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一種可注射型自愈合止血材料及其制備方法和應(yīng)用與流程

文檔序號(hào):11640465閱讀:1504來源:國知局
一種可注射型自愈合止血材料及其制備方法和應(yīng)用與流程

本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域,涉及一種止血材料及其制備方法,具體而言,本發(fā)明涉及一種可直接施用于外科手術(shù)(含微創(chuàng)手術(shù))以及外傷等原因造成的人及其它哺乳動(dòng)物的組織器官創(chuàng)面,用于止血、封閉傷口、減少組織滲出、促進(jìn)組織修復(fù)以及保護(hù)創(chuàng)面組織等目的的明膠基止血粉劑和止血凝膠材料的制備方法。



背景技術(shù):

外科手術(shù)過程中需要對(duì)不同原因造成的傷口進(jìn)行止血和封閉,因此止血材料是非常重要的一類生物醫(yī)用材料,具有重要的研發(fā)和應(yīng)用意義。目前臨床常用的止血材料從作用機(jī)制上可分為三類:第一類止血材料是通過材料的物理或化學(xué)作用使傷口部位加速凝血(如止血紗布、高分子多糖類、無機(jī)類沸石等);第二類是直接或間接提供外來的凝血成分、利用激發(fā)自身凝血機(jī)制加速實(shí)現(xiàn)凝血(如纖維蛋白類止血材料、含有凝血酶和凝血因子類止血材料);第三類是利用材料對(duì)組織很強(qiáng)的粘著力直接封閉創(chuàng)面,從而實(shí)現(xiàn)止血(如α氰基丙烯酸酯類材料)。然而不同類型的止血材料都存在諸多瓶頸。

對(duì)于利用止血機(jī)制來實(shí)現(xiàn)血凝的之血制品而言,其缺點(diǎn)是它們僅對(duì)流速較小的出血有效,因此使用時(shí)必須配合止血鉗夾,這就使得上述止血材料在使用時(shí)常常需要外科醫(yī)生提前預(yù)測(cè)出血量或者反復(fù)多次使用止血鉗。另外,載有凝血酶類凝血?jiǎng)┑闹寡破吩谑褂眠^程中,凝血酶類蛋白分子易外溢到正常血管中,因此存在誘發(fā)正常血流發(fā)生凝血產(chǎn)生血栓的風(fēng)險(xiǎn),因此不依賴機(jī)體凝血機(jī)制并能迅速封閉創(chuàng)面的止血制品在外科手術(shù)中更受青睞。

而通過物理作用實(shí)現(xiàn)止血的止血制品,如止血紗布、海綿等,在止血過程需要通過對(duì)出血?jiǎng)?chuàng)面進(jìn)行物理壓迫,同時(shí)材料通過吸收血液中的水,促使凝血,止血速度慢,效果較差。并且,這類材料僅對(duì)流速較小的出血有效,因此使用時(shí)必須配合止血鉗夾,這就使得上述止血材料在使用時(shí)常常需要外科醫(yī)生提前預(yù)測(cè)出血量或者反復(fù)多次使用止血鉗。同時(shí),傳統(tǒng)止血材料(如棉紗、繃帶)對(duì)于不規(guī)則形狀、深、窄、動(dòng)脈破裂等現(xiàn)場(chǎng)常見創(chuàng)傷的止血效果很不理想。另外,還存在其他的缺點(diǎn):1)影響術(shù)后縫合,增加新的創(chuàng)面出血;2)不能自然降解,在體內(nèi)形成殘留;3)止血過程需要長(zhǎng)時(shí)間的外力按壓實(shí)現(xiàn)物理止血,對(duì)于脆弱的神經(jīng)或腦組織不適用。另一類無機(jī)物止血材料,包括沸石、高嶺土等,這類材料利用了天然硅鋁酸鹽材料多孔結(jié)構(gòu)、高比表面積等特性,通過吸收血液中的水分,濃縮創(chuàng)面局部的凝血成分,從而實(shí)現(xiàn)快速止血。而人工制備的介孔硅材料同樣具有多孔結(jié)構(gòu)、高比表面積等特性,而且相比天然硅鋁酸鹽材料具有成分、粒徑、孔徑可控等優(yōu)勢(shì),同樣可實(shí)現(xiàn)有效止血。然而,這類材料對(duì)于血流大的出血無能為力,對(duì)于大面積創(chuàng)面效果也有限;并且這類材料雖然介局部組織反應(yīng)是良性的,但是進(jìn)入脈管和組織器官的介孔硅顆粒會(huì)引起嚴(yán)重的全身毒性。因此,開發(fā)針對(duì)現(xiàn)場(chǎng)和院前急救用的,快速、安全、有效的新型止血材料成為醫(yī)學(xué)和生物材料科學(xué)領(lǐng)域中的重要課題。

可注射的凝膠類止血制品因其臨床易操作性、適于微創(chuàng)手術(shù)近年來漸漸進(jìn)入臨床止血應(yīng)用。目前國內(nèi)臨床上使用的止血凝膠類產(chǎn)品主要依靠進(jìn)口,其中美國強(qiáng)生公司的占據(jù)了主要的市場(chǎng)份額。該材料由明膠組成,水溶后快速形成泡沫狀凝膠物,產(chǎn)品具有很好的可注射性。但在止血過程中存在諸多問題。首先,凝膠力學(xué)強(qiáng)度差,流變儀測(cè)得彈性模量<1kpa,對(duì)于出血量大、血管壓力高的出血組織無法實(shí)現(xiàn)止血;其次,該材料與組織間黏性差,對(duì)于臨床出血量稍大的創(chuàng)面,難以實(shí)現(xiàn)快速止血。因此,開發(fā)具有良好可注射性、可塑性等臨床操作性能,可用于血流量大、血壓高的組織器官創(chuàng)面止血的新型凝膠材料具有重要的實(shí)用意義。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

鑒于上述所述的止血材料在現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題,本發(fā)明提供一種可注射型自愈合止血材料及其制備方法。本發(fā)明的方法制備得到的止血材料具有良好的可注射性、自愈合性能和較好的力學(xué)強(qiáng)度,對(duì)于出血量大、血管壓力高的出血組織也可以實(shí)現(xiàn)快速止血。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下:

一種可注射型自愈合止血材料,由如下方法制備得到:

(1)以明膠為原料,使其在去離子水中加熱溶解,配置濃度為1~10w/v%的明膠水溶液,調(diào)ph值為1-6或8-14,向溶液中加入>2倍溶液體積的極性有機(jī)溶劑,生成明膠微凝膠顆粒分散液,加入交聯(lián)劑交聯(lián)反應(yīng)1~12h,離心、清洗得到明膠微凝膠顆粒;

其中,所述明膠微凝膠顆粒的zeta電勢(shì)為-30~+30mv,所述明膠微凝膠顆粒的直徑為20nm~2μm;

(2)將步驟(1)制備得到的表面zeta電勢(shì)>+10mv的明膠微凝膠顆粒,分散在ph<5的酸性水溶液或ph>9的堿性水溶液中,得分散有帶正電荷的明膠微凝膠顆粒的分散液,再與帶負(fù)電荷的高分子顆粒分散液按照顆粒數(shù)比1:10~10:1共混,或者與等電點(diǎn)<6的帶負(fù)電荷的親水性高分子水溶液按照明膠微凝膠顆粒與親水性高分子的質(zhì)量比1:10~10:1共混,用ph調(diào)節(jié)劑調(diào)ph至7.0,冷凍干燥,得明膠微凝膠顆粒凍干粉末i;

(3)將步驟(1)制備得到的表面zeta電勢(shì)<-10mv的明膠微凝膠顆粒,分散在ph<5的酸性水溶液或ph>9的堿性水溶液中,得明膠微凝膠顆粒的分散液,再與帶正電荷的高分子顆粒分散液按照顆粒數(shù)比1:10~10:1混合,或者與等電點(diǎn)>8的帶正電荷的親水性高分子水溶液按照明膠微凝膠顆粒與親水性高分子的質(zhì)量比1:10~10:1共混,用ph調(diào)節(jié)劑調(diào)ph至7.0,冷凍干燥,得明膠微凝膠顆粒凍干粉末ii;

(4)將步驟(1)制備得到的表面zeta電勢(shì)為-10~+10mv的明膠微凝膠顆粒分散在中性水溶液中,再與另一種表面zeta電勢(shì)在-10~+10mv的高分子顆粒分散液按照顆粒數(shù)比1:10~10:1共混,或者與等電點(diǎn)6~8的親水性高分子水溶液按照明膠微凝膠顆粒與親水性高分子的質(zhì)量比1:10~10:1共混,冷凍干燥,得明膠微凝膠顆粒凍干粉末ⅲ;

(5)將明膠微凝膠顆粒凍干粉末i、明膠微凝膠顆粒凍干粉末ii或明膠微凝膠顆粒凍干粉末ⅲ分別與水性溶液共混,得可注射型自愈合止血材料;

其中,所述的帶正電荷的高分子顆粒的表面電荷為+5~+60mv,帶負(fù)電荷的高分子顆粒的表面電荷為-5~-60mv,所述高分子顆粒的直徑為100nm~20μm,在步驟(5)中得到的可注射型自愈合止血材料中膠體顆粒占總體積的百分比為50vol%~150vol%;在步驟(3)、(4)和(5)中所述的親水性高分子的分子量為1k~500kda。

本發(fā)明上述可注射型自愈合止血材料的制備方法中,將步驟(1)制備得到的明膠微凝膠顆粒,冷凍干燥得到的明膠微凝膠顆粒凍干粉末與水性溶液共混,也可以得到本發(fā)明所述的可注射型自愈合止血材料,但其性能差于本發(fā)明中其他方法制備得到的可注射型自愈合膠體凝膠。

本發(fā)明上述可注射型自愈合止血材料的制備方法中,在步驟(1)中,根據(jù)調(diào)整明膠水溶液的濃度、極性有機(jī)溶劑的加入量、交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間等,可以制備得到帶有不同zeta電勢(shì)和直徑大小的明膠微凝膠顆粒。本發(fā)明上述技術(shù)方案中,明膠水溶液濃度優(yōu)選為1~10w/v%,更優(yōu)選為2.5~5w/v%;極性有機(jī)溶劑的加入量?jī)?yōu)選為明膠水溶液的>2倍,更優(yōu)選為3~6倍,明膠微凝膠顆粒直徑優(yōu)選為20nm~5μm,更優(yōu)選為100nm~2000nm。

本發(fā)明上述可注射型自愈合止血材料的制備方法中,步驟(2)、(3)和(4)中,明膠微凝膠顆粒的分散液和各有機(jī)高分子顆粒分散液中的顆粒數(shù)的比例影響所制備膠體凝膠的彈性模量和自修復(fù)效率,本發(fā)明中兩種分散液中顆粒數(shù)的比例優(yōu)選為1:10~10:1,更優(yōu)選為1:5~5:1,共混的兩種顆粒直徑比為1:5~5:1時(shí),可得到具有更高彈性模量和自修復(fù)效率的可注射型自愈合止血材料,若直徑的差異過大,則所得到的膠體凝膠彈性模量下降,自修復(fù)效率降低。

在本發(fā)明的上述技術(shù)方案中,將制備得到的明膠微凝膠顆粒凍干粉末i、明膠微凝膠顆粒凍干粉末ii或明膠微凝膠顆粒凍干粉末ⅲ直接作為止血材料來應(yīng)用,也可以與適量水性溶液共混,制備得到膠體凝膠狀的可注射型自愈合止血材料,其彈性模量為1pa~100kpa,優(yōu)選20kpa~100kpa。

進(jìn)一步地,在上述技術(shù)方案中,所述的帶正電荷的高分子顆粒分散液以殼聚糖、a型明膠、聚丙烯酰胺、聚(n-異丙基丙烯酰胺)、聚乙烯亞胺中的一種或幾種作為原料制備得到,所述的帶負(fù)電荷的高分子顆粒分散液以透明質(zhì)酸、海藻酸、a型明膠、b型明膠或聚丙烯酸中的一種或幾種作為原料制備得到,所述的表面zeta電勢(shì)在-10~+10mv的高分子顆粒分散液以膠原蛋白、白蛋白、明膠中的一種或幾種作為原料制備得到。所述帶正電荷的高分子顆粒分散液或帶負(fù)電荷的高分子顆粒分散液或表面zeta電勢(shì)在-10~+10mv的高分子顆粒分散液,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)高分子顆粒的常規(guī)制備技術(shù)來制備得到,在本申請(qǐng)中不再詳細(xì)陳述。

所述的等電點(diǎn)>8的帶正電荷的親水性高分子為殼聚糖、a型明膠、聚丙烯酰胺、聚(n-異丙基丙烯酰胺)、聚乙烯亞胺中的一種或幾種,所述等電點(diǎn)<6的帶負(fù)電荷的親水性高分子為透明質(zhì)酸、海藻酸、a型明膠、b型明膠或聚丙烯酸中的一種或幾種,所述的等電點(diǎn)6~8的高分子為膠原蛋白、白蛋白、明膠、聚乙烯醇、聚乙二醇中的一種或幾種。

進(jìn)一步地,在上述技術(shù)方案中,在步驟(1)中所述的極性有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇、丙酮、乙腈、四氫呋喃中的一種或幾種的組合;所述的交聯(lián)劑為戊二醛、甘油醛、甲醛、碳二亞胺、二鹵代烷、異氰酸酯、二異氰酸酯、谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶、京尼平中的一種或幾種。

進(jìn)一步地,在上述技術(shù)方案中,在步驟(1)中所述的交聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)體系中交聯(lián)劑與明膠中氨基基團(tuán)的摩爾比為0.1~10。交聯(lián)劑與明膠中氨基基團(tuán)的摩爾比影響所形成的明膠微凝膠顆粒的交聯(lián)度,交聯(lián)度過高明膠微流強(qiáng)度更高、表面電荷更傾向于帶負(fù)電,交聯(lián)度過低明膠微球強(qiáng)度低、表面電荷取決于明膠原料的等電點(diǎn),本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案中交聯(lián)度較低時(shí)較為好,優(yōu)選的,本發(fā)明中所述交聯(lián)劑與明膠中氨基基團(tuán)的摩爾比要控制在0.5~5。

進(jìn)一步地,在上述技術(shù)方案中,在步驟(2)和步驟(3)中所述的酸性水溶液和堿性水溶液中所含有的離子濃度均小于200mm。所述的酸性水溶液和堿性水溶液中所含有的離子的種類不特別限定,可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的用于調(diào)節(jié)酸性或堿性的試劑,如鹽酸、硫酸、醋酸、氫氧化鈣、氫氧化鉀、氨水、碳酸鈉等。

進(jìn)一步地,在上述技術(shù)方案中,在步驟(2)和步驟(3)中所述的ph調(diào)節(jié)劑包括酸性物質(zhì)和堿性物質(zhì),所述酸性物質(zhì)為葡萄糖酸內(nèi)酯、hcl、hno3、h2so4中的一種或幾種,所述堿性物質(zhì)為尿素和脲酶的組合、或者氫氧化鈉、氫氧化鈣、氫氧化鉀、氨水中的一種或幾種。

進(jìn)一步地,在上述技術(shù)方案中,在步驟(5)中所述的水性溶液是離子濃度120~200mm、ph值為6~8的任意水溶液、親水性高分子的水溶液、不水溶的納米顆粒分散液中的一種或幾種的組合。

進(jìn)一步地,在上述技術(shù)方案中,所述水性溶液中含有生物活性物質(zhì)和/或賦形劑。其中所述賦形劑為溶劑、分散介質(zhì)、包被劑、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑、等滲劑、粘合劑、潤滑劑、顏料,以及它們的組合或類似物;所述生物活性物質(zhì)為凝血?jiǎng)?、抗感染藥物、消炎藥、生物活性蛋白藥物中的至少一種。所述凝血?jiǎng)┻x自膠原蛋白、明膠、氧化纖維素、羧甲基纖維素、殼聚糖、透明質(zhì)酸、海藻酸鈉、高嶺土、凝血酶、纖維蛋白、鈣劑、魚精蛋白、多肽、縮氨酸、氨基酸中的一種或其組合;所述抗感染藥物選自抗生素、抗菌制劑、抗病毒制劑、抗真菌藥物、抗?jié)兯幬铩⒅兴幹苿┑囊环N或其組合;所述消炎藥物選自非類固醇類、固醇類消炎藥、抗?jié)兯幬铩⒅兴幹苿┑囊环N或其組合。

本發(fā)明還提供上述所述的可注射型自愈合止血材料在制備用于體表組織、體腔內(nèi)組織器官的有血?jiǎng)?chuàng)面的止血、防黏連、防感染、促進(jìn)組織愈合和/或封閉傷口的止血制品中的應(yīng)用。其中所述的止血制品可采用止血粉劑、止血顆粒、止血球、止血?dú)忪F劑、止血海綿、止血凝膠、止血膜、止血栓或止血貼等方式。

本發(fā)明的有益效果:

1.和傳統(tǒng)止血材料的區(qū)別和優(yōu)勢(shì);

外科手術(shù)過程中需要對(duì)不同原因造成的傷口進(jìn)行止血和封閉,因此止血材料是非常重要的一類生物醫(yī)用材料,具有重要的研發(fā)和應(yīng)用意義。目前臨床常用的止血材料從作用機(jī)制上可分為三類:第一類止血材料是通過材料的物理或化學(xué)作用使傷口部位加速凝血(如止血紗布、高分子多糖類、無機(jī)類沸石等);第二類是直接或間接提供外來的凝血成分、利用激發(fā)自身凝血機(jī)制加速實(shí)現(xiàn)凝血(如纖維蛋白類止血材料、含有凝血酶和凝血因子類止血材料);第三類是利用材料對(duì)組織很強(qiáng)的粘著力直接封閉創(chuàng)面,從而實(shí)現(xiàn)止血(如α氰基丙烯酸酯類材料)。然而不同類型的止血材料都存在諸多瓶頸。

對(duì)于利用止血機(jī)制來實(shí)現(xiàn)血凝的止血制品而言,其缺點(diǎn)是它們僅對(duì)流速較小的出血有效,因此使用時(shí)必須配合止血鉗夾,這就使得上述止血材料在使用時(shí)常常需要外科醫(yī)生提前預(yù)測(cè)出血量或者反復(fù)多次使用止血鉗。另外,載有凝血酶類凝血?jiǎng)┑闹寡破吩谑褂眠^程中,凝血酶類蛋白分子易外溢到正常血管中,因此存在誘發(fā)正常血流發(fā)生凝血產(chǎn)生血栓的風(fēng)險(xiǎn),因此不依賴機(jī)體凝血機(jī)制并能迅速封閉創(chuàng)面的止血制品在外科手術(shù)中更受青睞。

而通過物理作用實(shí)現(xiàn)止血的止血制品,如止血紗布、海綿等,在止血過程需要通過對(duì)出血?jiǎng)?chuàng)面進(jìn)行物理壓迫,同時(shí)材料通過吸收血液中的水,促使凝血,止血速度慢,效果較差。并且,這類材料僅對(duì)流速較小的出血有效,因此使用時(shí)必須配合止血鉗夾,這就使得上述止血材料在使用時(shí)常常需要外科醫(yī)生提前預(yù)測(cè)出血量或者反復(fù)多次使用止血鉗。同時(shí),傳統(tǒng)止血材料(如棉紗、繃帶)對(duì)于不規(guī)則形狀、深、窄、動(dòng)脈破裂等現(xiàn)場(chǎng)常見創(chuàng)傷的止血效果很不理想。另外,還存在其他的缺點(diǎn):1)影響術(shù)后縫合,增加新的創(chuàng)面出血;2)不能自然降解,在體內(nèi)形成殘留;3)止血過程需要長(zhǎng)時(shí)間的外力按壓實(shí)現(xiàn)物理止血,對(duì)于脆弱的神經(jīng)或腦組織不適用。另一類無機(jī)物止血材料,包括沸石、高嶺土等,這類材料利用了天然硅鋁酸鹽材料多孔結(jié)構(gòu)、高比表面積等特性,通過吸收血液中的水分,濃縮創(chuàng)面局部的凝血成分,從而實(shí)現(xiàn)快速止血。而人工制備的介孔硅材料同樣具有多孔結(jié)構(gòu)、高比表面積等特性,而且相比天然硅鋁酸鹽材料具有成分、粒徑、孔徑可控等優(yōu)勢(shì),同樣可實(shí)現(xiàn)有效止血。然而,這類材料對(duì)于血流大的出血無能為力,對(duì)于大面積創(chuàng)面效果也有限;并且這類材料雖然介局部組織反應(yīng)是良性的,但是進(jìn)入脈管和組織器官的介孔硅顆粒會(huì)引起嚴(yán)重的全身毒性。

而本發(fā)明提供的可注射型自愈合止血材料為使用帶表面電荷的高分子微凝膠顆粒,通過顆粒間的靜電相互作用自組裝得到的膠體凝膠材料。由于微凝膠之間的靜電作用是物理交聯(lián)且具有可逆性,因此當(dāng)這種膠體凝膠受到破壞性的剪切力破壞時(shí),微凝膠顆粒間的靜電相互作用被外力破壞,膠體凝膠從具有剛性的固體材料向具有流動(dòng)性的流體材料轉(zhuǎn)變,這一過程被稱為剪切變稀行為。當(dāng)外力取消時(shí),膠體間的相互作用快速恢復(fù),膠體顆粒通過重新形成物理交聯(lián)組裝成膠體凝膠。因此本發(fā)明所述的止血材料具有可注射性和自愈合性能,自愈合性能測(cè)試顯示,剪切破壞后的自修復(fù)率超過85%以上。更重要的是,本發(fā)明的止血材料在注射和固化過程無需引入化學(xué)交聯(lián)反應(yīng),不同于化學(xué)高分子,也沒有引入小分子交聯(lián)劑,生物相容性好,可降解吸收,無毒副作用,安全性好,使其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用成為可能。

另外,本發(fā)明提供的止血材料有較好的力學(xué)強(qiáng)度,凝膠狀止血材料的彈性模量大于10kpa,對(duì)于出血量大、血管壓力高的出血組織也可以實(shí)現(xiàn)快速止血。還有本發(fā)明止血材料的膠體顆粒的高比表面積、膠體凝膠的穩(wěn)定強(qiáng)度有利于創(chuàng)口的封閉。

2.在藥物緩釋方面的優(yōu)勢(shì)

止血制品是外科手術(shù)中必不可少的生物醫(yī)用材料之一,為促進(jìn)止血、控制手術(shù)創(chuàng)面感染等風(fēng)險(xiǎn)、加速催化創(chuàng)口愈合,將止血材料與功能性藥物聯(lián)合使用是提高臨床止血、促進(jìn)創(chuàng)面愈合的有效手段之一。這些凝血藥物、抗菌消炎藥物、或促進(jìn)組織修復(fù)再生的生物活性藥物包括小分子藥物和蛋白類大分子藥物,這些藥物在與止血制品復(fù)合使用的過程中都存在藥物釋放不可控,分子類藥物易失活的問題。因此,開發(fā)可加載藥物并可控釋放藥物的止血材料具有重要的醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。傳統(tǒng)的止血材料通常利用預(yù)加工好的止血制品(如止血膜、止血粉、止血海綿等),將材料直接混入藥物溶液,通過藥物在支架的表面物理吸附實(shí)現(xiàn)藥物的加載。這種方式通常導(dǎo)致止血材料在使用時(shí),所載藥物的暴釋,對(duì)于促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)的蛋白類藥物不能實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期持續(xù)的釋放。

本發(fā)明的止血材料對(duì)比與傳統(tǒng)載體材料具有更多優(yōu)勢(shì)。1)具有微納米尺寸的微凝膠顆粒為基本單元,相比傳統(tǒng)多孔支架材料具有更高比表面積,因此可表面吸附的蛋白量更高;2)生長(zhǎng)因子的加載是將微凝膠顆粒的凍干粉直接與生長(zhǎng)因子水溶液共混,在顆粒溶脹過程中蛋白分子在滲透壓作用下進(jìn)入微凝膠顆粒網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部,因此蛋白的釋放主要是由微凝膠的降解速率控制的;3)生長(zhǎng)因子的釋放速率主要由明膠微凝膠的降解速率調(diào)控,因此通過控制微凝膠的交聯(lián)度可以實(shí)現(xiàn)對(duì)加載的生長(zhǎng)因子的釋放速率進(jìn)行調(diào)控,進(jìn)一步將不同的生長(zhǎng)因子加載入不同交聯(lián)度的膠體顆粒,可以實(shí)現(xiàn)多種生長(zhǎng)因子的有序可控釋放。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1方法制備的a型明膠微凝膠顆粒的掃描電鏡照片。

圖2為實(shí)施例1方法制備的由帶相反電荷的a型和b型明膠膠體顆粒組成的復(fù)合膠體凝膠的自修復(fù)行為的流變學(xué)測(cè)試結(jié)果。

圖3為實(shí)施例2所述的方法制備的帶相反電荷的海藻酸鈣和a型明膠膠體顆粒組成的復(fù)合膠體凝膠的自修復(fù)行為的流變學(xué)測(cè)試結(jié)果。

圖4表示實(shí)施例6中所述方法制備的止血材料實(shí)現(xiàn)生物活性蛋白藥物的有序釋放。

圖5表示實(shí)施例7所述的通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明止血材料的止血功效。

具體實(shí)施方式

下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明,但不以任何方式限制本發(fā)明。下述實(shí)施例中,如無特殊說明,所使用的實(shí)驗(yàn)方法均為常規(guī)方法,所用材料、試劑等均可從生物或化學(xué)公司購買。

下面實(shí)施例中將膠體顆粒冷凍干燥后得各膠體顆粒的凍干粉末,其中所述冷凍干燥條件為:將膠體顆粒在-60℃、<300pa下冷凍干燥2-3天。

實(shí)施例1

以a型明膠為原料,使其在去離子水中加熱40℃溶解,配置濃度為5w/v%的明膠水溶液,調(diào)節(jié)明膠水溶液ph值為3,隨后向溶液中加入3倍溶液體積的乙醇,生成明膠微凝膠顆粒的分散液;分別向分散液中加入25wt%戊二醛水溶液,使明膠微凝膠顆粒交聯(lián),加入戊二醛的量分別為每克明膠對(duì)應(yīng)25wt%戊二醛66μl,交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間12hr,離心清洗得到表面zeta電勢(shì)位正的a型明膠微凝膠顆粒的分散液。同樣方法,以b型明膠為原料制備得到表面zeta電勢(shì)為負(fù)的b型明膠微凝膠顆粒的分散液。利用激光粒度儀測(cè)得制備微凝膠顆粒尺寸和zeta電勢(shì)數(shù)據(jù)如表1所示。經(jīng)冷凍干燥分別得到a型明膠顆粒的凍干粉末(標(biāo)記為gela)和b型明膠顆粒的凍干粉末(標(biāo)記為gelb)。通過掃描電子顯微鏡對(duì)明膠顆粒的形貌進(jìn)行觀測(cè),結(jié)果如圖1所示。制備得到的a型明膠顆粒的粒徑分布窄,尺寸在150-300nm范圍內(nèi)。

表1.不同類型明膠顆粒的性能參數(shù)

將a型明膠和b型明膠微凝膠顆粒分別分散在20mm的naoh堿性水溶液中,分別得到分散有帶正電荷的a型明膠微凝膠顆粒和帶負(fù)電荷的b型明膠微凝膠顆粒的分散液,將兩者充分混合、攪拌,得分散有兩種不同微凝膠顆粒的分散液,其中a型明膠和b型明膠混合的顆粒數(shù)量比為1:1;向分散液中加入100mm的鹽酸調(diào)節(jié)ph值至7.0,攪拌混合,冷凍干燥,得到含有兩種不同明膠膠體顆粒的凍干粉末,標(biāo)記為gela+b,可作為止血粉劑。將上述混合物凍干粉末分別與適當(dāng)量的1mm的nacl溶液共混,并快速攪拌混合均勻得到可注射型自愈合膠體凝膠,得到含不同微凝膠膠體顆粒體積分?jǐn)?shù)的膠體凝膠,得到可注射型止血凝膠。制備所得不同組分的膠體凝膠,通過流變儀對(duì)所得止血凝膠材料的粘彈性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果如表2所示,膠體體積分?jǐn)?shù)增加,凝膠的彈性模量增加;在體積分?jǐn)?shù)相同時(shí),帶相反電荷膠體顆粒組成的凝膠彈性模量顯著強(qiáng)于單一組分的膠體凝膠。在微凝膠膠體顆粒體積分?jǐn)?shù)為120vol%時(shí),gela+b組分的膠體凝膠彈性模量約為38kpa。

膠體凝膠的自修復(fù)行為是通過流變儀進(jìn)行表征,具體測(cè)試方法如下。對(duì)膠體凝膠進(jìn)行連續(xù)的流變測(cè)試:首先進(jìn)行震蕩時(shí)間掃描,對(duì)樣品施加頻率為1hz和應(yīng)變?yōu)?.5%的外力,測(cè)試樣品的儲(chǔ)能模量(或彈性模量,g’)和損耗模量(或粘性模量,g”),此時(shí)凝膠在低剪切力情況下表現(xiàn)出固體的剛性行為,因此儲(chǔ)能模量g’大于損耗模量g”且保持穩(wěn)定。這一階段的g’值即為樣品的初始彈性模量。隨后逐漸增加施加的應(yīng)變從0.1%至1000%,此過程中通過施加外力將樣品破壞,彈性模量g’逐漸降低,最終低于g”,即膠體體系從剛性固體向粘性流體發(fā)生轉(zhuǎn)變,結(jié)構(gòu)被破壞。隨后立即取消外力作用,考察樣品彈性模量的恢復(fù)情況。將外力釋放后,樣品恢復(fù)的儲(chǔ)能(彈性)模量與其初始儲(chǔ)能彈性模的百分比(%)定量考察凝膠的自修復(fù)效率。凝膠的自修復(fù)效率如表3所示,由帶相反電荷膠體顆粒組成的凝膠彈性模量顯著強(qiáng)于單一組分的膠體凝膠。gela+b膠體凝膠的自修復(fù)過程如圖2所示,凝膠在剪切破壞后其彈性模量瞬間恢復(fù),5分鐘內(nèi)自修復(fù)彈性模量恢復(fù)到初始模量超過85%。并且這樣自修復(fù)行為可以反復(fù)發(fā)生:在對(duì)樣品施加多個(gè)循環(huán)的剪切破壞過程中,每次取消外力后,凝膠的彈性模量都會(huì)快速恢復(fù),并恢復(fù)到初始彈性模量的80%以上。

表2.實(shí)施例1中制備的不同膠體凝膠含有不同體積分?jǐn)?shù)的微凝膠顆粒所得到凝膠材料的彈性模量g'

表3.實(shí)施例1中制備的不同膠體凝膠不同體積分?jǐn)?shù)的微凝膠顆粒所得的凝膠材料的自修復(fù)效率

*注:自修復(fù)效率是采用1000%的應(yīng)變持續(xù)你剪切凝膠材料60s后,檢測(cè)應(yīng)力釋放后5min內(nèi)的彈性模量恢復(fù)的百分比(%)。

實(shí)施例2

以a型明膠為原料,在加熱40℃下溶解,配置得到濃度為5w/v%的a型明膠水溶液,調(diào)節(jié)ph值為11,隨后向溶液中加入3.5倍體積的乙醇,生成a型明膠微凝膠顆粒懸浮液;向懸浮液中加入25wt%戊二醛水溶液,使明膠微凝膠顆粒交聯(lián),加入戊二醛的量為每g明膠對(duì)應(yīng)25wt%戊二醛66μl,交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間12hr,隨后加入甘氨酸中和未反應(yīng)的醛基,離心清洗得到a型明膠微凝膠顆粒,顆粒尺寸和表面zeta點(diǎn)位參數(shù)如表4所示。

通過乳液法制備海藻酸微凝膠顆粒,具體制備方法如下:將1wt%的海藻酸鈉的水溶液逐滴加入50mm氯化鈣水溶液中并持續(xù)高速攪拌(攪拌速度>5000rpm),即得到海藻酸鈣微凝膠顆粒,顆粒尺寸和表面zeta點(diǎn)位參數(shù)如表4所示。將a型明膠和海藻酸鈣微凝膠顆粒分別分散在10mm的醋酸酸性水溶液中,分別得到帶正電荷的a型明膠微凝膠顆粒的分散液ⅰ、帶負(fù)電荷的海藻酸微凝膠顆粒的分散液ⅱ,將分散液ⅰ和分散液ⅱ充分混合、攪拌,得分散液iii,其中a型明膠和海藻酸鈣微凝膠顆粒混合的顆粒數(shù)量比為2:1;向分散液iii中加入100mm的氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph值至7.0,攪拌混合,冷凍干燥,得到混有兩相不同膠體顆粒的凍干粉末。將上述微凝膠顆粒凍干粉末與一定體積的1mm的nacl鹽溶液共混,并快速攪拌混合均勻得到可注射型自愈合膠體凝膠,即本發(fā)明所述的止血材料,其中微凝膠膠體顆粒體積分?jǐn)?shù)占膠體凝膠體積的50vol%或100vol%。使用流變儀對(duì)膠體凝膠的力學(xué)參數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果如圖3和表5所示,帶相反電荷的海藻酸鈣和a型明膠膠體顆粒共混得到的膠體凝膠的彈性模量隨著膠體顆粒體積分?jǐn)?shù)的增加而增加,體積分?jǐn)?shù)100vol%時(shí),儲(chǔ)存(彈性)模量g’超過12kpa。剪切破壞后5分鐘內(nèi)自愈合效率同樣隨著膠體顆粒體積分?jǐn)?shù)的增加而增加,體積分?jǐn)?shù)100vol%時(shí),彈性模量g’自愈合效率超過80%。

表4.實(shí)施例2中制備的a型明膠和海藻酸微凝膠的性能參數(shù)

表5.實(shí)施例2中制備的自愈合膠體凝膠在不同膠體體積分?jǐn)?shù)情況下的力學(xué)強(qiáng)度(流變測(cè)試彈性模量g')和自愈合效率。

*注:自修復(fù)效率是采用1000%的應(yīng)變持續(xù)你剪切凝膠材料60s后,檢測(cè)應(yīng)力釋放后5min內(nèi)的彈性模量恢復(fù)的百分比(%)。

實(shí)施例3

以b型明膠為原料,在加熱40℃下溶解,配置得到濃度為5w/v%的b型明膠水溶液,調(diào)節(jié)ph值為3,隨后向溶液中加入3倍體積的乙醇,生成b型明膠微凝膠顆粒懸浮液;向懸浮液中加入25wt%戊二醛水溶液,使明膠微凝膠顆粒交聯(lián),加入戊二醛的量為每g明膠對(duì)應(yīng)25wt%戊二醛80μl,交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間12hr,反復(fù)離心并在去離子水中重懸,得到b型明膠微凝膠顆粒,顆粒尺寸和表面zeta點(diǎn)位參數(shù)如表6所示。

將殼聚糖季銨鹽溶于去離子水配置濃度為2.5w/v%殼聚糖季銨鹽水溶液。將明膠b微凝膠顆粒分散在20mm的醋酸酸性水溶液中,進(jìn)一步將殼聚糖季銨鹽水溶液與明膠b微凝膠顆粒分散液充分共混,攪拌,得分散液iii,其中b型明膠微凝膠顆粒與高分子殼聚糖季銨鹽的質(zhì)量比為10:1,向分散液iii中加入100mm的氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph值至7.0,然后冷凍干燥,得到b型明膠膠體顆粒和殼聚糖季銨鹽的復(fù)合凍干粉末。將上述凍干粉末與一定體積的10mm的nacl鹽溶液共混,并快速攪拌混合均勻得到可注射型自愈合膠體凝膠,即本發(fā)明所述的止血材料,其中明膠微凝膠顆粒體積分?jǐn)?shù)占自愈合凝膠體積分?jǐn)?shù)為100vol%。使用流變儀對(duì)膠體凝膠的力學(xué)參數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果如表7所示,帶相反電荷的b型明膠顆粒和殼聚糖季銨鹽共混得到的膠體凝膠在膠體顆粒體積分?jǐn)?shù)為100vol%時(shí),儲(chǔ)存(彈性)模量g’約48kpa。剪切破壞后5分鐘內(nèi)自愈合效率在膠體顆粒體積分?jǐn)?shù)為100vol%時(shí),彈性模量g’自愈合效率超過89%。

表6.實(shí)施例3中制備的b型明膠微凝膠顆粒的性能參數(shù)

表7.實(shí)施例3中制備的b型明膠微凝膠顆粒和殼聚糖季銨鹽共混制備的自愈合凝膠的力學(xué)強(qiáng)度(流變測(cè)試彈性模量g')和自愈合效率。

*注:自修復(fù)效率是采用1000%的應(yīng)變持續(xù)你剪切凝膠材料60s后,檢測(cè)應(yīng)力釋放后5min內(nèi)的彈性模量恢復(fù)的百分比(%)。

實(shí)施例4

以a型明膠為原料,在加熱40℃下溶解,配置得到濃度為10w/v%的a型明膠水溶液,調(diào)節(jié)ph值為11,隨后向溶液中各加入2倍體積的乙醇,生成a型明膠微凝膠顆粒懸浮液;向懸浮液中加入25wt%戊二醛水溶液,使明膠微凝膠顆粒交聯(lián),加入戊二醛的量為每g明膠對(duì)應(yīng)25wt%戊二醛264μl,交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間12hr,反復(fù)離心并在去離子水中重懸,得到a型明膠微凝膠顆粒,顆粒尺寸和表面zeta點(diǎn)位參數(shù)如表8所示。

將聚乙二醇(peg,分子量2kda)溶于去離子水配置濃度為5w/v%peg水溶液。將上述方法制備的a型明膠微凝膠顆粒分散得到的peg水溶液中,進(jìn)一步將peg水溶液與a型明膠微凝膠分散液充分共混,攪拌,得分散液iii,其中a型明膠微凝膠顆粒與peg的質(zhì)量比為1:2。隨后將分散液iii的ph值調(diào)節(jié)至7.0,然后冷凍干燥,得到a型明膠膠體顆粒和peg的復(fù)合凍干粉末。將上述凍干粉末與一定體積的10mm的nacl鹽溶液共混,并快速攪拌混合均勻得到自愈合膠體凝膠,即本發(fā)明所述的止血材料,其中明膠微凝膠顆粒體積分?jǐn)?shù)占自愈合凝膠體積分?jǐn)?shù)為100vol%。使用流變儀對(duì)膠體凝膠的力學(xué)參數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果如表9所示,當(dāng)膠體凝膠中a型明膠膠體顆粒體積分?jǐn)?shù)為100vol%時(shí),儲(chǔ)存(彈性)模量g’約19kpa。剪切破壞后5分鐘內(nèi)自愈合效率在膠體顆粒體積分?jǐn)?shù)為100vol%時(shí),彈性模量g’自愈合效率約為83%。

表8.實(shí)施例5中制備的a型明膠微凝膠顆粒的性能參數(shù)

表9.實(shí)施例4中制備的a型明膠微凝膠顆粒和peg共混制備的自愈合凝膠的力學(xué)強(qiáng)度(流變測(cè)試彈性模量g')和自愈合效率。

*注:自修復(fù)效率是采用1000%的應(yīng)變持續(xù)你剪切凝膠材料60s后,檢測(cè)應(yīng)力釋放后5min內(nèi)的彈性模量恢復(fù)的百分比(%)。

實(shí)施例5

以a型明膠為原料,在加熱40℃下溶解,配置得到濃度為5w/v%的a型明膠水溶液,調(diào)節(jié)ph值為11,隨后向溶液中各加入3.5倍體積的乙醇,生成a型明膠微凝膠顆粒懸浮液;隨后加入25wt%戊二醛水溶液交聯(lián)明膠微凝膠顆粒,加入戊二醛的量為每g明膠對(duì)應(yīng)25wt%戊二醛66μl,交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間12hr,離心清洗得到a型明膠微凝膠顆粒,顆粒尺寸和表面zeta點(diǎn)位參數(shù)如表10所示。

通過乳液法制備海藻酸微凝膠顆粒,具體制備方法如下:將1wt%的海藻酸鈉的水溶液加入氯化鈣水溶液中并持續(xù)高速攪拌(攪拌速度>5000rpm),即得到海藻酸鈣顆粒,顆粒尺寸和表面zeta點(diǎn)位參數(shù)如表10所示。

將a型明膠和海藻酸鈣微凝膠顆粒分別分散在10mm的醋酸酸性水溶液中,分別得到帶正電荷的a型明膠微凝膠顆粒的分散液ⅰ、帶負(fù)電荷的海藻酸微凝膠顆粒的分散液ⅱ,將分散液ⅰ和分散液ⅱ充分混合、攪拌,得分散液iii,其中a型明膠和海藻酸微凝膠顆?;旌系念w粒數(shù)量比為2:1;向分散液iii中加入100mm的氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph值至7.0,攪拌混合,冷凍干燥,得到混有兩相不同膠體顆粒的復(fù)合凍干粉末。將聚乙二醇(peg,分子量2kda)溶于去離子水配置濃度為5w/v%peg水溶液,與上述復(fù)合凍干粉末共混,并快速攪拌得到自愈合凝膠,即本發(fā)明所述的止血材料,其中兩種膠體顆粒體積分?jǐn)?shù)占膠體凝膠體積的100vol%。使用流變儀考察膠體凝膠的力學(xué)參數(shù),結(jié)果如表11所示,當(dāng)膠體顆粒體積分?jǐn)?shù)100vol%時(shí),儲(chǔ)存(彈性)模量g’超過87kpa。剪切破壞后5分鐘內(nèi)自愈合效率同樣隨著膠體顆粒體積分?jǐn)?shù)的增加而增加,體積分?jǐn)?shù)100vol%時(shí),彈性模量g’自愈合效率超過91%。

表10.實(shí)施例5中制備的a型明膠和海藻酸鈣微凝膠的性能參數(shù)

表11.實(shí)施例5中制備的自愈合膠體凝膠在不同膠體體積分?jǐn)?shù)情況下的力學(xué)強(qiáng)度(流變測(cè)試彈性模量g')和自愈合效率。

*注:自修復(fù)效率是采用1000%的應(yīng)變持續(xù)你剪切凝膠材料60s后,檢測(cè)應(yīng)力釋放后5min內(nèi)的彈性模量恢復(fù)的百分比(%)。

實(shí)施例6

以a型明膠為原料,通過實(shí)施例1所述反溶劑法制備a型明膠微凝膠顆粒,戊二醛交聯(lián)濃度為每g明膠使用25wt%戊二醛的量為66μl,制備得到帶正電荷的a型明膠微凝膠顆粒;以b型明膠為原料,通過實(shí)施例1所述的反溶劑法制備b型明膠微凝膠顆粒,其中戊二醛交聯(lián)濃度為每g明膠使用25wt%戊二醛的量為264μl,制備得到帶負(fù)電荷的b型明膠微凝膠顆粒,制備參數(shù)和所得微凝膠顆粒尺寸和zeta點(diǎn)位數(shù)據(jù)如表12。

表12.實(shí)施例6中制備的不同類型明膠微凝膠顆粒的性能參數(shù)

將a型明膠顆粒分散在含100ng/ml濃度的堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bfgf)的水溶液中,將b型明膠顆粒分散在含100ng/ml濃度的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bmp-2)的水溶液中,分別得到載有bfgf的a型明膠顆粒和載有bmp-2的b型明膠微凝膠顆粒的分散液。將上述兩種明膠顆粒分散液按照顆粒數(shù)比1:1充分混合,并冷凍干燥,得到載有不同生長(zhǎng)因子的兩種明膠顆粒凍干粉末。將上述微凝膠顆粒凍干粉末與一定體積的1mm的nacl鹽溶液共混,并快速攪拌混合均勻,得到載有不同生長(zhǎng)因子的、可注射型自愈合膠體凝膠,其中微凝膠膠體顆粒體積分?jǐn)?shù)占膠體凝膠體積的100vol%。兩種不同的生長(zhǎng)因子從膠體凝膠載體材料中體外釋放動(dòng)力學(xué)的釋放曲線如圖4所示,載有bfgf的a型明膠由于交聯(lián)度低降解速率較快,因此bfgf釋放速率較快,載有bmp-2的b型明膠由于交聯(lián)度高降解速率慢,因此bmp-2釋放速率較為緩慢;結(jié)果表明本發(fā)明所述的膠體凝膠可實(shí)現(xiàn)不同生長(zhǎng)因子藥物的有序釋放。

實(shí)施例7

通過實(shí)施1中的制備方法得到a型明膠和b型明膠微凝膠顆粒分散液,將兩種明膠顆粒分別分散在20mm的鹽酸水溶液中,分別得到分散有帶正電荷的a型明膠微凝膠顆粒和帶負(fù)電荷的b型明膠微凝膠顆粒的分散液,將兩者充分混合、攪拌,得分散有兩種不同微凝膠顆粒的分散液,其中a型明膠和b型明膠混合的顆粒數(shù)量比為1:1;向分散液中加入100mm的氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph值至7.0,攪拌混合,冷凍干燥,得到含有兩種不同明膠膠體顆粒的凍干粉末。將上述混合物凍干粉末與磷酸緩沖溶液pbs共混,并快速攪拌混合均勻得到可注射型自愈合膠體凝膠,即本發(fā)明所述的止血材料,其中兩種膠體顆粒體積分?jǐn)?shù)占膠體凝膠體積的100vol%。以新西蘭兔背部脊柱骨缺損出血?jiǎng)?chuàng)面為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)P停圃?.5-4mm的出血?jiǎng)?chuàng)口,將明膠基止血凝膠通過普通醫(yī)用注射器直接注射在出血?jiǎng)?chuàng)面,輕輕壓迫1min后出血點(diǎn)被封閉,止血時(shí)間為1min。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的過程如圖5所示。

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