本發(fā)明涉及一種具有抗炎、提高免疫力，用于輔助放化療的組合物。

背景技術(shù)：

根據(jù)2017年2月國(guó)家癌癥中心發(fā)布的中國(guó)最新癌癥數(shù)據(jù)，對(duì)比2012年，2013年癌癥新發(fā)人數(shù)從368萬(wàn)增加至365萬(wàn)，增幅達(dá)到3％，占世界癌癥新發(fā)病例的四成。癌癥已成為人類生命健康的一大威脅。

機(jī)體的免疫系統(tǒng)可以識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞。在免疫選擇壓力下，腫瘤細(xì)胞由于其高突變的特性可以逃避免疫監(jiān)視，甚至對(duì)機(jī)體的免疫反應(yīng)產(chǎn)生抑制，從而進(jìn)行失控性的快速增殖。臨床證據(jù)表明，腫瘤組織在臨床上處于免疫抑制環(huán)境，浸潤(rùn)免疫效應(yīng)細(xì)胞顯示出免疫功能不同程度的低下，甚至嚴(yán)重缺陷。

靈芝孢子油是利用超臨界二氧化碳流體萃取技術(shù)從破壁靈芝孢子中提取的脂質(zhì)物，富含多種活性成分。在免疫功能低下小鼠模型中，靈芝孢子油顯示有增強(qiáng)細(xì)胞因子分泌、表達(dá)，從而進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)的作用，能促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的轉(zhuǎn)化作用及遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，提高小鼠的抗體生成細(xì)胞和血清溶血素水平，并顯著提高nk細(xì)胞的活性。

角鯊烯是一種由六個(gè)異戊二烯連接而成的不飽和三萜類化合物，廣泛存在與多種生物體中。角鯊烯還是一種良好的免疫佐劑，能在顯示低毒性的前提下產(chǎn)生強(qiáng)有力的抗體反應(yīng)，誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫的發(fā)生。

灰樹(shù)花提取物從多孔菌科蕈菌灰樹(shù)花子實(shí)體中提取，其主要活性成分為灰樹(shù)花蛋白多糖。研究表明，灰樹(shù)花提取物對(duì)胃癌細(xì)胞株、hep3肝癌細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡的作用，還能誘導(dǎo)細(xì)胞周期在s期形成阻滯，并通過(guò)抑制pi3k和激活jnk信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬?；覙?shù)花提取物能抑制促炎介質(zhì)的產(chǎn)生和nf-κb信號(hào)通路的激活、激活巨噬細(xì)胞、促進(jìn)人多形核細(xì)胞的吞噬作用、提高人體外周血中nk細(xì)胞的免疫作用。

富硒酵母是一種有機(jī)硒源，酵母生長(zhǎng)時(shí)吸收的硒在體內(nèi)經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)與多糖的有機(jī)結(jié)合轉(zhuǎn)化為生物硒。研究表明，100-1500ngse/ml的富硒酵母可以增加乳腺癌細(xì)胞株的氧化應(yīng)激作用，并有抑制生長(zhǎng)、誘導(dǎo)凋亡的作用，但對(duì)非致瘤細(xì)胞并無(wú)影響。雙盲安慰劑對(duì)照臨床研究中，健康男性服用富硒酵母及安慰劑酵母后產(chǎn)生差異表達(dá)的蛋白參與補(bǔ)體與凝血途徑、免疫、脂質(zhì)代謝與胰島素抵抗，提示富硒酵母的攝入在以上方面有重要影響。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開(kāi)了一種具有具有抗炎、提高免疫力，用于輔助放化療的組合物。該組合物由以下質(zhì)量份的物質(zhì)組成：靈芝孢子油30-50份、角鯊烯10-30份、灰樹(shù)花提取物10-30份、富硒酵母1份。

所述的灰樹(shù)花提取物為以灰樹(shù)花為原料，采用水加熱提取后濃縮干燥得到的提取物；按質(zhì)量份計(jì)每份灰樹(shù)花提取物相當(dāng)于灰樹(shù)花干品原料6份。

優(yōu)選配比為：靈芝孢子油40份、角鯊烯20份、灰樹(shù)花提取物14份、富硒酵母1份。

經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明組合物具有顯著的抗炎和提高免疫作用，且安全無(wú)毒，特別適用于輔助放化療。該組方科學(xué)合理，各組分協(xié)同發(fā)揮抗炎和提高免疫作用，在同等藥效下，降低了組分的用量及用藥成本。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1各組合物的配制

取靈芝孢子油40克、角鯊烯20克、灰樹(shù)花提取物14克(每克相當(dāng)于灰樹(shù)花6克)、富硒酵母1克，混勻，即得受試樣品。

組合物a：取靈芝孢子油30克、角鯊烯10克、灰樹(shù)花提取物10克(每克相當(dāng)于灰樹(shù)花6克)、富硒酵母1克，混勻，即得組合物a。

組合物b：取靈芝孢子油50克、角鯊烯30克、灰樹(shù)花提取物30克(每克相當(dāng)于灰樹(shù)花6克)、富硒酵母1克，混勻，即得組合物b。

實(shí)施例2對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

阿司匹林組用樣品：實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水配成濃度為20mg/ml的溶液。

受試物高劑量組用樣品：加蒸餾水配成的0.3％的cmcna溶液，配成濃度為70mg/ml的混懸液。

受試物中劑量組用樣品：取“受試物高劑量組用樣品”加蒸餾水配成的0.3％的cmcna溶液，稀釋成濃度為35mg/ml的混懸液。

受試物低劑量組用樣品：取“受試物高劑量組用樣品”加蒸餾水配成的0.3％的cmcna溶液，稀釋成濃度為17.5mg/ml的混懸液。

組合物a組、組合物b組用樣品：分別加蒸餾水配成的0.3％的cmcna溶液，配成濃度為35mg/ml的混懸液。

靈芝孢子油、角鯊烯、灰樹(shù)花提取物、富硒酵母組用樣品：分別在實(shí)驗(yàn)前取各樣品加蒸餾水配成的0.3％的cmcna溶液，分別配成濃度為52mg/ml、52mg/ml、26mg/ml、1mg/ml的混懸液。

取nih小鼠，雄性，spf級(jí)，體重18～22g，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、受試物低、中、高劑量組、阿司匹林組、組合物a組、組合物b組、靈芝孢子油組、角鯊烯組、灰樹(shù)花提取物組、富硒酵母組，每組12只。實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水10h，然后各組按0.1ml/10g體重灌胃給藥，1次/d，共7d，其中正常對(duì)照組和模型組給等體積蒸餾水，末次給藥后30min，除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠于左耳正反兩面涂上二甲苯50μl致炎，致炎1h后脫頸椎處死動(dòng)物，用直徑9mm打孔器沖下左耳和右耳同一部位的圓片，于分析天平上稱重，以兩耳片重差值為炎癥腫脹度，并計(jì)算腫脹抑制率。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。受試物中劑量組耳廓重量差與模型組比較，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異(p＜0.05)；受試物中、高劑量組，組合物a組、組合物b組耳廓重量差與模型組比較，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有非常顯著性差異(p＜0.01)，提示受試物能抑制二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹，具有一定的抗炎作用。阿司匹林組耳廓重量差與模型組比較，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有非常顯著性差異(p＜0.01)。

表1受試物對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

注：與模型組比較：*p＜0.05；**p＜0.01。

例3對(duì)大鼠棉球肉芽腫的影響

阿司匹林組用樣品：實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水配成濃度為10mg/ml的溶液。

受試物高劑量組用樣品：加蒸餾水配成的0.3％的cmcna溶液，配成濃度為35mg/ml的混懸液。

受試物中劑量組用樣品：取“受試物高劑量組用樣品”加蒸餾水配成的0.3％的cmcna溶液，稀釋成濃度為17.5mg/ml的混懸液。

受試物低劑量組用樣品：取“受試物高劑量組用樣品”加蒸餾水配成的0.3％的cmcna溶液，稀釋成濃度為8.75mg/ml的混懸液。

組合物a組、組合物b組用樣品：分別加蒸餾水配成的0.3％的cmcna溶液，配成濃度為17.5mg/ml的混懸液。

靈芝孢子油、角鯊烯、灰樹(shù)花提取物、富硒酵母組用樣品：分別在實(shí)驗(yàn)前取各樣品加蒸餾水配成的0.3％的cmcna溶液，分別配成濃度為26mg/ml、26mg/ml、13mg/ml、0.5mg/ml的混懸液。

烏拉坦：化學(xué)純，實(shí)驗(yàn)前用生理鹽水配成濃度為0.25g/ml的溶液。

取sd大鼠120只，雄性，體重130～150g，清潔級(jí)。每只按1g/kg體重腹腔注射烏拉坦進(jìn)行麻醉。在各鼠的左右蹊部用碘酒消毒，75％乙醇脫碘后，各切開(kāi)1cm長(zhǎng)小口。將已稱重為30mg的滅菌脫脂棉球(直徑6.5mm～8.5mm)一個(gè)植入皮下。每個(gè)棉球加青霉素、鏈霉素各0.1mg(溶于0.2ml生理鹽水中)，以防感染。隨即縫合皮膚。將大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、阿司匹林組、受試物低、中、高劑量組、組合物a組、組合物b組、靈芝孢子油組、角鯊烯組、灰樹(shù)花提取物組、富硒酵母組，每組12只。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食不禁水10h，術(shù)后2h開(kāi)始按1ml/100g體重灌胃給藥，其中空白對(duì)照組給等體積蒸餾水，1次/d，共7d。在第8d殺死動(dòng)物，打開(kāi)原切口，將棉球連同周圍結(jié)締組織一起取出。剝出周圍已包裹肉芽組織的棉球，剔除脂肪組織。在60℃烘箱放置12h后稱重。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。受試物低劑量組的棉球肉芽腫凈重與空白對(duì)照組比較，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(p＜0.05)；受試物各劑量組、組合物a組、組合物b組，棉球肉芽腫凈重與空白對(duì)照組比較，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有非常顯著性差異(p＜0.01)。阿司匹林組棉球肉芽腫凈重與空白對(duì)照組比較，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有非常顯著性差異(p＜0.01)。

表2受試物對(duì)大鼠棉球肉芽腫的影響

注：與空白對(duì)照組比較：*p＜0.05；**p＜0.01。

實(shí)施例4對(duì)免疫功能低下小鼠血清溶血素的影響

阿司匹林組用樣品：實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水配成濃度為20mg/ml的溶液。

受試物高劑量組用樣品：加蒸餾水配成的0.3％的cmcna溶液，配成濃度為70mg/ml的混懸液。

受試物中劑量組用樣品：取“受試物高劑量組用樣品”加蒸餾水配成的0.3％的cmcna溶液，稀釋成濃度為35mg/ml的混懸液。

受試物低劑量組用樣品：取“受試物高劑量組用樣品”加蒸餾水配成的0.3％的cmcna溶液，稀釋成濃度為17.5mg/ml的混懸液。

組合物a組、組合物b組用樣品：分別加蒸餾水配成的0.3％的cmcna溶液，配成濃度為35mg/ml的混懸液。

靈芝孢子油、角鯊烯、灰樹(shù)花提取物、富硒酵母組用樣品：分別在實(shí)驗(yàn)前取各樣品加蒸餾水配成的0.3％的cmcna溶液，分別配成濃度為52mg/ml、52mg/ml、26mg/ml、1mg/ml的混懸液。

環(huán)磷酰胺(實(shí)驗(yàn)前用生理鹽水配成濃度為5mg/ml的溶液)、葡萄糖、檸檬酸鈉、檸檬酸、氯化鈉。

雞紅細(xì)胞懸液：無(wú)菌條件下雞翼下靜脈采血，放入相當(dāng)于雞血體積5倍的alsever’s液，4℃保存。臨用時(shí)用生理鹽水反復(fù)洗滌，離心3次，以恒定的血細(xì)胞比容數(shù)用生理鹽水配成5％雞紅細(xì)胞混懸液(alsever’s液的制備:葡萄糖2.05g，檸檬酸鈉0.80g，檸檬酸0.05g，氯化鈉0.42g，重蒸餾水加至1.0l，高壓滅菌，4℃保存)。

豚鼠血清：用心臟采血的方法取豚鼠全血，然后離心得到血清。

取昆明種小鼠132只，雌雄各半，spf級(jí)，體重18～22g，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、環(huán)磷酰胺造模組、受試物低、中、高劑量組、組合物a組、組合物b組、靈芝孢子油組、角鯊烯組、灰樹(shù)花提取物組、富硒酵母組，共11組，每組12只。實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水10h，然后按0.1ml/10g體重灌胃給藥，1次/d，共7d，其中正常對(duì)照組和環(huán)磷酰胺造模組給等體積蒸餾水。除正常對(duì)照組外，其余10組均于給藥的第3d至第5d腹腔注射環(huán)磷酰胺50mg/kg。在試驗(yàn)第1d每鼠腹腔注射5％雞紅細(xì)胞懸液0.2ml，刺激動(dòng)物免疫。末次給藥后1h，摘取動(dòng)物眼球取血，3000r/min離心10min，分離血清，用生理鹽水將血清稀釋100倍。取稀釋血清1ml，與5％雞紅細(xì)胞懸液0.5ml、10％豚鼠血清0.5ml混勻，在37℃水浴溫育30min，然后置0℃冰箱中中止反應(yīng)，將上述液體3000r/min離心10min，取上清液，于540nm處測(cè)定od值，另設(shè)不加小鼠血清的空白對(duì)照管調(diào)零。以樣品的od值代表血清溶血素水平。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。受試物各劑量組及組合物a組、組合物b組血清溶血素水平與環(huán)磷酰胺造模組比較，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異(p＜0.05)。

表3受試物對(duì)免疫功能低下小鼠血清溶血素的影響

注：與環(huán)磷酰胺模型組比較：*p＜0.05；**p＜0.01。

實(shí)施例5對(duì)免疫功能低下小鼠的碳粒廓清的影響

阿司匹林組用樣品：實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水配成濃度為20mg/ml的溶液。

受試物高劑量組用樣品：加蒸餾水配成的0.3％的cmcna溶液，配成濃度為70mg/ml的混懸液。

受試物中劑量組用樣品：取“受試物高劑量組用樣品”加蒸餾水配成的0.3％的cmcna溶液，稀釋成濃度為35mg/ml的混懸液。

受試物低劑量組用樣品：取“受試物高劑量組用樣品”加蒸餾水配成的0.3％的cmcna溶液，稀釋成濃度為17.5mg/ml的混懸液。

組合物a組、組合物b組用樣品：分別加蒸餾水配成的0.3％的cmcna溶液，配成濃度為35mg/ml的混懸液。

靈芝孢子油、角鯊烯、灰樹(shù)花提取物、富硒酵母組用樣品：分別在實(shí)驗(yàn)前取各樣品加蒸餾水配成的0.3％的cmcna溶液，分別配成濃度為52mg/ml、52mg/ml、26mg/ml、1mg/ml的混懸液。

環(huán)磷酰胺(實(shí)驗(yàn)前用生理鹽水配成濃度為5mg/ml的溶液)、碳酸鈉(實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水配成濃度為0.1％的碳酸鈉溶液)。

取昆明種小鼠165只，雌雄各半，spf級(jí)，體重18～22g，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、環(huán)磷酰胺造模組、受試物低、中、高劑量組、組合物a組、組合物b組、靈芝孢子油組、角鯊烯組、灰樹(shù)花提取物組、富硒酵母組共11組，每組15只，實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食不禁水10h，然后各組小鼠按0.1ml/10g體重灌胃給藥，1次/d，共7d，其中正常對(duì)照組和環(huán)磷酰胺造模組給等體積蒸餾水。除正常對(duì)照組外，其余10組均于給藥的第3d至第5d腹腔注射環(huán)磷酰胺50mg/kg。末次給藥后1h，各小鼠尾靜脈注射印度墨汁0.1ml/10g體重，注射后第2min(t1)、12min(t2)分別用肝素鈉潤(rùn)濕過(guò)的吸管從眼眶靜脈取血20μl，溶于2ml的0.1％碳酸鈉溶液中，搖勻，于680nm波長(zhǎng)處測(cè)od值，最后將小鼠放血處死，取肝脾稱其質(zhì)量，計(jì)算廓清指數(shù)、校正廓清指數(shù)。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表4。受試物中、高劑量組校正廓清指數(shù)與環(huán)磷酰胺造模組比較，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有非常顯著性差異(p＜0.01)。

表4受試物對(duì)免疫功能低下小鼠碳粒廓清的影響

注：與環(huán)磷酰胺造模組比較：*p＜0.05；**p＜0.01。

實(shí)施例6軟膠囊的制備

按優(yōu)選后的比例，稱取靈芝孢子油、角鯊烯、灰樹(shù)花提取物、富硒酵母，將灰樹(shù)花提取物、富硒酵母加入角鯊烯、靈芝孢子油中，邊放入邊攪拌混合得預(yù)混料液，將預(yù)混料置于膠體磨中研磨2～3次，使料液混懸均勻，混懸料液進(jìn)行抽真空脫氣(真空度為-0.06～-0.08mpa)至無(wú)氣泡，得到均勻的內(nèi)容物料液置容器內(nèi)備用；按比例稱取合格的明膠、甘油、純化水、巧克力棕，依次放入溶膠罐內(nèi)進(jìn)行化膠，開(kāi)啟蒸汽加熱閥門，待溫度升高后，開(kāi)啟攪拌機(jī)開(kāi)始攪拌，攪拌1.5～2小時(shí)，溫度為70℃～80℃，待罐內(nèi)膠液全部溶解后，打開(kāi)真空泵進(jìn)行抽空(真空度為-0.06～-0.08mpa)，當(dāng)罐內(nèi)膠液無(wú)氣泡時(shí)，用100目濾布過(guò)濾后置貯膠罐中60±5℃保溫備用；配料、膠液通過(guò)軟膠囊機(jī)制成軟膠囊，內(nèi)容物裝量600mg/粒。將壓制好的軟膠囊進(jìn)行定型處理，室內(nèi)溫度控制在18～26℃，濕度控制在30～40％；將定型后的軟膠囊用95％的食用乙醇洗丸，除去軟膠囊表面的油污等，待膠丸表面光潔，置于潔凈干燥室內(nèi)，靜態(tài)干燥，選丸，分裝即得。

實(shí)驗(yàn)例7急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)與30天喂養(yǎng)試驗(yàn)

由南京醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生分析測(cè)試中心，按《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版)進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果(檢驗(yàn)報(bào)告bg-gz01020140042-1)表明：

對(duì)實(shí)驗(yàn)例6制備而的軟膠囊雌、雄性小鼠急性經(jīng)口mtd大于18400mg/kg·bw,根據(jù)急性毒性劑量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，該樣品屬無(wú)毒級(jí)。

30天喂養(yǎng)試驗(yàn)，給予人體推薦劑量雌性為128倍，雄性為116倍，受試動(dòng)物一般情況良好、體重、食物利用率、臟器重量、臟器系數(shù)均無(wú)異常改變，血液學(xué)指標(biāo)及生化指標(biāo)結(jié)果顯示，各項(xiàng)指標(biāo)均在正常范圍，各臟器病理組織學(xué)檢查均未見(jiàn)與受試樣品有關(guān)的病理改變。

實(shí)施例8ames試驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)與小鼠精子畸形試驗(yàn)

由南京醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生分析測(cè)試中心，按《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版)進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果(檢驗(yàn)報(bào)告bg-gz01020140042-2)表明：

(1)實(shí)施6所制軟膠囊內(nèi)容物對(duì)鼠傷寒沙門氏菌ta97、ta98、ta100、ta102四菌株試驗(yàn)菌株，在加與不加s-9(多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)的大鼠肝s-9)時(shí)，晚未見(jiàn)有致基因突變作用。

(2)未見(jiàn)到對(duì)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核形成吸嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞比值(pce/nce)產(chǎn)生影響。

(3)對(duì)小鼠精子畸形率未產(chǎn)生影響。