本發(fā)明涉及中成藥工藝
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種抗肝腫瘤靈芝粉及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：靈芝又稱仙草，是擔(dān)子菌綱(basidiomycetes)多孔菌目(polyporales)多孔菌科(polyporaceae)靈芝屬(ganodermae)真菌，是傳統(tǒng)珍貴藥材，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中，被列為上品。靈芝作為藥用真菌已被《中國藥典》(2015版)和《美國草藥藥典》收錄。靈芝性溫、味甘，有補(bǔ)中益氣、滋外強(qiáng)壯、扶正固本之功效，主治虛勞、咳嗽、氣喘、失眠、消化不良?，F(xiàn)代藥理和臨床研究表明，靈芝在抗肝腫瘤，抗病毒，調(diào)節(jié)血糖，增強(qiáng)免疫力等方面均具有顯著的作用。靈芝被譽(yù)為“生物活性化合物的細(xì)胞工廠”，國內(nèi)外科學(xué)家已經(jīng)從靈芝中分離得到400多種活性成分，其中三萜和多糖是靈芝的主要活性成分。靈芝多糖是靈芝中最有效的成分之一，目前從靈芝中已分離到的靈芝多糖有200多種，其中大部分為β-葡聚糖，少數(shù)為α-葡聚糖，多糖鏈由三股單糖鏈構(gòu)成。靈芝多糖在熱水中溶解，大多存在于靈芝細(xì)胞內(nèi)壁。靈芝多糖能夠通過提高機(jī)體免疫力來抑制腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散增殖，具有廣譜抑制瘤作用，是臨床治療腫瘤的良好輔助藥物。靈芝三萜是靈芝中另一類有效成分。目前，從靈芝中分離得到的三萜類化合物達(dá)170余種。與靈芝多糖不同的是，靈芝三萜能夠抑制腫瘤細(xì)胞的分裂與增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡、抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，以及輔助常規(guī)治療等方法發(fā)揮抗肝腫瘤作用。靈芝三萜類是靈芝菌絲體的代謝產(chǎn)物。因此，由靈芝菌絲體發(fā)酵生產(chǎn)制成的產(chǎn)品，由于沒有經(jīng)過子實(shí)體成熟過程，三萜類化合物含量很低。同時，未成熟子實(shí)體內(nèi)三萜類化合物含量也不高。此外，靈芝子實(shí)體含有鎂、鈣和鍺等多種微量元素。靈芝對鍺的富集能力較強(qiáng)，有機(jī)鍺的含量是人參的4-6倍、枸杞的100倍，它能增強(qiáng)人體血液供氧量，能增強(qiáng)人體血液吸氧的能力達(dá)1.5倍以上，促進(jìn)血液新陳代謝，消除體內(nèi)自由基，防止細(xì)胞老化；可以從癌細(xì)胞中奪取電，使其電位下降，從而抑制癌細(xì)胞惡化和擴(kuò)散。靈芝多糖與三萜都具有抗肝腫瘤功效，但其作用機(jī)制不同。因此，通過靈芝多糖與靈芝三萜按比例結(jié)合，配合手術(shù)、放療或者化療，在進(jìn)一步提升治療效果的同時，有望實(shí)現(xiàn)“零毒化療”。目前，靈芝食用方式有：(1)以靈芝子實(shí)體片燉湯、煎水或泡酒。靈芝子實(shí)體中靈芝三萜含量不高，且沒有破壁分所的靈芝子實(shí)體，靈芝多糖利用率較低。(2)以靈芝孢子粉或靈芝孢子油直接服用。靈芝孢子粉或靈芝孢子油是目前市面上的主流產(chǎn)品，該類產(chǎn)品大多宣稱含有較高含量的靈芝三萜，而忽略了靈芝多糖，無法發(fā)揮靈芝多糖的免疫調(diào)節(jié)作用。(3)以靈芝多糖提取物直接服用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：鑒以此，本發(fā)明提出一種抗肝腫瘤靈芝粉，解決了有效成分含量低、抗肝腫瘤效果差的作用。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：本發(fā)明提供的一種抗肝腫瘤靈芝粉，由以下重量百分比的組分組成：靈芝超微粉10％～25％、靈芝提取物粉25％～40％和靈芝破壁孢子粉40％～60％。優(yōu)選地，由以下重量百分比的組分組成：靈芝超微粉17.5％、靈芝提取物粉32.5％和靈芝破壁孢子粉50％。本發(fā)明提供的一種抗肝腫瘤靈芝粉的制備方法，包括以下步驟：(1)制備靈芝超微粉：取成熟的靈芝子實(shí)體，破壁粉碎后過篩，粉碎溫度為-25℃～-5℃，粉碎時間10min～30min。(2)制備靈芝提取物粉：取靈芝加水煎煮，過濾，在壓力為0.1mpa～0.5mpa下進(jìn)行減壓濃縮，噴霧干燥至含水量為1％～5％，粉碎過篩。(3)制備靈芝破壁孢子粉：取靈芝孢子，干燥粉碎，過800～1000目篩。(4)混勻：將制備得的靈芝超微粉、靈芝提取物粉和靈芝破壁孢子粉進(jìn)行混合，得混合料。(5)制劑：將混合料制備成膠囊劑、散劑、顆粒劑、片劑、口服液。優(yōu)選地，所述步驟(1)中，粉碎后過600～800目篩。優(yōu)選地，所述步驟(2)中，粉碎后過70～100目篩。優(yōu)選地，所述步驟(2)中，過濾濃縮至相對密度為1.10～1.15。優(yōu)選地，所述步驟(3)中，干燥溫度為40℃～60℃。優(yōu)選地，所述步驟(3)中，所述靈芝超微粉、靈芝提取物粉和靈芝破壁孢子粉的質(zhì)量比為8～10：4～8：1～3。本發(fā)明提供的一種抗肝腫瘤靈芝粉在制備抗肝腫瘤藥物中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：靈芝多糖與三萜都具有抗腫瘤功效，但其作用機(jī)制不同。靈芝多糖的抑瘤的作用途徑主要有以下幾方面：增強(qiáng)人體免疫功能，提高機(jī)體抗腫瘤作用；活化巨噬細(xì)胞；活化淋巴細(xì)胞；影響腫瘤細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)分化；影響腫瘤細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)；抑制腫瘤細(xì)胞的核酸和蛋白質(zhì)合成；影響癌基因；促進(jìn)細(xì)胞因子分泌；活化補(bǔ)體等。靈芝三萜是一種有效的腫瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，能夠通過誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡而達(dá)到治療腫瘤的目的。因此，以靈芝破壁孢子粉為主要組成成分(含有較高含量的靈芝三萜)加上靈芝提取物粉(含有較高含量的靈芝多糖)，再配以靈芝超微粉(恰好成熟的子實(shí)體中靈芝三萜和靈芝多糖以及其他微量元素，補(bǔ)充了靈芝孢子破壁粉和靈芝提取物粉中成分的不足)，以上三者通過一定的比例混合，使靈芝多糖和靈芝三萜達(dá)到一定的比例范圍，其中靈芝三萜主要誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，靈芝多糖增加機(jī)體免疫作用，協(xié)同發(fā)揮抗肝腫瘤作用，從而增強(qiáng)其抗肝腫瘤活性。具體實(shí)施方式為了更好理解本發(fā)明技術(shù)內(nèi)容，下面提供具體實(shí)施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1一種抗肝腫瘤靈芝粉，由以下重量的組分組成：靈芝超微粉20g、靈芝提取物粉30g和靈芝破壁孢子粉50g。所述抗肝腫瘤靈芝粉的制備方法，包括以下步驟：(1)制備靈芝超微粉：取成熟的靈芝子實(shí)體，破壁粉碎，粉碎溫度為-25℃，粉碎時間為10min，再過600目篩。(2)制備靈芝提取物粉：取靈芝加水煎煮1h，過濾后在壓力為0.1mpa下進(jìn)行減壓濃縮，濃縮至相對密度為1.10，在溫度為40℃下進(jìn)行噴霧干燥，干燥至含水量為1％，再粉碎過70目篩。(3)制備靈芝破壁孢子粉：取靈芝孢子，干燥粉碎，過800目篩。(4)混勻：將制備得的靈芝超微粉、靈芝提取物粉和靈芝破壁孢子粉進(jìn)行混合，得混合料。(5)制劑：將混合料制備成膠囊劑。實(shí)施例2一種抗肝腫瘤靈芝粉，由以下重量的組分組成：靈芝超微粉15g、靈芝提取物粉25g和靈芝破壁孢子粉60g。所述抗肝腫瘤靈芝粉的制備方法，包括以下步驟：(1)制備靈芝超微粉：取成熟的靈芝子實(shí)體，破壁粉碎，粉碎溫度為-5℃，粉碎時間為30min，再過800目篩。(2)制備靈芝提取物粉：取靈芝加水煎煮2h，過濾后在壓力為0.5mpa下進(jìn)行減壓濃縮，濃縮至相對密度為1.15，在溫度為60℃下進(jìn)行噴霧干燥，干燥至含水量為5％，再粉碎過100目篩。(3)制備靈芝破壁孢子粉：取靈芝孢子，干燥粉碎，過1000目篩。(4)混勻：將制備得的靈芝超微粉、靈芝提取物粉和靈芝破壁孢子粉進(jìn)行混合，得混合料。(5)制劑：將混合料制備成散劑。實(shí)施例3一種抗肝腫瘤靈芝粉，由以下重量的組分組成：靈芝超微粉15g、靈芝提取物粉40g和靈芝破壁孢子粉45g。所述抗肝腫瘤靈芝粉的制備方法，包括以下步驟：(1)制備靈芝超微粉：取成熟的靈芝子實(shí)體，破壁粉碎，粉碎溫度為-20℃，粉碎時間為15min，再過700目篩。(2)制備靈芝提取物粉：取靈芝加水煎煮1h，過濾后在壓力為0.2mpa下進(jìn)行減壓濃縮，濃縮至相對密度為1.2，在溫度為45℃下進(jìn)行噴霧干燥，干燥至含水量為2％，再粉碎過80目篩。(3)制備靈芝破壁孢子粉：取靈芝孢子，干燥粉碎，過800目篩。(4)混勻：將制備得的靈芝超微粉、靈芝提取物粉和靈芝破壁孢子粉進(jìn)行混合，得混合料。(5)制劑：將混合料制備成顆粒劑。實(shí)施例4一種抗肝腫瘤靈芝粉，由以下重量的組分組成：靈芝超微粉20g、靈芝提取物粉25g和靈芝破壁孢子粉55g。所述抗肝腫瘤靈芝粉的制備方法，包括以下步驟：(1)制備靈芝超微粉：取成熟的靈芝子實(shí)體，破壁粉碎，粉碎溫度為-10℃，粉碎時間為25min，再過700目篩。(2)制備靈芝提取物粉：取靈芝加水煎煮2h，過濾后在壓力為0.3mpa下進(jìn)行減壓濃縮，濃縮至相對密度為1.13，在溫度為55℃下進(jìn)行噴霧干燥，干燥至含水量為4％，再粉碎過90目篩。(3)制備靈芝破壁孢子粉：取靈芝孢子，干燥粉碎，過900目篩。(4)混勻：將制備得的靈芝超微粉、靈芝提取物粉和靈芝破壁孢子粉進(jìn)行混合，得混合料。(5)制劑：將混合料制備成片劑。實(shí)施例5一種抗肝腫瘤靈芝粉，由以下重量的組分組成：靈芝超微粉17.5g、靈芝提取物粉32.5g和靈芝破壁孢子粉50g。所述抗肝腫瘤靈芝粉的制備方法，包括以下步驟：(1)制備靈芝超微粉：取成熟的靈芝子實(shí)體，破壁粉碎，粉碎溫度為-15℃，粉碎時間為20min，再過800目篩。(2)制備靈芝提取物粉：取靈芝加水煎煮2h，過濾后在壓力為0.5mpa下進(jìn)行減壓濃縮，濃縮至相對密度為1.15，在溫度為50℃下進(jìn)行噴霧干燥，干燥至含水量為3％，再粉碎過80目篩。(3)制備靈芝破壁孢子粉：取靈芝孢子，干燥粉碎，過900目篩。(4)混勻：將制備得的靈芝超微粉、靈芝提取物粉和靈芝破壁孢子粉進(jìn)行混合，得混合料。(5)制劑：將混合料制備成膠囊劑。上述靈芝粉在制備抗肝腫瘤藥物中的應(yīng)用。所述制劑還可制備成其它的醫(yī)藥學(xué)上的劑型。為了進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果，做了以下實(shí)驗(yàn)：一、設(shè)置對照組對照組1該對照組與實(shí)施例5的區(qū)別在于：所述靈芝粉由以下重量的組分組成：靈芝提取物粉20g和靈芝破壁孢子粉80g。所述抗肝腫瘤靈芝粉的制備方法，包括以下步驟：(1)制備靈芝提取物粉：取靈芝加水煎煮2h，過濾后在壓力為0.5mpa下進(jìn)行減壓濃縮，濃縮至相對密度為1.15，在溫度為50℃下進(jìn)行噴霧干燥，干燥至含水量為3％，再粉碎過80目篩。(2)制備靈芝破壁孢子粉：取靈芝孢子，干燥粉碎，過900目篩。(4)混勻：將制備得的靈芝提取物粉和靈芝破壁孢子粉進(jìn)行混合，得混合料。(5)制劑：將混合料制備成膠囊劑。對照組2該對照組與實(shí)施例5的區(qū)別在于：所述靈芝粉由以下重量的組分組成：靈芝超微粉30g和靈芝破壁孢子粉70g。所述抗肝腫瘤靈芝粉的制備方法，包括以下步驟：(1)制備靈芝超微粉：取成熟的靈芝子實(shí)體，破壁粉碎，粉碎溫度為-15℃，粉碎時間為20min，再過800目篩。(2)制備靈芝提取物粉：取靈芝加水煎煮2h，過濾后在壓力為0.5mpa下進(jìn)行減壓濃縮，濃縮至相對密度為1.15，在溫度為50℃下進(jìn)行噴霧干燥，干燥至含水量為3％，再粉碎過80目篩。(3)混勻：將制備得的靈芝超微粉和靈芝破壁孢子粉進(jìn)行混合，得混合料。(4)制劑：將混合料制備成膠囊劑。檢測實(shí)施例1～5、對照組1、對照組2的有效成分：組別多糖含量(％)三萜含量(％)實(shí)施例113.653.62實(shí)施例214.083.58實(shí)施例313.923.65實(shí)施例414.103.62實(shí)施例514.173.68對照組19.123.02對照組210.322.86其中實(shí)施例5制備的靈芝粉與孢子粉、提取物粉、超微粉的主要有效成分含量：靈芝多糖的抑瘤的作用途徑主要有以下幾方面：增強(qiáng)人體免疫功能，提高機(jī)體抗腫瘤作用；活化巨噬細(xì)胞；活化淋巴細(xì)胞；影響腫瘤細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)分化；影響腫瘤細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)；抑制腫瘤細(xì)胞的核酸和蛋白質(zhì)合成；影響癌基因；促進(jìn)細(xì)胞因子分泌；活化補(bǔ)體等。靈芝三萜是一種有效的腫瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，能夠通過誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡而達(dá)到治療腫瘤的目的。雖然本發(fā)明制備的超微粉中多糖和三萜的含量比例最高，但是三萜的含量是最少的，因此，發(fā)揮不出抑制腫瘤的良好效果；提取物粉的三萜含量雖然最高，相比于產(chǎn)品中的多糖含量卻是低的，發(fā)揮不出增強(qiáng)免疫力抑制腫瘤的良好效果。產(chǎn)品中靈芝三萜主要誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而靈芝多糖增加機(jī)體免疫作用，通過靈芝多糖和靈芝三萜達(dá)到一定的比例范圍，二者最優(yōu)含量比例3.9:1，使得二者協(xié)同發(fā)揮最優(yōu)抗肝腫瘤作用，從而增強(qiáng)其抗肝腫瘤活性。二、活性測試：本實(shí)驗(yàn)檢測了靈芝粉對小鼠肝癌細(xì)胞h22的細(xì)胞毒性。1、實(shí)驗(yàn)方法：(1)取對數(shù)生長的細(xì)胞，加入不含有fbs的培養(yǎng)液，培養(yǎng)6小時，調(diào)節(jié)細(xì)胞狀態(tài)使處于同一水平。(2)用0.25％的胰酶1ml消化2分鐘，1000rmp下離心5分鐘。(3)去除上清，加10％fbs重懸，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。(4)將h22稀釋至5×105cell/ml，96板每孔加入100μl細(xì)胞懸液進(jìn)行鋪板。外圈加入pbs，防止邊緣效應(yīng)。并設(shè)置對照組(加細(xì)胞，含血清培養(yǎng)基，mtt，dmso)和調(diào)零組(只加含血清的培養(yǎng)基，mtt和dmso)。(5)鋪板后24小時，加藥。藥物以及提取物事先用dmso溶解，并用10％fbs的1640稀釋到一定濃度(根據(jù)不同種細(xì)胞的耐受程度決定)。(6)加藥后24小時，加5mg/ml的mtt10μl，37℃5％co2孵育4小時后490nm下測量od值。(7)數(shù)據(jù)整理，藥物抑制率(％)＝od(對照)-od(實(shí)驗(yàn))/od(對照)-od(調(diào)零)。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)施例1～5制備靈芝粉的水提取物(濃度0.8mg/ml)對肝癌細(xì)胞的抑制率見下表：組別抑制率(％)實(shí)施例118.49實(shí)施例218.76實(shí)施例318.63實(shí)施例418.89實(shí)施例519.33由上表可知，本發(fā)明制備的靈芝粉對肝癌細(xì)胞具有一定的抑制效果，三種原料通過一定的配比，使得靈芝三萜和靈芝多糖的比例達(dá)到最優(yōu)，并且具有很好的抑制肝腫瘤細(xì)胞的效果。采用上述活性測試方法檢測上述對照組1、2的抑制效果，其中對照組1和2的抑制率分別為15.63％和14.14％。三、本發(fā)明用于臨床實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)1、尤先生，64歲，肝癌患者，2005年檢查結(jié)果顯示體內(nèi)肝腫瘤塊達(dá)7公分大小，手術(shù)后仍有殘留腫瘤塊，服用本品，10年沒有復(fù)發(fā)。2、林先生，59歲，2016年8月檢查發(fā)現(xiàn)肝腫瘤塊達(dá)8公分，2016年年底再次檢查腫瘤塊已達(dá)15公分，之后開始服用本品，6個月后，腫瘤塊沒有繼續(xù)擴(kuò)散，且腫瘤塊開始出現(xiàn)萎縮跡象。3、尤先生，73歲，2016年年底體檢時發(fā)現(xiàn)體內(nèi)肝腫瘤塊3.5公分，遂開始服用本品，6個月后沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤擴(kuò)散。綜上所述，采用本發(fā)明所提供的以靈芝破壁孢子粉為主要組成成分(含有較高含量的靈芝三萜)加上靈芝提取物粉(含有較高含量的靈芝多糖)，再配以靈芝超微粉(恰好成熟的子實(shí)體中靈芝三萜和靈芝多糖以及其他微量元素，補(bǔ)充了靈芝孢子破壁粉和靈芝提取物粉中成分的不足)，以上三者通過一定的比例混合，使靈芝多糖和靈芝三萜達(dá)到一定的比例范圍，協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用，從而增強(qiáng)其抗肝腫瘤活性。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12