本發(fā)明涉及一種植物提取物，具體涉及一種歐洲越橘提取物的制備方法。
背景技術(shù)：
歐洲越橘(vacciniummyrtilluslinn.)是生長于中北歐地區(qū)多年生矮灌木上的一類漿果。歐洲越橘提取物bilberryextract是以成熟的歐洲越橘漿果為原料，提取得到紫黑色粉末，具有預(yù)防視屏導(dǎo)致的眼睛疲勞，緩解疲勞或腿部腫脹，防止高血壓，抗衰老等功能，已載入歐洲藥典(ep)植物藥及制法專論部分(monographsonherbaldrugsandherbaldrugpreparations)，并作為膳食補(bǔ)充劑(dietarysupplments)載入美國藥典(usp)。因其所含的花色苷類成分具有抗氧化、清除自由基等生理活性，歐洲越橘提取物主要應(yīng)用于功能性食品及醫(yī)藥工業(yè)中。ep及usp中均對歐洲越橘提取物中總花色苷含量做出了規(guī)定。ep中規(guī)定，以高效液相色譜法(hplc)檢測，以氯代矢車菊素-3-0-葡萄糖苷計，總花色苷含量在32.4％至39.6％范圍內(nèi)。usp規(guī)定總花色苷含量不低于36％。
花色苷是一類天然的水溶性色素，廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實等器官的細(xì)胞液中，從而使其呈現(xiàn)出紅色、藍(lán)色或紫色等顏色?；ㄉ帐怯苫ㄉ张浠?苷元)與糖通過糖苷鍵結(jié)合而成的一類多酚類化合物。天然花色苷配基(花青素)的基本結(jié)構(gòu)為3，5，7-三羥基-2-苯基苯并吡喃。目前已知的花色素有20多種，但在植物中最常見的有6種，即矢車菊色素、天竺葵色素、飛燕草色素、芍藥色素、牽牛色素、錦葵色素。最有可能與花色素成苷的單糖依次是：葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖?；ㄉ胤肿由峡梢赃B接1個或幾個糖基，連接方式可以是單糖和低聚糖。通過改變花色苷分子中的羥基數(shù)目、羥基的甲基化程度、連接到花色苷分子上的糖的種類、數(shù)量及位置、連接到分子上的有機(jī)酸的數(shù)量和種類等，可以形成大量的花色苷。
花色苷很不穩(wěn)定，其結(jié)構(gòu)對其本身穩(wěn)定性影響很大。一般來說，2-苯基苯并吡喃陽離子結(jié)構(gòu)中羥基數(shù)目增加則穩(wěn)定性降低，而甲基化程度提高則有利于提高穩(wěn)定性。游離羥基的糖苷化也將增加花色苷的穩(wěn)定性，流動的糖鏈可以像一條帶子將折疊好的酰基纏繞在2-苯基苯并吡喃骨架的表面，這種堆積可以防止水化平衡轉(zhuǎn)換引起的花色苷的失色，對花色苷的色澤穩(wěn)定性起到保護(hù)作用。?；ㄉ盏姆枷闼崛鏿-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、五倍子酸和一些脂肪酸如丙二酸、乙酸、蘋果酸、琥珀酸和草酸也對花色苷的穩(wěn)定起到了很大作用，?；目臻g位阻使花色苷不易受到水的攻擊，難以形成無色假堿和查爾酮結(jié)構(gòu)。另外c4位上如果被取代也將有利于花色苷的穩(wěn)定，因為這樣可以防止水加成，也防止二氧化硫?qū)е碌耐噬；ㄉ盏姆€(wěn)定性除了受本身結(jié)構(gòu)影響外，還與加工和貯藏過程中的一些理化因子如ph、溫度、光、氧、酶、抗壞血酸、糖及其降解產(chǎn)物、二氧化硫、氨摹酸、酚酸、金屬離子、加工方法等有關(guān)。
由于黃烊鹽陽離子缺乏電子，游離的花色素很不穩(wěn)定。在歐洲越橘提取物制備過程中，應(yīng)盡力避免花色苷糖配基的丟失，從而影響其穩(wěn)定性。ep及usp均規(guī)定以氯代矢車菊素計總花色素含量低于1％(hplc)。
申請?zhí)?00710122746.x公開了一種紅豆越橘提取物及其制備方法和應(yīng)用，該技術(shù)是以紅豆為原料，用80％乙醇水溶液為溶劑，提取液濃縮出去乙醇后上樹脂柱，采用chpa20離子交換樹脂，用60％乙醇洗脫，除去醇，得到紅豆越橘提取物。含花青素19.6％，原花青素72.0％，未對花色苷含量進(jìn)行測定。
申請?zhí)?01310461582.9公開了一種從歐洲越橘中提取花色甙的方法，包括以下步驟：1)以歐洲越橘為原料，用40％～60％乙醇溶液中回流提取，乙醇溶液中添加有鹽酸，將提取液濃縮后，通過填充有大孔樹脂的層析柱，先對大孔樹脂水洗至流出液澄清，再用40％～60％乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，濃縮，干燥后得到粗提取物；2)以丙酮為萃取劑對粗提取物進(jìn)行亞臨界萃取，萃取劑注入量為粗提取物重量的1～2倍，萃取溫度為58～62℃，萃取壓力為2.8～3.2mpa，萃取時間為20～40min，回收自行揮發(fā)的丙酮后得到成品。該發(fā)明經(jīng)過乙醇溶液回流提取、大孔樹脂吸附、亞臨界萃取等過程，步驟簡單，所用時間短，試劑用量少，收率約為0.5％，花色甙含量約為70％，收率和純度高，更適合工業(yè)生產(chǎn)。但其對花青素沒做要求，且亞臨界操作要求高，成本大，工藝復(fù)雜。
申請?zhí)?01110184914.4公開了一種從越橘上提取含有花青甙的提取物的方法，為了解決現(xiàn)有提取含有花青甙的提取物的提取工藝通常用高溫的方式來完成提取工藝中出現(xiàn)的濃縮步驟，從而在提取過程中即使得部分花青甙的結(jié)構(gòu)遭到破壞的問題，該發(fā)明提供了一種從越橘上提取含有花青甙的提取物的方法，該方法包括：a、將越橘浸泡在提取液中以得到浸泡液的浸泡步驟；b、用吸附樹脂柱層分離浸泡液以得到分離液的分離步驟；c、干燥分離液使提取物形成的形成步驟；以及位于b步驟及c步驟之間的將分離液通過納濾膜的步驟，所述納濾膜的孔徑為1nm左右，采用以上技術(shù)方案即可有效解決上述技術(shù)問題。但其所述納濾膜需要更換清洗，不適合工業(yè)化。
申請?zhí)?01410253728.5公開了一種歐洲越橘提取物及制備這種提取物的方法。該發(fā)明所述歐洲越橘提取物的含量在55％～95％，并且與歐洲藥典所規(guī)定的指紋圖譜一致。該發(fā)明還涉及制備上述提取物的方法，該方法包括用大孔吸附樹脂提取歐洲越橘提取物的步驟，以及收集到的提取液濃縮、噴霧干燥的步驟，該方法中所用大孔吸附樹脂的二乙烯苯與酯類單體的投料比為19:1～7:3，解析過程所用解析劑為乙醇、或者甲醇或者丙酮的酸性水溶液。但其所述大孔吸附樹脂為自制樹脂，存在安全問題。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服背景技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種歐洲越橘提取物的制備方法。本發(fā)明制備得到的歐洲越橘提取物花青苷(以矢車菊素3-0-葡萄糖苷氯化物計)含量≥36％，且總花青素(以矢車菊素氯化物計)含量≤1.0％，符合美國藥典和歐洲藥典要求；本發(fā)明歐洲越橘提取物放射性核素137cs含量低，小于10bq/kg，符合《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)》(gb14883.10-2016)。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)手段為：
一種歐洲越橘提取物的制備方法，包括如下步驟：
(1)第一次提取：取歐洲越橘果實，加入酸化乙醇溶液，常溫攪拌提取，提取結(jié)束加入飽和檸檬酸鈉溶液，攪拌，離心，收集離心液，藥渣備用；
(2)第二次提?。簩⒌谝淮翁崛‰x心后的濾渣投入提取罐，加入乙醇溶液，開啟攪拌，常溫提取，提取期間保持?jǐn)嚢?，提取結(jié)束后離心，收集濾液，棄去濾渣；
(3)上柱預(yù)處理：將兩次乙醇提取離心液合并，濃縮至無醇得濃縮液，加水?dāng)嚢璧昧弦?，?zhǔn)備上大孔吸附樹脂柱，上柱吸附前用檸檬酸溶液清洗樹脂；
(4)上柱吸附：將料液上大孔吸附樹脂柱吸附，控制流速；
(5)水洗：料液上柱結(jié)束后用檸檬酸溶液進(jìn)行洗脫，控制流速；
(6)解吸：洗脫完畢后用乙醇溶液進(jìn)行解吸，控制流速，觀察有紅色液體出現(xiàn)時開始收集，將解吸得到的料液濃縮至無醇，干燥即為歐洲越橘提取物。
上述技術(shù)方案中，所述步驟(1)中，所述飽和檸檬酸鈉溶液制備方法為：按重量份計每100份的水中加入19份的檸檬酸鈉，充分溶解后見底部有白色不溶物即為飽和檸檬酸鈉溶液，如全部溶解則再加入適量的檸檬酸鈉溶解即可。
上述技術(shù)方案中，所述步驟(1)中，加入飽和檸檬酸鈉溶液調(diào)節(jié)溶液ph至3.0～3.5。
優(yōu)選地，所述步驟(1)中，所述酸化乙醇溶液為含濃硫酸的濃度為95％的乙醇溶液。
優(yōu)選地，所述步驟(1)中，所述常溫攪拌提取時間為2h。
優(yōu)選地，所述步驟(1)中，所述提取結(jié)束加入飽和檸檬酸鈉溶液攪拌時間為15～30min。
優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述乙醇溶液濃度為95％。
優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述常溫提取時間為1h。
優(yōu)選地，所述步驟(3)中，所述加水量按體積比為濃縮液體積的3倍。
優(yōu)選地，所述步驟(3)中，所述檸檬酸溶液的ph為3.0～3.5。
優(yōu)選地，所述步驟(3)中，所述大孔吸附樹脂為非極性大孔吸附樹脂；更優(yōu)選為hpd100、hpd300和hpd200a中的任意一種；最優(yōu)選為hpd100。
優(yōu)選地，所述步驟(3)中，所述料液與所述大孔吸附樹脂的重量比為3:1。
優(yōu)選地，所述步驟(4)中，所述流速為25～35ml/min。
優(yōu)選地，所述步驟(5)中，所述檸檬酸溶液ph為3.0～3.5。
優(yōu)選地，所述步驟(5)中，所述流速為25～35ml/min。
優(yōu)選地，所述步驟(6)中，所述乙醇溶液濃度為80～90％。
優(yōu)選地，所述步驟(6)中，所述流速為25～35ml/min。
本發(fā)明基本原理：
(1)作為活性物質(zhì)的花色苷很不穩(wěn)定，提取過程中的理化因子，如溫度、ph、光、氧、酶等都會對其穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。因此，花色苷的提取必須要在適宜的條件下進(jìn)行。本發(fā)明通過在常溫下加入含濃硫酸的濃度為95％的乙醇溶液攪拌提取，提取完后攪拌加入飽和檸檬酸鈉溶液，調(diào)節(jié)溶液ph至3.0～3.5，防止溶液過酸影響花色苷穩(wěn)定性，離心，去藥渣，可以最大限度保證活性物質(zhì)——花色苷從細(xì)胞中有效溶出，維持了花色苷結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；濃縮液加水上非極性的hpd100大孔吸附樹脂柱，ph3.0～3.5檸檬酸溶液洗脫，用80～90％的乙醇溶液解析，由于選擇了合適的大孔吸附樹脂、洗脫劑和解吸劑，可以最大限度的提高花色苷的含量，從而得到符合美國藥典和歐洲藥典要求的歐洲越橘提取物；
(2)隨著核技術(shù)的快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，核武器試驗和核事故，使大量人工放射性物質(zhì)釋放入人類環(huán)境中，對環(huán)境產(chǎn)生放射性污染，放射性核素可通過食物鏈及呼吸等途徑進(jìn)入體內(nèi)。因此，食物不僅是人類營養(yǎng)素的來源，也是有害污染物進(jìn)入的途徑。各國的研究表明，無論海洋還是大陸，從20世紀(jì)40年代起均受到人工放射性核素的污染，膳食中不僅存在著天然放射性核素，也存在人工放射性核素。137cs作為銫的同位素之一，被認(rèn)為是最危險的核素之一。銫作為鉀的營養(yǎng)類似物而容易被植物吸收，進(jìn)入食物鏈，從而對人類健康產(chǎn)生危害。137cs是高放廢液中主要的裂變產(chǎn)物,半衰期長達(dá)30年,容易遷移和轉(zhuǎn)移,對人體危害周期性長且危害大,這使得人們越來越地注重放射性核素137cs的去除。本發(fā)明由于選擇了合適的大孔吸附樹脂、洗脫劑和解吸劑，可以最大限度的減少歐洲越橘提取物中137cs的含量。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)方案具有如下優(yōu)點：
(1)本發(fā)明工藝簡便、易于操作、便于工業(yè)化生產(chǎn)；
(2)本發(fā)明制備得到的歐洲越橘提取物花青苷(以矢車菊素3-0-葡萄糖苷氯化物計)含量≥36％，且總花青素(以矢車菊素氯化物計)含量≤1.0％，符合美國藥典和歐洲藥典要求；
(3)本發(fā)明歐洲越橘提取物放射性核素137cs含量低，小于10bq/kg，符合《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)》(gb14883.10-2016)。
具體實施方式
為了更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容，下面結(jié)合具體實施例作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于對本發(fā)明進(jìn)一步說明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的內(nèi)容后，該領(lǐng)域的技術(shù)人員對本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改動或調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實施例1
(1)第一次提?。喝?00g歐洲越橘果實，加入2.4l95％乙醇溶液攪拌，再加入6.5g濃硫酸，常溫攪拌提取2h，提取結(jié)束加入飽和檸檬酸鈉溶液25g，調(diào)節(jié)溶液ph至3.0～3.5，攪拌15min，離心，收集離心液，濾渣備用；
(2)第二次提取：將第一次提取離心后的濾渣投入提取罐，加入3.6l95％乙醇溶液，開啟攪拌，常溫提取1h，提取期間保持?jǐn)嚢?，提取結(jié)束后離心，收集濾液，棄去濾渣；
(3)上柱預(yù)處理：將兩次乙醇提取離心液合并，濃縮至無醇得濃縮液，加入濃縮液體積3倍的水?dāng)嚢璧昧弦?，?zhǔn)備上大孔吸附樹脂柱，上柱吸附前用ph3.0～3.5檸檬酸溶液清洗樹脂；
(4)上柱吸附：將料液上hpd100柱吸附，控制流速為25～30ml/min；
(5)水洗：料液上柱結(jié)束后用1.5lph3.0～3.5的檸檬酸溶液進(jìn)行洗脫，控制流速為25～30ml/min；
(6)解吸：洗脫完畢后用3.6l80％乙醇溶液進(jìn)行解吸，控制流速為25～30ml/min，觀察有紅色液體出現(xiàn)時開始收集，將解吸得到的料液濃縮至無醇，干燥即為歐洲越橘提取物。
本實施例制備得到的花青苷(以矢車菊素3-0-葡萄糖苷氯化物計)含量為37.1％，總花青素(以矢車菊素氯化物計)含量0.6％，放射性核素137cs含量為8.9bq/kg。
實施例2
(1)第一次提?。喝?000g歐洲越橘果實，加入3l95％乙醇溶液攪拌，再加入7.5g濃硫酸，常溫攪拌提取2h，提取結(jié)束加入飽和檸檬酸鈉溶液30g，調(diào)節(jié)溶液ph至3.0～3.5，攪拌30min，離心，收集離心液，濾渣備用；
(2)第二次提?。簩⒌谝淮翁崛‰x心后的濾渣投入提取罐，加入4.5l95％乙醇溶液，開啟攪拌，常溫提取1h，提取期間保持?jǐn)嚢?，提取結(jié)束后離心，收集濾液，棄去濾渣；
(3)上柱預(yù)處理：將兩次乙醇提取離心液合并，濃縮至無醇得濃縮液，加入濃縮液體積3倍的水?dāng)嚢璧昧弦?，?zhǔn)備上大孔吸附樹脂柱，上柱吸附前用ph3.0～3.5檸檬酸溶液清洗樹脂；
(4)上柱吸附：將料液上hpd300柱吸附，控制流速為30～35ml/min；
(5)水洗：料液上柱結(jié)束后用1.8lph3.0～3.5的檸檬酸溶液進(jìn)行洗脫，控制流速為30～35ml/min；
(6)解吸：洗脫完畢后用4.1l90％乙醇溶液進(jìn)行解吸，控制流速為30～35ml/min，觀察有紅色液體出現(xiàn)時開始收集，將解吸得到的料液濃縮至無醇，干燥即為歐洲越橘提取物。
本實施例制備得到的花青苷(以矢車菊素3-0-葡萄糖苷氯化物計)含量為37.5％，總花青素(以矢車菊素氯化物計)含量0.7％，放射性核素137cs含量為9.3bq/kg。
實施例3
(1)第一次提取：取900g歐洲越橘果實，加入2.8l95％乙醇溶液攪拌，再加入7.0g濃硫酸，常溫攪拌提取2h，提取結(jié)束加入飽和檸檬酸鈉溶液27g，調(diào)節(jié)溶液ph至3.0～3.5，攪拌18min，離心，收集離心液，濾渣備用；
(2)第二次提?。簩⒌谝淮翁崛‰x心后的濾渣投入提取罐，加入3.8l95％乙醇溶液，開啟攪拌，常溫提取1h，提取期間保持?jǐn)嚢?，提取結(jié)束后離心，收集濾液，棄去濾渣；
(3)上柱預(yù)處理：將兩次乙醇提取離心液合并，濃縮至無醇得濃縮液，加入濃縮液體積3倍的水?dāng)嚢璧昧弦海瑴?zhǔn)備上大孔吸附樹脂柱，上柱吸附前用ph3.0～3.5檸檬酸溶液清洗樹脂；
(4)上柱吸附：將料液上hpd200a柱吸附，控制流速為28～33ml/min；
(5)水洗：料液上柱結(jié)束后用2.0lph3.0～3.5的檸檬酸溶液進(jìn)行洗脫，控制流速為28～33ml/min；
(6)解吸：洗脫完畢后用4.5l85％乙醇溶液進(jìn)行解吸，控制流速為28～33ml/min，觀察有紅色液體出現(xiàn)時開始收集，將解吸得到的料液濃縮至無醇，干燥即為歐洲越橘提取物。
本實施例制備得到的花青苷(以矢車菊素3-0-葡萄糖苷氯化物計)含量為37.2％，總花青素(以矢車菊素氯化物計)含量0.8％，放射性核素137cs含量為8.5bq/kg。
實施例1～3中所述hpd100、hpd300和hpd200a購于滄州寶恩吸附材料科技有限公司。
實施例1～3所述飽和檸檬酸鈉溶液制備方法為：每50g的水中加入9.5g的檸檬酸鈉，充分溶解后見底部有白色不溶物即為飽和檸檬酸鈉溶液，如全部溶解則再加入適量的檸檬酸鈉溶解即可。
上述說明并非對發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在發(fā)明的實質(zhì)范圍內(nèi)，做出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。