本發(fā)明涉及由硫化葉菌細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)包含古細(xì)菌脂質(zhì)的組合物。

背景技術(shù)：

1、脂質(zhì)體是圍繞水性空間的球形脂質(zhì)體雙層囊泡(脂質(zhì)體酯)。它們是用于施用藥物、疫苗、基因、蛋白質(zhì)、小分子、抗生素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要載體。脂質(zhì)體由磷脂組成，主要是磷脂酰膽堿和膽固醇，但也可能包括其他脂質(zhì)，如磷脂酰乙醇胺。脂質(zhì)體由多種不同的方法產(chǎn)生(參見例如van?hoogevest,eur.j.pharm.sci.108(2017),1-12；szoka等人,ann.rev.biophys.bioeng.9(1980),467-508)，例如通過將磷脂質(zhì)分散在水性介質(zhì)中，例如使用機(jī)械處理(例如在均質(zhì)器中，優(yōu)選采用高壓均質(zhì))或超聲波處理。它們的直徑分布在0.02～10μm之間。它們的大小和組成顯著影響其性質(zhì)。

2、四醚脂質(zhì)體(即部分或完全由古細(xì)菌脂質(zhì)體組成的脂質(zhì)囊泡)代表一類特殊的脂質(zhì)體，其來源于從古細(xì)菌分離的膜脂質(zhì)體。四醚脂質(zhì)體由脂醚組成，即二醚結(jié)構(gòu)(雙植烷甘油二醚(archaeols))或四醚結(jié)構(gòu)(雙植烷雙甘油四醚(caldarchaeols))(例如kaur等人,drug?delivery?23(2016),2497；patel等人,critical?reviews?inbiotechnology?19(1999),317；圖4)。二醚結(jié)構(gòu)由在sn-2,3位攜帶兩條植烷基鏈(長(zhǎng)度為20-40個(gè)碳)的甘油部分組成。四醚結(jié)構(gòu)攜帶兩個(gè)以反平行方式(雙植烷雙甘油四醚)或平行方式(異雙植烷雙甘油四醚(isocaldarchaeol))連接到兩個(gè)甘油殘基的二植烷基鏈。此外，四醚脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)中還可能出現(xiàn)一個(gè)或幾個(gè)環(huán)戊烷環(huán)。一般來說，四醚脂質(zhì)體是由眾多的異質(zhì)脂質(zhì)結(jié)構(gòu)組成的，這極大地影響了它們的特性。根據(jù)組成(雙植烷甘油二醚與雙植烷雙甘油四醚的量)，脂質(zhì)體層是單層或雙層或其混合物。通過溶劑提取獲得的古細(xì)菌總脂質(zhì)約占細(xì)胞干重的5％。如幾項(xiàng)研究所示，古細(xì)菌脂質(zhì)的類型和結(jié)構(gòu)取決于作為提取來源的生物體及其各自的生活環(huán)境(如溫度)以及生長(zhǎng)期(jensen等人，life?5(2015)，1539)。例如，詹氏甲烷球菌的生長(zhǎng)溫度從50℃增加到65℃，導(dǎo)致雙植烷甘油二醚、雙植烷雙甘油四醚和大環(huán)雙植烷甘油二醚的核心脂質(zhì)體分布百分比分別從60％、21％和19％變?yōu)?5％、42％和43％(sprott等人，j.bact.173(1991),3907)。此外，對(duì)于古細(xì)菌屬硫化葉菌(archaea?sulfolobus)而言，據(jù)推測(cè)，膜流動(dòng)性受雙植烷雙甘油四醚脂質(zhì)體的植烷基鏈內(nèi)環(huán)戊烷環(huán)的數(shù)量控制，該數(shù)量隨著生長(zhǎng)溫度的升高而增加(jensen等人，2015年)。

3、美國(guó)專利申請(qǐng)us?5,098,588a公開了使用古細(xì)菌脂質(zhì)體作為金屬表面潤(rùn)滑劑的新用途。但是該文獻(xiàn)中既沒有公開古細(xì)菌的培養(yǎng)方法，也沒有提供不同古細(xì)菌脂質(zhì)體的組合物的特定組成。wo?2007/112567?a1公開了一種極性合成脂質(zhì)體，其包含至少一個(gè)碳水化合物或陰離子基團(tuán)，所述陰離子通過共價(jià)鍵連接到古細(xì)菌核心脂質(zhì)體的至少一個(gè)游離羥基上，其中熱原體屬古菌被用作雙植烷雙甘油四醚脂質(zhì)體的來源。在該文獻(xiàn)中公開了與使用硫化葉菌作為來源相比，更優(yōu)選使用來自熱原體屬古菌的那些脂質(zhì)體，以避免硫化葉菌中發(fā)現(xiàn)的雙植烷雙甘油四醚和雙植烷甘油諾尼醇四醚(nonitol-caldarchaeols)的混合物。德國(guó)專利申請(qǐng)de?102012216378a1描述了一種包含四醚脂質(zhì)體層的固定化基質(zhì)和生物傳感器芯片，在所述四醚脂質(zhì)體層上可以共價(jià)固定能夠結(jié)合到靶的配體(捕獲分子)，用于基于芯片的分析方法的所述生物傳感器芯片包含這種基質(zhì)。

4、目前，在被證明對(duì)熱、ph、膽鹽、脂肪酶和氧化高度穩(wěn)定之后，四醚脂質(zhì)體比傳統(tǒng)脂質(zhì)體更具吸引力，也因此受到了越來越多的關(guān)注。在幾項(xiàng)體外研究中，證明了四醚脂質(zhì)體可用作不同物質(zhì)的通用納米載體系統(tǒng)，具有對(duì)抗各種疾病的廣闊前景。然而，由于以下限制，四醚脂質(zhì)體還沒有實(shí)現(xiàn)在應(yīng)用上的突破：

5、1)其是在復(fù)雜的環(huán)境(復(fù)雜的培養(yǎng)基和不受控制的搖瓶培養(yǎng))中產(chǎn)生的，因此是異質(zhì)的，

6、2)其不能在與監(jiān)管指南(qualityby?design(qbd))相矛盾的規(guī)定條件下生產(chǎn)，

7、3)古細(xì)菌的脂質(zhì)組成無法控制，

8、4)其不能以低成本進(jìn)行大量生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、因此，本發(fā)明的目的是減少四醚脂質(zhì)體的異質(zhì)性，并使其能夠在古細(xì)菌的受控培養(yǎng)條件下通過控制工藝參數(shù)生產(chǎn)特制的古細(xì)菌脂質(zhì)體。更具體地說，本發(fā)明的目的是提供一種包含許多環(huán)戊烷環(huán)脂質(zhì)體但同時(shí)也包含磷脂酰雙植烷甘油二醚的四醚脂質(zhì)體組合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供適于特定遞送途徑和/或給藥(例如用于口服緩釋遞送和/或口服急性遞送)的古細(xì)菌脂質(zhì)組合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供具有適當(dāng)穩(wěn)定性(例如，定義為穩(wěn)定的包裹目標(biāo)藥物并使其通過胃或皮膚或粘膜的能力)的古細(xì)菌脂質(zhì)體組合物和/或足夠的功能性(例如，定義為雙植烷甘油二醚與雙植烷雙甘油四醚的比例)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是制備一種脂質(zhì)混合物，該混合物在保持來自古細(xì)菌的脂質(zhì)體中雙植烷雙甘油四醚:雙植烷甘油二醚的比例的可調(diào)節(jié)性的同時(shí)，在古細(xì)菌的雙植烷雙甘油四醚種類中的植烷基鏈中具有盡可能多的環(huán)(在生理限度內(nèi))。

2、因此，本發(fā)明提供了在確定的培養(yǎng)基和控制條件下培養(yǎng)硫化葉菌的方法，從而產(chǎn)生特定的、更均勻的脂質(zhì)組合物，以產(chǎn)生具有更低異質(zhì)性的特制四醚脂質(zhì)體，用作生物制藥工業(yè)的囊泡。

3、更具體地，本發(fā)明提供了一種由硫化葉菌細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)含有古細(xì)菌脂質(zhì)的組合物的方法，包括：

4、(1)在75～85℃和0.025～0.035/h的生長(zhǎng)速率的條件下培養(yǎng)硫化葉菌細(xì)胞培養(yǎng)物，并從古細(xì)菌培養(yǎng)物中提取古細(xì)菌脂質(zhì)，以獲得用于口服緩釋療法的組合物，或

5、(2)在75～85℃和0.005～0.015/h的生長(zhǎng)速率的條件下培養(yǎng)硫化葉菌細(xì)胞培養(yǎng)物，并從所述古細(xì)菌培養(yǎng)物中提取所述古細(xì)菌脂質(zhì)，以獲得用于口服急性療法的組合物。

6、四醚脂質(zhì)體有益的性質(zhì)使得其成為現(xiàn)有技術(shù)中未來藥物的有前途的候選藥物。然而，迄今為止，使其成為實(shí)際相關(guān)候選藥物的主要障礙主要是生產(chǎn)過程缺乏可控性以及它們的脂醚組成的高度可變性。本發(fā)明使得將四醚脂質(zhì)體成為輸送給人類患者的現(xiàn)實(shí)候選藥物這一工業(yè)途徑變成了現(xiàn)實(shí)：

7、對(duì)于人類治療中的用途，通常要求配方藥物的最小保質(zhì)期為1～2年。這意味著需要藥物具有較高的物理穩(wěn)定性(聚合、物質(zhì)損失)和儲(chǔ)存期間的化學(xué)穩(wěn)定性(氧化、水解)。近年來，脂質(zhì)體在藥物/疫苗遞送中的應(yīng)用已經(jīng)延伸到口服遞送系統(tǒng)。常規(guī)的脂質(zhì)體不能用于此目的，因?yàn)樗鼈冊(cè)谖改c道的惡劣環(huán)境中穩(wěn)定性差(胃中的ph低至1，且還會(huì)受到脂肪酶和膽鹽的攻擊)。與常規(guī)脂質(zhì)體相比，四醚脂質(zhì)體的主要優(yōu)點(diǎn)是它們的高穩(wěn)定性。本發(fā)明已經(jīng)測(cè)試了多方面的穩(wěn)定性，證明了四醚脂質(zhì)體相比于常規(guī)脂質(zhì)體的優(yōu)點(diǎn)：

8、儲(chǔ)存穩(wěn)定性：四醚脂質(zhì)體含有飽和植烷基鏈，因此不會(huì)被空氣氧化。因此，它們可以在室溫下儲(chǔ)存在氯仿/甲醇中多年而不發(fā)生任何蝕變。

9、熱穩(wěn)定性：與常規(guī)脂質(zhì)體相比，由例如嗜酸熱硫化葉菌制成的四醚脂質(zhì)體的熱穩(wěn)定性表明，與常規(guī)脂質(zhì)體在35～40℃時(shí)變得可滲透并發(fā)生物質(zhì)損失不同，四醚脂質(zhì)體在更高的溫度下也不會(huì)滲漏。古細(xì)菌脂質(zhì)中的環(huán)狀結(jié)構(gòu)作為熱適應(yīng)反應(yīng)沉積，賦予緊密的膜堆積和降低的膜流動(dòng)性。這種高熱穩(wěn)定性允許通過高壓滅菌進(jìn)行滅菌，這是脂質(zhì)囊泡體內(nèi)應(yīng)用的關(guān)鍵要求。相比之下，常規(guī)脂質(zhì)體的熱滅菌會(huì)導(dǎo)致聚集、水解和滲漏，使得無菌脂質(zhì)體的制備成為一項(xiàng)繁瑣的工作。

10、ph穩(wěn)定性：體外試驗(yàn)表明，四醚脂質(zhì)體在酸性ph下比常規(guī)脂質(zhì)體更穩(wěn)定：在3.0的ph下儲(chǔ)存21天后，脂質(zhì)體損失了高達(dá)60％的物質(zhì)，而四醚脂質(zhì)體僅損失了30％。

11、抗脂肪酶的穩(wěn)定性：胃腸道中的脂肪酶引起脂質(zhì)體的嚴(yán)重水解，使得被包裹的物質(zhì)快速釋放。先前的研究表明，當(dāng)暴露于磷脂酶a2小時(shí)時(shí)，常規(guī)脂質(zhì)體損失高達(dá)100％的物質(zhì)，而四醚脂質(zhì)體損失不到20％。

12、在膽鹽存在下的穩(wěn)定性：研究表明，在37℃的模擬人膽汁中孵育90min后，四醚脂質(zhì)體保留了所有的物質(zhì)，這比脂質(zhì)囊泡在胃中的平均停留時(shí)間要長(zhǎng)。

13、抗脂肪酶和膽鹽聯(lián)合作用的穩(wěn)定性：在胃腸道中，脂質(zhì)囊泡與脂肪酶和膽鹽接觸，影響其穩(wěn)定性。當(dāng)在模擬人膽汁中的胰脂肪酶存在下孵育30min后，常規(guī)脂質(zhì)體失去100％的物質(zhì)，而脂肪酶和膽鹽對(duì)四醚脂質(zhì)體沒有顯示出協(xié)同作用。

14、總的來說，四醚脂質(zhì)體在穩(wěn)定性方面(隨著時(shí)間的推移更加穩(wěn)定，更耐熱、耐ph、耐脂肪酶、耐膽汁酸、耐高壓滅菌)已經(jīng)有超過目前使用的脂質(zhì)體的潛力。本發(fā)明提供了一種可靠的方法，以使合適的和可重復(fù)的組合物能夠通過四醚脂質(zhì)體特異性遞送藥物。因此，本發(fā)明能夠以足夠的質(zhì)量生產(chǎn)足夠數(shù)量的四醚脂質(zhì)體。

15、四醚脂質(zhì)體被認(rèn)為是運(yùn)送各種物質(zhì)的非常有用的載體。目前最有前途的藥物載體應(yīng)用是將四醚脂質(zhì)體用作口服遞送治療性蛋白質(zhì)或肽(如胰島素)的微膠囊。迄今為止，它們還被認(rèn)為是疫苗中高度受人關(guān)注的佐劑，因?yàn)橥淌杉?xì)胞對(duì)四醚脂質(zhì)體的攝取比常規(guī)脂質(zhì)體高50多倍。對(duì)小鼠的研究表明，全身性施用包埋在四醚脂質(zhì)體中的幾種試驗(yàn)抗原產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答與用強(qiáng)效但有毒的弗氏佐劑獲得的免疫應(yīng)答相當(dāng)。迄今為止進(jìn)行的所有體外和體內(nèi)研究表明，四醚脂質(zhì)體是安全的，不會(huì)引起任何明顯的毒性。通常，醫(yī)療應(yīng)用中對(duì)脂質(zhì)載體的要求是：

16、安全性、穩(wěn)定性、生物利用度、成本效益；

17、對(duì)人體無毒性影響；

18、誘導(dǎo)非病理性炎癥反應(yīng)；

19、促進(jìn)先天免疫系統(tǒng)和后天免疫系統(tǒng)之間的相互作用(cross-talk)；

20、體液抗體反應(yīng)的增強(qiáng)和t細(xì)胞介導(dǎo)反應(yīng)的誘導(dǎo)。

21、四醚脂質(zhì)體滿足所有這些要求，因此已被成功地測(cè)試用于癌癥疫苗的藥物遞送系統(tǒng)、針對(duì)恰加斯病的免疫佐劑、新型基因遞送系統(tǒng)、用于口服遞送蛋白質(zhì)和肽的載體、新型抗原遞送系統(tǒng)等。

22、在體外和動(dòng)物模型中已經(jīng)顯示了具有醫(yī)學(xué)相關(guān)性的四醚脂質(zhì)體的潛在廣泛應(yīng)用。然而，由于脂質(zhì)組合物的異質(zhì)性，臨床應(yīng)用尚未實(shí)現(xiàn)。

23、從不同的古細(xì)菌物種中成功制備了四醚脂質(zhì)體。通常，通過使用氯仿/甲醇/水的有機(jī)溶劑提取法從冷凍生物量中提取總古細(xì)菌脂質(zhì)。然后，使用丙酮沉淀法分離極性和中性脂質(zhì)體。得到的脂質(zhì)體提取物可以直接用于制備不同脂質(zhì)體種類的復(fù)雜混合物形式的四醚脂質(zhì)體，或者可以通過色譜法進(jìn)一步純化以分離特定種類的純極性脂質(zhì)體。從這些特殊的天然古細(xì)菌脂質(zhì)體開始，使用為制備常規(guī)脂質(zhì)體而開發(fā)的可用方法，如機(jī)械分散法、脂質(zhì)體水合法、膜擠壓或超聲波處理，可以制備四醚脂質(zhì)體的制劑并包封或締合親水性或疏水性化合物。從古細(xì)菌制備脂質(zhì)的方法或培養(yǎng)古細(xì)菌的方法公開在例如美國(guó)專利申請(qǐng)us2017/0152533?a1、美國(guó)專利us?6,316,260?b1、歐洲專利ep?1999137?b1、歐洲專利ep0883624?b1、歐洲專利ep?2109459b1、siliakus等人(extremophiles?21(2017),651-670)、jain等人(frontiers?in?microbiol.5(2014),article?641))。

24、眾所周知，盡管已知古細(xì)菌是這些特殊脂質(zhì)的有用來源，但它們尚未廣泛用于所述目的，因?yàn)槟壳爸|(zhì)的組成無法控制且非常不均勻。大多數(shù)古細(xì)菌是在搖瓶中的復(fù)雜培養(yǎng)基上在不受控制的條件下培養(yǎng)的，這導(dǎo)致不同批次之間在脂質(zhì)種類組成、脂質(zhì)核心結(jié)構(gòu)以及脂質(zhì)分支結(jié)構(gòu)方面的差異。此外，脂質(zhì)體的組成和性質(zhì)到目前為止是不可控制的。然而，這對(duì)于具有降低的異質(zhì)性和藥物應(yīng)用所需的特定性質(zhì)的可重復(fù)的高質(zhì)量四醚脂質(zhì)體的形成至關(guān)重要。據(jù)觀察，在不同的過程中，特別是當(dāng)溫度變化或在不同的生長(zhǎng)階段采集樣品時(shí)(jensen等人,life?5(2015),1539)，島鏈霉菌和超嗜熱古細(xì)菌的脂質(zhì)體組成不是恒定的。通過在生物反應(yīng)器的受控環(huán)境中和確定成分的培養(yǎng)基上培養(yǎng)古細(xì)菌，本發(fā)明通過改變關(guān)鍵工藝參數(shù)(例如溫度、生長(zhǎng)速率等)提供了對(duì)古細(xì)菌脂醚質(zhì)量(異質(zhì)性和組成)的有效控制，但是這會(huì)阻礙本發(fā)明明確定義的四醚脂質(zhì)體的制備。

25、四醚脂質(zhì)體可用于執(zhí)行類似于脂質(zhì)體的任務(wù)(對(duì)患者給藥)，但表現(xiàn)出了比脂質(zhì)體更好的性質(zhì)(隨著時(shí)間的推移更穩(wěn)定，更耐熱、耐ph、耐膽汁酸、耐高壓滅菌)，并被認(rèn)為是常規(guī)脂質(zhì)體的可行替代物，因?yàn)樗鼈兛梢员Ｙ|(zhì)保量的進(jìn)行生產(chǎn)。

26、2017年，全球輸送至市場(chǎng)的脂質(zhì)體藥物價(jià)值為24億美元，預(yù)計(jì)到2025年底將達(dá)到52億美元，2018～2025年間將以10.1％的年增長(zhǎng)率增長(zhǎng)。

27、最近一項(xiàng)關(guān)于脂質(zhì)制劑臨床應(yīng)用的綜述列出了全球15種批準(zhǔn)的臨床產(chǎn)品，涵蓋抗癌、抗真菌、疫苗、抗炎藥物和治療基因等領(lǐng)域。

28、對(duì)于使用四醚脂質(zhì)體作為藥物活性成分的載體，有必要根據(jù)所需的作用部位和藥效學(xué)確保不同的釋放動(dòng)力學(xué)。這種釋放動(dòng)力學(xué)基本上受四醚脂質(zhì)體穩(wěn)定性的影響。

29、對(duì)于穩(wěn)定性來說，除了基本類型的脂質(zhì)外，尤其是短鏈和長(zhǎng)鏈脂質(zhì)的比例至關(guān)重要；以及脂質(zhì)鏈中可能存在的環(huán)結(jié)構(gòu)，通過限制鏈的流動(dòng)性，導(dǎo)致更密集的堆積和膜滲透性的降低。雙植烷甘油二醚(arc，植烷基鏈中總共有40個(gè)碳原子)和雙植烷雙甘油四醚(cal，植烷基鏈中總共有80個(gè)碳原子)的組合在這里代表了一個(gè)合適的控制桿。這兩種物質(zhì)都是嗜酸熱硫化葉菌和其他古細(xì)菌的天然膜成分。目前存在末端甘油殘基上多種修飾(無修飾，磷脂酰肌醇(phosphatidyl?inositol，pi)修飾，二己糖(dihexose，2hex)修飾，及其組合：cal，pi-cal，2hex-cal，pi-cal-2hex)的雙植烷雙甘油四醚的變體。此外，具有不同環(huán)數(shù)的cal變體出現(xiàn)在植烷基鏈中(在嗜酸熱硫化葉菌的情況下，優(yōu)選4、5或6個(gè)環(huán))。雙植烷甘油二醚主要以pi-arc形式出現(xiàn)。

30、出于多種原因，對(duì)于本發(fā)明所述的四醚脂質(zhì)體的制備，特別是對(duì)于口服應(yīng)用，2hex-cal和pi-arc的混合物是特別受人關(guān)注的組合：

31、可以使用不同環(huán)數(shù)的雙植烷雙甘油四醚；

32、短鏈和長(zhǎng)鏈脂質(zhì)的混合物確保了對(duì)形成的四醚脂質(zhì)體穩(wěn)定性的影響；

33、兩種脂質(zhì)在頭基中都有足夠數(shù)量的功能基團(tuán)，以便采用用于靶向給藥的接頭進(jìn)行有效修飾(例如，抗體片段、適體等的附著)；

34、這種修飾可以選擇性地在兩種脂質(zhì)中的任一種上進(jìn)行，因?yàn)轭^部基團(tuán)的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)不同。

35、如本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)所示，cal與arc的比例可能通過溫度和生長(zhǎng)速率(最佳生長(zhǎng)溫度和最高生長(zhǎng)速率下的最大cal:arc比例，反之亦然)這些工藝參數(shù)來改變。然而，令人驚訝地的是，更高數(shù)量的環(huán)的比例(6個(gè)環(huán)相對(duì)于5個(gè)或4個(gè)環(huán))僅取決于溫度，與生長(zhǎng)速率無關(guān)。在硫化葉菌中觀察到了溫度對(duì)環(huán)數(shù)的影響。然而，沒有文獻(xiàn)記載了生長(zhǎng)率的影響。

36、如本發(fā)明所示，基本上，盡可能多的環(huán)對(duì)于實(shí)現(xiàn)盡可能低的膜滲透性和胃阻力是必要的，因此需要在盡可能高的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)。然而，如本發(fā)明所述，可以通過生長(zhǎng)速率來控制相關(guān)的溫度損失，作為建立cal:arc的比例的合適手段。對(duì)于藥物在腸道中的釋放，四醚脂質(zhì)體可能不太穩(wěn)定，因?yàn)樗幬锊荒苡行нf送至相關(guān)部位。因此，本發(fā)明所述的四醚脂質(zhì)體制劑的釋放動(dòng)力學(xué)的可修飾性得以維持，并且在來自于本發(fā)明提供的特制脂質(zhì)混合物的四醚脂質(zhì)體上產(chǎn)生的藥物，例如口服給藥后，在腸中具有不同的作用持續(xù)時(shí)間。

37、本發(fā)明基于在本發(fā)明過程中獲得的至少兩個(gè)重要結(jié)果。首先，本發(fā)明提供了一種受控的生產(chǎn)方法，該方法使得古細(xì)菌脂質(zhì)具有可重現(xiàn)性和確定的組成；其次，有了本發(fā)明所述的應(yīng)用和利用古細(xì)菌脂質(zhì)的受控生產(chǎn)方法(取決于特定的和不同的培養(yǎng)條件)的知識(shí)，通過采用不同的培養(yǎng)條件，也可以以放大的形式可重復(fù)地提供兩種特定種類的古細(xì)菌組合物，所述培養(yǎng)條件特別適用于(a)口服緩釋療法(即顯示緩釋效果的藥物組合物)或(b)口服急性療法(即當(dāng)口服給藥時(shí)立即釋放給患者的藥物組合物)。

38、生物反應(yīng)器培養(yǎng)方法在最近已經(jīng)與新的分析工具、計(jì)算機(jī)指導(dǎo)的過程監(jiān)控和軟件指導(dǎo)的過程控制一起被開發(fā)，以在完全不同的水平上實(shí)現(xiàn)微生物培養(yǎng)技術(shù)的突破。尤其是影響了需要復(fù)雜培養(yǎng)條件的微生物的培養(yǎng)技術(shù)，如古細(xì)菌，其培養(yǎng)溫度明顯高于常規(guī)培養(yǎng)溫度，如30℃或37℃或室溫。十年或五年前還不存在觀察過程參數(shù)的現(xiàn)代方法，這使得本發(fā)明所述的方法能夠作為用于培養(yǎng)古細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物的可控和可重復(fù)的生產(chǎn)過程的必要基礎(chǔ)，特別是對(duì)于生長(zhǎng)速率的有效控制。

39、例如，patel等人(critical?reviews?in?biotechnology?19(1999))在表1中報(bào)告了代表性古細(xì)菌中主要核心脂質(zhì)的相對(duì)豐度(單位為％)。由于當(dāng)時(shí)沒有合適的分析工具，只能對(duì)核心脂質(zhì)進(jìn)行半定量分析，即相對(duì)含量。除了低生長(zhǎng)溫度(70℃，相比于至少75℃的最佳生長(zhǎng)溫度)，脂質(zhì)是從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期獲得的，因?yàn)樵诋?dāng)時(shí)更為具體的生長(zhǎng)期是不可控制的，但在培養(yǎng)過程中發(fā)生了顯著變化(sprott等人，can.j.microbiol.43(1997),467-476)。直到目前可用的新培養(yǎng)方法的引入，古細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物才能夠調(diào)節(jié)培養(yǎng)參數(shù)，例如特定的生長(zhǎng)速率。因此，現(xiàn)有技術(shù)甚至不能提供通過不同的工藝參數(shù)和/或不同的培養(yǎng)條件培養(yǎng)的得到的古細(xì)菌脂質(zhì)組合物，所述脂質(zhì)體組合物以不同的但總是可重復(fù)定義的定性和定量脂質(zhì)實(shí)體組合物的形式提供。這是本發(fā)明首次提供的來源于古細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物的古細(xì)菌脂質(zhì)，尤其是來源于硫化葉菌細(xì)胞培養(yǎng)物的古細(xì)菌脂質(zhì)。

40、根據(jù)本發(fā)明，在保持cal:arc的比例具有可調(diào)節(jié)性(在生理限度內(nèi))的同時(shí)，制備在雙植烷雙甘油四醚物種的植烷基鏈中具有最高可能環(huán)數(shù)的脂質(zhì)混合物將成為可能。由于它們特殊的化學(xué)適應(yīng)性，本發(fā)明所述的2hex-cal和pi-arc是特別優(yōu)選的目標(biāo)物種。因此，根據(jù)本發(fā)明，由于生長(zhǎng)溫度的提高，以及在生長(zhǎng)速率上調(diào)節(jié)cal:arc的比例，可以提供具有大量環(huán)的四醚脂質(zhì)體的組合物。通過控制工藝條件，本發(fā)明可以獲得脂質(zhì)提取物，其可以直接使用或以最小的純化代價(jià)用于生產(chǎn)具有高胃液耐受性和不同藥物活性成分的定制釋放動(dòng)力學(xué)的四醚脂質(zhì)體。

41、本發(fā)明提供了兩種特定的組合物，其包含來自硫化葉菌細(xì)胞培養(yǎng)物的古細(xì)菌脂質(zhì)，一種特別適用于口服緩釋療法，另一種特別適用于口服急性療法。所述術(shù)語“口服緩釋療法”和“口服急性療法”是以其通常的含義使用：然而所述“緩釋”(或“緩慢釋放”、“持續(xù)釋放”、“延長(zhǎng)釋放”的口服療法顯示出“緩釋效果”，即使在遞送后一段時(shí)間后，例如在(口服)遞送后12小時(shí)后，該效果仍能持續(xù)釋放，但“急性”(或“立即釋放”)的口服療法在施用后立即釋放，并在遞送后立即具有最大釋放量，例如在口服后3小時(shí)內(nèi)(pschyrembel,“緩釋效果”:由于蓋侖制劑引起的活性物質(zhì)的長(zhǎng)期釋放；andrade,j.clin.psychiatry?76(2015),e995-e999；perrie等人，“制藥學(xué)中藥物遞送的控制：藥物遞送和靶向”，(2012),pharmaceutical?press)。

42、用于生產(chǎn)具有持續(xù)釋放效果的口服四醚脂質(zhì)體而產(chǎn)生的脂質(zhì)特別適合于口服給藥的需要，并因此表現(xiàn)出高的胃液耐受性。這種抗性是由于大量環(huán)戊烷環(huán)的存在。根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)環(huán)戊烷環(huán)的數(shù)量可以通過施加高的工藝溫度來實(shí)現(xiàn)，特別是在75～85℃的范圍內(nèi)。對(duì)于持續(xù)釋放所必需的緩釋效果，需要活性物質(zhì)在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)緩慢釋放，因此需要其具有時(shí)間穩(wěn)定性。根據(jù)本發(fā)明，這可以通過相對(duì)穩(wěn)定的pi-arc的存在來實(shí)現(xiàn)。為了獲得這種特定的脂質(zhì)組合物，本發(fā)明提供了下述教導(dǎo)，即脂質(zhì)組合物的制備需要高的生長(zhǎng)速率，即優(yōu)選生長(zhǎng)速率為0.025～0.035/h，尤其是0.027～0.033/h。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本方法提供了一種用于口服緩釋療法的組合物，該組合物包含比例為1:5～1:7，特別是1:5.5～1:6.5的二己糖-雙植烷雙甘油四醚(2hex-cal)與磷脂酰肌醇-雙植烷甘油二醚(pi-arc)。

43、一方面，針對(duì)急性療法的口服四醚脂質(zhì)體的生產(chǎn)而制備的脂質(zhì)也特別適合于口服給藥的需要，并因此表現(xiàn)出高的胃液耐受性。所述耐受性——如在緩釋方案下——由大量環(huán)戊烷環(huán)的存在來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)所述環(huán)戊烷環(huán)的數(shù)量可以通過施加高溫來實(shí)現(xiàn)，特別是75～85℃的溫度。另一方面，用于急性療法的組合物需要藥物在腸道中快速釋放。因此，組合物需要具有較低的穩(wěn)定性。根據(jù)本發(fā)明所述，這可以通過更不穩(wěn)定的pi-arc的存在來實(shí)現(xiàn)。為了獲得這種特定的脂質(zhì)組合物，本發(fā)明提供了下述教導(dǎo)，即脂質(zhì)組合物的制備需要低的生長(zhǎng)速率，即優(yōu)選生長(zhǎng)速率為0.005～0.015/h，尤其是0.007～0.013/h。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本方法提供了一種用于口服急性療法的組合物，該組合物包含比例為1:2～1:4，尤其是1:2.5～1:3.5的二己糖-雙植烷雙甘油四醚(2hex-cal)與磷脂酰肌醇-雙植烷甘油二醚(pi-arc)。

44、利用可通過本發(fā)明方法獲得的這些組合物，可以制備特制的四醚脂質(zhì)體，其中將待遞送的藥物包裹后進(jìn)行給藥，優(yōu)選用于口服給予需要有效劑量的人類患者。

45、培養(yǎng)硫化葉菌細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的技術(shù)，并且原則上是已經(jīng)建立相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間的技術(shù)(早在如brock等人，arch.mikrobiol.84(1972),54-68記載的)。一種優(yōu)選的硫化葉菌菌株是嗜酸熱硫化葉菌細(xì)胞，這是當(dāng)前技術(shù)領(lǐng)域中已確立的菌株之一。這種硫化葉菌的保藏中心可以是，例如德國(guó)微生物菌種保藏中心(dsmz德國(guó)微生物菌種保藏中心)，保藏號(hào)dsm?639。另一種供應(yīng)來源是美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(atcc)，保藏號(hào)為atcc?33909。其他保藏于dmsz或atcc中的古細(xì)菌也是可以使用的。

46、根據(jù)規(guī)定的培養(yǎng)條件培養(yǎng)硫化葉菌細(xì)胞培養(yǎng)物后，提取硫化葉菌細(xì)胞脂質(zhì)。所述提取過程可以以本領(lǐng)域公開的方式進(jìn)行。優(yōu)選地，將細(xì)胞在培養(yǎng)后進(jìn)行均質(zhì)化，優(yōu)選通過均質(zhì)化處理，特別是高壓均質(zhì)化處理或超聲處理，使得脂質(zhì)可從水性培養(yǎng)物中提取。本發(fā)明所述的純化脂質(zhì)的優(yōu)選方法是超臨界流體萃取，特別是用超臨界co2萃取(參見例如hanif等人，int.j.mol.sci.13(2012),3022-3037)。

47、在提取之前，優(yōu)選將均質(zhì)化的細(xì)胞與緩沖液混合，所述緩沖溶液例如本領(lǐng)域已知和記載的適用于硫化葉菌細(xì)胞脂質(zhì)提取的緩沖液，例如乙酸銨緩沖液，特別是濃度為100～200mm的乙酸銨緩沖液。