本發(fā)明一種重組人干擾素α2a栓，同時(shí)提供了及其制備方法，屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

干擾素是（interferon，ifn）是由細(xì)胞基因控制，在特定誘導(dǎo)劑作用下產(chǎn)生的一類高活性、多功能蛋白質(zhì)，具有廣譜抗病毒、抗細(xì)胞分裂、抗腫瘤和細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性。干擾素抗病毒機(jī)理是主要作用于細(xì)胞膜上的受體系統(tǒng)，細(xì)胞內(nèi)抗病毒蛋白基因去抑制而被激活，合成抗病毒蛋白mrna，轉(zhuǎn)移到胞漿核糖體，再轉(zhuǎn)譯成幾種抗病毒蛋白，從而阻斷病毒的繁殖。干擾素是當(dāng)前國內(nèi)外臨床應(yīng)用于有效治療乙型肝炎、丙型肝炎、尖銳濕疣、慢性宮頸炎、宮頸糜爛、毛細(xì)胞性白血病等30多種病毒疾病的生物制劑。我國自從1990年批準(zhǔn)衛(wèi)生部長春生物制品研究所干擾素α1b滴眼劑治療單皰性角膜炎以來，已相繼批準(zhǔn)治療乙型肝炎、丙型肝炎、慢性宮頸炎、尖銳濕疣、單純皰疹等10多種疾病，取得了理想的臨床療效。自60年代起，干擾素劑型已由滴眼劑發(fā)展為注射劑，軟膏劑，栓劑等多種劑型，這些劑型可根據(jù)不同疾病進(jìn)行選擇并在臨床應(yīng)用中都獲得了好的治療效果。

重組人干擾素α2a，是一類由白細(xì)胞及淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生的多功能和高活性的誘生蛋白，遇光和濕不穩(wěn)定。重組人干擾素α2a具有廣譜抗病毒作用和對機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)功能，其抗病毒機(jī)制主要通過干擾素同靶細(xì)胞表面干擾素受體結(jié)合，誘導(dǎo)靶細(xì)胞內(nèi)2-5（a）合成酶、蛋白激酶pkr、mx蛋白等多種抗病毒蛋白，阻止病毒蛋白質(zhì)的合成、抑制病毒核酸的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄而實(shí)現(xiàn)。重組人干擾素α2a的劑型開發(fā)一直很不理想，影響了重組人干擾素α2a的應(yīng)用。

目前臨床使用的重組人干擾素α2a有注射劑、軟膏劑、片劑和栓劑等。臨床證明干擾素濃度越高，其治療病毒的效果就越好。但有些劑型的重組人干擾素α2a，由于全身給藥或者局部給藥濃度過高帶來了各種副作用反應(yīng)，治療效果受到很大的影響。常用的重組人干擾素α2a注射劑存在使用不便和有輕微疼痛的問題，且不能直接作用于病灶，到達(dá)用藥部位的濃度有限，且存在一定的不良反應(yīng)。重組人干擾素α2a軟膏劑雖然在治療顏面和生殖器皰疹有很好的療效，但同時(shí)也存在局限性。重組人干擾素α2a片劑塞入陰道后，重組人干擾素α2a難以溶出，難于發(fā)揮作用，且片劑對人體陰道的適應(yīng)性不好。重組人干擾素α2a栓劑在臨床上主要用于因病毒感染所引起的婦女慢性宮頸炎、宮頸糜爛和陰道炎的治療，其臨床療效主要與重組人干擾素α2a的生物活性有關(guān)。重組人干擾素α2a作為一種蛋白質(zhì)，因受各種因素的影響，其結(jié)構(gòu)往往會被破壞而失去生物活性，因此在傳統(tǒng)的重組人干擾素α2a栓劑生產(chǎn)過程中需要加入人血白蛋白作為保護(hù)劑，保持其生物活性，然而以人血白蛋白作為保護(hù)劑存在著來源困難、價(jià)格昂貴、生產(chǎn)成本增加、有感染血液病毒的風(fēng)險(xiǎn)。目前上市的重組人干擾素α2a栓劑的貯藏條件還必須要在2～8℃下避光保存和運(yùn)輸，不僅增加藥品保存及運(yùn)輸過程中的能源消耗從而增加成本。同時(shí)，冰箱冷藏下保存使患者用藥的依從性下降，不能更好的保證藥品的療效。因此，研究開發(fā)和改進(jìn)重組人干擾素α2a栓的生產(chǎn)工藝，可使栓劑更加穩(wěn)定，用藥更加方便，局部用藥能夠讓低濃度栓劑在陰道能夠保持高水平的藥物濃度，從而有效改善干擾素臨床用藥的一些不良反應(yīng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種重組人干擾素α2a栓，解決了傳統(tǒng)重組人干擾素α2a栓的價(jià)格高，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，貯藏難，患者注射使用依從性不好等問題，是一種將經(jīng)過發(fā)酵、純化得到的重組人干擾素α2a原液與甘油明膠基質(zhì)混合均勻后制成的重組人干擾素α2a栓。

本發(fā)明進(jìn)一步還提供了重組人干擾素α2a栓的制備方法，藥物的主要有效成分重組人干擾素α2a原液是利用大腸桿菌表達(dá)技術(shù)構(gòu)建含有人干擾素α2a基因的重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中獲得穩(wěn)定的工程菌，工程菌發(fā)酵后通過一系列純化工藝獲得重組人干擾素α2a原液，經(jīng)無菌過濾后和用作保護(hù)有效成分生物學(xué)活性的甘油明膠基質(zhì)混合制成重組人干擾素α2a栓。

本發(fā)明公開的一種重組人干擾素α2a栓的制備方法，包括以下步驟：

1)將甘油、明膠、注射用水按照5：2：1～5：3：2比例加入到無菌密閉的栓劑基質(zhì)罐中，溫度加熱至80～90℃，并不斷攪拌使其溶解，攪拌速度為20～40rpm，攪拌時(shí)間為2～4小時(shí)；

2)將均勻混合后的栓劑基質(zhì)在111～131℃下滅菌60～70分鐘，從而達(dá)到無菌狀態(tài)；

3)將滅菌后的栓劑基質(zhì)冷卻至52～56℃，并保持基質(zhì)溫度在此范圍內(nèi)；

4)將重組人干擾素α2a原液加入至栓劑基質(zhì)中，并在加入重組人干擾素α2a原液時(shí)，保持溫度在52～56℃范圍內(nèi)，充分?jǐn)嚢?5～20分鐘使其混合均勻；

5)將混合均勻后的原液和基質(zhì)通入過濾壓縮空氣，經(jīng)過用120～140目過濾器在線過濾，除去基質(zhì)中的雜質(zhì)成分；

6)將過濾后的原液和基質(zhì)，用全自動栓劑灌裝機(jī)灌裝，即得。

本發(fā)明所述的重組人干擾素α2a栓在制備治療由病毒感染引起的慢性宮頸炎、宮頸糜爛、陰道炎疾病藥物中的用途。

本發(fā)明所述的重組人干擾素α2a栓在制備治療內(nèi)人乳頭瘤病毒及單純皰疹病毒引起的疾病藥物中的用途。

【用法用量】：將本發(fā)明置于陰道后穹隆處，每次1片，隔日1次，6~10次為一個療程。

本發(fā)明的積極效果在于：

1.本發(fā)明的基質(zhì)配方適用于干擾素特性。甘油明膠栓劑基質(zhì)：甘油不僅作為賦形劑，物理作用為脫水劑。由于細(xì)菌在局部脫水環(huán)境下繁殖緩慢，有一定抑菌作用，從而能夠有效保護(hù)受損的陰道黏膜。明膠是由動物膠原經(jīng)溫和斷裂后的產(chǎn)物，是一種成分復(fù)雜的高分子量水溶性蛋白質(zhì)混合物，不僅作為賦形劑，還可作為蛋白酶抑制劑。健康婦女的陰道內(nèi)均會存在一定數(shù)量的菌群會分泌蛋白酶，同時(shí)受損的生殖道上皮細(xì)胞也會分泌釋放蛋白酶。如果不能有效抑制蛋白酶的活性，不僅會進(jìn)一步消化破壞健康細(xì)胞，而且會使干擾素α2a蛋白質(zhì)在未同干擾素ⅰ型受體結(jié)合就會被降解。明膠作為蛋白酶的底物，能夠有效保護(hù)干擾素α2a的蛋白質(zhì)不被降解，保證其結(jié)構(gòu)完整，使干擾素生物活性穩(wěn)定，從而充分保證其生物活性的有效發(fā)揮，同時(shí)可干擾細(xì)胞釋放的蛋白酶進(jìn)一步破壞陰道受損的黏膜組織，從而實(shí)現(xiàn)良好的治療效果。甘油明膠基質(zhì)在人體內(nèi)37.0～37.5℃的溫度下逐漸溶解，通過陰道黏膜上皮吸收，釋放干擾素α2a蛋白質(zhì)與黏膜干擾素ⅰ型受體結(jié)合，從而發(fā)揮良好的抗病毒作用。

2.本發(fā)明的生產(chǎn)工藝簡單易行，制造成本低廉，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，同時(shí)保證產(chǎn)品的質(zhì)量均一性和穩(wěn)定性更好。

3.本發(fā)明的貯藏條件是于2～30℃下避光保存和運(yùn)輸，有效使用期限為0～42個月。藥品貯藏溫度范圍更加寬泛，可常溫下保存和運(yùn)輸不僅降低了藥品保存及運(yùn)輸過程中的能源消耗從而節(jié)約成本，同時(shí)使患者用藥的依從性得到提高，保證了藥品的療效。

4.本發(fā)明作為局部外用制劑，直接作用于病變局部，使低濃度的干擾素在受損的陰道黏膜保持高活性成分，局部藥物濃度較高，治療效果非常顯著，并且產(chǎn)品不會存在干擾素全身用藥后常見的感冒樣癥狀等副反應(yīng)癥狀的發(fā)生，無任何毒副作用。

5.本發(fā)明是一種使用方便，安全，無痛苦，經(jīng)濟(jì)，療效明確的局部外用制劑，主要經(jīng)陰道后穹隆給藥用于治療由病毒感染引起的慢性宮頸炎、宮頸糜爛、陰道炎等疾病，且療效顯著。還能消除體內(nèi)人乳頭瘤病毒及單純皰疹病毒，從而具有預(yù)防宮頸癌的作用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明重組人干擾素α2a栓ph加速穩(wěn)定性考察結(jié)果（36.5～37.5℃）；

圖2為本發(fā)明重組人干擾素α2a栓生物學(xué)活性加速穩(wěn)定性考察結(jié)果（36.5～37.5℃）。

圖3為本發(fā)明重組人干擾素α2a栓ph長期穩(wěn)定性考察結(jié)果(29～31℃)；

圖4為本發(fā)明重組人干擾素α2a栓生物學(xué)活性長期穩(wěn)定性考察結(jié)果(29～31℃)。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步解釋本發(fā)明，并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。

實(shí)施例1

重組人干擾素α2a栓的制備

（1）基質(zhì)配制及初溶

將甘油、明膠、注射用水按照5：2：1～5：3：2比例加入到無菌密閉的栓劑基質(zhì)罐中。關(guān)閉進(jìn)料口閥門，打開攪拌開關(guān)、排氣閥門、循環(huán)下水閥門和蒸汽閥門，溫度加熱至80～90℃，并不斷攪拌使其溶解，攪拌速度為20～40rpm；

（2）基質(zhì)滅菌

保持?jǐn)嚢杷俣葹?0～40rpm。打開栓劑基質(zhì)罐蒸汽總閥，打開排氣總閥，排凈冷凝水，關(guān)上排氣總閥；打開基質(zhì)罐夾層進(jìn)氣閥，打開夾層排氣閥，排凈夾層冷凝水，關(guān)閉夾層排氣閥；待基質(zhì)罐內(nèi)壓力達(dá)到0.10～0.13mpa后，打開基質(zhì)罐內(nèi)排氣閥，排凈基質(zhì)罐內(nèi)冷空氣，關(guān)閉基質(zhì)罐內(nèi)排氣閥；同時(shí)打開濾器進(jìn)氣閥，打開濾器排氣閥，待溫度達(dá)到111～131℃，滅菌60～70分鐘；

（3）基質(zhì)保溫

待栓劑基質(zhì)罐內(nèi)溫度降至52～56℃后，啟動夾層恒溫水浴系統(tǒng)，使栓劑基質(zhì)罐內(nèi)溫度保持在52～56℃，待下一步使用；

（4）原液與基質(zhì)混合過濾

將重組人干擾素α2a原液（50萬iu/枚）加入到已滅菌基質(zhì)內(nèi)，原液加入基質(zhì)時(shí)，基質(zhì)溫度應(yīng)保持在52～56℃內(nèi)。打開攪拌開關(guān)，充分?jǐn)嚢?5～20分鐘，混勻，關(guān)閉攪拌開關(guān)。打開罐底閥門，向罐內(nèi)通入過濾壓縮空氣，將加入原液混勻后的基質(zhì)經(jīng)過120～140目過濾器在線過濾，通過管道打入全自動栓劑灌裝機(jī)桶內(nèi)，灌裝即得。

實(shí)施例2

重組人干擾素α2a栓的穩(wěn)定性考察試驗(yàn)

為了進(jìn)一步確定本發(fā)明的配方和制備方法的穩(wěn)定性，通過檢測數(shù)據(jù)的匯總和分析來判斷藥品在擬變更的貯藏溫度下是否穩(wěn)定，為產(chǎn)品的包裝、運(yùn)輸、貯存條件、有效期的確定提供理論依據(jù)，并在穩(wěn)定期內(nèi)重新設(shè)定產(chǎn)品的有效期。采用2013年連續(xù)生產(chǎn)的3批重組人干擾素α2a栓（生產(chǎn)批號：s20130201、s20130202、s20130203）作為考察對象，分別進(jìn)行36.5～37.5℃加速穩(wěn)定性考察試驗(yàn)和29～31℃長期穩(wěn)定性考察試驗(yàn)。

1.本發(fā)明重組人干擾素α2a栓36.5～37.5℃加速穩(wěn)定性考察試驗(yàn)：

根據(jù)本發(fā)明重組人干擾素α2a的理化性質(zhì)，結(jié)合栓劑劑型的自身特殊性，對本發(fā)明進(jìn)行了36.5～37.5℃加速穩(wěn)定性考察試驗(yàn)。考察項(xiàng)目參照中華人民共和國藥典(2015版)，選擇鑒別、外觀、重量差異、融變時(shí)限、ph值和生物學(xué)活性為考察指標(biāo)，進(jìn)行了為期6個月的穩(wěn)定性考察，具體考察檢測項(xiàng)目和考察時(shí)間見表1。由于栓劑的使用要求是在人體溫度下逐漸軟化溶解，在36.5～37.5℃保存一段時(shí)間后會出現(xiàn)栓體融化現(xiàn)象。因此，在栓劑穩(wěn)定性考察時(shí)，應(yīng)先將栓劑應(yīng)置于冰箱中冷卻后再進(jìn)行檢驗(yàn)。從36.5～37.5℃取出的栓劑應(yīng)直立置于冰箱中冷卻30分鐘以上。

表1：重組人干擾素α2a栓加速穩(wěn)定性考察

注：表中標(biāo)“√”為進(jìn)行檢測；“/”為不進(jìn)行檢測。

36.5～37.5℃加速穩(wěn)定性考察結(jié)果：通過為期6個月的36.5～37.5℃加速穩(wěn)定性考察試驗(yàn)，鑒別、外觀、重量差異、融變時(shí)限等理化性狀沒有改變；ph值略有降低，但較為穩(wěn)定，趨勢分析如圖1所示；生物學(xué)活性雖有波動現(xiàn)象，但6個月內(nèi)均在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，趨勢分析如圖2所示。具體考察檢測結(jié)果見表2。

表2：重組人干擾素α2a栓36.5～37.5℃加速穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.重組人干擾素α2a栓29～31℃長期穩(wěn)定性考察試驗(yàn)：

根據(jù)重組人干擾素α2a的理化性質(zhì)，結(jié)合栓劑劑型的自身特殊性，對本發(fā)明進(jìn)行了29～31℃長期穩(wěn)定性考察試驗(yàn)?？疾祉?xiàng)目參照《中華人民共和國藥典》(2015版)，選擇鑒別、外觀、重量差異、融變時(shí)限、ph值、生物學(xué)活性和微生物限度為考察指標(biāo)，進(jìn)行了為期42個月的穩(wěn)定性考察，具體考察檢測項(xiàng)目和考察時(shí)間見表3。由于栓劑的使用要求是在人體溫度下逐漸軟化溶解，在29～31℃保存一段時(shí)間后會出現(xiàn)栓體軟化現(xiàn)象，因此，在栓劑穩(wěn)定性考察時(shí)，應(yīng)先將栓劑應(yīng)置于冰箱中冷卻后再進(jìn)行檢驗(yàn)。從29～31℃取出的栓劑應(yīng)置于冰箱中冷卻3～5分鐘。

表3：重組人干擾素α2a栓29～31℃長期穩(wěn)定性考察

注：表中標(biāo)“√”為進(jìn)行檢測；“/”為不進(jìn)行檢測。

29～31℃長期穩(wěn)定性考察結(jié)果：通過為期42個月的29～31℃長期穩(wěn)定性考察試驗(yàn)，鑒別、外觀、重量差異、融變時(shí)限等理化性狀沒有改變，微生物限度等指標(biāo)沒有改變；ph值略有降低，但較為穩(wěn)定，趨勢分析如圖3所示；生物學(xué)活性雖有波動現(xiàn)象，但42個月內(nèi)均在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，趨勢分析如圖4所示。具體考察檢測結(jié)果見表4。

表4：重組人干擾素α2a栓29～31℃長期穩(wěn)定性考察結(jié)果

重組人干擾素α2a栓的穩(wěn)定性考察試驗(yàn)結(jié)果分析：對三批重組人干擾素α2a栓劑成品(s20130101、s20130102、s20130103)進(jìn)行了穩(wěn)定性考察，從各項(xiàng)檢測的數(shù)據(jù)匯總表中可以觀察到，重組人干擾素α2a栓劑成品的穩(wěn)定性較佳。在監(jiān)測期內(nèi)栓劑成品各項(xiàng)檢測結(jié)果均在中華人民共和國藥典(2015版)規(guī)定的合格范圍內(nèi)。檢測數(shù)據(jù)顯示，栓劑成品在鑒別、外觀、重量差異、融變時(shí)限、微生物限度等項(xiàng)均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。ph值雖在最初檢測時(shí)略有降低，但在其余檢測期內(nèi)較為穩(wěn)定，這是因?yàn)樗▌┗|(zhì)組成成分明膠本身就是緩沖體系，具有ph緩沖作用，栓劑ph值會在配制初期逐漸趨于穩(wěn)定，達(dá)到穩(wěn)定期后將不再變化。由于生物學(xué)活性檢驗(yàn)操作本身存在系統(tǒng)誤差，其誤差范圍為80%～150%，因此，栓劑的生物學(xué)活性在此范圍內(nèi)波動屬正常波動，非藥品質(zhì)量不穩(wěn)定導(dǎo)致。此三批栓劑在監(jiān)測期內(nèi)栓劑的生物學(xué)活性雖有波動，但均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

結(jié)論：通過重組人干擾素α2a栓的36.5～37.5℃加速穩(wěn)定性考察和29～31℃長期穩(wěn)定性考察，重組人干擾素α2a栓的各項(xiàng)指標(biāo)在檢測期均無顯著變化。因此，可以證明重組人干擾素α2a栓在2～30℃下避光貯藏很穩(wěn)定，有效使用期限可定為0～42個月。

實(shí)施例3

質(zhì)量控制評價(jià)

1.鑒別試驗(yàn)

用免疫印跡法(《中華人民共和國藥典》(2015版)三部通則3401)或免疫斑點(diǎn)法(《中華人民共和國藥典》(2015版)三部通則3402)測定，結(jié)果為陽性。

2.外觀檢查

本品應(yīng)為淡黃色至棕黃色栓劑，外形應(yīng)完整、均勻、光滑、質(zhì)硬。

3.重量差異按《中華人民共和國藥典》(2015版)三部通則0107)的方法進(jìn)行測定，重量差異應(yīng)為標(biāo)示量±5%，結(jié)果合格。

4.融變時(shí)限按《中華人民共和國藥典》(2015版)三部通則0922的方法進(jìn)行測定，應(yīng)合格。

5.ph值按《中華人民共和國藥典》(2015版)三部通則0631的方法進(jìn)行測定，ph值為6.5～7.5。

6.生物學(xué)活性按《中華人民共和國藥典》(2015版)三部通則3523的方法進(jìn)行測定。干擾素效價(jià)為標(biāo)示量的80％～150％。

7.微生物限度檢查

按《中華人民共和國藥典》(2015版)三部通則1105，1106，1107的方法進(jìn)行測定，應(yīng)合格。

雖然以上描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，這僅僅是舉例說明，本發(fā)明的保護(hù)范圍是由所附權(quán)利要求書限定的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的原理和實(shí)質(zhì)的前提下，可以對這些實(shí)施方式做出多種變更或修改，這些變更和修改均落入本使用新型的保護(hù)范圍。