本發(fā)明屬于桐花樹技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種桐花樹葉正丁醇提取物及其制備和治療前列腺癌的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

紅樹林植物桐花樹(aegicerascorniculatum)，又名蠟燭果，浪柴，紅蒴等，系紫金?？葡灎T果屬植物，屬紅樹植物分布很廣的植物之一，一般分布在熱帶，亞熱帶海岸的中灘、內(nèi)灘。民間用藥記載其莖皮和葉熬汁對(duì)糖尿病、哮喘和風(fēng)濕等疾病有一定的療效。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)桐花樹提取物具有細(xì)胞毒性、抗真菌、止瀉、抗氧化與保肝等藥理作用，但對(duì)桐花樹葉正丁醇部位提取物抗癌的研究尚未見有報(bào)道。

前列腺癌(prostatecancer，pca)是老年男性泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居歐美發(fā)達(dá)國(guó)家男性惡性腫瘤之首，死亡率居第2位，僅次于肺癌。隨著我國(guó)人口老齡化和生活方式的改變、男性平均壽命的延長(zhǎng)以及醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)的提高，我國(guó)pca發(fā)病率和檢出率已呈顯著上升趨勢(shì)。

由于pca發(fā)病隱匿，早期臨床癥狀常不典型。因此，大多數(shù)pca確診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移或進(jìn)入晚期。pca的發(fā)病主要受年齡、種族和家庭遺傳的影響，同時(shí)也與激素、營(yíng)養(yǎng)有關(guān)。其主要的治療方法有雄激素剝奪療法、根治性前列腺切除術(shù)、化療和局部照射療等。目前，80％以上的pca晚期患者在臨床上使用雄激素阻斷治療，但這是一種有爭(zhēng)議的并且療效不明確的治療手段。超過半數(shù)的pca晚期患者在接受化療藥物/靶向治療后(如紫杉醇或多烯紫杉醇)，很快會(huì)出現(xiàn)耐藥，不得不采用其他的姑息療法，例如使用磷酸雌二醇氮芥(estramustinephosphate，emp)，以及類固醇進(jìn)行治療。但是，臨床效果令人失望。大約有半數(shù)以上的患者在一至兩年內(nèi)死亡。因此，從中醫(yī)藥中尋求新型、安全有效的的治療藥物是目前治療前列腺癌的重要研究方向。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供一種桐花樹葉正丁醇提取物及其制備和治療前列腺癌的應(yīng)用，以擴(kuò)大桐花樹的使用范圍，為癌癥治療開辟新途徑。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

桐花樹葉正丁醇提取物在制備治療前列腺癌藥物方面的應(yīng)用。

藥物為膠囊劑、片劑、丸劑、顆粒劑、膏劑、合劑、混懸劑，該藥物以桐花樹葉正丁醇部位為活性成分，加入常規(guī)輔料按照常規(guī)工藝制成。

前列腺癌源于人前列腺癌細(xì)胞pc3、du145。

桐花樹葉正丁醇提取物的制備方法，將桐花樹葉加入乙醇浸泡得到桐花樹葉乙醇總提物，將乙醇總提物中乙醇揮發(fā)后，加入石油醚進(jìn)行萃取，獲取下層水相，下層水相先加乙酸乙酯后加正丁醇繼續(xù)萃取，獲取上層正丁醇部位提取物，再經(jīng)水浴干燥，即得。

上述桐花樹葉正丁醇提取物的制備方法，按以下操作進(jìn)行：將桐花樹葉曬干打成粗粉，加入25倍量95％乙醇浸泡7天；通過減壓濃縮得到桐花樹葉乙醇總提物，將乙醇總提物加純水溶解成混懸液，揮發(fā)至無乙醇味后，加入石油醚進(jìn)行萃取，獲取下層水相，將下層水相加乙酸乙酯繼續(xù)萃取，得到的下層水相繼續(xù)加正丁醇繼續(xù)萃取，獲得上層正丁醇部位提取物，將上層正丁醇部位提取物水浴干燥，即得桐花樹葉正丁醇提取物。

上述制備方法得到的桐花樹葉正丁醇提取物。

為充分開發(fā)桐花樹資源，發(fā)明人建立了一種桐花樹葉正丁醇提取物的制備方法，將桐花樹葉加入乙醇浸泡得到桐花樹葉乙醇總提物，將乙醇總提物中乙醇揮發(fā)后，加入石油醚進(jìn)行萃取，獲取下層水相，下層水相先加乙酸乙酯后加正丁醇繼續(xù)萃取，獲取上層正丁醇部位提取物，再經(jīng)水浴干燥，即得。體外分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明，桐花樹葉正丁醇提取物對(duì)人前列腺癌pc3、du145細(xì)胞具有增殖抑制作用，并可抑制人前列腺癌細(xì)胞pc3和du145的轉(zhuǎn)移。因此，桐花樹葉正丁醇提取物在制備治療前列腺癌藥物方面具有潛在應(yīng)用前景，可用于制備抗前列腺癌藥物。深入開發(fā)桐花樹葉正丁醇提取物可以擴(kuò)大桐花樹的使用范圍，為癌癥治療開辟新途徑。

附圖說明

圖1是本發(fā)明桐花樹葉正丁醇提取物對(duì)人前列腺癌細(xì)胞增殖抑制作用的結(jié)果圖。

圖2是本發(fā)明桐花樹葉正丁醇提取物對(duì)人前列腺癌細(xì)胞活性影響的平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

圖3是本發(fā)明桐花樹葉正丁醇提取物對(duì)人前列腺癌細(xì)胞活性影響的結(jié)果柱狀圖。

圖4是本發(fā)明桐花樹葉正丁醇提取物對(duì)人前列腺癌細(xì)胞遷移抑制作用的劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

圖5是本發(fā)明桐花樹葉正丁醇提取物對(duì)人前列腺癌細(xì)胞遷移抑制作用結(jié)果的柱狀圖。

圖6是本發(fā)明桐花樹葉正丁醇提取物誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡結(jié)果的流式細(xì)胞儀圖。

圖7是本發(fā)明桐花樹葉正丁醇提取物誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡結(jié)果的柱狀圖。

具體實(shí)施方式

一、桐花樹葉正丁醇部位提取物(nacl)的制備

1.藥材：桐花樹葉采于廣西防城港，經(jīng)廣西北部灣海洋研究中心許銘本鑒定為金?？葡灎T果屬植物桐花樹的葉子。

2.提取與分離：將桐花樹葉曬干打成粗粉(2500g)，加入25倍量(62.5l)95％乙醇浸泡7天；通過減壓濃縮得到桐花樹葉乙醇總提物，將乙醇總提物加純水溶解成混懸液，揮發(fā)至無乙醇味后，加入石油醚進(jìn)行萃取，獲取下層水相，將下層水相加乙酸乙酯繼續(xù)萃取，得到的下層水相繼續(xù)加正丁醇繼續(xù)萃取，獲得上層正丁醇部位提取物，將上層正丁醇部位提取物水浴干燥，即得桐花樹葉正丁醇提取物。

二、桐花樹葉正丁醇部位提取物藥效學(xué)研究

1.實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞株——人前列腺癌細(xì)胞pc3，du145由廣西醫(yī)科大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心提供。

藥材——桐花樹葉

主要試劑和耗材——

主要試劑——

凋亡試劑盒(pharmingenfitcannexinvapoptosisdetectionkit1)：美國(guó)raybiotech公司；

細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(mts)：美國(guó)promega公司；

結(jié)晶紫染色液：中國(guó)碧云天公司；

氯仿、異丙醇、無水乙醇、水合氯醛等為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

主要耗材——

25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶：美國(guó)bd公司；

6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿、10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿：美國(guó)bd公司；

細(xì)胞6孔板、24孔板、96孔板：美國(guó)bd公司；

15毫升離心管、50毫升離心管：美國(guó)bd公司；

凍存管：美國(guó)bd公司；

移液管：美國(guó)corning公司；

槍頭盒、ep管、pcr管：美國(guó)axygen公司；

主要儀器——

電動(dòng)移液器、可調(diào)式移液器、低溫高速離心機(jī)：德國(guó)eppendorf公司生產(chǎn)；

細(xì)胞培養(yǎng)孵箱、生物安全柜、液氮罐：美國(guó)thermo科學(xué)公司；

-80℃生物超低溫冰箱：美國(guó)thermo科學(xué)公司；

超凈工作臺(tái)：蘇州金凈公司；

37℃細(xì)菌培養(yǎng)箱、烤箱：中國(guó)精宏公司；

倒置熒光顯微鏡：日本olympus公司；

掌上離心機(jī)：美國(guó)thermofisherscientific公司；

高壓滅菌鍋、-20℃生物冰箱、4℃生物冰箱：中國(guó)海爾公司；

碎冰制冰機(jī)：日本sanyo公司；

計(jì)算機(jī)：中國(guó)聯(lián)想公司；

nanodrop2000分光光度計(jì)：美國(guó)thermoscientific公司；

電磁攪拌器、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀：美國(guó)thermoscientific公司。

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(mts)

(1)待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用真空泵吸走細(xì)胞培養(yǎng)基，加入dpbs清洗細(xì)胞，棄掉dpbs后加入0.25％胰酶，待細(xì)胞大部分都可以脫離培養(yǎng)瓶時(shí)，加入含10％胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化，用移液槍吸取培養(yǎng)液將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上吹打下來，轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，放入離心機(jī)中設(shè)置1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心3分鐘，用真空泵吸走上清，加入5ml完全培養(yǎng)基重懸、混勻，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，重懸，將細(xì)胞的密度調(diào)整為2×10⁴個(gè)/ml，在96孔板中每孔加入100μl細(xì)胞懸液，即使得每個(gè)孔2000個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，共設(shè)5個(gè)給藥梯度組(25，37.5，50，75，100μg/ml)，以及培養(yǎng)液對(duì)照組、dmso對(duì)照組。置于37℃，5％co2恒溫孵箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

(2)配置待測(cè)藥物母液：取待測(cè)藥物0.2g溶解于2mldmso中配成100mg/ml的母液，提取物不易溶解，需置于超聲儀超聲溶解，并用0.22μm尼龍過濾篩過濾后分裝于ep管，保存于-20℃。

(3)待細(xì)胞培養(yǎng)貼壁后，各列分別加入不同濃度梯度的桐花樹葉正丁醇部位提取物(25，37.5，50，75，100μg/ml)，對(duì)照組加入等體積的含對(duì)應(yīng)濃度dmso的完全培養(yǎng)基，以及單獨(dú)只含完全培養(yǎng)基的對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h。

(4)分別在培養(yǎng)24、48、72h后，用排槍于每孔加入20μl完全融化后的celltiter96aqueousonesolutionreagent，然后將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h，于酶標(biāo)儀上在490nm波光處處讀取吸光度值。將無細(xì)胞僅含培養(yǎng)基的孔作為空白孔，制作表格，縱坐標(biāo)為細(xì)胞活力，橫坐標(biāo)為藥物濃度，繪制出mts結(jié)果圖。并用軟件計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，其公式為：

(5)以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用spss21檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，與空白組相比，p＜0.01，差異有顯著性；并用graphpadprism5作線性圖，求出ic50。

2.2單細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞常規(guī)消化，重懸細(xì)胞，反復(fù)吹打，盡量使細(xì)胞充分分散，使分散度達(dá)到95％以上，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為200個(gè)/ml，每孔接種2ml于6孔板中，培養(yǎng)過夜。

(2)第二天加藥，設(shè)兩個(gè)藥物濃度，分別為12.5，25μg/ml，另設(shè)一個(gè)空白組(完全培養(yǎng)液)。

(3)細(xì)胞經(jīng)藥物作用4天后，棄掉培養(yǎng)液，重新給同樣的藥物。

(4)當(dāng)兩個(gè)細(xì)胞團(tuán)交合時(shí)，用真空泵吸走培養(yǎng)液，加dpbs緩沖液清洗兩次，然后用4％的多聚甲醛固定15min。

(5)吸棄多聚甲醛，用結(jié)晶紫染色液染色35min。

(6)回收結(jié)晶紫，用dpbs緩沖液清洗兩次，吸走dpbs緩沖液，將六孔板用掃描儀掃描。

(7)用spss21檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析本實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次的結(jié)果，與空白組相比，p＜0.01，差異有顯著性，并用graphpadprism5作柱狀圖；

2.3細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

(1)在6孔板的背面借助直尺用marker筆畫橫線，每條線距離大約0.5cm左右，使6孔板的每個(gè)孔有5條直線經(jīng)過。

(2)將細(xì)胞消化下來的細(xì)胞離心后重懸計(jì)數(shù)后，以8×10⁵個(gè)/孔接種于6孔板中，每組設(shè)置2個(gè)復(fù)孔。

(3)第二天細(xì)胞貼壁后鋪滿整個(gè)孔時(shí)，用絲裂霉素(0.5μg/ml)處理細(xì)胞，du145處理濃度為10μg/ml，pc320μg/ml，3小時(shí)后，再輔助以直尺，用10μl的槍頭均勻的于六孔板背面上標(biāo)記的線畫痕，確保畫的每條痕寬度一致，垂直背面的直線。

(4)用真空泵吸去含絲裂霉素的培養(yǎng)基，用dpbs清洗2遍六孔板后棄掉，加入完全培養(yǎng)基。給藥組濃度為12.5μg/ml，空白組為完全培養(yǎng)基。分別于22h時(shí)于顯微鏡下拍照，拍照時(shí)確保每孔每次拍照的位置保持一致。

(5)運(yùn)用imagej進(jìn)行傷口面積分析，計(jì)算傷口愈合率。細(xì)胞爬行的距離即0小時(shí)的寬度減去該時(shí)間點(diǎn)的寬度。遷移率＝1-拍照時(shí)的傷口面積/0小時(shí)傷口面積×100％。用spss21檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，與空白組相比，p＜0.01，差異有顯著性，并用graphpadprism5作柱狀圖；

2.4細(xì)胞凋亡

(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化后接種于六孔板，于第二天給藥，設(shè)置兩個(gè)濃度組，一個(gè)對(duì)照組。藥物處理24h、48h、72h后，用bd細(xì)胞周期試劑盒處理細(xì)胞。

(2)取適量bd凋亡試劑盒中10×緩沖鹽溶液配成1×的緩沖液。分別在24、48、72h將三組細(xì)胞取出，棄去上清，加入提前預(yù)冷的dpbs清洗。加入0.25％胰酶消化細(xì)胞，用移液槍吸取培養(yǎng)液將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上吹打下來，轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，放入離心機(jī)中設(shè)置1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心3分鐘，去掉上清。

(3)取6個(gè)ep管，以a-f命名，用1×緩沖鹽溶液重懸各組細(xì)胞，計(jì)數(shù)后調(diào)為1×10⁶個(gè)/ml，從空白組分別取100μl細(xì)胞懸浮液于a-d四個(gè)ep管，從兩個(gè)給藥組分別取100μl細(xì)胞懸浮液于e，f管。

(4)向a，e，f管分別加入bd凋亡試劑盒中的av和pi試劑各5μl。向b管加入5μlav試劑，c管加入5μlpi試劑，混勻后置于黑暗的室溫中避光存放15min。

(5)于每個(gè)ep管中分別加入1×的緩沖鹽溶液400μl，混勻靜置15min后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

(6)用軟件graphpadprism5分析作柱狀圖。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用spss統(tǒng)計(jì)軟件處理分析數(shù)據(jù)，進(jìn)行組間比較，*，p＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，**，p＜0.01差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果

桐花樹葉正丁醇部位提取物對(duì)人前列腺癌細(xì)胞pc3，du145具有增殖抑制作用，其ic50如表1所示，細(xì)胞活性曲線如圖1所示。

表1桐花樹葉正丁醇部位提取物作用于前列腺癌細(xì)胞的ic50(μg/ml)

3.2單細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果

桐花樹葉正丁醇部位提取物可明顯抑制人前列腺癌細(xì)胞pc3，du145的克隆形成，并與給藥濃度呈濃度依賴性。du145細(xì)胞的對(duì)照組克隆形成率為53.63％，高、低濃度給藥組克隆形成率分別為23.88％、40.00％；pc3細(xì)胞的對(duì)照組克隆形成率為59.38％，高、低濃度給藥組克隆形成率分別為12.50％、29.88％。細(xì)胞克隆形成數(shù)如圖2和圖3所示。

3.3細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

桐花樹葉正丁醇部位提取物對(duì)前列腺癌細(xì)胞的遷移具有明顯的抑制作用，與對(duì)照組比較具有顯著差異(p＜0.01)。經(jīng)桐花樹葉正丁醇部位提取物(12.5μg/ml)作用22h后，du145對(duì)照組和給藥組的愈合率分別為74.17％、8.22％；pc3對(duì)照組和給藥組的愈合率分別為100.00％、4.00％。結(jié)果如圖4和圖5所示。

3.4流式凋亡檢測(cè)結(jié)果

桐花樹葉正丁醇部位提取物可誘導(dǎo)人前列腺癌細(xì)胞pc3，du145凋亡，高濃度組與對(duì)照組比較具有顯著差異(p＜0.01)，具體結(jié)果如圖6和圖7所示。