本發(fā)明屬于生物，具體涉及isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白在制備預(yù)防、治療prrsv感染的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、豬繁殖與呼吸綜合征（porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome，prrs）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine?reproductive?and?respiratory?syndromevirus，prrsv）引起的一種以妊娠母豬呼吸困難、流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎或木乃伊胎和仔豬生長(zhǎng)緩慢為特征的一種高度接觸性傳染性疾病。由于病豬耳朵發(fā)紺發(fā)紫，此病也稱為“豬藍(lán)耳病”。prrsv有著變異快、防控難的特點(diǎn)，與豬流感病毒感染不同，prrsv能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的天然免疫反應(yīng)從而引起免疫抑制，疫苗的防控效果并不理想。prrs臨床癥狀以母豬呼吸困難和繁殖障礙、仔豬生長(zhǎng)緩慢為主，對(duì)新生仔豬和母豬具有極高致死率，嚴(yán)重危害著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。prrsv存在變異快、防控難的特點(diǎn)，滅活疫苗的免疫保護(hù)較弱，而弱毒苗又存在毒力返祖的現(xiàn)象，導(dǎo)致prrsv疫苗的整體保護(hù)效果并不理想。因此實(shí)現(xiàn)對(duì)prrsv的有效防控目前仍是亟待解決的一個(gè)難題。

2、干擾素（interferon,?ifn）是細(xì)胞在病毒或其他刺激因子的作用下產(chǎn)生的一大類具有抗病毒活性的蛋白質(zhì)，具有廣譜的抗病毒作用和免疫調(diào)節(jié)作用，在天然免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要功能。ifn根據(jù)其編碼基因序列及受體類型不同可分為三大家族：ifn-ⅰ、ifn-ⅱ、ifn-ⅲ。ifn-ⅲ（ifn-λ）是近些年最新發(fā)現(xiàn)的一種干擾素亞型，其抗病毒功能及機(jī)制與ifn-?。╥fn-α/β）相似，但不同于ifn-α/β可以作用于全身組織的特性，ifn-λ主要作用于上皮細(xì)胞，特別是肺臟、胃腸道及腎臟的上皮細(xì)胞，從而能夠避免像ifn-ⅰ一樣產(chǎn)生全身性炎癥反應(yīng)，因此被認(rèn)為在某些病毒性傳染?。ㄈ绾粑到y(tǒng)感染）的治療中具有優(yōu)于ifn-α/β用于治療的潛力，成為了近些年抗病毒治療研究的熱點(diǎn)。在豬病毒性傳染病中，大部分病毒都是通過呼吸道、胃腸道進(jìn)行感染，而ifn-λ作用于此類疾病的“前沿陣地”，因此，開發(fā)ifn-ⅲ型制劑對(duì)豬病毒疾病的防治意義重大。

3、目前，ifn的生產(chǎn)除了從豬白細(xì)胞中分離外，主要依靠基因工程方法進(jìn)行表達(dá)純化。將ifn的目的基因插入宿主基因，誘導(dǎo)宿主基因表達(dá)ifn，并通過一定的方法進(jìn)行純化，從而獲取ifn。常用的ifn表達(dá)系統(tǒng)有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)、腺病毒表達(dá)系統(tǒng)等，桿狀病毒和酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)出來的蛋白活性優(yōu)于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，能夠正確折疊并發(fā)揮生物學(xué)活性，但是蛋白表達(dá)量低、生產(chǎn)周期及生產(chǎn)成本高，難以大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。而大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)周期短、蛋白表達(dá)量高，因此利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行ifn的表達(dá)更加適合生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用。但是，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白多為包涵體表達(dá)，難以正確折疊并復(fù)性成功，例如連丹花（“ⅲ型干擾素ifn-λ的表達(dá)純化及活性鑒定”[d]）構(gòu)建了bl21/pet26b（+）/?ifn-λ3原核表達(dá)菌株，并通過1?μg/ml的iptg誘導(dǎo)劑成功誘導(dǎo)出可溶性ifn-λ3重組蛋白，但是重組蛋白在胞周質(zhì)內(nèi)總體表達(dá)量偏低。

4、因而，如何實(shí)現(xiàn)ifn-λ3的大規(guī)模生產(chǎn)是ifn-ⅲ制劑開發(fā)中面臨的重大技術(shù)問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決現(xiàn)有技術(shù)中缺乏對(duì)prrsv感染有效的防控和治療手段的問題以及ifn-λ3難以大規(guī)模生產(chǎn)的問題，本發(fā)明旨在提供一種isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白，并將其用于制備預(yù)防、治療prrsv感染的藥物，驗(yàn)證了其具體功效。

2、為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白在制備預(yù)防、治療prrsv感染的藥物中的應(yīng)用，通過連接肽(h4)2將isg15與ifn-λ3連接起來，所述isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

4、進(jìn)一步地，所述藥物具有抑制prrsv的復(fù)制、抗prrsv活性的作用。

5、進(jìn)一步地，所述藥物具有減輕肺臟病變的作用，對(duì)prrsv感染的仔豬有治療效果。

6、進(jìn)一步地，所述藥物能夠改善仔豬的病毒血癥。

7、進(jìn)一步地，所述藥物能夠減輕肺臟中的炎性因子的表達(dá)和分泌，具有良好的抗炎作用。

8、進(jìn)一步地，編碼isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

9、進(jìn)一步地，所述isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白的制備方法包括如下步驟：

10、1）將seq?id?no.2所示的核苷酸序列克隆到載體從而構(gòu)建重組載體-isg15-(h4)2-ifn-λ3；

11、2）將重組載體-isg15-(h4)2-ifn-λ3轉(zhuǎn)化大腸桿菌從而得到用于制備isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白的重組菌；

12、3）誘導(dǎo)表達(dá)獲得isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白。

13、更進(jìn)一步地，所述isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白的制備方法包括如下步驟：

14、1）將seq?id?no.2所示的核苷酸序列克隆到pet-28a載體從而構(gòu)建重組載體pet-28a-isg15-(h4)2-ifn-λ3；

15、2）將重組載體pet-28a-isg15-(h4)2-ifn-λ3轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21（de3）從而得到用于制備isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白的重組菌；

16、3）誘導(dǎo)表達(dá)獲得isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白。

17、進(jìn)一步地，所述isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白的制備方法包括如下步驟：將重組載體pet-28a-isg15-(h4)2-ifn-λ3轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞bl21（de3）后得到重組菌，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)獲得isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白。

18、第二方面，提供預(yù)防、治療prrsv感染的藥物，所述藥物含有安全有效量的isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白，所述isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

19、進(jìn)一步地，編碼isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

20、進(jìn)一步地，所述藥物具有抑制prrsv的復(fù)制、抗prrsv活性的作用；或者所述藥物具有減輕肺臟病變的作用。

21、相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：

22、本發(fā)明選擇不同的連接肽：rl、hl、(h4)2，將isg15與ifn-λ3連接來促進(jìn)isg15-ifn-λ3的生物活性，研究表明isg15與ifn-λ3通過rl和hl連接后，盡管蛋白表達(dá)量有所提升，但在pbs中大量析出，難以復(fù)性成功，使用(h4)2連接肽的isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白成功復(fù)性透析至pbs，且表達(dá)量和穩(wěn)定性顯著提升，在同等條件下，本發(fā)明選擇(h4)2連接肽將isg15和ifn-λ3連接起來，可以實(shí)現(xiàn)ifn-λ3蛋白的穩(wěn)定、大量表達(dá)，解決了無法使用原核表達(dá)系統(tǒng)大量生產(chǎn)ifn-λ3的技術(shù)問題，且其純化后的產(chǎn)量是rl、hl作為連接肽時(shí)的4倍以上，取得了預(yù)料不到的技術(shù)效果，為ifn-λ3大規(guī)模、低成本量產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

23、本發(fā)明對(duì)isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白在體內(nèi)的抗prrsv活性進(jìn)行了驗(yàn)證，證明重組表達(dá)的isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白對(duì)抑制prrsv在體內(nèi)的復(fù)制有抑制效果，減輕了肺臟的病變、減輕肺臟中的炎性因子的分泌并改善了prrsv感染后引起的病毒血癥。