本發(fā)明涉及制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及束花石斛降血糖有效部位、有效成分及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
石斛，蘭科植物之一，在我國主要分布于西南、華南、臺灣等地，對人體具有曲解虛熱、益精強陰等療效，藥用價值已被世人所認可，并被廣泛使用。石斛始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，記載：“味甘、平，無毒；治傷中，除痹，下氣，補五臟虛勞，贏瘦，強陰；久服厚腸胃，輕身，延年，長肌肉，逐皮膚邪熱，定志除驚等”。《本草綱目拾遺》(清·趙學敏)：“清胃除虛熱，生津，已勞損，以之代茶，開胃健脾，定驚療風，能鎮(zhèn)炎痰，解暑，甘芳降氣等”。
石斛屬為蘭科比較大的屬之一，全球約有1000余種，我國有石斛屬植物共74種2變種，其中有藥用價值且能進行商品流通的有50余種，如束花石斛、鐵皮石斛、金釵石斛等。束花石斛(dendrobiumchrysanthumlindl.)是《中華人民共和國藥典》收載入藥的石斛中藥材之一，味淡、性微寒，有滋陰養(yǎng)胃、清熱解毒的功效，在臨床上多用于治療慢性咽喉炎、眼科疾病、血栓閉塞性疾病，效果十分明顯，現(xiàn)是脈絡(luò)寧、通塞脈片、石斛夜光丸等著名中成藥的主要原料之一，為我國常用的傳統(tǒng)中藥植物，國內(nèi)外需求量大。在我國主要分布在云南、廣西、貴州等省。
現(xiàn)有研究中，尚未有束花石斛及其制劑用于糖脂代謝紊亂防治中的研究報道。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題，就是提出一種束花石斛降血糖有效部位和有效成分，其具有降血糖活性，可用于防治糖脂代謝紊亂，同時提出上述有效部位和有效成分的制備方法和應(yīng)用。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：
一種束花石斛降血糖有效部位的制備方法，包括以下步驟：
(1)以干燥束花石斛莖為原料，粉碎后用極性溶劑提取得到提取液，然后進行抽濾處理得到總浸膏；
(2)將總浸膏與水混溶，然后依次用極性由低到高的a、b、c、d四種溶劑進行梯度萃取，分別得到四種萃取部位的浸膏，其中，溶劑a為非極性溶劑，溶劑b為常用的中等偏低極性溶劑，溶劑c為中強極性溶劑，溶劑d為強極性溶劑；
(3)最后將四種萃取部位的浸膏分別進行濃縮和蒸干，得到a、b、c、d四種有效部位。
作為優(yōu)選地，所述步驟(1)中提取用的極性溶劑為丙酮、甲醇、乙醇、水中的一種或多種，提取溫度為60～100℃,回流提取3-5次，每次2-4h。
作為優(yōu)選地，所述步驟(2)中的溶劑a為石油醚、環(huán)己烷、苯中的一種或多種，溶劑b為三氯甲烷、乙醚、四氫呋喃中的一種或多種，所述溶劑c為乙酸乙酯，所述溶劑d為正丁醇、異丙醇中的一種或兩種。
作為優(yōu)選地，上述束花石斛降血糖有效部位的制備方法具體包括以下步驟：
(1)以干燥束花石斛莖為原料，粉碎后用95％的乙醇提取得到提取液，然后進行抽濾處理得到總浸膏；
(2)將總浸膏與水按2:1混溶，然后依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇四種溶劑進行梯度萃取，分別得到四種萃取部位的浸膏；
(3)最后將四種萃取部位的浸膏分別進行濃縮和蒸干，得到石油醚有效部位、三氯甲烷有效部位、乙酸乙酯有效部位及正丁醇有效部位。
一種束花石斛降血糖有效成分的制備方法，包括如下步驟：將溶劑b萃取得到的有效部位先經(jīng)200-300目的硅膠柱色譜分離，然后用極性從小到大的洗脫劑體系e和洗脫劑體系f進行梯度洗脫，tlc檢識，合并相同組分，得到各組分再反復經(jīng)200-300目的硅膠柱色譜，sephadexlh-20柱色譜及石油醚或乙酸乙酯重結(jié)晶分離純化得到化合物異紐替皂苷元和26-o-紐替皂苷元葡萄糖苷。
作為優(yōu)選地，所述洗脫劑體系e為石油醚-二氯甲烷體系，所述洗脫劑體系f為二氯甲烷-甲醇體系。
作為優(yōu)選地，上述束花石斛降血糖有效成分的制備方法，具體包括如下步驟：將三氯甲烷部位經(jīng)過200-300目硅膠柱色譜，以硅膠作為吸附劑，石油醚-二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇進行梯度洗脫，每1000ml為一個流分，以石油醚:二氯甲烷＝100:1、20:1、10:1、8:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1和二氯甲烷11個梯度進行第一階段洗脫，然后以二氯甲烷：甲醇＝100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、4:1、2:1及純甲醇8個梯度進行第二階段洗脫；二氯甲烷：甲醇＝50:1的流分經(jīng)200-300目硅膠柱色譜，sephadexlh-20柱色譜及石油醚/乙酸乙酯混合重結(jié)晶分離純化得到變形螺甾烷醇類甾體皂苷：26-o-紐替皂苷元葡萄糖苷及異紐替皂苷元化合物。
本發(fā)明還提出了采用上述束花石斛降血糖有效部位的制備方法制備得到的束花石斛降血糖有效部位。
本發(fā)明還提出了采用上述束花石斛降血糖有效成分的制備方法制備得到的束花石斛降血糖有效成分。
本發(fā)明還提出了束花石斛在制備降血糖的藥物或者功能性食品方面的應(yīng)用，具體地，是束花石斛制備得到的降血糖有效部位或有效成分在制備降血糖的藥物或者功能性食品方面的應(yīng)用。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果為：本發(fā)明的以束花石斛根莖作為依托，開發(fā)其功效，擴大束花石斛新的藥用資源和實現(xiàn)資源的綜合利用。后期采用hplc-ms/ms對束花石斛醇提物化學成分進行分析，結(jié)合保留時間、分子離子峰及二級質(zhì)譜的碎片信息等，推定出苯丙素類化合物29個(其中14個為新化合物)、黃酮及黃酮苷類9個、菲類及聯(lián)芐類25個、糖苷類18個、簡單苯取代物18個、芴酮類化合物4個、生物堿類化合物12個。動物實驗研究表明：將束花石斛三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位不同濃度的樣品作用于胰島素抵抗的hepg2細胞，用葡萄糖試劑盒檢測細胞對葡萄糖的消耗量，mtt法檢測細胞活性，結(jié)果顯示，與模型組比較，束花石斛各部位浸膏都能夠在一定程度上促進胰島素抵抗的hepg2細胞對葡萄糖的消耗，其中三氯甲烷部位給藥組hepg2細胞胰島素敏感性顯著改善。
另外，三氯甲烷部位進行處理獲得異紐替皂苷元和26-o-紐替皂苷元葡萄糖苷的束花石斛降血糖有效成分，其通過改善胰島素抵抗，恢復胰島素這種降血糖激素對血糖的調(diào)節(jié)，用于防治糖脂代謝紊亂。
附圖說明
圖1為試驗大鼠口服葡萄糖后各個時刻血糖值。
具體實施方式
為讓本領(lǐng)域的技術(shù)人員更加清晰直觀的了解本發(fā)明，下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例1
束花石斛總浸膏的制備：用7.5kg束花石斛干燥莖粉碎后用95％乙醇加熱回流提取4次，每次3h，抽濾，旋蒸回收溶劑，得束花石斛總浸膏550g。
將束花石斛總浸膏(高、低劑量組)作用于2型糖尿病大鼠(高糖高脂喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量注射stz誘導)，通過比較給藥前后大鼠血糖和體重的變化，并測定給藥后大鼠血脂四項、胰島素的含量和血糖值，結(jié)合口服糖耐量試驗來研究束花石斛對2型糖尿病大鼠的影響。
結(jié)果顯示，與給藥前大鼠血糖值比較，束花石斛高劑量組能顯著降低糖尿病大鼠血糖；束花石斛給藥組(高、低劑量組)的hdl-c含量明顯高于模型組，而ldl-c含量明顯低于模型組；束花石斛給藥組(高、低劑量組)血糖和糖化血清蛋白均明顯低于模型組，束花石斛高劑量組胰島素抵抗指數(shù)也明顯低于模型組；口服糖耐量試驗顯示，模型組大鼠的藥時曲線下面積最大。說明束花石斛具有顯著的降低糖尿病大鼠血糖、綜合改善糖尿病大鼠脂代謝紊亂和胰島素抵抗、增強糖尿病大鼠耐受葡萄糖的能力，為研究束花石斛降血糖物質(zhì)基礎(chǔ)提供了實驗依據(jù)。
因此，本發(fā)明的束花石斛莖提取物可應(yīng)用在降血糖的藥物或者功能性食品中，用于防治糖脂代謝紊亂。
上述驗證實驗具體過程如下：
一、實驗材料
1、實驗動物
4-5周雄性sd大鼠50只，體重80-110g，購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心。
2、材料來源
束花石斛干燥莖，購于云南文山。
3、主要試劑與儀器
鏈脲佐菌素(stz)購于美國sigma公司，臨用前用0.1mol/ml檸檬酸鹽緩沖液(ph＝4.4)配成1％的溶液(10mg/ml的stz)；陽性藥：羅格列酮(購于廣州有田生物科技有限公司)，配成0.084mg/ml備用；麻醉藥：戊巴比妥鈉(購于廣州東巨實驗儀器有限公司)；甘油三酯(tg，批號：20151207)；總膽固醇(tc，批號：20151206)；高密度脂蛋白膽固醇(hdl，批號：20151204)；低密度脂蛋白膽固醇(ldl，批號：20151207)；葡萄糖(glu，批號：20150603147)；糖化血清蛋白(gsp，批號：20151216)試劑盒購于南京建成生物工程研究所；高糖高脂飼料購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心；歐姆龍血糖儀(購于歐姆龍健康醫(yī)療(中國)有限公司)；血糖試紙(購于達而泰(天津)實業(yè)有限公司)。
二、實驗方法
1、造模
4-5周雄性sd大鼠50只，免疫觀察室喂養(yǎng)三天后將其置于室溫(18-25℃)，相對濕度(50％-80％)的環(huán)境下，自由采食飲水，適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，高糖高脂飼料喂養(yǎng)，喂養(yǎng)四周后，禁食過夜。將已配好的10mg/ml的stz，避光、冰浴、即用。按35mg/kg的stz腹腔注射造模，繼續(xù)高脂飲食，觀察大鼠飲食飲水量、尿量、毛色、體重等情況，兩周后禁食8h測血糖，選取血糖高于11.1mmol/l者作為高血糖模型大鼠。
2、降血糖實驗
將高血糖模型大鼠隨機分成4組，分別為模型組、陽性對照組、束花石斛高劑量組、束花石斛低劑量組，每組8只，正常對照組8只。記錄給藥前各大鼠的血糖值和體重。束花石斛高劑量組的給藥劑量折算為生藥材按平均每日2.16g/kg體重給藥，束花石斛低劑量組的給藥劑量折算為生藥材按平均每日1.08g/kg體重給藥。模型對照組給予同體積生理鹽水，陽性對照組每日平均給予0.42mg/kg羅格列酮，連續(xù)灌胃給藥。因糖尿病模型大鼠具有典型的三多一少癥狀，每日觀察記錄體重、飲食、飲水、墊料情況，每10天檢測血糖值(尾靜脈取血)，給藥8周后，將所有大鼠禁食過夜，尾靜脈取血測血糖值，并記錄大鼠體重。采用1％戊巴比妥鈉(0.3ml/100g)麻醉大鼠，將鼠仰臥并固定于鼠固定板上，剪去胸腹部位的被毛，并且用75％酒精消毒皮膚，剪開腹腔，靜脈采血，血樣置入無酶采血管中，離心(3000rpm，15min)，棄去血漿，留血清備用。取大鼠腎臟、下丘腦、垂體備用。測定血清中的甘油三酯(tg)、總膽固醇(tc)、高密度脂蛋白膽固醇(hdl-c)、低密度脂蛋白膽固醇(ldl-c)、糖化血清蛋白(gsp)、胰島素及血糖值。
三、實驗原理
1、血脂四項的測定
血脂四項包括血漿總膽固醇(tc)，血漿甘油三酯(tg)，低密度脂蛋白膽固醇(ldl-c)，高密度脂蛋白膽固醇(hdl-c)?？偰懝檀际侵秆褐兴兄鞍姿懝檀贾偤?，是臨床血脂分析的重要指標，總膽固醇升高，患心腦血管病的危險性增加。甘油三酯是人體內(nèi)含量最多的脂類，其首要功能是為細胞代謝提供能量。但當其升高可見于各種高脂蛋白血癥、糖尿病、痛風、梗阻、黃疸、甲狀腺功能低下、胰腺炎等，同時甘油三酯也是冠心病的一個危險因素。高密度脂蛋白為血清蛋白之一，是一種抗動脈粥樣硬化的血漿脂蛋白，是冠心病的保護因子。俗稱“血管清道夫”。相反，低密度脂蛋白則被稱之為“壞的膽固醇”。
糖尿病患者血脂異常典型特征：tg增高、ldl-c升高或正常、ldl-c亞型小而密、ldl(sldl-c)比例增高，從而致粥樣硬化血脂異常。臨床上高tg合并高ldl-c較為多見，最常見的是tc和tg水平都顯著升高，而單純性血脂異常很少。因此，血脂四項的測定可以在一定程度上反映出糖尿病大鼠的狀態(tài)。
2、血糖、糖化血清蛋白、胰島素的測定及胰島素抵抗指數(shù)的計算
對于糖尿病病人而言，血糖濃度是其臨床檢驗的重要指標，但它具有臨時性的特點。糖化血清蛋白(gsp)主要是白蛋白與葡萄糖發(fā)生糖化反應(yīng)，形成果糖胺，其形成量與血糖水平呈正相關(guān)，gsp在血中濃度穩(wěn)定，半衰期為14-20天，血清中g(shù)sp的水平能有效反映過去2-3周內(nèi)平均血糖水平，其不會受到臨時血糖濃度波動的干擾。因此，聯(lián)合測定空腹血糖和糖化血清蛋白在糖尿病檢測中具有重要的意義，測定結(jié)果可以成為糖尿病病人的敏感性診斷標準。
胰島素由胰島β細胞分泌，是機體內(nèi)唯一降低血糖的激素，同時也是唯一能促進糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成的激素。測定血清胰島素是糖尿病診斷和分型的參考指標。
homa-ir是用于評價個體胰島素抵抗水平的指標，本實驗中胰島素抵抗指數(shù)計算公式如下：
homair＝fpg×fins/22.5
fpg：空腹血糖值(mmol/l)；fins：空腹胰島素水平(miu/l)。
四、口服糖耐量實驗
口服葡萄糖耐量試驗(ogtt)是一種葡萄糖負荷試驗，指給成人口服75g無水葡萄糖，兒童按每公斤體重1.75g計算，總量不超過75g，然后測其血糖變化，觀察病人耐受葡萄糖的能力，其目的是了解胰島β細胞功能和機體對血糖的調(diào)節(jié)能力，是診斷糖尿病的金標準。
五、實驗結(jié)果
1、束花石斛對血糖和體重的影響
在造模前，各大鼠的血糖平均值在(4.8±0.5)mmol/l，造模后各大鼠逐漸出現(xiàn)多食多飲、多尿、體重下降、毛色灰暗等癥狀，造模2周后大鼠血糖顯著升高，模型較穩(wěn)定，各給藥組對大鼠空腹血糖和體重的實驗結(jié)果如表1所示，給藥8周后，束花石斛高劑量組大鼠血糖降低差異具有統(tǒng)計學意義，模型組大鼠血糖值有所升高。后期羅格列酮陽性組以及束花石斛給藥組大鼠毛色和精神狀態(tài)都有好轉(zhuǎn)，運動量增加，多食、多飲、多尿的癥狀顯著減輕，后期的體重也有所增加。
表1給藥前后大鼠的血糖和體重(
給藥前后比較：*p<0.05。
六、束花石斛對血脂四項的影響
sd大鼠造模成功之后出現(xiàn)了糖尿病常見的三多一少癥狀：多尿，多食，多飲，體重減輕。測得的大鼠血清中的血脂四項結(jié)果如下：從表2可知，與模型組相比，羅格列酮陽性組、束花石斛高劑量給藥組及束花石斛低劑量給藥組的高密度脂蛋白含量顯著高于模型組(p<0.05)，同時也顯著高于正常組(p<0.05)，具有統(tǒng)計學意義；正常組、羅格列酮陽性組、束花石斛高劑量給藥組及束花石斛低劑量給藥組的低密度脂蛋白含量顯著低于模型組(p<0.05)；正常組、束花石斛高劑量組及束花石斛低劑量的甘油三酯含量均顯著低于模型組(p<0.05)，模型組的甘油三酯水平顯著高于正常組(p<0.05)；給藥組和模型組的總膽固醇水平均高于正常組，尤其是模型組、陽性組和束花石斛低劑量組顯著高于正常組(p<0.05)。
表2給藥后大鼠的血脂四項(
與模型組比較：*p<0.05；與正常組比較：△p<0.05
七、血糖、糖化血清蛋白、胰島素及胰島素抵抗指數(shù)
測得的大鼠血清中的血糖、糖化血清蛋白及胰島素水平結(jié)果如下：從表3可知，羅格列酮陽性組、束花石斛高劑量組和束花石斛低劑量組的血糖和糖化血清蛋白含量均明顯低于模型組(p<0.05)，具有統(tǒng)計學意義。與正常組比較，所有組的的血糖水平都明顯高于正常組(p<0.05)，但只有模型組的糖化血清蛋白明顯高于正常組(p<0.05)；正常組和束花石斛低劑量組血清胰島素含量明顯高于模型組(p<0.05)，羅格列酮陽性組和束花石斛高劑量組的胰島素水平也高于模型組，但不具有統(tǒng)計學意義。
模型組、羅格列酮陽性組、束花石斛高劑量組和束花石斛低劑量組的胰島素抵抗指數(shù)均大于正常組(p<0.05)，但陽性藥組、束花石斛高劑量組和束花石斛低劑量組的胰島素抵抗指數(shù)均小于模型組，而且束花石斛高劑量組明顯低于模型組，說明束花石斛可顯著改善糖尿病大鼠的胰島素抵抗。
表3給藥后大鼠的血糖、糖化血清蛋白、胰島素及胰島素抵抗指數(shù)(
與模型組比較：*p<0.05；與正常組比較：△p<0.05
八、口服葡萄糖耐量試驗(ogtt)
大鼠口服葡萄糖耐量試驗結(jié)果如圖1所示，由此可知，正常組大鼠在口服葡萄糖1h后，血糖值達最大，在3h時基本恢復至空腹血糖水平。模型組、陽性組、束花石斛高劑量組、束花石斛低劑量組大鼠在口服葡萄糖0.5h后，血糖值達最大，隨后隨著時間的推移，血糖值逐漸降低，但不能降至空腹水平。模型組大鼠的藥時曲線下面積大于陽性組、束花石斛高劑量給藥組、束花石斛低劑量給藥組，說明藥物干預(yù)能提高糖尿病大鼠對葡萄糖耐受能力。
上述實施例中，95％乙醇可以用丙酮、甲醇、水代替，并不會影響實驗結(jié)果，本實施例中不再進行贅述。
實施例2
束花石斛降血糖有效部位的制備：將實施例1獲得的總浸膏用2倍體積的水溶解，先后用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇進行萃取，分別得到四種萃取部位的浸膏；最后將各萃取部位的浸膏進行濃縮，分別蒸干，得到石油醚有效部位、三氯甲烷有效部位、乙酸乙酯有效部位以及正丁醇有效部位。
采用高濃度胰島素誘導的胰島素抵抗的肝癌細胞(hepg2)對各部位浸膏進行改善胰島素抵抗活性測試，綜合細胞葡萄糖消耗量和mtt篩選結(jié)果，表明三氯甲烷部位給藥組hepg2細胞胰島素敏感性顯著改善，當加藥濃度為2.0mg/ml時，葡萄糖消耗量達到模型組的4.424倍，為繼續(xù)研究束花石斛三氯甲烷部位的降血糖活性成分提供了實驗依據(jù)。
本實施例中，萃取溶劑石油醚還可以由環(huán)己烷和/或苯代替，三氯甲烷還可以由乙醚和/或四氫呋喃代替，正丁醇還可以由異丙醇代替。
實施例3
將實施例2中獲得的三氯甲烷部分經(jīng)過200-300目硅膠柱色譜，以硅膠作為吸附劑，石油醚-二氯甲烷，二氯甲烷-甲醇進行梯度洗脫，每1000ml為一個流分，以石油醚：二氯甲烷＝100:1、20:1、10:1、8:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1和二氯甲烷11個梯度進行第一階段洗脫，然后以二氯甲烷：甲醇＝100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、4:1、2:1及純甲醇8個梯度進行第二階段洗脫；二氯甲烷：甲醇＝50:1的流分經(jīng)200-300目硅膠柱色譜，sephadexlh-20柱色譜及石油醚或乙酸乙酯重結(jié)晶分離純化得到化合物異紐替皂苷元和26-o-紐替皂苷元葡萄糖苷。
化合物1：異紐替皂苷元；化合物2：26-o-紐替皂苷元葡萄糖苷的單體降血糖部位。
表4化合物1、2葡萄糖消耗量(x±s，n＝4)
與模型組比較：**p≤0.01*p≤0.05
表5化合物1、2mtt檢測od值(x±s，n＝4)
由表4可知，異紐替皂苷元加藥組葡萄糖消耗在藥物濃度為3.125-12.5μmol·l-1時隨濃度增加而逐漸增大，當濃度為12.5μmol·l-1時，異紐替皂苷元加藥組葡萄糖消耗達到最大，為模型組的179.4％。隨著加藥濃度的繼續(xù)增加，葡萄糖消耗量逐漸減小。在濃度為25μmol·l-1時，26-o-紐替皂苷元葡萄糖苷加藥組的葡萄糖消耗達到最大，為模型組的186.5％。隨著濃度增加，葡萄糖消耗量逐漸減少。由表5可知，當濃度為100μmol·l-1時，26-o-紐替皂苷元葡萄糖苷加藥組的細胞存活量為模型組的55.1％，可見26-o-紐替皂苷元葡萄糖苷在高濃度時對hepg2細胞的活力影響較大。26-o-紐替皂苷元葡萄糖苷為變形螺甾烷型甾體皂苷，其苷元為異紐替皂苷元。
化合物2的活性優(yōu)于化合物1，其結(jié)構(gòu)上存在相似性，區(qū)別在于葡萄糖分子，可見與葡萄糖分子結(jié)合形成苷后，能促進細胞的葡萄糖消耗。
因此，本發(fā)明的束花石斛、束花石斛降血糖有效部位以及束花石斛降血糖有效成分可在降血糖方面得到應(yīng)用，尤其是在制備降血糖的藥物或者功能性食品方面的應(yīng)用。
本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)石斛屬中含有變形螺甾烷型甾體皂苷：26-o-紐替皂苷元葡萄糖苷及其作用，豐富了該屬植物的成分類型和降血糖機理。