本發(fā)明涉及成像技術(shù)，具體是一種熒光顯微內(nèi)窺成像系統(tǒng)，同時(shí)，其還展示利用一種熒光顯微內(nèi)窺成像系統(tǒng)進(jìn)行一種熒光顯微內(nèi)窺成像的一種熒光顯微內(nèi)窺成像方法。

背景技術(shù)：

消化系統(tǒng)腫瘤是世界范圍內(nèi)最常見腫瘤之一。

早發(fā)現(xiàn)、早治療，提高早期癌癥的診斷水平對(duì)于提高患者生存率、減輕社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)有著深遠(yuǎn)的意義。

目前國(guó)際研究表明，內(nèi)鏡檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)消化系統(tǒng)腫瘤的最有效途徑。然而現(xiàn)有內(nèi)鏡技術(shù)存在檢出率低，漏診率高等諸多問題。為解決現(xiàn)有問題，分子影像學(xué)為我們提供了新的思路。分子影像學(xué)對(duì)活體內(nèi)的生物過程在細(xì)胞和分子水平進(jìn)行研究，同時(shí)利用靶向探針與特定分子結(jié)合可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)、定量成像。將分子影像學(xué)技術(shù)與消化內(nèi)鏡結(jié)合的消化內(nèi)鏡分子影像學(xué)，成為實(shí)現(xiàn)消化道腫瘤早期診斷的有效途徑。目前的研究成果已經(jīng)展現(xiàn)出這一領(lǐng)域良好的發(fā)展應(yīng)用前景。

(1)自體熒光成像設(shè)備

自發(fā)熒光成像(AFI)系統(tǒng)運(yùn)用氙氣光透過藍(lán)綠色旋轉(zhuǎn)濾光片后形成激發(fā)藍(lán)光(波長(zhǎng)390-470nm)和綠光(波長(zhǎng)540-560nm)直接照射胃腸道黏膜，除反射的藍(lán)光被吸收濾片(吸收波長(zhǎng)在500-630nm)阻擋外，反射綠光和自發(fā)熒光透過吸收濾片被CCD捕捉，經(jīng)光電轉(zhuǎn)化及圖像重建后在顯示器上顯示。

(2)拉曼光譜成像

拉曼光譜成像(RSI)是基于非彈性光散射現(xiàn)象，提供詳細(xì)的化學(xué)信息。利用拉曼光譜，通過檢測(cè)惡性和正常組織之間的化學(xué)差異而做出臨床早期診斷。然而早期診斷的一個(gè)重要的限制是固有拉曼散射的低效性，因?yàn)樗男盘?hào)較差、曝光時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度不足和穿透深度有限，已經(jīng)嚴(yán)重限制該技術(shù)向臨床轉(zhuǎn)化。

(3)共聚焦顯微成像

共聚焦顯微成像(CLI)其原理類似于激光共聚焦顯微鏡，可以是內(nèi)鏡下的組織結(jié)構(gòu)放大1000倍，從而使得臨床醫(yī)師在內(nèi)鏡觀察的同時(shí)對(duì)患者實(shí)時(shí)進(jìn)行組織病理學(xué)診斷成為可能。而目前共聚焦內(nèi)鏡僅能提供488nm的激發(fā)光，在多光譜熒光成像方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。熒光素鈉作為共聚焦內(nèi)鏡的熒光對(duì)比劑，使用時(shí)需靜脈注射，國(guó)內(nèi)外雖有文獻(xiàn)表明熒光素鈉可以安全使用，但靜脈注射的風(fēng)險(xiǎn)相較表面噴灑要高的多，安全性難以保證。共聚焦內(nèi)鏡在原理上與共聚焦顯微鏡無異，均采用“點(diǎn)掃描”的成像方式，然而這種成像方式雖然可以提供高分辨率的清晰圖像，但成像速度大打折扣，并且熒光由探測(cè)器檢測(cè)，需在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中轉(zhuǎn)換成電圖像，后期人工圖像選擇耗時(shí)費(fèi)力。

(4)光相干斷層成像

光相干斷層成像(OCT)在組織中使用低相干干涉測(cè)量法，用光學(xué)測(cè)距檢測(cè)反射信號(hào)。因?yàn)樗軝z測(cè)到彈性散射光，保持入射光的相干性，但是OCT不能直接檢測(cè)生物發(fā)光信號(hào)或熒光信號(hào)。同時(shí)應(yīng)用OCT檢查時(shí)只能組織淺層結(jié)構(gòu)進(jìn)行橫斷面成像，對(duì)于深層浸潤(rùn)的腫瘤無法成像。

(5)高分辨率熒光成像

高分辨率熒光成像(HRME)，通過激發(fā)噴灑在組織上的熒光造影劑而成像。目前，常用的熒光造影劑鹽酸吖啶黃可與細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的DNA、RNA結(jié)合而染色，受到波長(zhǎng)445nm的激發(fā)光照射后，可以發(fā)射出波長(zhǎng)515nm的熒光。然而目前HRME只能進(jìn)行單光譜成像，還無法聯(lián)合多種熒光探針進(jìn)行多光譜成像，同時(shí)缺乏圖像分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行定量及定性分析。

上述成像方式具有如下缺陷：

(1)自體熒光成像：

理論上只要分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，自體熒光就會(huì)發(fā)生特征性改變，AFI圖像的光學(xué)對(duì)比并不體現(xiàn)腫瘤特異性光學(xué)對(duì)比，是一個(gè)綜合了多個(gè)分子改變的結(jié)果。由于AFI沒有使用特異性靶向造影劑，因而假陽性率較高，對(duì)于炎癥與腫瘤的區(qū)分有一定難度。同時(shí)由于自體熒光信號(hào)強(qiáng)度十分微弱，易受到激發(fā)光混疊的影響。

(2)拉曼光譜成像

拉曼光譜成像早期診斷的一個(gè)重要的限制是固有拉曼散射的低效性，因?yàn)樗男盘?hào)較差、曝光時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度不足和穿透深度有限，已經(jīng)嚴(yán)重限制該技術(shù)向臨床轉(zhuǎn)化。

(3)共聚焦顯微成像：

共聚焦顯微成像需由熒光素鈉作為共聚焦內(nèi)鏡的熒光對(duì)比劑，使用時(shí)需靜脈注射，國(guó)內(nèi)外雖有文獻(xiàn)表明熒光素鈉可以安全使用，但靜脈注射的風(fēng)險(xiǎn)相較表面噴灑要高的多，安全性難以保證。共聚焦內(nèi)鏡在原理上與共聚焦顯微鏡無異，均采用“點(diǎn)掃描”的成像方式，然而這種成像方式雖然可以提供高分辨率的清晰圖像，但成像速度大打折扣，并且熒光由探測(cè)器檢測(cè)，需在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中轉(zhuǎn)換成電圖像，后期人工圖像選擇耗時(shí)費(fèi)力。

(4)光相干斷層成像

光相干斷層成像不能直接檢測(cè)生物發(fā)光信號(hào)或熒光信號(hào)。同時(shí)應(yīng)用OCT檢查時(shí)只能組織淺層結(jié)構(gòu)進(jìn)行橫斷面成像，對(duì)于深層浸潤(rùn)的腫瘤無法成像。

(5)高分辨率熒光成像

目前高分辨率熒光成像只能進(jìn)行單光譜成像，還無法聯(lián)合多種熒光探針進(jìn)行多光譜成像，同時(shí)缺乏圖像分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行定量及定性分析。

(6)不能實(shí)現(xiàn)多光譜成像。

上述現(xiàn)有熒光成像設(shè)備的濾光片已固化，不能方便拆換。不同的熒光探針需要不同譜段的激發(fā)光，其發(fā)射的熒光也分布在不同的譜段，所以針對(duì)某種熒光探針需要特定的激發(fā)光源和濾光裝置，目前常用的熒光內(nèi)窺鏡僅能對(duì)特定一種熒光探針進(jìn)行激發(fā)成像。

(7)缺乏圖像數(shù)據(jù)處理軟件。

由于通過傳像光纖束進(jìn)行成像，傳像光纖束中光纖單絲之間的固有的間隔會(huì)在成像時(shí)產(chǎn)生網(wǎng)格圖案，嚴(yán)重影響圖像質(zhì)量，以及對(duì)圖像信息的判讀。同時(shí)，所得無法對(duì)所得圖像進(jìn)行圖像數(shù)據(jù)處理及定量分析。

因此，有必要提供一種熒光顯微內(nèi)窺成像系統(tǒng)來解決上述問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種熒光顯微內(nèi)窺成像系統(tǒng)。

本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的：

一種熒光顯微內(nèi)窺成像系統(tǒng)，包括新型細(xì)徑光纖多光譜熒光顯微成像設(shè)備，所述新型細(xì)徑光纖多光譜熒光顯微成像設(shè)備包括由寬光譜照明光源模塊構(gòu)成的照明模塊、由科學(xué)級(jí)低溫制冷CCD相機(jī)或工業(yè)級(jí)CCD相機(jī)構(gòu)成的圖像采集部、用于數(shù)據(jù)傳遞的細(xì)徑柔性傳像光纖、放大物鏡、物鏡切換裝置、多光譜分光采集裝置、調(diào)焦裝置、傳像光學(xué)系統(tǒng)、機(jī)械電子控制模塊、以及圖像數(shù)據(jù)處理控制模塊；新型細(xì)徑光纖多光譜熒光顯微成像設(shè)備包括的各組件均設(shè)置于外殼內(nèi)，且彼此間相互連通且相配合使用。

進(jìn)一步的，所述細(xì)徑柔性傳像光纖外部套設(shè)有光纖外套管。

進(jìn)一步的，照明模塊包括單色可調(diào)光源和導(dǎo)光光纖，可根據(jù)用戶的需要調(diào)節(jié)產(chǎn)生不同能量的寬光譜準(zhǔn)直光線，通過調(diào)節(jié)光源的光斑大小，照明光線通過導(dǎo)光光纖進(jìn)入多光譜分光采集裝置；多光譜分光采集裝置包括熒光立方體模塊和電控平移臺(tái)；電控平移臺(tái)由可編程的微型步進(jìn)電機(jī)控制，根據(jù)所使用的熒光探針，快速便捷的調(diào)節(jié)激發(fā)光波長(zhǎng)，以便獲取能充分激發(fā)熒光探針的窄譜段激發(fā)光。又不引入其他譜段光干擾的窄譜段出射光。同時(shí)此裝置還能接受待測(cè)物體反射的反射光、激發(fā)光和受激發(fā)射的熒光信號(hào)，并通過二向色鏡濾光片及發(fā)射光濾光片進(jìn)行光譜過濾，產(chǎn)生與激發(fā)光同軸且方向相反的受激發(fā)射的熒光信號(hào)光線作為反方向出射光。

進(jìn)一步的，所述細(xì)徑柔性傳像光纖，其為柔性探測(cè)器，能順利伸入人體內(nèi)部空腔組織內(nèi)，光纖外套管采用醫(yī)用級(jí)聚丙烯酰胺或聚四氟乙烯材料制作；所述細(xì)徑柔性傳像光纖近端接受多光譜分光采集裝置的出射激發(fā)光，經(jīng)過人體外開頭伸入需檢測(cè)的空心器官中，將此出射激發(fā)光傳導(dǎo)入人體內(nèi)部空腔組織中，并以圓形光光斑模式均勻照射在檢測(cè)區(qū)域，此外，所述細(xì)徑柔性傳像光纖其還能收集人體內(nèi)部空腔組織反射的白光、激發(fā)光和受激發(fā)射的熒光信號(hào)，并通過此光纖束將光學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)到體外。

進(jìn)一步的，所述放大物鏡及所述物鏡切換裝置設(shè)置于所述細(xì)徑柔性傳像光纖與多光譜分光采集裝置之間，由待測(cè)物體發(fā)出的反射光、激發(fā)光和受激發(fā)射的熒光信號(hào)被傳像光纖束收集后，可通過放大物鏡并形成放大的圖像，所述的物鏡切換裝置由可編程微型步進(jìn)電機(jī)控制，可以將不同放大倍數(shù)的物鏡進(jìn)行相互切換，以搭配不同粗細(xì)直徑的傳像光纖束進(jìn)行使用。

進(jìn)一步的，所述圖像采集部包括調(diào)焦裝置，所述調(diào)焦裝置能采集所述多光譜分光采集裝置產(chǎn)生的反方向出射光，科學(xué)級(jí)低溫制冷CCD相機(jī)或工業(yè)級(jí)CCD相機(jī)通過調(diào)焦裝置細(xì)微前后移動(dòng)，成像反方向出射光的光學(xué)信號(hào)，得到原始熒光圖像，也能不對(duì)入射光學(xué)信號(hào)進(jìn)行譜段濾波，獲得激發(fā)光圖像。

進(jìn)一步的，所述多光譜分光采集裝置由暗箱包裹，并通過暗箱側(cè)孔將導(dǎo)光光纖伸入暗箱，通過另一側(cè)孔將濾光片切換器電源線、濾光片切換器控制數(shù)據(jù)傳輸線伸入暗箱。

進(jìn)一步的，所述機(jī)械電子控制模塊包括設(shè)計(jì)控制軟件，通過數(shù)據(jù)傳輸線將控制信息傳達(dá)到馬達(dá)上控制平移臺(tái)移動(dòng)，避免了每次滑動(dòng)平移臺(tái)需要開啟暗箱的操作，使成像系統(tǒng)具有多光譜信息獲取功能。

進(jìn)一步的，圖像數(shù)據(jù)處理控制模塊讀取所述圖像采集部獲取的圖像，使用原始熒光圖像利用高斯濾波算法進(jìn)行去噪處理，去除原始熒光圖像中光纖間隔造成的網(wǎng)格圖像，再通過直方圖均衡化算法提高熒光圖像的對(duì)比度，生成校正熒光圖像，并在顯示器上實(shí)時(shí)同步顯示所述的校正熒光圖像，并能計(jì)算相關(guān)熒光圖像中的細(xì)胞核數(shù)量，核面積、核質(zhì)比及核間距。并能將所得圖像及相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分類存儲(chǔ)。

一種熒光顯微內(nèi)窺成像方法，其利用上述一種熒光顯微內(nèi)窺成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集、傳輸、處理和存儲(chǔ)；照明光源發(fā)出的光通過傳光光纖進(jìn)入多光譜分光采集裝置，由熒光立方體模塊上的激發(fā)光濾光片過濾出窄帶激發(fā)光，被模塊上的二向色鏡濾光片反射并穿過放大物鏡，再由聚光耦合部件耦合到傳像光纖束的近端，在經(jīng)過傳像光纖束傳輸并照明被觀察物體，此時(shí)傳像光纖束緊貼被觀察物體，被觀察物體被激發(fā)光照射后產(chǎn)生熒光信號(hào)，熒光信號(hào)被傳像光纖束接收后通過傳像光纖束后被放大物鏡放大，放大后的熒光光束通過二向色鏡濾光片和熒光立方體模塊上的發(fā)射光濾光片，投射到攝像頭的靶面上，攝像頭將圖像的光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)輸入計(jì)算機(jī)，計(jì)算機(jī)對(duì)圖像進(jìn)行采集并顯示在熒光屏上，并可以對(duì)圖像進(jìn)行處理、存儲(chǔ)及進(jìn)行文件管理；

圖像采集、處理、存儲(chǔ)及文件管理包括下述步驟：

1)開啟裝置電源，包括相機(jī)電源、光源電源和電腦電源；

2)將內(nèi)窺鏡前端緊貼待測(cè)物體；

3)相機(jī)將圖像的光學(xué)信號(hào)(或輸入圖像卡)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)并輸入計(jì)算機(jī)；

4)使用原始熒光圖像利用高斯濾波算法進(jìn)行去噪處理，去除原始熒光圖像中光纖間隔造成的網(wǎng)格圖像，再通過直方圖均衡化算法提高熒光圖像的對(duì)比度，生成校正熒光圖像，并在顯示器上實(shí)時(shí)同步顯示所述的校正熒光圖像，并能計(jì)算相關(guān)熒光圖像中的細(xì)胞核數(shù)量、核面積、核質(zhì)比及核間距等定量參數(shù)。

5)計(jì)算機(jī)將校正圖像及細(xì)胞核數(shù)量、核面積、核質(zhì)比，核間距等定量參數(shù)顯示在顯示器上；

6)重復(fù)步驟2-4，得到一定數(shù)量的熒光圖像和相關(guān)定量參數(shù)；

7)建立分類文件夾，采集的圖像及相關(guān)定量參數(shù)存入文件夾中；

8)切斷設(shè)備電源關(guān)閉電腦。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明結(jié)合熒光顯微鏡的成像原理和多光譜信息獲取技術(shù)，通過優(yōu)化硬件設(shè)備、研發(fā)圖像處理軟件，構(gòu)建細(xì)徑光纖多光譜熒光顯微成像設(shè)備；將此設(shè)備為子鏡與現(xiàn)有消化內(nèi)鏡融合，建立全新的熒光顯微分子成像-特殊光解剖構(gòu)造成像的雙模態(tài)內(nèi)鏡成像模式。在此基礎(chǔ)上應(yīng)用此設(shè)備進(jìn)行消化系統(tǒng)腫瘤的多光譜熒光顯微成像，分析早期腫瘤病變圖像的特點(diǎn)，探討此設(shè)備對(duì)早期消化道腫瘤的診斷價(jià)值，從而為進(jìn)一步提高消化道腫瘤的檢出率提供一種新方法。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的整體結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本發(fā)明的熒光立方體結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3為本發(fā)明的傳像光纖束的剖面結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4為本發(fā)明的傳像光纖束的截面結(jié)構(gòu)示意圖；

圖5為圖像采集處理存儲(chǔ)流程圖；

圖中數(shù)字標(biāo)記：

1寬光譜光源；2熒光立方體模塊；3熒光立方體模塊；4傳光光纖；5放大物鏡；6物鏡轉(zhuǎn)輪；7物鏡安裝孔；8物鏡轉(zhuǎn)輪控制器；9光學(xué)準(zhǔn)直耦合器；10傳像光纖；11光斑調(diào)節(jié)器；12暗箱；13機(jī)械電子控制模塊；14圖像數(shù)據(jù)處理控制模塊；15相機(jī)；16熒光立方體模塊；17電控平移臺(tái)。

具體實(shí)施方式

請(qǐng)參閱圖1至圖5，一種熒光顯微內(nèi)窺成像方法，其利用熒光顯微內(nèi)窺成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集、傳輸、處理和存儲(chǔ)，熒光顯微內(nèi)窺成像系統(tǒng)構(gòu)成如下：

寬光譜光源1、傳光光纖4及光斑調(diào)節(jié)器11構(gòu)成寬光譜照明光源模塊。可以產(chǎn)生可見光到近紅外范圍內(nèi)光強(qiáng)分布均勻，光斑大小可變的準(zhǔn)直寬光譜光線，以備從中過濾出特定譜段的激發(fā)光。所述的寬光譜光源1可以根據(jù)用戶的需要調(diào)節(jié)光照的強(qiáng)度，最大光強(qiáng)4000mw/cm2。所述的傳光光纖4為石英光纖，長(zhǎng)約100cm，直徑2.5mm，配備SMA905輸出端口。寬光譜光源1產(chǎn)生的寬光譜光線由傳光光纖4傳導(dǎo)，并通過光纖遠(yuǎn)端的光斑調(diào)節(jié)器11形成特定直徑的準(zhǔn)直光線。

其中寬光譜光源1可以為大功率氙燈、鹵燈光源或汞燈光源，其出射光譜段覆蓋可見光到近紅外波長(zhǎng)范圍。

寬光譜照明光源模塊產(chǎn)生的寬光譜光線進(jìn)入多光譜分光采集裝置內(nèi)的熒光立方體模塊，其通過對(duì)寬光譜光源進(jìn)行光譜過濾，產(chǎn)生特定譜段的激發(fā)光，達(dá)到能配合多種熒光探針使用的目的。每個(gè)熒光立方體模塊其含有激發(fā)光濾光片18、二向色鏡濾光片20、發(fā)射光濾光片19、通孔21。電動(dòng)平移臺(tái)17，機(jī)械電子控制模塊13及暗箱12。電動(dòng)平移臺(tái)17上可裝載多個(gè)熒光立方體模塊2。用戶可根據(jù)所使用的熒光探針，調(diào)節(jié)電動(dòng)平移臺(tái)17，已選擇匹配的熒光立方體模塊2進(jìn)入光路過濾寬光譜照明光源模塊的寬譜段白光，使過濾后產(chǎn)生的特定窄帶光譜能夠充分激發(fā)熒光探針。二向色鏡濾光片20將特定的窄帶光譜完全反射后進(jìn)入光路下一級(jí)。待測(cè)物體被激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生的特定激發(fā)光譜可以通過特定的二向色鏡濾光片20而不被反射，進(jìn)而通過發(fā)射光濾光片19。特定激發(fā)光譜被發(fā)射光濾光片15過濾后產(chǎn)生原始熒光信號(hào)進(jìn)入光路下一級(jí)。

其中多光譜分光采集裝置包括熒光立方體模塊2，電動(dòng)平移臺(tái)17。電動(dòng)平移臺(tái)17上可裝載多個(gè)熒光立方體模塊2。用戶可通過機(jī)械電子控制模塊13控制電動(dòng)平移臺(tái)17將與所用熒光探針匹配的熒光立方體模塊2接入光路。

其中激發(fā)光濾光片18為小直徑帶通干涉濾光片，其帶通譜段應(yīng)與所用熒光探針的吸收譜相匹配。

其中二向色鏡濾光片20為小直徑長(zhǎng)波通二向色鏡濾光片，其截止波長(zhǎng)應(yīng)與所用熒光探針的吸收譜相匹配。激發(fā)光被二向色鏡發(fā)射到物鏡上，發(fā)射的熒光(比激發(fā)光的波長(zhǎng)要長(zhǎng))通過二向色鏡進(jìn)相機(jī)。后向反射或者由待測(cè)物體散射的激發(fā)光被二向色鏡二次反射，防止其進(jìn)入到相機(jī)形成雜散信號(hào)。

其中發(fā)射光濾光片19小直徑帶通干涉濾光片，其帶通譜段應(yīng)覆蓋所用熒光劑的發(fā)射譜峰，且與所用的激發(fā)光濾光片不重疊，以在拍攝熒光圖像時(shí)有效濾去非熒光信號(hào)，保留熒光信號(hào)。

其中機(jī)械電子控制模塊13為可編程機(jī)械控制器，總體控制電控平移臺(tái)17旋轉(zhuǎn)切換。

多光譜分光采集裝置產(chǎn)生的特定激發(fā)光譜進(jìn)入光學(xué)準(zhǔn)直耦合器9。

其中光學(xué)準(zhǔn)直耦合器9可為聚焦透鏡組，起到準(zhǔn)直和聚集光束的作用，其將出射光聚集成于傳像光纖束的直徑接近的光束，并垂直入射到下級(jí)光路傳像光纖束。

傳像光纖束10將激發(fā)光傳導(dǎo)到人體內(nèi)部空心器官的檢測(cè)區(qū)，并從檢測(cè)區(qū)收集感興趣的光學(xué)信號(hào)，傳導(dǎo)到體外。其包含細(xì)徑柔性傳像光纖束22和傳像光纖外套管23。細(xì)徑柔性傳像光纖22接受并傳導(dǎo)上級(jí)光路光學(xué)準(zhǔn)直耦合器9的出射光以及待測(cè)物體產(chǎn)生激發(fā)熒光。

其中細(xì)徑柔性傳像光纖束22為一柔性小外徑的高分辨率，光傳輸通透率高的相干光線束，能有效傳導(dǎo)激發(fā)光，熒光至體外進(jìn)行成像。其中傳像光纖束結(jié)構(gòu)如圖2所示，其內(nèi)為細(xì)徑柔性傳像光纖束22，外包傳像光纖外套管23，能順利經(jīng)人口腔等開口到達(dá)食道、胃等空心器官，并能有效傳導(dǎo)激發(fā)光和熒光，并將激發(fā)光和熒光傳導(dǎo)到體外。

其中光纖外套管采用醫(yī)用級(jí)聚丙烯酰胺或聚四氟乙烯材料制作。

物鏡切換器放置在光學(xué)準(zhǔn)直耦合器9和多光譜分光采集裝置之間，其包含放大物鏡5、物鏡轉(zhuǎn)輪6、物鏡安裝孔7及物鏡轉(zhuǎn)輪控制器8。傳像光纖束將待測(cè)物體產(chǎn)生的激發(fā)光和熒光傳導(dǎo)到體外通過放大物鏡5放大后，再次進(jìn)入多光譜分光采集裝置。放大后的熒光信號(hào)的圖像可以通過二向色鏡濾光片20，而反射的激發(fā)光無法通過。通過二向色鏡濾光片20的熒光信號(hào)再通過發(fā)射光濾光片19，其帶通譜段應(yīng)覆蓋所用熒光劑的發(fā)射譜峰，且與所用的激發(fā)光濾光片不重疊，以在拍攝熒光圖像時(shí)有效濾去非熒光信號(hào)，保留熒光信號(hào)。過濾后產(chǎn)生熒光信號(hào)進(jìn)入光路下一級(jí)。

其中物鏡切換器包括放大物鏡5、物鏡轉(zhuǎn)輪6、物鏡安裝孔7及物鏡轉(zhuǎn)輪控制器8。物鏡轉(zhuǎn)輪6上可裝載多個(gè)放大物鏡5。用戶可通過物鏡轉(zhuǎn)輪控制器8將與不同放大倍數(shù)放大物鏡5的接入光路。

其中放大物鏡5為帶有RMS外螺紋的有限遠(yuǎn)平場(chǎng)消色差物鏡，放大倍數(shù)分別為4X，10X，20X，40X，各物鏡之間齊焦，可對(duì)熒光圖像進(jìn)行放大，并在物鏡共軛點(diǎn)上形成放大的實(shí)像，并投射到CCD相機(jī)15的探測(cè)芯片上。放大物鏡5放大倍數(shù)計(jì)算方法為：

M＝L_min/d

其中M為放大倍數(shù)，L_min為矩形CCD探測(cè)芯片的短邊長(zhǎng)度，d為傳像光纖束的直徑。

其中物鏡安裝孔7為帶有RMS內(nèi)螺紋的圓孔，可安裝帶有RMS外螺紋的物鏡。

CCD相機(jī)15對(duì)通過發(fā)射光濾光片19過濾后的原始熒光圖像進(jìn)行采集。其中相機(jī)為電荷耦合器件(CCD)相機(jī)或互補(bǔ)型金屬氧化物半導(dǎo)體管(CMOS)相機(jī)，用于接收成像強(qiáng)度弱的光信號(hào)，并將采樣轉(zhuǎn)換為數(shù)字圖像，其有效成像光強(qiáng)微弱的熒光信號(hào)，得到原始熒光圖像。

圖像數(shù)據(jù)處理控制模塊14使用原始熒光圖像利用高斯濾波算法進(jìn)行去噪處理，去除原始熒光圖像中光纖間隔造成的網(wǎng)格圖像，再通過直方圖均衡化算法提高熒光圖像的對(duì)比度，生成校正熒光圖像，并在顯示器上實(shí)時(shí)同步顯示所述的校正熒光圖像，并能計(jì)算相關(guān)熒光圖像中的細(xì)胞核數(shù)量、核面積、核質(zhì)比及核間距等定量參數(shù)，并能將所得圖像及相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分類存儲(chǔ)。

熒光顯微內(nèi)窺成像系統(tǒng)可對(duì)兩種或多種熒光探針進(jìn)行快速多譜成像方法，以裸鼠結(jié)腸癌模型用被FITC標(biāo)記EGFR抗體及Alexa Fluor680標(biāo)記的VEGF抗體兩種熒光探針進(jìn)行多譜成像為例，包括以下步驟：

根據(jù)所使用的FITC、Alexa Fluor680兩種熒光探針的光譜學(xué)特征，選擇適宜的兩套激發(fā)光濾光片488nm和645nm，兩套二向色鏡濾光片490nm和690nm，兩套發(fā)射光濾光片525nm和710nm的組合。

開啟寬光譜光源1，相機(jī)15及計(jì)算機(jī)，將傳像光纖束的遠(yuǎn)端對(duì)準(zhǔn)并緊貼待測(cè)部位。

先對(duì)FITC標(biāo)記EGFR抗體進(jìn)行激發(fā)成像，分別切換熒光立方體模塊2，使一組激發(fā)光濾光片18，二向色鏡濾光片20及發(fā)射光濾光片21進(jìn)入光路，用窄譜段激發(fā)光照射探測(cè)物，使CCD相機(jī)15拍攝第一組原始熒光圖像。

在對(duì)Alexa Fluor680標(biāo)記的VEGF抗體進(jìn)行激發(fā)成像，分別切換熒光立方體模塊2，使另一組激發(fā)光濾光片18，二向色鏡濾光片20及發(fā)射光濾光片21進(jìn)入光路，用窄譜段激發(fā)光照射探測(cè)物，使CCD相機(jī)15拍攝第二組原始熒光圖像。

圖像數(shù)據(jù)處理控制模塊14讀取兩組原始熒光圖像，分別對(duì)兩組原始熒光圖像使用高斯濾波算法進(jìn)行去噪處理，去除原始熒光圖像中光纖間隔造成的網(wǎng)格圖像，再通過直方圖均衡化算法提高熒光圖像的對(duì)比度，生成校正熒光圖像，并在顯示器上實(shí)時(shí)同步顯示所述的校正熒光圖像。

本實(shí)施例中，所述的高斯濾波算法和直方圖均衡化算法具體包括以下步驟；

分別讀取兩組原始熒光圖像，用(-1)x+y乘以輸入圖像進(jìn)行坐標(biāo)變換，利用離散傅里葉變換計(jì)算圖像的DFT，用濾波器函數(shù)H(μ，ν)乘以F(μ，ν)計(jì)算反DFT，得到結(jié)果再乘以(-1)x+y即得到高斯濾波后的圖像。

高斯濾波的二維形式如下：

其中D(μ，ν)是模糊半徑(r2＝μ2+ν2)；σ是正態(tài)分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

再通過直方圖均衡化算法進(jìn)行處理，具體映射方法如下：

其中n是圖像中像素的總和，Nk是當(dāng)前灰度級(jí)的像素個(gè)數(shù)，L是圖像中可能的灰度級(jí)總數(shù)。即可得圖像灰度值映射并通過圖像灰度值計(jì)算相關(guān)熒光圖像中的細(xì)胞核數(shù)量、核面積、核質(zhì)比及核間距等定量參數(shù)，并能將所得圖像及相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分類存儲(chǔ)。

熒光顯微內(nèi)窺成像系統(tǒng)可將不同的濾光片切換至光路上，以滿足不同探針對(duì)濾光裝置成像的要求，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)多種熒光探針快速成像。另外，由于采用電控平移臺(tái)，切換時(shí)無需打開暗箱，可以快速電動(dòng)切換，避免了外界雜散光的干擾同時(shí)減少了光學(xué)系統(tǒng)內(nèi)光學(xué)信號(hào)的損失。并且由于進(jìn)行了圖像處理，提高了熒光圖像的質(zhì)量，并能對(duì)圖像進(jìn)行定量分析計(jì)算。

本發(fā)明的有益效果為：

1、采用模塊化設(shè)計(jì)，方便設(shè)備維修，安裝。

2、可以對(duì)多種熒光探針進(jìn)行成像。

3、采用電控平移臺(tái)設(shè)計(jì)，通過機(jī)械電子控制，無需手動(dòng)，切換快速，使用方便。

4、采用電動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)輪設(shè)計(jì)，可以提供多種放大倍數(shù)的放大圖像。

5、可以對(duì)采集的熒光圖像進(jìn)行處理，定量分析。

6、測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確、直觀，能迅速地顯示在顯示屏上。

7、可以結(jié)合靶向熒光探針實(shí)現(xiàn)特異性靶向分子成像。

8、可以實(shí)現(xiàn)熒光成像與寬視野成像設(shè)備結(jié)合，通過熒光圖像可以獲得特異性靶向分子成像的信息，通過寬視野成像設(shè)備可以獲得解剖結(jié)構(gòu)的信息，通過圖像融合可以實(shí)現(xiàn)熒光靶向分子成像-白光解剖成像的雙模態(tài)成像模式。

以上所述的僅是本發(fā)明的一些實(shí)施方式。對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。