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一種疏風(fēng)解毒膠囊及其制備方法與檢測方法及用途與流程

文檔序號:11204393閱讀:1384來源:國知局
一種疏風(fēng)解毒膠囊及其制備方法與檢測方法及用途與流程

本發(fā)明涉及中藥領(lǐng)域,具體涉及一種疏風(fēng)解毒膠囊及其制備方法與檢測方法及制藥用途。



背景技術(shù):

疏風(fēng)解毒膠囊,是本專利申請人安徽濟人藥業(yè)有限公司的獨家產(chǎn)品,批準(zhǔn)文號為:國藥準(zhǔn)字z2009004,規(guī)格:每粒裝0.52g。該品種是根據(jù)我國著名老中醫(yī)向楚賢的祖?zhèn)髅芊?,原名“祛毒散”,研制的中藥新藥,由虎杖、連翹、敗醬草、柴胡、馬鞭草、板藍根、蘆根、甘草等藥味組成。具有疏風(fēng)清熱,解毒利咽之功,用于治療急性上呼吸道感染屬風(fēng)熱證,癥見發(fā)熱,惡風(fēng),咽痛,頭痛,鼻塞,流濁涕,咳嗽等,臨床應(yīng)用多年,療效確切。本品被列為衛(wèi)生部《甲型h1n1流感診療方案》(2009年第二版、第三版、2010年版)治療風(fēng)熱犯衛(wèi)首選中成藥、《流行性感冒診斷與治療指南(2011年版)》、國家中醫(yī)藥管理局《外感發(fā)熱(上呼吸道感染)診療方案》和《時行感冒(甲型h1n1流感)診療方案》推薦用藥,并納入2009年版國家醫(yī)保目錄。

本品為本專利申請人安徽濟人藥業(yè)的拳頭產(chǎn)品,是年產(chǎn)值、年銷售額均過億的中藥大品種。2011年獲得國家現(xiàn)代中藥高技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項支持,先后榮獲“國家重點新產(chǎn)品”、“安徽省自主創(chuàng)新產(chǎn)品”、“呼吸系統(tǒng)疾病類中藥十強”等一系列榮譽稱號。本產(chǎn)品具有自主知識產(chǎn)權(quán)(專利號zl200510117119.8),在治療急性上呼吸道感染有著較好的療效和市場,如何保證產(chǎn)品的穩(wěn)定均一性及其安全有效性,是本品發(fā)展的亟待解決的問題?,F(xiàn)行的疏風(fēng)解毒膠囊檢測方法僅規(guī)定了連翹、柴胡、馬鞭草的薄層色譜鑒別方法和薄層掃描法測定大黃素含量的方法,而本品為8種中藥藥味原料組成,成分復(fù)雜,現(xiàn)有的檢測方法尚處在較簡單的初級階段,顯然不利于產(chǎn)品質(zhì)量及療效的保證。

產(chǎn)品質(zhì)量的提高離不開檢測方法的提高,因此,本發(fā)明的申請人安徽濟人藥業(yè)有限公司對疏風(fēng)解毒膠囊檢測方法進行大幅度提升,曾經(jīng)于2014年10月27日申請了兩件發(fā)明專利,發(fā)明名稱分別為:一種疏風(fēng)解毒膠囊指紋圖譜的建立方法、一種疏風(fēng)解毒膠囊的檢測方法,申請?zhí)柗謩e為:2014105823185、201410583418x,專利公開號分別為:104316613b、104330489b,兩件專利分別提出了對疏風(fēng)解毒膠囊的指紋圖譜的檢測方法,以及對其馬鞭草苷、馬鞭草苷、虎杖苷、連翹酯苷a、毛蕊花糖苷、甘草酸單銨鹽、大黃素等幾個成分進行檢測的方法,這些檢測方法對于提升疏風(fēng)解毒膠囊的質(zhì)量,起到了重要的推動作用。不過,在生產(chǎn)實踐和科研實驗中,申請人發(fā)現(xiàn),表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?;窈碥誨是疏風(fēng)解毒膠囊重要活性成分,所以,申請人對此進行了反復(fù)的實驗研究,提出并建立了同時對表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?;窈碥誨的含量進行檢測的方法。

此外,申請人按照國家中藥大品種開發(fā)戰(zhàn)略的指導(dǎo)思想,對疏風(fēng)解毒膠囊的新的治療用途開展了系統(tǒng)性的研究,在研究中意外發(fā)現(xiàn),疏風(fēng)解毒膠囊對非酒精性脂肪肝具有非常突出的、令人意想不到的治療效果。

本項目得到了國家科學(xué)技術(shù)部科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金的重點支持,項目名稱:疏風(fēng)解毒膠囊,項目類型:重點項目,立項代碼:10c26213404286,批準(zhǔn)文號:國科發(fā)計字[2010]543號。



技術(shù)實現(xiàn)要素:

基于背景技術(shù)存在的技術(shù)問題,本發(fā)明提出了一種疏風(fēng)解毒膠囊及其制備方法與檢測方法及制藥用途。

本發(fā)明的目的是提供一種疏風(fēng)解毒膠囊藥物及其制備方法。

本發(fā)明的另一目的是提供疏風(fēng)解毒膠囊的藥物檢測方法。

本發(fā)明還提供了疏風(fēng)解毒膠囊的新的制藥用途。

本發(fā)明的目的是通過以下方式實現(xiàn)的:

一種疏風(fēng)解毒膠囊,是由以下重量份的藥味原料制成:虎杖5重量份、連翹4重量份、板藍根4重量份、柴胡4重量份、敗醬草4重量份、馬鞭草4重量份、蘆根3重量份、甘草2重量份。

一種疏風(fēng)解毒膠囊的制備方法,該疏風(fēng)解毒膠囊是由以下重量份的藥味原料制成:虎杖5重量份、連翹4重量份、板藍根4重量份、柴胡4重量份、敗醬草4重量份、馬鞭草4重量份、蘆根3重量份、甘草2重量份,采用如下方法制備:

s1:取虎杖、板藍根粉碎成粗顆粒,加5倍量70%乙醇加熱回流提取2h,濾過;藥渣再加3倍量70%乙醇加熱回流提取1h,濾過,濾液合并,回收乙醇并減壓濃縮至60℃下相對密度1.35~1.40的稠膏,備用;

s2:取連翹、柴胡加7倍量的水,加熱回流提取揮發(fā)油4h,分取分層的揮發(fā)油,備用;藥渣和藥液粗濾,濾液離心分離,上清液和藥渣分別保存?zhèn)溆茫?/p>

s3:取敗醬草、馬鞭草、蘆根、甘草與s2步驟得到的柴胡、連翹提取揮發(fā)油后藥渣合并,加水煎煮提取二次,第一次加18倍量水提取2h,第二次加12倍量水提取1h,粗濾,濾液離心分離,兩次提取的上清液與s2步驟得到的柴胡、連翹提取揮發(fā)油后的上清液合并,減壓濃縮至60℃下相對密度1.35~1.40的稠膏,備用;

s4:取糊精、微粉硅膠,混勻,加入到上述s1步驟得到的水提濃縮稠膏與s3步驟得到的醇提濃縮稠膏中,充分攪拌均勻,鋪層,真空干燥,粉碎,加入糊精,噴入s2步驟得到的揮發(fā)油,過篩,混勻,裝入膠囊,即得。

一種疏風(fēng)解毒膠囊的檢測方法,該疏風(fēng)解毒膠囊是由以下重量份的藥味原料制成:虎杖5重量份、連翹4重量份、板藍根4重量份、柴胡4重量份、敗醬草4重量份、馬鞭草4重量份、蘆根3重量份、甘草2重量份,該疏風(fēng)解毒膠囊是采用如下方法制備的:

s1:取虎杖、板藍根粉碎成粗顆粒,加5倍量70%乙醇加熱回流提取2h,濾過;藥渣再加3倍量70%乙醇加熱回流提取1h,濾過,濾液合并,回收乙醇并減壓濃縮至60℃下相對密度1.35~1.40的稠膏,備用;

s2:取連翹、柴胡加7倍量的水,加熱回流提取揮發(fā)油4h,分取分層的揮發(fā)油,備用;藥渣和藥液粗濾,濾液離心分離,上清液和藥渣分別保存?zhèn)溆茫?/p>

s3:取敗醬草、馬鞭草、蘆根、甘草與s2步驟得到的柴胡、連翹提取揮發(fā)油后藥渣合并,加水煎煮提取二次,第一次加18倍量水提取2h,第二次加12倍量水提取1h,粗濾,濾液離心分離,兩次提取的上清液與s2步驟得到的柴胡、連翹提取揮發(fā)油后的上清液合并,減壓濃縮至60℃下相對密度1.35~1.40的稠膏,備用;

s4:取糊精、微粉硅膠,混勻,加入到上述s1步驟得到的水提濃縮稠膏與s3步驟得到的醇提濃縮稠膏中,充分攪拌均勻,鋪層,真空干燥,粉碎,加入糊精,噴入s2步驟得到的揮發(fā)油,過篩,混勻,裝入膠囊,即得;

采用rp-hplc雙波長切換法同時測定疏風(fēng)解毒膠囊中表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?;窈碥誨的含量,其檢測方法的步驟如下:

(1)色譜條件:色譜柱:c18柱,規(guī)格:250mm×4.6mm,5μm;流動相:乙腈-0.4mol/l磷酸二氫鈉溶液,梯度洗脫,洗脫程序為:0至10min,乙腈從5%線性上升至15%,0.4mol/l磷酸二氫鈉溶液從95%線性下降至85%,從11至20min,乙腈從15%線性上升至35%,0.4mol/l磷酸二氫鈉溶液從85%線性下降至65%;流速:0.5~2.0ml·min-1;檢測波長:0至10min檢測波長230~240nm,11至20min檢測波長330~340nm;柱溫:30~40℃;進樣量:5~20μl;

(2)混合對照品溶液的制備:分別取表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?;窈碥誨對照品,精密稱定,置同一量瓶中,用0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成混合對照品溶液;

(3)供試品溶液的制備:取本品內(nèi)容物,精密稱定,置離心管中,精密加入0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液,稱定質(zhì)量,超聲提取,放冷,再稱定質(zhì)量,用0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液補足所減失的質(zhì)量,離心,取上清液,濾紙過濾后,取續(xù)濾液,再用0.45μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得供試品溶液;

(4)測定:取混合對照品溶液、供試品溶液注入高效液相色譜儀,測定。

上述檢測方法,采用rp-hplc雙波長切換法同時測定疏風(fēng)解毒膠囊中表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?;窈碥誨的含量,其檢測方法的優(yōu)選步驟如下:

(1)色譜條件:色譜柱:c18柱,規(guī)格:250mm×4.6mm,5μm;流動相:乙腈-0.4mol/l磷酸二氫鈉溶液,梯度洗脫,洗脫程序為:0至10min,乙腈從5%線性上升至15%,0.4mol/l磷酸二氫鈉溶液從95%線性下降至85%,從11至20min,乙腈從15%線性上升至35%,0.4mol/l磷酸二氫鈉溶液從85%線性下降至65%;流速:1.5ml·min-1;檢測波長:0至10min檢測波長235nm,11至20min檢測波長336nm;柱溫:36℃;進樣量:20μl;

(2)混合對照品溶液的制備:分別取表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d對照品,精密稱定,置同一100ml棕色量瓶中,用0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成質(zhì)量濃度分別為300.0mg·l-1、350.0mg·l-1和450.0mg·l-1的混合對照品溶液;

(3)供試品溶液的制備:取本品內(nèi)容物0.1g,精密稱定,置5ml離心管中,精密加入0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液4ml,稱定質(zhì)量,以功率300w、頻率60khz超聲提取40min,放冷,再稱定質(zhì)量,用0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液補足所減失的質(zhì)量,離心,取上清液,濾紙過濾后,取續(xù)濾液,再用0.45μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得供試品溶液;

(4)測定:取混合對照品溶液、供試品溶液各20μl,注入高效液相色譜儀,測定。

一種疏風(fēng)解毒膠囊在制備治療非酒精性脂肪肝藥物中的應(yīng)用,該疏風(fēng)解毒膠囊是由以下重量份的藥味原料制成:虎杖5重量份、連翹4重量份、板藍根4重量份、柴胡4重量份、敗醬草4重量份、馬鞭草4重量份、蘆根3重量份、甘草2重量份,該疏風(fēng)解毒膠囊是采用如下方法制備的:

s1:取虎杖、板藍根粉碎成粗顆粒,加5倍量70%乙醇加熱回流提取2h,濾過;藥渣再加3倍量70%乙醇加熱回流提取1h,濾過,濾液合并,回收乙醇并減壓濃縮至60℃下相對密度1.35~1.40的稠膏,備用;

s2:取連翹、柴胡加7倍量的水,加熱回流提取揮發(fā)油4h,分取分層的揮發(fā)油,備用;藥渣和藥液粗濾,濾液離心分離,上清液和藥渣分別保存?zhèn)溆茫?/p>

s3:取敗醬草、馬鞭草、蘆根、甘草與s2步驟得到的柴胡、連翹提取揮發(fā)油后藥渣合并,加水煎煮提取二次,第一次加18倍量水提取2h,第二次加12倍量水提取1h,粗濾,濾液離心分離,兩次提取的上清液與s2步驟得到的柴胡、連翹提取揮發(fā)油后的上清液合并,減壓濃縮至60℃下相對密度1.35~1.40的稠膏,備用;

s4:取糊精、微粉硅膠,混勻,加入到上述s1步驟得到的水提濃縮稠膏與s3步驟得到的醇提濃縮稠膏中,充分攪拌均勻,鋪層,真空干燥,粉碎,加入糊精,噴入s2步驟得到的揮發(fā)油,過篩,混勻,裝入膠囊,即得;

采用rp-hplc雙波長切換法同時測定疏風(fēng)解毒膠囊中表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?;窈碥誨的含量,其檢測方法的步驟如下:

(1)色譜條件:色譜柱:c18柱,規(guī)格:250mm×4.6mm,5μm;流動相:乙腈-0.4mol/l磷酸二氫鈉溶液,梯度洗脫,洗脫程序為:0至10min,乙腈從5%線性上升至15%,0.4mol/l磷酸二氫鈉溶液從95%線性下降至85%,從11至20min,乙腈從15%線性上升至35%,0.4mol/l磷酸二氫鈉溶液從85%線性下降至65%;流速:1.5ml·min-1;檢測波長:0至10min檢測波長235nm,11至20min檢測波長336nm;柱溫:36℃;進樣量:20μl;

(2)混合對照品溶液的制備:分別取表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?;窈碥誨對照品,精密稱定,置同一100ml棕色量瓶中,用0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成質(zhì)量濃度分別為300.0mg·l-1、350.0mg·l-1和450.0mg·l-1的混合對照品溶液;

(3)供試品溶液的制備:取本品內(nèi)容物0.1g,精密稱定,置5ml離心管中,精密加入0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液4ml,稱定質(zhì)量,以功率300w、頻率60khz超聲提取40min,放冷,再稱定質(zhì)量,用0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液補足所減失的質(zhì)量,離心,取上清液,濾紙過濾后,取續(xù)濾液,再用0.45μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得供試品溶液;

(4)測定:取混合對照品溶液、供試品溶液各20μl,注入高效液相色譜儀,測定。

以下實驗研究用于驗證本發(fā)明的技術(shù)方案的技術(shù)內(nèi)容和技術(shù)效果,但并不限制本發(fā)明的保護范圍。

實驗一:rp-hplc雙波長切換法同時測定疏風(fēng)解毒膠囊中表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?;窈碥誨的含量

1儀器與材料

hitachil2130高效液相色譜儀,包括hi-tachil-2400紫外檢測器、d-2000ellte色譜工作站,由特賽恩斯儀器有限公司制造;kromasilc18色譜柱,規(guī)格:250mm×4.6mm,5μm,由安捷倫科技(中國)有限公司制造;sk250h超聲波發(fā)生儀,由上海大廣電超聲波發(fā)生器公司生產(chǎn);hc-2516高速離心機,由上海利鑫堅離心機有限公司制造。

表兒茶素沒食子酸酯對照品(純度質(zhì)量分數(shù)為98.5%),由上海哈靈生物科技有限公司生產(chǎn);決明松-8-o-葡萄糖苷對照品(純度質(zhì)量分數(shù)為99.0%),由成都德思特生物技術(shù)有限公司生產(chǎn);丙二?;窈碥誨(純度質(zhì)量分數(shù)為99.0%),由成都瑞芬思生物科技有限公司生產(chǎn)。乙腈(色譜純),由上海安譜實驗科技股份有限公司生產(chǎn);其他試劑(分析純),由上海安譜實驗科技股份有限公司生產(chǎn);水為重蒸餾水,由安徽濟人藥業(yè)有限公司實驗室自制。

疏風(fēng)解毒膠囊:處方:虎杖450g、連翹360g、板藍根360g、柴胡360g、敗醬草360g、馬鞭草360g、蘆根270g、甘草180g;

制備方法:

s1:取虎杖、板藍根粉碎成粗顆粒,加5倍量70%乙醇加熱回流提取2h,濾過;藥渣再加3倍量70%乙醇加熱回流提取1h,濾過,濾液合并,回收乙醇并減壓濃縮至60℃下相對密度1.35~1.40的稠膏,備用;

s2:取連翹、柴胡加7倍量的水,加熱回流提取揮發(fā)油4h,分取分層的揮發(fā)油,備用;藥渣和藥液粗濾,濾液離心分離,上清液和藥渣分別保存?zhèn)溆茫?/p>

s3:取敗醬草、馬鞭草、蘆根、甘草與s2步驟得到的柴胡、連翹提取揮發(fā)油后藥渣合并,加水煎煮提取二次,第一次加18倍量水提取2h,第二次加12倍量水提取1h,粗濾,濾液離心分離,兩次提取的上清液與s2步驟得到的柴胡、連翹提取揮發(fā)油后的上清液合并,減壓濃縮至60℃下相對密度1.35~1.40的稠膏,備用;

s4:取糊精、微粉硅膠,混勻,加入到上述s1步驟得到的水提濃縮稠膏與s3步驟得到的醇提濃縮稠膏中,充分攪拌均勻,鋪層,真空干燥,粉碎,加入糊精,噴入s2步驟得到的揮發(fā)油,過篩,混勻,裝入膠囊,制成1000粒,即得。

2方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1混合對照品溶液的制備:分別取表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?;窈碥誨對照品適量,精密稱定,置同一100ml棕色量瓶中,用0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成質(zhì)量濃度分別為300.0mg·l-1、350.0mg·l-1和450.0mg·l-1的混合對照品溶液。

2.1.2供試品溶液的制備:取本品內(nèi)容物0.1g,精密稱定,置5ml離心管中,精密加入0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液4ml,稱定質(zhì)量,以功率300w、頻率60khz超聲提取40min,放冷,再稱定質(zhì)量,用0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液補足所減失的質(zhì)量,離心,取上清液,濾紙過濾后,取續(xù)濾液,再用0.45μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得供試品溶液。

2.1.3陰性對照溶液的制備

以膠囊制備工藝的處方比例,按“2.1.2”條方法分別制備缺虎杖和缺柴胡的陰性對照溶液。

2.2色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:kromasilc18柱,規(guī)格:250mm×4.6mm,5μm;流動相:乙腈-0.4mol/l磷酸二氫鈉溶液,梯度洗脫,洗脫程序為:0至10min,乙腈從5%線性上升至15%,0.4mol/l磷酸二氫鈉溶液從95%線性下降至85%,從11至20min,乙腈從15%線性上升至35%,0.4mol/l磷酸二氫鈉溶液從85%線性下降至65%;流速:1.5ml·min-1;檢測波長:0至10min檢測波長235nm,11至20min檢測波長336nm;柱溫:36℃;進樣量:20μl。

在上述色譜條件下分別取表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?;窈碥誨的混合對照品溶液、陰性對照溶液和供試品溶液各20μl進樣分析,各被測成分的色譜峰與相鄰色譜峰的分離度大于1.5,拖尾因子符合要求,理論塔板數(shù)按丙二?;窈碥誨計算不低于5000,色譜圖見圖1、圖2、圖3、圖4。

2.3方法學(xué)驗證

2.3.1線性關(guān)系的考察

分別精密量取混合對照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0ml置10ml量瓶中,甲醇稀釋至刻度,配成不同質(zhì)量濃度的混合對照標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。按“2.2”條色譜條件進樣分析,以各自的峰面積(y)為縱坐標(biāo),以質(zhì)量濃度(x,mg·l-1)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?;窈碥誨回歸方程,結(jié)果見表1。

表1線性關(guān)系

2.3.2精密度試驗

取表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?;窈碥誨質(zhì)量濃度分別為190.0、220.5、290.5mg·l-1的同一混合對照品溶液,按“2.2”條色譜條件連續(xù)進樣6次,測得表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?;窈碥誨峰面積的rsd分別為1.6%、1.2%、1.1%。表明儀器的精密度良好。

2.3.3重復(fù)性試驗

精密稱取同一批號疏風(fēng)解毒膠囊(批號:160128)內(nèi)容物0.1g,按“2.1.2”條方法平行制備6份供試品溶液,按“2.2”條色譜條件進樣分析,測得表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?;窈碥誨含量的rsd分別為1.5%、1.3%、1.4%。表明方法重復(fù)性良好

2.3.4穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液,室溫放置,分別于0、2、4、6、8、10h,按“2.2”條色譜條件進樣分析,求得表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?;窈碥誨峰面積的rsd分別為2.3%、1.9%、2.8%。結(jié)果表明,供試品溶液在室溫下10h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5加樣回收率試驗

稱取已知含量的疏風(fēng)解毒膠囊(批號:160128)內(nèi)容物9份,3份為一組,每份約50mg,精密稱定。分別精密加入對照溶液適量,按“2.1.2”條方法制成低、中、高3個質(zhì)量濃度的供試品溶液,按“2.2”條色譜條件進樣分析,結(jié)果見表2。

表2表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?;窈碥誨的回收率試驗(n=9)

2.4供試品的含量測定

分別稱取各批號疏風(fēng)解毒膠囊10粒,精密稱定。按“2.1.2”條方法制備供試品溶液,按“2.2”條色譜條件進樣分析,采用外標(biāo)法計算表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d的含量,結(jié)果見表3。

表3疏風(fēng)解毒膠囊中表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d的含量(n=3)(mg·g-1)

3結(jié)論

采用本研究方法對疏風(fēng)解毒膠囊的10個批次進行了指標(biāo)性成分的含量測定。結(jié)果表明,表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?;窈碥誨每克含量分別在1.20~1.45mg、0.90~1.55mg和2.40~3.60mg內(nèi)。

本研究所建立的含量測定方法,同時測定3個指標(biāo)性成分,結(jié)果準(zhǔn)確,操作簡便,分析時間快速,為完善疏風(fēng)解毒膠囊的檢測分析方法提供了依據(jù)。

實驗二:疏風(fēng)解毒膠囊對小鼠非酒精性脂肪肝的治療作用

本研究用高糖高脂飼料喂養(yǎng)小鼠建立非酒精性脂肪肝模型,研究疏風(fēng)解毒膠囊對非酒精性脂肪肝的治療作用。

1儀器與試藥

1.1試藥

疏風(fēng)解毒膠囊:處方:虎杖450g、連翹360g、板藍根360g、柴胡360g、敗醬草360g、馬鞭草360g、蘆根270g、甘草180g;

制備方法:

s1:取虎杖、板藍根粉碎成粗顆粒,加5倍量70%乙醇加熱回流提取2h,濾過;藥渣再加3倍量70%乙醇加熱回流提取1h,濾過,濾液合并,回收乙醇并減壓濃縮至60℃下相對密度1.35~1.40的稠膏,備用;

s2:取連翹、柴胡加7倍量的水,加熱回流提取揮發(fā)油4h,分取分層的揮發(fā)油,備用;藥渣和藥液粗濾,濾液離心分離,上清液和藥渣分別保存?zhèn)溆茫?/p>

s3:取敗醬草、馬鞭草、蘆根、甘草與s2步驟得到的柴胡、連翹提取揮發(fā)油后藥渣合并,加水煎煮提取二次,第一次加18倍量水提取2h,第二次加12倍量水提取1h,粗濾,濾液離心分離,兩次提取的上清液與s2步驟得到的柴胡、連翹提取揮發(fā)油后的上清液合并,減壓濃縮至60℃下相對密度1.35~1.40的稠膏,備用;

s4:取糊精、微粉硅膠,混勻,加入到上述s1步驟得到的水提濃縮稠膏與s3步驟得到的醇提濃縮稠膏中,充分攪拌均勻,鋪層,真空干燥,粉碎,加入糊精,噴入s2步驟得到的揮發(fā)油,過篩,混勻,裝入膠囊,制成1000粒,即得。

殼脂膠囊(商品名:甘復(fù)生),由內(nèi)蒙古福瑞醫(yī)療科技股份有限公司生產(chǎn),批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字z20050665,規(guī)格:0.25g*30s,批號:20160125-8。

1.2試劑與儀器

丙二醛(mda)檢測試劑盒,由北京百萊博科技有限公司制造,批號:20151223-9;超氧化物歧化酶(sod)檢測試劑盒,由北京百萊博科技有限公司制造,批號:20160120;全自動生化分析儀,由北京華奧智恒科技有限公司制造,批號:20151227;三筒光學(xué)顯微鏡,由桂林市邁特光學(xué)儀器有限公司制造。

1.3動物

昆明種小鼠,spf級,♂,體質(zhì)量(20±2)g,由安徽中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供,動物生產(chǎn)許可證號:scxk(皖)2012-2013。給予標(biāo)準(zhǔn)食物,自由飲水,保持光照和避光循環(huán)飼養(yǎng)(12/12h);實驗開始前保持室內(nèi)飼養(yǎng)1周。

2方法

2.1非酒精性脂肪肝小鼠模型的建立

將小鼠隨機分為2組,正常對照組小鼠(14只)喂飼普通飼料,其余小鼠(34只)喂飼高脂飼料(40%普通飼料粉、20%豬油、15%蛋黃粉、10%奶粉、10%蔗糖、2.5%膽固醇、2.5%膽酸鈉),自由攝食、飲水。連續(xù)喂養(yǎng)5周后,從正常對照組和脂肪肝模型組分別處死4只小鼠,比較2組小鼠的血清和肝臟生化指標(biāo),以及肝臟組織病理切片,判斷非酒精性脂肪肝模型小鼠是否建立成功。

2.2分組與給藥

將造模成功小鼠30只隨機分為3組,每組10只,分別為模型對照組、陽性藥物組(殼脂膠囊100mg·kg-1,1次·d-1)、疏風(fēng)解毒膠囊組(100mg·kg-1,1次·d-1)。連續(xù)給藥6周,正常對照組(10只)和模型對照組給予等量蒸餾水。給藥期間,除正常對照組標(biāo)準(zhǔn)鼠料飼養(yǎng)外,其余各組繼續(xù)給予高脂飲食,直到實驗結(jié)束。所有小鼠在末次給藥后,禁食不禁水12h,小鼠眼球取血,分離血清,采用全自動生化分析儀檢測血清谷總膽固醇(tc)、甘油三脂(tg)含量和丙轉(zhuǎn)氨酶(alt)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast)活性。取血后處死小鼠,取出肝臟,一部分用4%福爾馬林固定,he染色,切片,送安徽中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科,供組織病理學(xué)檢查;另一部分,制成10%肝組織勻漿,測定其中tg、tc、mda、sod含量或活性。

2.3數(shù)據(jù)處理

采用spss12.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)描述和分析,結(jié)果以(x±s表示,采用單因素方差分析進行多組間均數(shù)比較。

3結(jié)果

3.1非酒精性脂肪肝模型的建立

與正常對照組比較,高脂飼料喂養(yǎng)的模型小鼠血清和肝臟中tg、tc含量均顯著升高(p<0.05或p<0.01),血清中alt、ast活性和肝臟中mda含量顯著升高(p<0.01),sod活力降低(p<0.05),結(jié)果見表1,肝組織病理切片觀察可見肝細胞脂肪變性。表明非酒精性脂肪肝小鼠模型建立成功。

高脂飼料的配方是在基礎(chǔ)飼料的基礎(chǔ)上添加膽固醇、豬油、膽酸鈉等,膽酸鈉可以乳化脂肪,促進吸收。本實驗通過高脂飼料喂養(yǎng)小鼠成功建立了非酒精性脂肪肝動物模型。

3.2小鼠血清和肝組織生化指標(biāo)檢測

實驗結(jié)束時,陽性藥物組小鼠的各項生化指標(biāo)都有改善(p<0.05或p<0.01)。與模型對照組相比,疏風(fēng)解毒膠囊組表現(xiàn)出降低非酒精性脂肪肝小鼠血清中tg、tc含量和alt、ast活性的作用,降低非酒精性脂肪肝小鼠肝臟中tg、tc、mda含量,升高sod活力的作用(p<0.05或p<0.01)。而且從各項生化指標(biāo)的比較中,疏風(fēng)解毒膠囊組的治療效果與陽性藥物組相當(dāng)(p>0.05),對于降低血清中的tc含量,疏風(fēng)解毒膠囊組還優(yōu)于陽性藥物組(p<0.05)。結(jié)果見表4。

表4對非酒精性脂肪肝小鼠生化指標(biāo)的影響(n=10,)

注:與模型對照組比較,*p<0.05,#p<0.01

3.3疏風(fēng)解毒膠囊對非酒精性脂肪肝小鼠肝組織病理學(xué)的影響

給藥6周后,陽性藥物組和疏風(fēng)解毒膠囊組小鼠肝臟顏色接近正常肝臟的暗紅色,而模型對照組小鼠的肝臟為乳白色。組織病理切片見圖5、圖6、圖7、圖8,實驗結(jié)果顯示,疏風(fēng)解毒膠囊組的小鼠肝細胞脂肪病變程度減輕,肝細胞中幾乎沒有脂滴的沉積,肝細胞壞死程度降低。

4結(jié)論

本實驗結(jié)果顯示,疏風(fēng)解毒膠囊組治療6周,非酒精性脂肪肝小鼠血清和肝臟中tg、tc含量均明顯降低,非酒精性脂肪肝小鼠的血清alt、ast水平和肝臟mda的量明顯降低,sod活性顯著升高,肝細胞脂肪變性得到修復(fù),疏風(fēng)解毒膠囊高劑量組小鼠肝臟組織形態(tài)接近正常狀態(tài)。研究表明,疏風(fēng)解毒膠囊對于非酒精性脂肪肝有治療作用。

實驗三:疏風(fēng)解毒膠囊對小鼠慢性酒精性肝損傷模型的實驗研究

疏風(fēng)解毒膠囊對于非酒精性脂肪肝有治療作用,按照常規(guī)的邏輯推理,疏風(fēng)解毒膠囊對酒精性肝損傷也應(yīng)該具有一定的治療作用,發(fā)明人對此也進行了試探的實驗研究。

1實驗材料

1.1藥物和試劑

造模劑:紅星二鍋頭酒(清香型白酒,酒精度56%vol),200ml/瓶,北京紅星股份有限公司,啟封后4℃冷藏保存。

受試藥:

疏風(fēng)解毒膠囊:處方:虎杖450g、連翹360g、板藍根360g、柴胡360g、敗醬草360g、馬鞭草360g、蘆根270g、甘草180g;

制備方法:

s1:取虎杖、板藍根粉碎成粗顆粒,加5倍量70%乙醇加熱回流提取2h,濾過;藥渣再加3倍量70%乙醇加熱回流提取1h,濾過,濾液合并,回收乙醇并減壓濃縮至60℃下相對密度1.35~1.40的稠膏,備用;

s2:取連翹、柴胡加7倍量的水,加熱回流提取揮發(fā)油4h,分取分層的揮發(fā)油,備用;藥渣和藥液粗濾,濾液離心分離,上清液和藥渣分別保存?zhèn)溆茫?/p>

s3:取敗醬草、馬鞭草、蘆根、甘草與s2步驟得到的柴胡、連翹提取揮發(fā)油后藥渣合并,加水煎煮提取二次,第一次加18倍量水提取2h,第二次加12倍量水提取1h,粗濾,濾液離心分離,兩次提取的上清液與s2步驟得到的柴胡、連翹提取揮發(fā)油后的上清液合并,減壓濃縮至60℃下相對密度1.35~1.40的稠膏,備用;

s4:取糊精、微粉硅膠,混勻,加入到上述s1步驟得到的水提濃縮稠膏與s3步驟得到的醇提濃縮稠膏中,充分攪拌均勻,鋪層,真空干燥,粉碎,加入糊精,噴入s2步驟得到的揮發(fā)油,過篩,混勻,裝入膠囊,制成1000粒,即得。

陽性藥物:聯(lián)苯雙酯片,由河北東風(fēng)藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字h13023295,規(guī)則:25mg,批號:20160221。用蒸餾水配制成濃度為0.40mg/ml的藥液,4℃冷藏保存。

試劑:丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alt)試劑盒,天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ast)試劑盒,膽固醇(tc)試劑盒,上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司。

1.2實驗動物icr小鼠,雄性,18~22g。由安徽中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供,動物生產(chǎn)許可證號:scxk(皖)2012-2013。

1.3實驗儀器selectra-e全自動生化儀,由北京華奧智恒科技有限公司制造;低速大容量多管離心機,由上海嘉鵬科技有限公司制造;電子天平,由常州市天之平儀器設(shè)備有限公司制造;j-50型流化床氣流粉碎機,由上海賽山粉體機械制造有限公司生產(chǎn);winner2308智能型全量程干濕一體激光粒徑儀,由濟南微納顆粒儀器股份有限公司制造;bp211d型電子分析天平,由常州市天之平儀器設(shè)備有限公司制造。

2.實驗方法

2.1動物分組

雄性icr小鼠,分為疏風(fēng)解毒膠囊、正常對照組、模型對照組、陽性對照(聯(lián)苯雙酯滴丸)組,每組10只,共10組。

2.2給藥與造模

每日灌胃給藥1次,灌胃容積均為0.1ml/10g體重。正常對照組和模型對照組給予水;疏風(fēng)解毒膠囊灌胃給予0.5g/ml的疏風(fēng)解毒膠囊。每次給藥后2h,除正常對照組外,其余組按10ml/kg體重灌胃給予56°白酒,連續(xù)60天造成慢性酒精性肝損傷模型。

2.3指標(biāo)測定末次灌胃給予酒精后禁食不禁水,12h后摘眼球取血,4000r/min離心15min,取血清備測alt,ast,tc。

2.4統(tǒng)計學(xué)處理:實驗數(shù)據(jù)以x±s表示,組間差異采用t檢驗。

3.結(jié)果

對酒精性肝損傷小鼠血清alt,ast,tc的影響

表5結(jié)果顯示,與正常對照組比較,模型對照組小鼠血清alt、ast、tc明顯升高(p<0.05,p<0.01)。與模型對照組比較,疏風(fēng)解毒膠囊不能降低血清alt(p>0.05)、血清ast(p>0.05)和血清tc(p>0.05)。說明疏風(fēng)解毒膠囊對慢性酒精性肝損傷小鼠血清alt、ast、tc沒有明顯的改善作用,對酒精性肝損傷小鼠的改善作用不明顯。

表5對酒精性肝損傷小鼠血清alt、ast的影響n=10

與正常組相比:p<0.05,△△p<0.01;與模型組相比:*p<0.05

附圖說明:

圖1為混合對照品溶液的高效液相色譜圖

圖2為缺柴胡陰性對照溶液的高效液相色譜圖

圖3為缺虎杖陰性對照溶液的高效液相色譜圖

圖4為疏風(fēng)解毒膠囊樣品的高效液相色譜圖

圖5為正常對照組小鼠肝臟組織病理切片圖(200×)

圖6為模型對照組小鼠肝臟組織病理切片圖(200×)

圖7為陽性對照組小鼠肝臟組織病理切片圖(200×)

圖8為疏風(fēng)解毒膠囊組小鼠肝臟組織病理切片圖(200×)

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步解說。

實施例1:

疏風(fēng)解毒膠囊:

處方:虎杖450g、連翹360g、板藍根360g、柴胡360g、敗醬草360g、馬鞭草360g、蘆根270g、甘草180g;

制備方法:

s1:取虎杖、板藍根粉碎成粗顆粒,加5倍量70%乙醇加熱回流提取2h,濾過;藥渣再加3倍量70%乙醇加熱回流提取1h,濾過,濾液合并,回收乙醇并減壓濃縮至60℃下相對密度1.35~1.40的稠膏,備用;

s2:取連翹、柴胡加7倍量的水,加熱回流提取揮發(fā)油4h,分取分層的揮發(fā)油,備用;藥渣和藥液粗濾,濾液離心分離,上清液和藥渣分別保存?zhèn)溆茫?/p>

s3:取敗醬草、馬鞭草、蘆根、甘草與s2步驟得到的柴胡、連翹提取揮發(fā)油后藥渣合并,加水煎煮提取二次,第一次加18倍量水提取2h,第二次加12倍量水提取1h,粗濾,濾液離心分離,兩次提取的上清液與s2步驟得到的柴胡、連翹提取揮發(fā)油后的上清液合并,減壓濃縮至60℃下相對密度1.35~1.40的稠膏,備用;

s4:取糊精、微粉硅膠,混勻,加入到上述s1步驟得到的水提濃縮稠膏與s3步驟得到的醇提濃縮稠膏中,充分攪拌均勻,鋪層,真空干燥,粉碎,加入糊精,噴入s2步驟得到的揮發(fā)油,過篩,混勻,裝入膠囊,制成1000粒,即得。

采用rp-hplc雙波長切換法同時測定疏風(fēng)解毒膠囊中表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?;窈碥誨的含量,其檢測方法的步驟如下:

(1)色譜條件:色譜柱:c18柱,規(guī)格:250mm×4.6mm,5μm;流動相:乙腈-0.4mol/l磷酸二氫鈉溶液,梯度洗脫,洗脫程序為:0至10min,乙腈從5%線性上升至15%,0.4mol/l磷酸二氫鈉溶液從95%線性下降至85%,從11至20min,乙腈從15%線性上升至35%,0.4mol/l磷酸二氫鈉溶液從85%線性下降至65%;流速:1.5ml·min-1;檢測波長:0至10min檢測波長235nm,11至20min檢測波長336nm;柱溫:36℃;進樣量:20μl;

(2)混合對照品溶液的制備:分別取表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d對照品,精密稱定,置同一100ml棕色量瓶中,用0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成質(zhì)量濃度分別為300.0mg·l-1、350.0mg·l-1和450.0mg·l-1的混合對照品溶液;

(3)供試品溶液的制備:取本品內(nèi)容物0.1g,精密稱定,置5ml離心管中,精密加入0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液4ml,稱定質(zhì)量,以功率300w、頻率60khz超聲提取40min,放冷,再稱定質(zhì)量,用0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液補足所減失的質(zhì)量,離心,取上清液,濾紙過濾后,取續(xù)濾液,再用0.45μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得供試品溶液;

(4)測定:取混合對照品溶液、供試品溶液各20μl,注入高效液相色譜儀,測定;

(5)測定結(jié)果:本品每克含表兒茶素沒食子酸酯、決明松-8-o-葡萄糖苷和丙二?;窈碥誨分別為1.35mg、1.26mg、2.88mg。

以上所述,僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式,但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此,任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi),根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變,都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

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