本發(fā)明涉及醫(yī)藥，特別是一種敗醬草總黃酮在制備治療局灶性腦缺血藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：局灶性腦缺血是指短暫性腦缺血發(fā)作(tia)，頸動(dòng)脈或椎-基底動(dòng)脈系統(tǒng)發(fā)生短暫性血液供應(yīng)不足，引起局灶性腦缺血導(dǎo)致突發(fā)的、短暫性、可逆性神經(jīng)功能障礙。發(fā)作持續(xù)數(shù)分鐘，通常在30分鐘內(nèi)完全恢復(fù)，超過2小時(shí)常遺留輕微神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，或ct及mri顯示腦組織缺血征象。tia好發(fā)于34～65歲，65歲以上占25.3％，男性多于女性。發(fā)病突然，多在體位改變、活動(dòng)過度、頸部突然轉(zhuǎn)動(dòng)或屈伸等情況下發(fā)病。發(fā)病無先兆，有一過性的神經(jīng)系統(tǒng)定位體征，一般無意識(shí)障礙，歷時(shí)5～20分鐘，可反復(fù)發(fā)作，但一般在24小時(shí)內(nèi)完全恢復(fù)，無后遺癥。敗醬草(拉丁學(xué)名：thlaspiarvenselinn.)，又叫菥蓂、遏藍(lán)菜，是罌粟目菥蓂屬下的植物，為草本植物，味辛、苦，用于中藥熬煮時(shí)有濃烈的腳臭味，有清熱解毒，祛瘀排膿等功效，用于闌尾炎、痢疾、腸炎、肝炎、眼結(jié)膜炎、產(chǎn)后瘀血腹痛、癰腫疔瘡。但至今未見有從敗醬草中提取的總黃酮在缺血治療治療局灶性腦缺血藥物中的應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種敗醬草總黃酮在制備治療局灶性腦缺血藥物中的應(yīng)用，可有效解決從敗醬草中提取敗醬草總黃酮，實(shí)現(xiàn)敗醬草總黃酮作為唯一活性成分在制備治療局灶性腦缺血藥物中的應(yīng)用問題。本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，一種敗醬草總黃酮在制備治療局灶性腦缺血藥物中的應(yīng)用，所述的敗醬草總黃酮是，將敗醬草粉碎成粗粉，乙醚回流提取脫脂，棄去乙醚；敗醬草藥渣揮干乙醚，加質(zhì)量濃度80％乙醇浸泡，回流提取，過濾，濾液減壓回收乙醇至無醇味，加蒸餾水分散至相當(dāng)于含生藥量0.3g/ml的分散液，分散液上ab-8型大孔吸附樹脂，先用蒸餾水洗脫，棄去水液；繼用質(zhì)量濃度10％乙醇洗脫，棄去洗脫液；再用質(zhì)量濃度80％乙醇洗脫，收集80％乙醇洗脫液，減壓回收乙醇至無醇味，冷凍干燥，粉碎，得敗醬草總黃酮。本發(fā)明可有效解決從敗醬草中提取敗醬草總黃酮，并有效用于治療局灶性腦缺血，開拓了敗醬草的新用途和藥用價(jià)值，是藥物上的一大創(chuàng)新，有顯著的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體情況為本發(fā)明的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說明。本發(fā)明在具體實(shí)施中，一種敗醬草總黃酮在制備治療局灶性腦缺血藥物中的應(yīng)用，所述的敗醬草總黃酮是，將敗醬草粉碎成過20-30目篩的粗粉，先加10倍重量的乙醚回流提取1h，脫脂，棄去乙醚；敗醬草藥渣揮干乙醚，加敗醬草10倍重量的、質(zhì)量濃度80％乙醇浸泡0.5h，回流提取1h，過濾，得第一次濾液；藥渣再加敗醬草10倍重量的、質(zhì)量濃度80％乙醇，回流提取1h，過濾，得第二次濾液，合并兩次濾液，減壓回收乙醇至無醇味，加蒸餾水分散至相當(dāng)于含生藥量0.3g/ml的分散液，分散液上ab-8型大孔吸附樹脂，先用2倍柱體積蒸餾水洗脫，棄去水液；繼用4倍柱體積的、質(zhì)量濃度10％乙醇洗脫，棄去洗脫液；再用6倍柱體積的、質(zhì)量濃度80％乙醇洗脫，收集80％乙醇洗脫液，減壓回收乙醇至無醇味，冷凍干燥，粉碎，得敗醬草總黃酮，敗醬草總黃酮質(zhì)量含量51％以上。本發(fā)明所制備的敗醬草總黃酮經(jīng)實(shí)驗(yàn)具有抗局灶性腦缺血之功效，有效用于制備治療局灶性腦缺血的藥物，是治療局灶性腦缺血藥物上的創(chuàng)新，并經(jīng)敗醬總黃酮對大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的影響實(shí)驗(yàn)取得了非常好的有益技術(shù)效果，有關(guān)實(shí)驗(yàn)資料如下：1材料1.1動(dòng)物wistar大鼠，spf級，雄性，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供。合格證號(hào)：37005400000023，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心許可證號(hào)：syxk(豫)2015-0005，倫理批號(hào)：dwll15010017，上崗證號(hào)：201302001。1.2藥品與試劑本發(fā)明敗醬總黃酮；尼莫地平片，亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：140861；腦絡(luò)通膠囊，吉林金寶藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：150401；生理鹽水，河南雙鶴華利藥業(yè)有限公司，批號(hào)c115052005-2；青霉素，華北制藥股份有限公司，批號(hào)：f4013504；甲醛溶液，分析純，煙臺(tái)市雙雙化工有限公司，批號(hào)：20150701；水合氯醛，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)20141025；醫(yī)用乙醇(酒精)，新鄉(xiāng)市三偉消毒制劑有限公司，批號(hào)：20150520；紅四氮唑(ttc)，中國華東師范大學(xué)化工廠(上海)，批號(hào)：04102711；磷酸氫二鈉，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20141110；磷酸二氫鈉，天津市化學(xué)試劑三廠，批號(hào)：20110108；細(xì)胞間粘附分子1(icam-1)elisa檢測試劑盒，r&d公司，批號(hào)：20150901a；白細(xì)胞介素-1β(il-1β)elisa檢測試劑盒，r&d公司，批號(hào)：20150901a；白細(xì)胞介素-6(il-6)elisa檢測試劑盒，r&d公司，批號(hào)：20150901a；腫瘤壞死因子α(tnf-α)elisa檢測試劑盒，r&d公司，批號(hào)：20150901a；bcl-2相關(guān)x蛋白(bax)elisa檢測試劑盒，r&d公司，批號(hào)：20150801a；b細(xì)胞淋巴瘤因子2(bcl-2)elisa檢測試劑盒，r&d公司，批號(hào)：20150801a；半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)elisa檢測試劑盒，r&d公司，批號(hào)：20150901a；考馬斯亮藍(lán)試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20150821；超氧化物歧化酶(sod)檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20150821；丙二醛(mda)檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20150901；atp酶試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20150826；1.3儀器線栓，北京西濃生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品號(hào)：2838-a4；電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：fa2204b；電子稱：上海精密科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：yp1201n；臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)：長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司，型號(hào)：tdl-40b；恒溫水浴，上海一恒科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：hws12；酶標(biāo)儀，美國bio-rad公司，型號(hào)：biorad-680；可調(diào)式移液器，上海雷勃分析儀器有限公司。2方法2.1造模與給藥取健康大鼠98只，雄性，正常飼養(yǎng)3天，稱重并隨機(jī)分為7組，每組14只，分別為假手術(shù)組﹑模型組、尼莫地平組、腦絡(luò)通組、大、中、小劑量敗醬總黃酮組。尼莫地平組(陽性對照藥，給藥劑量為20mg/kg，相當(dāng)于臨床劑量的10倍)，腦絡(luò)通組(陽性對照藥，腦絡(luò)通，給藥劑量為500mg/kg，臨床用量的10倍)；大、中、小劑量敗醬總黃酮組(200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg)。假手術(shù)組及模型組分別灌胃同體積生理鹽水(各組灌胃體積均為2ml/100g)。每天給藥1次，連續(xù)給藥7d。于第6天晚上8點(diǎn)禁食不禁水，第7天上午8點(diǎn)分批稱重，給藥1h后，用10％水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉，用眼科剪在頸部正中偏左剪口，逐層分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(cca)并穿兩根線備用，分離頸外動(dòng)脈(eca)穿一根線備用，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端，遠(yuǎn)心端輕打一個(gè)小結(jié)以線栓能穿過為準(zhǔn)，于頸總動(dòng)脈距離分叉約5mm處剪開約0.2mm寬的小口，將線栓插入，經(jīng)頸總動(dòng)脈分叉部進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，向上深入至分叉以上18-20mm，直至有阻力，即阻斷大腦中動(dòng)脈入口處，結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端，2h后輕輕抽出栓線至略有阻力，實(shí)現(xiàn)再灌注，建立大腦中動(dòng)脈阻塞-再灌注(mcao)動(dòng)物模型。假手術(shù)組僅暴露左側(cè)血管，不做插線處理，手術(shù)過程中保持室溫23～25℃。2.2檢測指標(biāo)和檢測方法2.2.1神經(jīng)癥狀評分所有大鼠再灌注22h后，進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分(longa評分法)，評分標(biāo)準(zhǔn)：無神經(jīng)功能缺失癥狀，活動(dòng)正常：0分；不能完全伸展對側(cè)前爪：1分；爬行時(shí)出現(xiàn)向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈：2分；行走時(shí)，身體向偏癱側(cè)傾倒：3分；不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失：4分；死亡：5分。評分為0分和5分者剔除；2.2.2腦組織取材及處理大鼠斷頭后，迅速剝?nèi)∧X組織，放入-20℃低溫冰箱中冷卻15min，取出腦組織，去掉嗅球、小腦、低位腦干后的剩余部分，沿冠狀面切成3部分(第一部分為腦前極至視交叉冠狀面前1mm處，第二部分為視交叉冠狀面前后1mm處，約為2mm的薄片，第三部分為視交叉冠狀面后1mm處至尾端的腦組織)。2.2.3腦組織勻漿制備取第一部分腦組織，矢狀切取左側(cè)腦組織(插線栓側(cè))，生理鹽水清洗后，分析天平準(zhǔn)確稱量其重量，以生理鹽水(ml)：腦組織(g)＝9∶1的比例加入的冰冷的生理鹽水，在盛有冰塊的大燒杯中用玻璃勻漿器制成10％的腦勻漿，4℃、3000r/min離心10min，取上清液分裝，-20℃冰箱低溫保存，測定腦勻漿中il-6、il-1β、tnf-α、bcl-2、bax、casp-3、icam-1、atp酶、sod、mda水平。2.2.4腦梗死面積測定取第二部分腦切片迅速放入以ph＝7.2磷酸緩沖液配置的1％ttc溶液中，37℃避光孵育15min，其間翻動(dòng)一次，以利于腦切片雙面充分染色。染色后取出腦片，放置于10％福爾馬林溶液中避光保存并拍照，染色后未梗死的腦組織為玫瑰紅色，梗死的腦組織為白色。經(jīng)圖像分析系統(tǒng)分析并計(jì)算梗死區(qū)面積，求其占總面積的百分比。2.2.5he染色及免疫組織化學(xué)染色第三部分腦組織，常規(guī)石蠟包埋，進(jìn)行he染色，免疫組織化學(xué)染色法進(jìn)行ngf及nfκbp65染色。2.2.6腦組織中il-6、il-1β、tnf-α、bcl-2、bax、casp-3、icam-1的測定方法檢測原理、操作步驟：同實(shí)驗(yàn)一中神經(jīng)元烯醇化酶(nse)。2.2.7考馬斯亮藍(lán)蛋白定量側(cè)定方法樣品前處理：10％腦組織勻漿，用生理鹽水按1:4稀釋成2％的組織勻漿，待測?？瞻坠軜?biāo)準(zhǔn)管測定管雙蒸水(ml)0.050.563/l蛋白標(biāo)準(zhǔn)液(ml)0.05樣品(ml)0.05考馬斯亮藍(lán)顯色液(ml)3.03.03.0加入各管相對應(yīng)試劑后混勻，靜置10min，蒸餾水調(diào)零，1cm光徑，于595nm處，測各管od值。計(jì)算公式2.2.8腦組織中atp酶的測定方法腦勻漿中atp酶測定操作順序表測試前a、b、c混合劑的配制管號(hào)a管液體量b管液體量c管液體量試劑一(μl)130×(n+2)130×(n+2)90×(n+2)試劑二(μl)40×(n+2)40×(n+2)40×(n+2)試劑三(μl)試劑四(μl)40×(n+2)40×(n+2)40×(n+2)試劑五(μl)40×(n+2)試劑六(μl)40×(n+2)40×(n+2)40×(n+2)混合試劑總量(μl)250×(n+2)250×(n+2)250×(n+2)每管應(yīng)吸液量(μl)250250250酶促反應(yīng)混勻，3000-4000r/min離心10min，取上清200μl定磷?；靹颍?7℃水浴30分鐘，冷卻至室溫，在660nm處，1cm光徑，蒸餾水調(diào)零比色。注：a管為對照管；b管為na+k+-atp酶管；c管為mg++-atp酶管；標(biāo)準(zhǔn)管濃度為0.5μmol/ml計(jì)算公式：組織中atp活力(μmolpi/mgprot/hour)＝(測定管od值－對照管od值)/標(biāo)準(zhǔn)管od值*標(biāo)準(zhǔn)管濃度×反應(yīng)體系中樣品稀釋倍數(shù)*6/勻漿蛋白濃度(mgprot/ml)2.2.9腦組織中sod的測定方法測定原理：黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶互相反應(yīng)后可產(chǎn)生超氧陰離子自由基，經(jīng)氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下可呈現(xiàn)出紫紅色，用紫外分光光度計(jì)測其吸光度。sod對超氧陰離子自由基有專一的抑制作用，形成的亞硝酸鹽減少，用比色法，測定管的吸光度值低于對照管的吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)管測定值建立公式，計(jì)算出被測樣品sod活力?？俿od(t-sod)活力的測定：混勻，室溫放置10分鐘，于波長50nm處，1cm光徑比色杯，蒸餾水調(diào)零，比色。組織勻漿中sod活力＝(對照管吸光度－測定管吸光度)/對照管吸光度/50％*反應(yīng)液總體積/取樣量(ml)/組織中蛋白濃度(mgprot/ml)mgprot為毫克蛋白數(shù)。2.2.10腦組織中mda的測定方法測定原理：過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)生中含有丙二酫(mda)，mda與硫代巴比妥酸(tba)縮合后可形成紅色產(chǎn)物，該產(chǎn)物在532nm處具有最大吸收峰。操作順序混勻后用保鮮薄膜扎緊試管口，95℃水浴40min后取出，流動(dòng)水冷卻，3500-4000r/min離心10min。用移液槍取上清液，1cm光徑532nm處，蒸餾水調(diào)零，調(diào)各管od值。組織中mda含量(nmol/mgprot)＝(測定管吸光度－測定空白管吸光度)*標(biāo)準(zhǔn)品濃度/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度－標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度)/蛋白含量(mgprot/ml)3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法數(shù)據(jù)分析用spss19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間比較采用單因素方差分析，方差檢驗(yàn)齊者用最小顯著差數(shù)(lsd)法，方差不齊者用games-howell法檢驗(yàn)，等級資料用radit檢驗(yàn)。4結(jié)果4.1對局灶性腦缺血再灌注大鼠模型死亡率和神經(jīng)功能缺失評分的影響(結(jié)果見表6)表6對局灶性腦缺血再灌注大鼠模型死亡率和神經(jīng)功能缺失評分的影響注：與模型組比，**p<0.01，*p<0.05由表6可以看出，模型組的死亡率最高，尼莫地平組、腦絡(luò)通組、大、中、小劑量敗醬總黃酮組大鼠的死亡率均有所降低，說明給藥各組均能不同程度降低局灶性腦缺血再灌注大鼠模型的死亡率，減少腦組織損傷，保護(hù)腦組織。與假手術(shù)組相比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺失評分顯著升高(p<0.01)，提示造模成功；與模型組比，腦絡(luò)通組、尼莫地平組、大劑量敗醬總黃酮組大鼠神經(jīng)功能缺失評分顯著降低(p<0.01)，中、小劑量敗醬總黃酮組大鼠神經(jīng)功能缺失評分明顯降低(p<0.05)，說明給藥各組具有不同程度的改善局灶性腦缺血再灌注大鼠腦神經(jīng)狀況的作用。4.2對局灶性腦缺血再灌注大鼠模型腦勻漿il-6、il-1β、tnf-α含量的影響(結(jié)果見表7)表7對局灶性腦缺血再灌注大鼠模型腦勻漿il-6、il-1β、tnf-α含量的影響注：與模型組比，**p<0.01，*p<0.05由表7可以看出，與假手術(shù)組比，局灶性缺血再灌注大鼠模型腦組織il-6、il-1β、tnf-α水平均顯著上升(p<0.01)，說明造模成功；與模型組比，尼莫地平組、腦絡(luò)通組、大劑量敗醬總黃酮組大鼠腦組織il-6水平顯著降低(p<0.01)，中、小劑量敗醬總黃酮組大鼠腦組織il-6水平明顯降低(p<0.05)；與模型組比，尼莫地平組、腦絡(luò)通組、大、中、小劑量敗醬總黃酮組大鼠腦組織il-1β水平顯著降低(p<0.01)；與模型組比，尼莫地平組、腦絡(luò)通組、大劑量敗醬總黃酮組大鼠腦組織tnf-α水平顯著降低(p<0.01)，中劑量敗醬總黃酮組大鼠腦組織tnf-α水平明顯降低(p<0.05)，小劑量敗醬總黃酮組大鼠腦組織tnf-α水平有降低趨勢(p＞0.05)。說明給藥各組具有降低局灶性缺血再灌注大鼠模型腦組織il-6、il-1β、tnf-α水平，減輕炎癥反應(yīng)對腦組織損傷的作用。4.3對局灶性腦缺血再灌注大鼠模型腦勻漿bax、bcl-2、casp-3含量的影響(結(jié)果見表8)表8對局灶性腦缺血再灌注大鼠模型腦勻漿bax、bcl-2、casp-3含量的影響注：與模型組比，**p<0.01，*p<0.05由表8可以看出，與假手術(shù)組比，模型組大鼠腦組織bax、caspase-3水平顯著升高(p<0.01)，bcl-2水平明顯升高(p<0.05)，說明造模成功；與模型組比，尼莫地平組、腦絡(luò)通組、大、中、小劑量敗醬總黃酮組大鼠腦組織bax水平顯著降低(p<0.01)；與模型組比，尼莫地平組、腦絡(luò)通組、大、中、小劑量敗醬總黃酮組大鼠腦組織bcl-2水平顯著升高(p<0.01)；與模型組比，尼莫地平組、腦絡(luò)通組、大、中劑量敗醬總黃酮組大鼠腦組織caspase-3水平顯著降低(p<0.01)，小劑量敗醬總黃酮組大鼠腦組織caspase-3水平明顯降低(p<0.05)，說明給藥各組能不同程度增加局灶性腦缺血大鼠模型腦組織中抑制細(xì)胞凋亡基因表達(dá)，降低促細(xì)胞凋亡基因表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)腦組織，緩解腦缺血癥狀。4.4對局灶性腦缺血再灌注大鼠模型腦梗死面積百分比、腦勻漿icam-1水平的影響(結(jié)果見表9)表9對局灶性腦缺血再灌注大鼠模型腦梗死面積百分比、腦勻漿icam-1水平的影響注：與模型組比，**p<0.01，*p<0.05由表9可以看出，與假手術(shù)組比，模型組大鼠腦組織icam-1水平、腦梗死面積百分比均顯著升高(p<0.01)，說明造模成功；與模型組比，尼莫地平組、腦絡(luò)通組、大劑量敗醬總黃酮組大鼠腦組織icam-1水平均顯著降低(p<0.01)，中、小劑量敗醬總黃酮組大鼠腦組織icam-1水平均明顯降低(p<0.05)；與模型組比，尼莫地平組、腦絡(luò)通組、大劑量敗醬總黃酮組大鼠腦梗死面積百分比顯著降低(p<0.01)，中劑量敗醬總黃酮組大鼠腦梗死面積百分比明顯降低(p<0.05)，小劑量敗醬總黃酮組大鼠腦梗死面積百分比有降低趨勢(p＞0.05)，說明給藥各組具有不同程度的降低局灶性腦缺血再灌注模型大鼠腦組織icam-1水平，減少腦梗死面積的作用。4.5對局灶性腦缺血再灌注大鼠模型腦勻漿na+-k+-atp酶活力和mg++-atp酶活力的影響(結(jié)果見表10)表10對局灶性腦缺血再灌注大鼠模型腦勻漿na+-k+-atp酶活力和mg++-atp酶活力的影響注：與模型組比，**p<0.01，*p<0.05由表10可以看出，與假手術(shù)組比，模型組大鼠腦組織na+-k+-atp酶和mg++-atp酶活力均顯著降低(p<0.01)，說明造模成功；與模型組比，尼莫地平組、腦絡(luò)通組、大劑量敗醬總黃酮組大鼠腦組織na+-k+-atp酶活力均顯著升高(p<0.01)，中、小劑量敗醬總黃酮組大鼠腦組織na+-k+-atp酶活力明顯升高(p<0.05)；尼莫地平組、腦絡(luò)通組、大、中、小劑量敗醬總黃酮組大鼠腦組織mg++-atp酶活力均顯著升高(p<0.01)，說明給藥各組均能不同程度升高局灶性腦缺血再灌注模型大鼠腦組織atp酶活力。4.6對局灶性腦缺血再灌注大鼠模型腦勻漿mda和sod水平的影響(結(jié)果見表11)表11對局灶性腦缺血再灌注大鼠模型腦勻漿mda和sod水平的影響注：與模型組比，**p<0.01，*p<0.05由以上表11可以看出，與假手術(shù)組相比較，模型組大鼠腦組織勻漿中mda含量顯著升高、sod含量顯著降低(p<0.01)，說明造模成功；與模型組相比，腦絡(luò)通組、尼莫地平組、大劑量敗醬總黃酮組腦組織中mda水平顯著降低(p<0.01)，中、小劑量敗醬總黃酮組腦組織中mda水平明顯降低(p<0.05)；腦絡(luò)通組、尼莫地平組、大、中劑量敗醬總黃酮組腦組織中sod水平顯著升高(p<0.01)，小劑量敗醬總黃酮組腦組織中sod水平明顯升高(p<0.05)，提示敗醬總黃酮可減輕局灶腦缺血模型大鼠腦組織過氧化反應(yīng)，保護(hù)腦組織。4.7對局灶性腦缺血再灌注大鼠模型腦組織ngf、nf-kbp65免疫陽性表達(dá)水平的影響(結(jié)果見表12)表12對局灶性腦缺血再灌注大鼠模型腦組織ngf、nf-kbp65免疫陽性表達(dá)水平的影響注：與模型組比，**p<0.01，*p<0.05由以上表12可以看出，與假手術(shù)組比，模型組大鼠腦組織ngf、nf-kbp65免疫陽性表達(dá)水平顯著升高(p<0.01)，說明造模成功；與模型組比，腦絡(luò)通組、尼莫地平組、大、中、小劑量敗醬總黃酮組大鼠腦組織ngf免疫陽性表達(dá)水平均顯著升高(p<0.01)；與模型組比，腦絡(luò)通組、尼莫地平組、大劑量敗醬總黃酮組大鼠腦組織nf-kbp65免疫陽性表達(dá)水平均顯著降低(p<0.01)，中劑量敗醬總黃酮組大鼠腦組織nf-kbp65免疫陽性表達(dá)水平均明顯降低(p<0.05)，小劑量敗醬總黃酮組大鼠腦組織nf-kbp65免疫陽性表達(dá)水平均有降低趨勢(p＞0.05)，說明各給藥組能夠促進(jìn)腦神經(jīng)細(xì)胞ngf表達(dá)，抑制nf-kbp65表達(dá)，預(yù)防大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞變性或死亡，從而維持腦神經(jīng)正常功能，減輕腦缺血再灌注所造成的損傷。4.8對局灶性腦缺血再灌注模型大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)的病理變化影響(結(jié)果見表14)對局灶性腦缺血再灌注模型大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)組織病理觀察(見附錄1)：假手術(shù)組大腦皮質(zhì)無水腫，神經(jīng)細(xì)胞正常；模型組大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞水腫，大片神經(jīng)元壞死，梗死面積占皮質(zhì)的2/3以上；腦絡(luò)通組大腦皮質(zhì)部分神經(jīng)細(xì)胞水腫，少數(shù)神經(jīng)元壞死，梗死面積占皮質(zhì)的1/3以內(nèi)；尼莫地平組大腦皮質(zhì)部分神經(jīng)細(xì)胞水腫，少數(shù)神經(jīng)元壞死，梗死面積占皮質(zhì)的1/3以內(nèi)；大劑量敗醬總黃酮組大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞水腫，少數(shù)神經(jīng)元壞死，梗死面積占皮質(zhì)的1/3以內(nèi)；中劑量敗醬總黃酮組大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞水腫，少數(shù)神經(jīng)元壞死，梗死面積占皮質(zhì)的1/3～2/3以內(nèi)；小劑量敗醬總黃酮組大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞水腫，大片神經(jīng)元壞死，梗死面積占皮質(zhì)的1/3～2/3以內(nèi)。表13對局灶性腦缺血再灌注模型大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)病理變化的影響“—”大腦皮質(zhì)無水腫，神經(jīng)細(xì)胞正常；“+”大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞水腫，少數(shù)神經(jīng)元壞死，梗死面積占皮質(zhì)的1/3以內(nèi)；“++”大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞水腫，成片神經(jīng)元壞死，梗死面積占皮質(zhì)的1/3～2/3以內(nèi)；“+++”大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞水腫，大片神經(jīng)元壞死，梗死面積占皮質(zhì)的2/3以上。經(jīng)ridit檢驗(yàn)，與假手術(shù)組比，模型組有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)，說明模型組大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)出現(xiàn)顯著的病理變化，造模成功；與模型組比，腦絡(luò)通組、尼莫地平組有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)；大、中、小劑量敗醬總黃酮組有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，說明各給藥組能不同程度的改善局造性腦缺血再灌注模型大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)的病理損傷程度，保護(hù)腦組織。4.9對局灶性腦缺血再灌注大鼠模型腦組織海馬區(qū)病理變化的影響(結(jié)果見表15)對局灶性腦缺血再灌注模型大鼠腦組織海馬區(qū)組織病理觀察如下：假手術(shù)組大腦海馬組織無水腫，神經(jīng)細(xì)胞正常；模型組大腦海馬組織水腫，大片神經(jīng)元壞死，梗死面積占海馬組織的2/3以上；腦絡(luò)通組大腦海馬組織水腫，少數(shù)神經(jīng)元壞死，梗死面積占海馬組織的1/3以內(nèi)；尼莫地平組大腦海馬組織水腫，少數(shù)神經(jīng)元壞死，梗死面積占海馬組織的1/3以內(nèi)；大劑量敗醬總黃酮組大腦海馬組織水腫，少數(shù)神經(jīng)元壞死，梗死面積占海馬組織的1/3以內(nèi)；中劑量敗醬總黃酮組大腦海馬組織水腫，少數(shù)神經(jīng)元壞死，梗死面積占海馬組織的1/3～2/3以內(nèi)；小劑量敗醬總黃酮組大腦海馬組織水腫，成片神經(jīng)元壞死，梗死面積占海馬組織的1/3～2/3以內(nèi)。表14對局灶性腦缺血再灌注模型大鼠腦組織海馬區(qū)病理變化的影響“—”大腦海馬組織無水腫，神經(jīng)細(xì)胞正常；“+”大腦海馬組織水腫，少數(shù)神經(jīng)元壞死，梗死面積占海馬組織的1/3以內(nèi)；“++”大腦海馬組織水腫，成片神經(jīng)元壞死，梗死面積占海馬組織的1/3～2/3以內(nèi)；“+++”大腦海馬組織水腫，大片神經(jīng)元壞死，梗死面積占海馬組織的2/3以上。經(jīng)ridit檢驗(yàn)，與假手術(shù)組比，模型組有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)，說明模型組大鼠腦組織海馬區(qū)出現(xiàn)顯著的病理變化，造模成功；與模型組比，腦絡(luò)通組、尼莫地平組劑量具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)；大、中、小劑量敗醬總黃酮組有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，說明各給藥組能不同程度的改善局造性腦缺血再灌注模型大鼠腦組織海馬區(qū)的病理損傷程度，保護(hù)腦組織。5結(jié)論通過觀察敗醬總黃酮對大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的神經(jīng)功能缺失評分、死亡率、腦梗死面積百分比、腦組織中il-6、il-1β、tnf-α、bcl-2、bax、casp-3、icam-1、atp酶、sod、mda水平、ngf及nf-kbp65表達(dá)以及腦組織病理損傷變化的影響，提示敗醬總黃酮可以降低動(dòng)物神經(jīng)功能缺失評分、死亡率、腦梗死面積百分比，對腦組織和神經(jīng)元具有保護(hù)作用，降低腦組織中il-6、il-1β、icam-1、tnf-α水平，抑制缺血再灌注后炎癥反應(yīng)，減少炎癥引起的一系列級聯(lián)反應(yīng)釋放的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子；減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低腦部mda含量，升高腦部sod含量，保護(hù)腦組織；升高腦組織中atp酶水平，改善因能量代謝障礙對缺血腦組織的損傷；降低腦組織中bax、caspase-3水平，顯著升高腦組織bcl-2水平，抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞；促進(jìn)腦組織ngf陽性表達(dá)，抑制腦組織nf-kbp65陽性表達(dá)，保護(hù)神經(jīng)元，腦細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制被激活，減輕腦缺血再灌注損傷，以大劑量敗醬總黃酮組為最佳。在動(dòng)物試驗(yàn)確保安全的基礎(chǔ)上，在臨床上進(jìn)行了對比試驗(yàn)，對比組采用氯吡格雷，試驗(yàn)組采用敗醬草總黃酮加氯吡格雷，有關(guān)試驗(yàn)情況如下：敗醬草總黃酮加氯吡格雷治療短暫腦缺血60例選擇符合全國第四次腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議制訂的短暫腦缺血診斷標(biāo)準(zhǔn):即為短暫的、可逆的、局部的腦血液循環(huán)障礙，可反復(fù)發(fā)作，少者1～2次，多至數(shù)十次，每次發(fā)作持續(xù)時(shí)間通常在數(shù)分鐘至1h左右，癥狀和體征應(yīng)該在24h內(nèi)完全消失。abcd2評分標(biāo)準(zhǔn):年齡＞60歲(1分)；血壓為收縮壓＞140mmhg或舒張壓＞90mmhg(1分)；臨床癥狀為單側(cè)無力(2分)，不伴無力的言語障礙(1分)；癥狀持續(xù)時(shí)間＞60min(2分)，10～59min(1分)；患有糖尿病(1分)。危險(xiǎn)分層:0～3分為低危組；4～5分為中危組；6～7分為高危組。選擇abcd2評分標(biāo)準(zhǔn)在低危層的患者60人，隨機(jī)分為2組，每組30人，對照組口服氯吡格雷(商品名為波立維，75mg/片，法國賽諾菲公司)，每次75mg，1d1次，首劑300mg。治療組除按對照組方法服用氯吡格雷外，加用敗醬草總黃酮(敗醬草總黃酮制成膠囊，每粒0.3g，每次2粒，每天2次。以上兩組均治療30d，治療期間常規(guī)調(diào)控血壓及血糖，停用其他能夠影響凝血功能的藥物。氯吡格雷組與氯吡格雷加敗醬草總黃酮組7d內(nèi)短暫腦缺血發(fā)作終止的例數(shù)分別為24例、27例，7d內(nèi)短暫腦缺血發(fā)作終止時(shí)的時(shí)間分別為(9.66±1.21)d、(0.50±1.06)d，7d后仍有發(fā)作的例數(shù)分別為6例、3例，30d內(nèi)短暫腦缺血加重的例數(shù)均為0例。敗醬草總黃酮加氯吡格雷對短暫腦缺血患者的總體療效優(yōu)于常規(guī)氯吡格雷治療組。從上述實(shí)驗(yàn)中可以清楚的看出，本發(fā)明從敗醬草中提取的敗醬草總黃酮具有抗腦缺血之功效，有效用于制備治療反復(fù)局灶性腦缺血的藥物，實(shí)現(xiàn)敗醬草總黃酮在制備治療局灶性腦缺血藥物中的應(yīng)用，其制備方法簡單，易操作，開拓了敗醬草新的藥用價(jià)值和商業(yè)價(jià)值，是治療局灶性腦缺血藥物上的創(chuàng)新，經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益顯著。當(dāng)前第1頁12