本發(fā)明涉及生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗菌保濕適宜組織粘附的修復材料及其制備方法和應用。

背景技術(shù)：

理想的組織修復材料應能最大程度地模擬細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，同時具備儲存及緩釋活性因子的能力，從而指導和促進細胞行為，誘導組織再生。因此，研究和設(shè)計“結(jié)構(gòu)和功能仿生”的修復材料是當今生物醫(yī)學材料發(fā)展的重要方向。通過靜電紡絲得到的納米紡絲纖維具有較大的比表面積、可調(diào)控的孔隙率和較好的延展性，并且能模擬天然細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，能夠廣泛的應用在人造血管、皮膚創(chuàng)傷修復以及骨組織工程等修復醫(yī)學的各個方面。天然及合成高分子材料、陶瓷材料等均可用于靜電紡絲纖維的制備，其中，人工合成高分子材料由于其優(yōu)良的力學性能及易加工性在靜電紡絲修復材料的研究中應用最為廣泛。然而，此類合成高分子材料制備的紡絲納米纖維往往具備較差的親水性、生物活性因子吸附性、組織粘附性及細胞親和性。

將人工合成高分子材料與天然高分子材料進行復合紡絲或與活性因子如生長因子、藥物等進行共紡等是目前用于改善人工合成高分子納米紡絲纖維性能的重要手段。將天然高分子及人工合成高分子材料進行復合紡絲，是賦予紡絲纖維良好力學及生物學性能的重要手段，然而此法往往需要尋找合適的共溶劑，這極大地限制了紡絲原料的選擇范圍。采用共紡技術(shù)實現(xiàn)活性因子的負載雖一定程度上能夠提高材料的生物學活性，然而紡絲工藝條件對負載因子的活性有一定影響，且基于高分子材料對特殊溶劑的需求也會極大程度限制活性因子的選擇范圍。層層自組裝技術(shù)是一種可用于對修復材料進行表面修飾的重要技術(shù)手段，其反應條件溫和、操作簡單、經(jīng)濟，且自組裝層本身就可作為生物活性因子及藥物的天然儲存庫。然而，層層自組裝修飾層雖具有良好的生物學活性，但其在生理環(huán)境下的穩(wěn)定性往往不夠，也難以真正實現(xiàn)對負載因子或藥物緩釋的效果。

因此，仍需研究一種生物學活性好、結(jié)構(gòu)和功能仿生，并能夠負載藥物或生物活性因子并實現(xiàn)其緩釋，還具有較好穩(wěn)定性的組織修復材料。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有抗菌保濕適宜組織粘附的修復材料，本發(fā)明提供的修復材料具有良好的抗菌和保濕性能，并具有較好的組織粘附性；其可作為水溶性藥物及生物活性因子的穩(wěn)定、高效緩釋載體，適用于組織工程應用領(lǐng)域尤其是皮膚修復領(lǐng)域。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述具有抗菌保濕適宜組織粘附的修復材料作為載體在水溶性藥物及生物活性因子負載中的應用。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述具有抗菌保濕適宜組織粘附的修復材料在組織工程領(lǐng)域中的應用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種具有抗菌保濕適宜組織粘附的修復材料，所述修復材料的制備方法如下：

s1：對透明質(zhì)酸溶液進行巰基化修飾并控制游離巰基含量為100～200μmol·g^-1，經(jīng)透析、冷凍干燥即得巰基化透明質(zhì)酸；

s2：對殼聚糖溶液進行馬來酰化改性并控制乙?；繛?500～2000μmol·g^-1，經(jīng)透析、冷凍干燥即得馬來?；瘹ぞ厶牵?/p>

s3.將納米紡絲纖維經(jīng)多巴胺溶液浸泡后充分水洗，然后將納米紡絲纖維依次浸入巰基化透明質(zhì)酸溶液和馬來酰化殼聚糖溶液中吸附，吸附完后洗脫；

s4：重復吸附、洗脫步驟若干次后即得巰基化透明質(zhì)酸和馬來?；瘹ぞ厶墙惶嫖降男迯筒牧希?/p>

其中，巰基化透明質(zhì)酸溶液的濃度為0.25～0.75mg·ml^-1，所述馬來?；瘹ぞ厶侨芤旱臐舛葹?.25～0.75mg·ml^-1。

通過靜電紡絲技術(shù)制備的納米紡絲纖維具有較大的比表面積、可調(diào)控的孔隙率和較好的延展性、吸附性，且能模擬天然細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能等優(yōu)勢，成為了修復材料發(fā)展的新方向，然而單純的人工合成高分子納米紡絲纖維往往不具有抗菌、保濕性。需要對其進行適當?shù)男揎椗c改性，以提高其用于創(chuàng)面修復的可行性。與單純通過殼聚糖與透明質(zhì)酸修飾相比，本發(fā)明通過對殼聚糖與透明質(zhì)酸的化學改性，將其用于紡絲纖維修飾后可賦予修復材料良好的抗菌能力，無需進行額外的抗菌藥物負載。

天然高分子自組裝修飾層雖然具有良好的生物學活性，然而其在生理環(huán)境下的穩(wěn)定性往往不夠，需通過化學或物理交聯(lián)手段提高其穩(wěn)定性。本發(fā)明通過對透明質(zhì)酸和殼聚糖進行化學修飾，在分子間引入具有反應活性的巰基及雙鍵，使其在對納米紡絲纖維進行自組裝修飾過程中可以原位形成分子內(nèi)交聯(lián)，達到穩(wěn)定透明質(zhì)酸和殼聚糖修飾層的效果。同時，避免了事后小分子化學交聯(lián)劑的使用，從而減少了后續(xù)的一系列小分子清洗等步驟，也一定程度上規(guī)避了小分子化學交聯(lián)劑存在的潛在毒性作用。

本發(fā)明通過自組裝生物功能化修飾對納米紡絲纖維進行改性，在維持納米紡絲纖維基體材料良好性能的基礎(chǔ)上改善了其生物學功能，經(jīng)修飾所得的修復材料具有良好的抗菌和保濕性能，其持水性也得到了明顯的改善，還具有較好的組織粘附性。另外，本發(fā)明提供的生物功能化修飾后的納米紡絲纖維能夠承受諸如ph、高離子強度以及機械力等外界環(huán)境壓力，可作為藥物載體、組織工程支架或傷口修復材料應用在生物醫(yī)學組織工程領(lǐng)域。

本發(fā)明方法采用層層自組裝技術(shù)對紡絲纖維進行修飾，反應介質(zhì)為水溶液，修飾過程在室溫下進行，后續(xù)生物活性因子或藥物的負載亦是在此條件下開展，不會引起材料的降解和變性，也不會影響負載因子的生物學活性。

優(yōu)選地，所述游離巰基含量為100～200μmol·g^-1。

優(yōu)選地，所述乙酰基含量為1500～2000μmol·g^-1。

優(yōu)選地，巰基化透明質(zhì)酸溶液的濃度為0.5mg·ml^-1，所述馬來?；瘹ぞ厶侨芤旱臐舛葹?.5mg·ml^-1。

優(yōu)選地，s4中重復吸附、洗脫步驟9～11次。

優(yōu)選地，s1中選用1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽和n-羥基琥珀酰亞胺對透明質(zhì)酸水溶液進行活化處理；選用半胱氨酸鹽酸鹽對透明質(zhì)酸進行巰基化修飾。

優(yōu)選地，s2中殼聚糖和馬來酸酐的摩爾比為0.5～2:1。

優(yōu)選地，s3中巰基化透明質(zhì)酸溶液的ph為5～7，馬來?；瘹ぞ厶侨芤旱膒h為3～5。

上述具有抗菌保濕適宜組織粘附的修復材料作為載體在水溶性藥物或生物活性因子負載中的應用也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

上述具有抗菌保濕適宜組織粘附的修復材料在組織工程領(lǐng)域中的應用也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

優(yōu)選地，所述修復材料在皮膚修復領(lǐng)域中的應用。

在本發(fā)明中，所述修飾層主要通過高分子間功能團的反應實現(xiàn)其在紡絲纖維表面的自組裝。

在本發(fā)明中，所述s3中的納米紡絲纖維可以是聚乳酸納米紡絲纖維，也可以根據(jù)修復醫(yī)學領(lǐng)域需求選用本領(lǐng)域的其它高分子納米紡絲纖維如聚乳酸羥基乙酸納米紡絲纖維等。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明通過對現(xiàn)有的納米紡絲纖維進行生物功能化修飾，提供了一種具有良好抗菌和保濕性能的修復材料，該修復材料還具有較好的組織粘附性。本發(fā)明提供的修復材料可作為水溶性藥物或生物活性因子的穩(wěn)定、高效緩釋載體，適用于組織工程應用領(lǐng)域尤其是皮膚修復領(lǐng)域。另外，本發(fā)明用于制備修復材料的方法和體系容易操作和控制，實驗條件溫和、成本低，避免了高能源的投入，具有較大的推廣應用價值。

附圖說明

圖1為改性前后的透明質(zhì)酸及殼聚糖的核磁譜圖；

圖2為不同修飾條件下聚乳酸納米紡絲纖維的形貌結(jié)構(gòu)；

圖3為自組裝修飾前后聚乳酸納米紡絲纖維的親疏水性圖；

圖4為自組裝修飾前后聚乳酸納米紡絲纖維的抗菌能力圖；

圖5為自組裝修飾前后聚乳酸納米紡絲纖維的組織粘附能力圖（*p<0.05）；

圖6為自組裝修飾前后聚乳酸納米紡絲纖維內(nèi)胰島素的緩釋行為；

圖7為不同紡絲纖維表面臍帶間充質(zhì)干細胞增殖行為（*p<0.05）。

具體實施方式

下面結(jié)合實例對本發(fā)明做進一步的說明，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，但本發(fā)明要求保護的范圍不局限于實例所表述的范圍。

實施例1一種具有抗菌保濕適宜組織粘附的修復材料

（1）聚乳酸納米紡絲纖維的制備

將7wt%的聚乳酸粉末溶解于dcm/dmf混合液中并裝入20ml注射器中并固定于微量注射泵上，采用削平的針頭作為噴射細流的的毛細管，毛細管內(nèi)徑為0.4mm，電場強度0.8kv·cm^-1，接收距離12cm，擠出量1ml·h^-1。將紡絲得到的纖維收集到旋轉(zhuǎn)滾筒上，真空干燥去除殘留的有機溶劑即可得聚乳酸納米紡絲纖維。

（2）聚乳酸納米紡絲纖維的自組裝修飾

①透明質(zhì)酸的巰基化改性

配制透明質(zhì)酸（ha）水溶液，依次加入終濃度為50mmol·l^-1的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽（edac）和n-羥基琥珀酰亞胺（nhs），調(diào)節(jié)體系ph約為5～6。避光、室溫攪拌反應一定時間后，在反應體系中加入一定量半胱氨酸鹽酸鹽，控制游離巰基含量在160μmol·g^-1左右，調(diào)節(jié)體系ph約為5，避光、室溫攪拌反應5h后，透析3天，冷凍干燥后即可得巰基化ha（tha）。

②殼聚糖的馬來?；男?/p>

將完全溶解的1wt%的殼聚糖（chi）溶液置于三口燒瓶中，根據(jù)chi重復單元與馬來酸酐摩爾比為1:1的投料比向殼聚糖溶液中加入馬來酸酐，控制乙酰基數(shù)目為1971μmol·g^-1左右，室溫下避光反應24h后透析3天，以除去雜質(zhì)和未反應的小分子，冷凍干燥后即可得馬來酰化chi（ma-chi）。

③高分子聚電解質(zhì)溶液的配置

各聚電解質(zhì)溶液的配制如下：

多巴胺（2mg·ml^-1）溶解于tris-hcl（ph為8.5）溶液中；

將巰基化修飾后的ha（0.5mg·ml^-1）溶解于水溶液中，馬來酰化chi（0.5mg·ml^-1）溶解于0.1m醋酸溶液中，磁力攪拌過夜使其充分溶解；同時配制同等濃度的天然ha和天然chi溶液作為對比。

上述各溶液在使用前，除了多巴胺與tha溶液之外，所有溶液的ph值均調(diào)至4。

④自組裝修飾

聚乳酸納米紡絲纖維經(jīng)75%乙醇浸潤后充分水洗，首先將其轉(zhuǎn)移至2mg·ml^-1的多巴胺溶液中浸泡4h，然后充分水洗，使其在紡絲纖維表面組裝上一層帶正電的多巴胺基礎(chǔ)層。經(jīng)多巴胺修飾后的納米紡絲纖維依次浸入tha與ma-chi溶液中，每一層吸附12分鐘后都伴隨著洗脫步驟（3×3min），洗脫液為水溶液；同時將多巴胺修飾后的納米紡絲纖維依次浸入ha與chi溶液中，同等條件處理作對比。

重復以上步驟多次最終在多巴胺基礎(chǔ)層上分別得到11層ha與chi及tha與ma-chi交替吸附的納米紡絲纖維。

對上述經(jīng)自組裝修飾后的聚乳酸納米紡絲纖維的形貌特征等物化性能進行檢測，測試結(jié)果如下。

物化性能測試

（1）活性基團的鑒定

圖1為改性前后的透明質(zhì)酸及殼聚糖的核磁譜圖，從圖1可以看出，經(jīng)過巰基化改性后的ha與馬來?；男缘腸hi分子上成功地引入了巰基與雙鍵。此外，通過ellman’s測試和馬來酸標準曲線法更進一步證實成功地對ha和chi進行了巰基化和馬來酰化改性，其中巰基含量為160μmol·g^-1左右，乙?；鶖?shù)目為1971μmol·g^-1左右。

（2）自組裝修飾后的聚乳酸納米紡絲纖維的形貌結(jié)構(gòu)

圖2分別為純聚乳酸納米紡絲纖維（plla）、多巴胺修飾后聚乳酸納米紡絲纖維（da），天然chi與ha層層自組裝修飾后聚乳酸納米紡絲纖維（chi-ha）以及ma-chi與tha層層自組裝修飾后聚乳酸納米紡絲纖維（mchi-tha）的形貌結(jié)構(gòu)。

從圖2可以看出，經(jīng)過ma-chi與tha修飾后聚乳酸紡絲纖維表面粗糙度有了明顯的提高，這表明ma-chi和tha已經(jīng)成功地吸附到聚乳酸納米紡絲纖維上。

（3）自組裝修飾后的聚乳酸納米紡絲纖維的親水性、保濕、持水能力

接觸角（wca）檢測是反應材料表面親疏水性的重要手段，隨著材料表面親水性的增加，其wca值將降低。

由圖3可以看出，經(jīng)chi和ha或ma-chi與tha修飾后的紡絲纖維的親水性都有了明顯的提高。而進一步對材料的吸水、保濕性進行研究后發(fā)現(xiàn)，純聚乳酸紡絲纖維的吸水、保濕能力分別為20.48%±6.44和12.31%±3.13，而經(jīng)ma-chi和tha修飾后材料的吸水、保濕能力高達527.78%±25.46和56.87%±10.54，表明通過此法制備的修復材料具有良好的吸水、保濕效果。

（4）自組裝修飾后聚乳酸納米紡絲纖維抗菌性能

由圖4可見，純聚乳酸納米紡絲纖維本身無抗菌性，周圍未見抑菌圈，而經(jīng)天然chi及ha修飾后的聚乳酸納米紡絲纖維周圍亦未見明顯抑菌圈，提示其不具有抗菌能力。相反地，聚乳酸納米紡絲纖維通過ma-chi與tha自組裝修飾后紡絲纖維周圍出現(xiàn)了明顯的抑菌圈，抑菌圈寬度約為6.53mm±1.54，表明該修復材料具有明顯的抗菌、抑菌能力。

（5）自組裝修飾后聚乳酸納米紡絲纖維組織粘附性能

圖5為自組裝修飾前后聚乳酸納米紡絲纖維的組織粘附能力圖，由圖5可知，經(jīng)自組裝修飾后尤其是ma-chi與tha修飾后的納米紡絲纖維的組織粘附能力有了顯著的提高。我們推測，這可能是由于tha分子上的巰基可與組織內(nèi)糖蛋白的富含半胱氨酸的亞結(jié)構(gòu)域形成二元鍵，從而產(chǎn)生更強的組織粘附能力。

應用試驗例一實施例1提供的修復材料在胰島素負載中的應用

在我們前期研究中發(fā)現(xiàn)無血清條件下，一定濃度的胰島素具有顯著的促進臍帶間充質(zhì)干細胞增殖的能力。在此基礎(chǔ)上，我們利用以實施例1中紡絲纖維修飾后的自組裝高分子層為載體，通過簡單浸泡的方式實現(xiàn)胰島素在紡絲纖維內(nèi)的負載，并對其理化性能進行測試。

（1）胰島素緩釋效果

圖6為自組裝修飾前后聚乳酸納米紡絲纖維內(nèi)胰島素的緩釋行為，由圖6結(jié)果可見，經(jīng)過ma-chi與tha修飾后的紡絲纖維內(nèi)負載的胰島素其緩釋控釋效果有了明顯提高，胰島素的釋放能夠持續(xù)到15天以后。

（2）細胞學評價

生物材料用于皮膚創(chuàng)面修復的一個重要因素即要求其具有促創(chuàng)面修復能力，前期實驗在二維培養(yǎng)條件下發(fā)現(xiàn)一定濃度的胰島素能夠在無血清條件下明顯的促進臍帶間充質(zhì)干細胞增殖。本專利利用自組裝修飾層作為胰島素載體，發(fā)現(xiàn)經(jīng)ma-chi與tha修飾后的紡絲纖維可以明顯提高胰島素的緩釋效果。圖7為不同紡絲纖維表面臍帶間充質(zhì)干細胞增殖行為，由圖7可知，負載胰島素后的紡絲纖維可以顯著促進細胞增殖，提示通過利用本專利發(fā)明的修復材料負載上胰島素可以實現(xiàn)加速皮膚創(chuàng)面愈合的效果。

本發(fā)明通過對聚乳酸納米紡絲纖維進行生物功能化修飾，得到了一種具有良好抗菌、保濕、適宜組織粘附性的修復材料，同時該技術(shù)還可推廣應用于其他的高分子納米紡絲纖維修飾上，以及其他組織工程應用領(lǐng)域。