本發(fā)明屬于納米生物醫(yī)用領(lǐng)域，包含基于腫瘤微環(huán)境響應(yīng)性納米凝膠載體的構(gòu)建及其體內(nèi)蛋白質(zhì)的遞送。。

背景技術(shù)：

1、癌癥在我國(guó)乃至世界范圍內(nèi)都是人類(lèi)健康的主要敵人，其發(fā)病率也在日益增加。目前常用的癌癥治療方法并不能提供令人滿(mǎn)意的治療效果，且存在特異性低、毒副作用強(qiáng)、復(fù)發(fā)率高等缺陷。早期的癌癥難以發(fā)現(xiàn)?，而癌細(xì)胞又易通過(guò)淋巴血管等途徑轉(zhuǎn)移擴(kuò)散?，導(dǎo)致癌癥的治愈居高不下。目前臨床癌癥的治療方法是手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療。然而，手術(shù)治療存在高風(fēng)險(xiǎn)、創(chuàng)傷面積大和易復(fù)發(fā)的缺點(diǎn)?；放療和化療在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)會(huì)損傷機(jī)體的正常細(xì)胞?，導(dǎo)致正常生理功能受損。因此?，人類(lèi)急需開(kāi)發(fā)新型的癌癥診療策略攻克這一醫(yī)學(xué)難題。

2、近年來(lái)，用于治療許多人類(lèi)疾?。ò◥盒阅[瘤和心血管疾病）的臨床翻譯的蛋白質(zhì)療法越來(lái)越多，引起了人們的極大關(guān)注。這種治療性蛋白一般安全無(wú)毒，具有良好的特異性和優(yōu)異的抗腫瘤功效。然而，它們也有一些缺點(diǎn)，如體內(nèi)外穩(wěn)定性差、血液半衰期短、酶降解、非靶向細(xì)胞毒性和細(xì)胞下滲透性。為了提高凋亡蛋白對(duì)癌癥的治療效率，從聚合物膠束到各種納米載體，多聚體，脂質(zhì)體，納米凝膠?，到水凝膠。為克服細(xì)胞色素、赫塞汀、凋亡素和蓖麻毒素等凋亡蛋白在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的障礙，進(jìn)行了設(shè)計(jì)和探索。這些用于細(xì)胞內(nèi)傳遞凋亡蛋白的納米系統(tǒng)顯示出更長(zhǎng)的血漿半衰期、更好的細(xì)胞選擇性和優(yōu)越的抗腫瘤能力。

3、納米載體用于藥物對(duì)實(shí)體腫瘤的體外靶向是一種很有前途的工具，可以實(shí)現(xiàn)更穩(wěn)定和長(zhǎng)效的制劑。納米醫(yī)學(xué)因其體積小、藥物毒性小、藥物緩釋、生物分布方便等優(yōu)點(diǎn)而成為一個(gè)受歡迎的領(lǐng)域。納米載藥系統(tǒng)將納米技術(shù)與藥物遞送系統(tǒng)相結(jié)合，相對(duì)于傳統(tǒng)腫瘤化療擁有諸多優(yōu)勢(shì)。首先，藥物有效成分被緊密包裹或分散在微納載體的聚合物材料中，提升了藥物分子在生產(chǎn)、運(yùn)輸、儲(chǔ)存、給藥過(guò)程中的穩(wěn)定性。給藥后，隨著殼材的崩裂、分解，芯材逐漸緩慢釋放，藥物作用更加持久。納米載體的尺寸有利于細(xì)胞以?xún)?nèi)吞方式將其攝入，進(jìn)一步延長(zhǎng)藥物作用有效時(shí)間，從而增強(qiáng)治療效果。除了抗癌藥物，微納載體還能夠包裹超聲或熒光造影劑，實(shí)現(xiàn)對(duì)病人的診斷治療一體化；我們也可以在載體中加入可激發(fā)介質(zhì)材料，從而控制藥物遞送的時(shí)間與空間；納米載體還能與生物靶向材料相結(jié)合，提高藥物對(duì)病灶的特異性。而穩(wěn)定性、緩釋性、有效性、靶向性俱佳的藥劑，相對(duì)傳統(tǒng)藥劑又可以減少原藥的用藥量，自然而然地降低了毒副作用和用藥成本。。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明針對(duì)蛋白質(zhì)治療在癌癥治療中的局限性，如無(wú)法靶向釋放、失活時(shí)間短和膜滲透性差等問(wèn)題，提供了一種新型紫外光交聯(lián)納米凝膠載體制備方法。這一新型納米凝膠載體通過(guò)紫外光進(jìn)行交聯(lián)并使用細(xì)胞色素c進(jìn)行蛋白質(zhì)治療，具有良好的生物安全性和高抗腫瘤效率。本新型紫外光交聯(lián)納米凝膠載體具有以下幾種特點(diǎn)：

2、溶酶體逃逸能力：一般納米粒子通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞后，會(huì)通過(guò)溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)途徑降解，從而失去原有的功能。為了防止這種現(xiàn)象，該納米凝膠成功接枝二乙烯三胺避免被溶酶體降解并成功逃逸到細(xì)胞質(zhì)中。

3、血液循環(huán)與靶向性:?甲氧基聚乙二醇氨基的存在可以延長(zhǎng)納米凝膠在血液中的循環(huán)時(shí)間，并減少血液蛋白的吸附，從而提高其靶向性。

4、藥物輸送與釋放:?透明質(zhì)酸作為殼層聚合物的骨架，可以靶向腫瘤細(xì)胞表面的cd44受體，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)該納米粒子的胞吞。細(xì)胞色素c作為載體內(nèi)的有效成分，可以在達(dá)到腫瘤細(xì)胞后，由于腫瘤微環(huán)境的特殊性（如低ph、高還原性等），實(shí)現(xiàn)有針對(duì)性的藥物釋放。

5、響應(yīng)性:?由于包含胱胺基團(tuán)二硫鍵，這些納米凝膠具有優(yōu)越的腫瘤微環(huán)境響應(yīng)性，可以在接觸腫瘤細(xì)胞并受腫瘤微環(huán)境影響后，納米凝膠會(huì)迅速降解并釋放出蛋白質(zhì)治療藥物。

6、為了實(shí)現(xiàn)以上要求，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案，所述的一種新型紫外光交聯(lián)納米凝膠載體制備方法步驟如下：

7、a、聚合物配體1合成過(guò)程：

8、(1)將透明質(zhì)酸(ha)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)共同溶解于15~30?ml去離子水中，其中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽與n-羥基琥珀酰亞胺的摩爾量相同，透明質(zhì)酸和二者任一的摩爾量的比例可以為1:1.2~1.4。去離子水溶劑中edc和nhs的濃度范圍在0.5~3?mg/ml。在30℃的氮?dú)獗Ｗo(hù)環(huán)境中反應(yīng)2?h，來(lái)活化ha。

9、(2)將1~2?g的甲氧基聚乙二醇氨基?(平均分子量5000)?(mpeg)溶于10~20?ml去離子水中充分溶解后滴加到步驟(1)中，在30℃的氮?dú)獗Ｗo(hù)環(huán)境中反應(yīng)24~48?h，獲得聚乙二醇化的透明質(zhì)酸。

10、(3)將(2)中得到的溶液用注射泵逐滴加入含有二乙烯三胺(diethylenetriamine)的10?ml去離子水溶液中，在30℃的氮?dú)獗Ｗo(hù)環(huán)境中反應(yīng)24~48?h，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)溶液置于截留分子量為3000~8000的透析膜中，用0.01~0.05?mol/l的鹽酸溶液透析24~48?h，隨后用過(guò)量的去離子水透析純化兩到三天，冷凍干燥，得到甲氧基聚乙二醇氨基和二乙烯三胺修飾的透明質(zhì)酸鈉聚合物(ha-g-mpeg/deta)。

11、(4)?將0.15~0.20?g?硫辛酸(dl-α-lipoic?acid)和0.13~0.15?g?cdi?(n，n'-羰基二咪唑)用10~15?ml?dmso溶解，在30℃的氮?dú)獗Ｗo(hù)環(huán)境中反應(yīng)2?h?。

12、(5)?取(3)的聚合物0.8~1.0?g加入15?ml去離子水溶解，溶解完成后用注射泵注射進(jìn)?(4)中的雙口燒瓶中，在30℃的氮?dú)獗Ｗo(hù)環(huán)境中反應(yīng)24~48?h，置于截留分子量為3000~8000的透析膜中，之后用過(guò)量的去離子水透析純化48?h，冷凍干燥,最終得到聚合物配體(ha-g-mpeg/deta-c-la)。

13、b、納米凝膠的制備及負(fù)載蛋白質(zhì)：

14、(6)?稱(chēng)取100?mg聚合物ha-g-mpeg/deta-c-la于燒瓶中，用10~20?ml去離子水溶液溶解，在黑暗條件下用365?nm的紫外光照射一定時(shí)間，使其發(fā)生交聯(lián)而形成納米凝膠。

15、(7)?取100?mg納米凝膠(nanogel@la)以及cy5標(biāo)記的細(xì)胞色素c(cy5-cc)于燒瓶中，用10~20?ml?pbs緩沖溶液溶解，在黑暗條件下用365?nm的紫外光照射反應(yīng)不同時(shí)間，使其在紫外光照射的條件下負(fù)載細(xì)胞色素c(邊光照邊負(fù)載)。照射完成后將溶液置于截留分子量為30000的透析膜中，用過(guò)量去離子水(ph為7~8)?透析純化20?~?24?h，凍干，得到負(fù)載細(xì)胞色素c的納米凝膠。

16、2.步驟（1）所述的聚合物1中透明質(zhì)酸的平均分子質(zhì)量可以為7000~10000。

17、3.步驟（1）所述的聚合物1中的ha與edc/nhs的摩爾比為1:1.2

18、4.步驟（2）所述的聚合物1中的甲氧基聚乙二醇氨基(mpeg)平均分子量范圍為2000~5000。

19、5.步驟（2）所述的聚合物1中的甲氧基聚乙二醇氨基(mpeg)接枝到透明質(zhì)酸(ha)主鏈數(shù)量為1~4。

20、6.步驟（3）所述的聚合物1中的二乙烯三胺(deta)對(duì)透明質(zhì)酸(ha)的重復(fù)單元的摩爾比例為過(guò)量的20~40倍，二乙烯三胺接枝透明質(zhì)酸的配體個(gè)數(shù)為15~25個(gè)。

21、7.步驟（7）所述的聚合物1中的蛋白質(zhì)藥物可以是細(xì)胞色素c，granzyme?b?和grb-2等。

22、8.步驟（7）所述的聚合物1中的納米凝膠負(fù)載蛋白質(zhì)藥物的溶液ph范圍為7.4~8.0。

23、9.步驟（7）所述的聚合物1中的聚合物配體與蛋白質(zhì)藥物的質(zhì)量比控制在10:1~20:1。

24、本發(fā)明方法中所使用的含有二硫鍵結(jié)構(gòu)的原料可以是dl-α-硫辛酸((dl-α-lipoic?acid)。

25、本發(fā)明方法中所用到蛋白質(zhì)治療的藥物可以是細(xì)胞色素c，granzyme?b?和grb-

26、本發(fā)明方法是在ph?7.4~8.0水溶液或pbs緩沖溶液，通過(guò)合成聚合物，在紫外光的照射下二硫鍵斷裂形成雙自由基發(fā)生交聯(lián)而形成納米凝膠并負(fù)載蛋白質(zhì)藥物。

27、與目前技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

28、本發(fā)明提供一種新型通過(guò)紫外光交聯(lián)形成納米凝膠載體來(lái)更好地進(jìn)行蛋白質(zhì)治療癌癥，選用含具有靶向癌細(xì)胞表面cd44受體的透明質(zhì)酸作為納米凝膠的骨架，定位更加精準(zhǔn)，提高治療效果。

29、對(duì)透明質(zhì)酸主鏈接枝改性。其中甲氧基聚乙二醇氨基可以延長(zhǎng)其在血液系統(tǒng)中的循環(huán)時(shí)間，接枝的二乙烯三胺可以幫助溶酶體逃逸，凝膠中的二硫鍵可被腫瘤微環(huán)境中高濃度谷胱甘肽破壞，造成納米凝膠的解體，釋放出細(xì)胞色素c。即利用腫瘤微環(huán)境特點(diǎn)，提高蛋白質(zhì)的靶向釋放效率，控制更精準(zhǔn)、靈活。

30、制備獲得的納米凝膠在多種生物介質(zhì)中具有較好的穩(wěn)定性和生物相容性。

31、蛋白質(zhì)治療是基于蛋白質(zhì)藥物其高的治療效率和較低的毒副作用等優(yōu)勢(shì)廣泛應(yīng)用在癌癥治療方面。