35-37℃，轉(zhuǎn)速為200-300rpm。

9、作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟s1中，菌液od600值為0.8-1。

10、作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟s1中，離心的速度為3000-4000g，離心時(shí)間為10-20min。

11、作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟s2中，濃縮的倍數(shù)為10-30倍。

12、作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟s3中，超速離心的轉(zhuǎn)速為100000g-200000g，時(shí)間為1-3h。

13、第二方面，本發(fā)明還提供上述基于卡介苗bcg的omvs訓(xùn)練免疫誘導(dǎo)劑在制備膿毒癥免疫治療藥物中的應(yīng)用。

14、作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，藥物的劑型為注射劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、口服液或乳劑。

15、作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，藥物還包括藥學(xué)上或藥理上可接受的載體。

16、具體的，所述載體包括崩解劑、稀釋劑、潤(rùn)滑劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、矯味劑、助懸劑、表面活性劑和防腐劑中的一種或多種。

17、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

18、1、本發(fā)明通過分離收集bcg菌分泌的omvs，得到一種基于卡介苗bcg的omvs訓(xùn)練免疫誘導(dǎo)劑（記為b-omvs），本發(fā)明提供的b-omvs訓(xùn)練免疫誘導(dǎo)劑融合了bcg與omvs的顯著優(yōu)勢(shì)，同時(shí)規(guī)避了兩者的缺點(diǎn)，開發(fā)的b-omvs訓(xùn)練免疫誘導(dǎo)劑具有無復(fù)制性、無傳染性、低毒性等特性，對(duì)機(jī)體影響小，安全性高；

19、2、本發(fā)明提供的b-omvs訓(xùn)練免疫誘導(dǎo)劑展現(xiàn)出更為溫和而有效的免疫調(diào)節(jié)能力，可以誘導(dǎo)訓(xùn)練免疫，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)微生物的抵抗能力，減少抗生素的使用，更加有效地改善膿毒癥的預(yù)后。

技術(shù)特征：

1.一種基于卡介苗bcg的omvs訓(xùn)練免疫誘導(dǎo)劑在制備膿毒癥免疫治療藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述基于卡介苗bcg的omvs訓(xùn)練免疫誘導(dǎo)劑的制備方法如下：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟s1中，菌液的od600值為0.8-1。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟s2中，濃縮的倍數(shù)為10-30倍。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟s3中，超速離心的轉(zhuǎn)速為100000g-200000g，時(shí)間為1-3h。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，藥物的劑型為注射劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、口服液或乳劑。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，藥物還包括藥學(xué)上或藥理上可接受的載體。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述載體包括崩解劑、稀釋劑、潤(rùn)滑劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、矯味劑、助懸劑、表面活性劑和防腐劑中的一種或多種。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種基于卡介苗BCG的OMVs訓(xùn)練免疫誘導(dǎo)劑在制備膿毒癥免疫治療藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明通過分離收集BCG菌分泌的OMVs，得到一種基于卡介苗BCG的OMVs訓(xùn)練免疫誘導(dǎo)劑（記為B?OMVs），本發(fā)明提供的B?OMVs訓(xùn)練免疫誘導(dǎo)劑融合了BCG與OMVs的顯著優(yōu)勢(shì)，同時(shí)規(guī)避了兩者的缺點(diǎn)，開發(fā)的B?OMVs訓(xùn)練免疫誘導(dǎo)劑具有無復(fù)制性、無傳染性、低毒性等特性，對(duì)機(jī)體影響小，安全性高；此外，本發(fā)明提供的B?OMVs訓(xùn)練免疫誘導(dǎo)劑展現(xiàn)出更為溫和而有效的免疫調(diào)節(jié)能力，可以誘導(dǎo)訓(xùn)練免疫，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)微生物的抵抗能力，減少抗生素的使用，更加有效地改善膿毒癥的預(yù)后。

技術(shù)研發(fā)人員：周慧婷,汪健,龔元,郝文燕,徐鈴琪,楊穎伊
受保護(hù)的技術(shù)使用者：蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19