本發(fā)明涉及護(hù)膚品
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種干細(xì)胞護(hù)膚組合物及其制備方法和使用方法。
背景技術(shù)：
：隨著生活水平的不斷提高，人們對(duì)健康尤其是皮膚的保養(yǎng)越來越重視。皮膚組織是人體最大組織器官，覆蓋在人體表面，阻隔自然界一切有害物質(zhì)對(duì)生命機(jī)體產(chǎn)生的損害作用。但是，隨著年齡的增加，皮膚組織器官的功能逐漸老化，從美學(xué)觀點(diǎn)看，嚴(yán)重影響人們對(duì)生命的熱情；從生理學(xué)的角度看，影響人體內(nèi)部器官的有效保護(hù)。于是各種各樣的美容護(hù)膚品應(yīng)運(yùn)而生。干細(xì)胞是具有增殖和分化潛能的細(xì)胞，具有自我更新復(fù)制的能力，能夠產(chǎn)生高度分化的功能細(xì)胞。除具有高度分化潛能外，干細(xì)胞還可分泌多種細(xì)胞因子，包括表皮生長因子(egf)、血小板源生長因子(pdgf)、轉(zhuǎn)化生長因子(tgf)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(b-fgf)、胰島素樣生長因子(igf)和神經(jīng)生長因子(ngf)等等。這些細(xì)胞因子可以促進(jìn)人皮膚的新陳代謝、促進(jìn)皮膚再生修復(fù)、延緩皮膚衰老，使皮膚重新恢復(fù)彈性和光澤。但目前相關(guān)的美容護(hù)膚品，多是一種或兩種細(xì)胞因子添加到美容護(hù)膚品中。皮膚的細(xì)胞因子修復(fù)是一個(gè)系統(tǒng)的復(fù)雜的調(diào)節(jié)過程，一種或兩種細(xì)胞因子不能滿足皮膚修護(hù)、細(xì)胞更新的需求，多種因子聯(lián)合應(yīng)用才能促進(jìn)表皮更新。而且這些因子因沒有修飾，不能透過皮膚，實(shí)際上并不能真正起到作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種干細(xì)胞護(hù)膚組合物及其制備方法和使用方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種干細(xì)胞護(hù)膚組合物，由a組分和b組分組成，a組分1-800質(zhì)量份，包括干細(xì)胞提取物、血清白蛋白、甘露醇、arg9透膜肽冷凍干燥得到，其中，干細(xì)胞提取物為培養(yǎng)干細(xì)胞后的干細(xì)胞培養(yǎng)基和培養(yǎng)的干細(xì)胞的凍融裂解物；b組分按質(zhì)量份數(shù)計(jì)，包括：使用時(shí)，將a組分和b組分進(jìn)行混合。進(jìn)一步地，血清白蛋白為干細(xì)胞提取物總質(zhì)量的1％，甘露醇為干細(xì)胞提取物總質(zhì)量的5％，arg9透膜肽為干細(xì)胞提取物總質(zhì)量的0.05％。進(jìn)一步地，干細(xì)胞提取物制備包括干細(xì)胞本源表達(dá)、質(zhì)粒電轉(zhuǎn)介導(dǎo)的干細(xì)胞因子表達(dá)、慢病毒介導(dǎo)的干細(xì)胞因子表達(dá)或者腺病毒介導(dǎo)的干細(xì)胞因子表達(dá)，其中，質(zhì)粒電轉(zhuǎn)介導(dǎo)的干細(xì)胞因子表達(dá)、慢病毒介導(dǎo)的干細(xì)胞因子表達(dá)或者腺病毒介導(dǎo)的干細(xì)胞因子表達(dá)制備時(shí)，將干細(xì)胞因子與透膜肽基因系列融合構(gòu)建新的融合基因后再進(jìn)行后續(xù)步驟，細(xì)胞因子與透膜肽基因系列可通過氨基酸系列在密碼子表中查詢。進(jìn)一步地，干細(xì)胞包括動(dòng)物源或人源的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞或肝干細(xì)胞。進(jìn)一步地，透膜肽種類與氨基酸系列包括：透膜肽類型1：tat：rkkrrqrrr；透膜肽類型2：vp-22：daatargrgrsaasrpterpraparsasrprrpvd；透膜肽類型3：ntp：rqikiwfqnrrmkwkk；透膜肽類型4：transportan：gwtlnsagyllgkinlkalaalakkil；透膜肽類型5：pep-1：ketwwetwwtewsqpkkkrkv；透膜肽類型6：mpg：galflgflgaagstmgawsqpkkkrkv；透膜肽類型7：map：klalklalkalkaalkla：透膜肽類型8：kala：weaklakalakalakhlakalakalkacea；透膜肽類型9：pptg20：glfrallrllrslwrlllra；透膜肽類型10：arg9：rrrrrrrrr；或透膜肽類型11：hct(9-32)：lgtytqdfnkfhtfpqtaigvgap。進(jìn)一步地，質(zhì)粒電轉(zhuǎn)介導(dǎo)的干細(xì)胞因子表達(dá)所用載體包括egfp-n1、n-p3xflag-cmv或pcdna3.1；慢病毒介導(dǎo)的干細(xì)胞因子表達(dá)所用載體包括phblv-cmvie-puro、plvx-tre3g、慢病毒包裝系統(tǒng)plvx-ac－puro、pspax2、pmd2.g、ppack-h1-gag、ppack-h1-rev、ppack-h1-vsvg、plp1、plp2、plp-vsvg、pmdlg/prre、pres-rev、pcmv-vsvg、pcmv-deltar8或pcmv-vsvg；腺病毒介導(dǎo)的干細(xì)胞因子表達(dá)所用載體包括pdc315、pdc316、pdc311、pdc312、admaxtm腺病毒載體系統(tǒng)或admaxtmhi-iq腺病毒載體系統(tǒng)。進(jìn)一步地，血清白蛋白包括人源血清白蛋白，動(dòng)物源血清白蛋白，重組人源血清白蛋白，或重組動(dòng)物源血清白蛋白。進(jìn)一步地，鞣花酸來源包括紅石榴。上述干細(xì)胞護(hù)膚組合物的制備方法，包括如下步驟：步驟1、將培養(yǎng)干細(xì)胞后的干細(xì)胞培養(yǎng)基、培養(yǎng)的干細(xì)胞的凍融裂解物、血清白蛋白、甘露醇、arg9透膜肽混合冷凍干燥，得到凍干粉；步驟2、將甘油、檸檬酸鈉、鞣花酸、維生素e、水混合均勻，得到溶媒液；步驟3、將步驟1制備的凍干粉和步驟2得到的溶媒液分別包裝，使用時(shí)再混合。上述干細(xì)胞護(hù)膚組合物的使用方法，包括如下步驟：將凍干粉和溶媒液混合均勻，輕晃至凍干粉全部溶化，之后進(jìn)行使用；早晚各一次。本發(fā)明的有益效果：1、本發(fā)明基于皮膚代謝的研究與對(duì)皮膚衰老的分析，選擇合適的組分、用量，諸多因子協(xié)同作用，重組皮膚深層彈性結(jié)構(gòu)和功能，使老化變形、變硬的膠原訊速水解，重建膠原平衡，促使肌膚皺紋迅速淺化，令肌膚盡顯白里透紅的健康色彩。2、本發(fā)明將細(xì)胞因子的基因與透膜肽基因系列融合，并表達(dá)帶有透膜肽的新的融合蛋白，同時(shí)配合人工合成的arg9透膜肽，可有效實(shí)現(xiàn)將這些因子透過皮膚，從深層增強(qiáng)皮膚的新陳代謝，延緩皮膚衰老，達(dá)到美白、預(yù)防或改善皮膚斑和皺紋、去痘、防過敏的目的。3、本發(fā)明活性成分(干細(xì)胞提取物和血清白蛋白)以凍干狀態(tài)保存，使用時(shí)與溶媒液配合。作為蛋白的細(xì)胞因子，在凍干狀態(tài)下，活性保持時(shí)間長，使用時(shí)與溶媒液混合，將其溶解，促進(jìn)吸收。4、本發(fā)明干細(xì)胞護(hù)膚組合物不添加任何化學(xué)有害物質(zhì)、重金屬與激素，不會(huì)出現(xiàn)因護(hù)膚品自身功效成分對(duì)皮膚的滲透造成二次損傷(化學(xué)有害物質(zhì)、重金屬與激素慢性滲入皮膚導(dǎo)致使用一定時(shí)間后皮膚變薄、長斑、皺紋增加等)。本發(fā)明主要通過增強(qiáng)皮膚自身代謝能力，延緩皮膚衰老，達(dá)到美白、預(yù)防或改善皮膚斑、皺紋、去痘、防過敏的目的，長期使用無任何副作用。適合所有年齡段的男性與女性護(hù)膚。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做更進(jìn)一步地解釋。下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，但并不用來限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。一種干細(xì)胞護(hù)膚組合物，由a組分和b組分組成，a組分1-800質(zhì)量份，包括干細(xì)胞提取物、血清白蛋白、甘露醇、arg9透膜肽冷凍干燥得到，其中，干細(xì)胞提取物為培養(yǎng)干細(xì)胞后的干細(xì)胞培養(yǎng)基和培養(yǎng)的干細(xì)胞的凍融裂解物；血清白蛋白為干細(xì)胞提取物總質(zhì)量的1％，甘露醇為干細(xì)胞提取物總質(zhì)量的5％，arg9透膜肽為干細(xì)胞提取物總質(zhì)量的0.05％；b組分按質(zhì)量份數(shù)計(jì)，包括：使用時(shí)，將a組分和b組分進(jìn)行混合。干細(xì)胞提取物制備包括干細(xì)胞本源表達(dá)、質(zhì)粒電轉(zhuǎn)介導(dǎo)的干細(xì)胞因子表達(dá)、慢病毒介導(dǎo)的干細(xì)胞因子表達(dá)或者腺病毒介導(dǎo)的干細(xì)胞因子表達(dá)等，其中，質(zhì)粒電轉(zhuǎn)介導(dǎo)的干細(xì)胞因子表達(dá)、慢病毒介導(dǎo)的干細(xì)胞因子表達(dá)或者腺病毒介導(dǎo)的干細(xì)胞因子表達(dá)制備時(shí)，將干細(xì)胞因子與透膜肽基因系列融合構(gòu)建新的融合基因后再進(jìn)行后續(xù)步驟，細(xì)胞因子與透膜肽基因系列可通過氨基酸系列在密碼子表中查詢。干細(xì)胞包括動(dòng)物源或人源的間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞或肝干細(xì)胞等。透膜肽種類與氨酸酸系列包括但不限于：透膜肽類型1：tat：rkkrrqrrr；透膜肽類型2：vp-22：daatargrgrsaasrpterpraparsasrprrpvd；透膜肽類型3：ntp：rqikiwfqnrrmkwkk；透膜肽類型4：transportan：gwtlnsagyllgkinlkalaalakkil；透膜肽類型5：pep-1：ketwwetwwtewsqpkkkrkv；透膜肽類型6：mpg：galflgflgaagstmgawsqpkkkrkv；透膜肽類型7：map：klalklalkalkaalkla：透膜肽類型8：kala：weaklakalakalakhlakalakalkacea；透膜肽類型9：pptg20：glfrallrllrslwrlllra；透膜肽類型10：arg9：rrrrrrrrr；或透膜肽類型11：hct(9-32)：lgtytqdfnkfhtfpqtaigvgap。血清白蛋白包括人源血清白蛋白，動(dòng)物源血清白蛋白，重組人源血清白蛋白，或重組動(dòng)物源血清白蛋白。鞣花酸來源包括紅石榴等。上述干細(xì)胞護(hù)膚組合物的制備方法，包括如下步驟：步驟1、將培養(yǎng)干細(xì)胞后的干細(xì)胞培養(yǎng)基、培養(yǎng)的干細(xì)胞的凍融裂解物、血清白蛋白、甘露醇、arg9透膜肽混合冷凍干燥，得到凍干粉；步驟2、將甘油、檸檬酸鈉、鞣花酸、維生素e、水混合均勻，得到溶媒液；步驟3、將步驟1制備的凍干粉和步驟2得到的溶媒液分別包裝，使用時(shí)再混合。上述制備的干細(xì)胞護(hù)膚組合物的使用方法，包括如下步驟：將凍干粉和溶媒液混合均勻，輕晃至凍干粉全部溶化，之后進(jìn)行使用；早晚各一次。先用清水或洗面奶清潔皮膚，取適量產(chǎn)品輕抹于皮膚表面，輕拍直至全部吸收。早上使用半小時(shí)后再使用其它化妝品，晚上使用后建議不再使用其它護(hù)膚品。實(shí)施例1采用干細(xì)胞本源表達(dá)1、凍干粉的制備：1.1干細(xì)胞培養(yǎng)：將復(fù)蘇好的干細(xì)胞10000000個(gè)與15毫升干細(xì)胞培養(yǎng)基接種于t75的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，在5％co2和37℃條件下培養(yǎng)48－72小時(shí)。其中，干細(xì)胞培養(yǎng)基配方如表1所示。表1試劑貯備液濃度貨號(hào)終濃度100ml培養(yǎng)基所需的量knockouttmdmemctstm—a128611x82.75mlknockouttmsrxenofreectstm—1261815％15mlglutamaxtm-ictstm200mma128602mm1mlneaa10mm111400.1mm1mlbfgf10μg/ml132568ng/ml80μl2-mercaptoethanol55mm219850.1mm182μl1.2收集和處理：收集培養(yǎng)干細(xì)胞后的干細(xì)胞培養(yǎng)基，另存于無菌容器中備用；用無菌生理鹽水將培養(yǎng)的干細(xì)胞洗兩次，加1毫升胰蛋白酶，37度處理5分鐘，吸出消化的干細(xì)胞，收集到2毫升的ep管中，56度處理10分鐘，再冷凍于-80度冰箱30分鐘，再置于56度水浴直至溶化，如此反復(fù)三次(冷凍、溶化)。在12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集上清并與上述無菌容器中的干細(xì)胞培養(yǎng)基混合，在10k的分子篩中濃縮十倍以上，加入5％的甘露醇，1％的血清白蛋白、0.05％的arg9透膜肽，混合均勻，再置于-80度冰箱過夜，在冷凍干燥儀中冷凍干燥，得到凍干粉。2、將4×106ug甘油、2×106ug檸檬酸鈉、15ug鞣花酸、10ug維生素e、15×106ug水混合均勻，得到溶媒液。3、步驟1制備的凍干粉取400ug單獨(dú)包裝，步驟2制備的溶媒液?jiǎn)为?dú)包裝。4、使用時(shí)，將凍干粉和溶媒液進(jìn)行混合。實(shí)施例2采用質(zhì)粒電轉(zhuǎn)介導(dǎo)的干細(xì)胞因子表達(dá)1、凍干粉的制備：1.1分別將表皮生長因子(egf)、血小板源生長因子(pdgf)、轉(zhuǎn)化生長因子(tgf)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(b-fgf)、胰島素樣生長因子(igf)和神經(jīng)生長因子(ngf)、人角質(zhì)細(xì)胞生長因子(kgf-2)、白介素-1受體拮抗劑(il-1r)基因5’端分別與透膜肽tat基因系列融合，并將融合后的基因分別克隆到egfp-n1載體。用于干細(xì)胞因子表達(dá)的載體不限于egfp-n1載體，包括其它能在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的載體如n-p3xflag-cmv，pcdna3.1等。1.2、干細(xì)胞電轉(zhuǎn)化1.2.1轉(zhuǎn)化前干細(xì)胞的準(zhǔn)備：(1)貼壁細(xì)胞干細(xì)胞轉(zhuǎn)移至75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，至轉(zhuǎn)化前使細(xì)胞匯合度約50-70％。此時(shí)細(xì)胞數(shù)約為2-10x106，而每次電轉(zhuǎn)需約1-10x105個(gè)細(xì)胞。(2)12mlpbs緩慢沖洗細(xì)胞。(3)吸出pbs，用0.4ml胰蛋白酶消化細(xì)胞。(4)加入10ml含血清的培養(yǎng)基，中和胰酶。(5)400x離心5-7min收集細(xì)胞。(6)用pbs、hepes、無血清培養(yǎng)基等重懸細(xì)胞，使之密度為1-5x106cell/ml。1.2.2電轉(zhuǎn)化：(1)設(shè)置電轉(zhuǎn)程序，或選擇預(yù)設(shè)程序。(2)將上述質(zhì)粒加入電轉(zhuǎn)杯，所需質(zhì)粒量根據(jù)細(xì)胞不同而定，一般起始濃度為10-50ug/ml。(3)向電擊杯中加入細(xì)胞，顛轉(zhuǎn)電擊杯使之混勻。細(xì)胞濃度和體積的使用建議請(qǐng)參照表2。表2(4)將電擊杯放入電擊槽中，脈沖電擊一次。(5)脈沖后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至已含0.5ml干細(xì)胞培養(yǎng)基的孔中(6)輕輕晃動(dòng)孔板，使細(xì)胞均勻分布，培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(7)電轉(zhuǎn)24-48小時(shí)后，參照實(shí)施例1收集和處理，得到凍干粉。2、將2.5×106ug甘油、0.1×106ug檸檬酸鈉、0.1ug鞣花酸、0.1ug維生素e、10×106ug水混合均勻，得到溶媒液。3、步驟1制備的凍干粉取1ug單獨(dú)包裝，步驟2制備的溶媒液?jiǎn)为?dú)包裝。4、使用時(shí)，將凍干粉和溶媒液進(jìn)行混合。實(shí)施例3采用慢病毒介導(dǎo)的干細(xì)胞因子表達(dá)1、凍干粉的制備：1.1分別將表皮生長因子(egf)、血小板源生長因子(pdgf)、轉(zhuǎn)化生長因子(tgf)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(b-fgf)、胰島素樣生長因子(igf)和神經(jīng)生長因子(ngf)、人角質(zhì)細(xì)胞生長因子(kgf-2)、白介素-1受體拮抗劑(il-1r)基因5’端分別與透膜肽tat基因系列融合，并將融合后的基因分別克隆到phblv-cmvie-puro載體。共獲得八個(gè)表達(dá)載體質(zhì)粒，分別命名為phblv-cmvie-egf，phblv-cmvie-pdgf，phblv-cmvie-tgf，phblv-cmvie-b-fgf，phblv-cmvie-igf，phblv-cmvie-ngf，phblv-cmvie-kgf-2，phblv-cmvie-il-1r。慢病毒表達(dá)載體不限于phblv-cmvie-puro，還包括其它慢病毒表達(dá)載體如plvx-tre3g，慢病毒包裝系統(tǒng)plvx-ac-puro、pspax2、pmd2.g、ppack-h1-gag、ppack-h1-rev、ppack-h1-vsvg、plp1、plp2、plp-vsvg、pmdlg/prre、pres-rev、pcmv-vsvg、pcmv-deltar8、pcmv-vsvg等。1.2慢病毒包裝：每個(gè)載體樣品需要1×106個(gè)293t細(xì)胞，本方法中因有8個(gè)不同的表達(dá)載體質(zhì)粒，共需包裝8個(gè)不同的慢病毒，具體步驟如下：(1)、取1.5ml滅菌ep管，加入1.5μg包裝混合質(zhì)粒(pmd2.g和pspax2)和0.5μg表達(dá)質(zhì)粒(phblv-cmvie-x，x代表不同上面八個(gè)基因)以及250μl的無血清optimem。輕柔混勻，室溫孵育5min。(2)、取1.5ml滅菌ep管，取9μl脂質(zhì)體2000l溶于250μl無血清opti-memi培養(yǎng)基中。輕柔混勻，室溫孵育5min。(3)、將dna溶液和脂質(zhì)體溶液輕柔混勻。室溫孵育20min。(4)、用胰酶消化并記數(shù)293ft細(xì)胞。用含血清的dmem培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。(5)、在六孔板中每孔，加入1ml含血清的生長培養(yǎng)基，再加入dna-脂質(zhì)體復(fù)合物。(6)、將1ml重懸的293ft細(xì)胞(1×106個(gè)細(xì)胞/ml)加入到平板中。37℃co2孵箱中孵育過夜。(7)、移除含有dna-脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)基，代之以dmem(含丙酮酸鈉和非必須氨基酸)。(8)、轉(zhuǎn)染后48-72h收獲含病毒的上清。3000rpm離心20min，去除沉淀，上清用0.45um的微孔濾膜過濾。(9)、病毒上清-80℃貯存，以保存一年。包裝出來的慢病毒對(duì)nih/3t3細(xì)胞達(dá)90％以上感染效率。1.3干細(xì)胞的感染與培養(yǎng)：貼壁細(xì)胞干細(xì)胞轉(zhuǎn)移至八瓶75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，至轉(zhuǎn)化前使細(xì)胞匯合度約50-70％。此時(shí)細(xì)胞數(shù)約為2-10x106。將3.2中收集到的八種慢病毒分別感染干細(xì)胞，加入1ml的慢病毒培養(yǎng)基以及1ml室溫溶解的病毒液，終濃度為4ug/mlpolybere，第二天再次感染，將細(xì)胞放置于新鮮的干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)。1.4參照實(shí)施例1收集和處理，得到凍干粉。2、將6.5×106ug甘油、3×106ug檸檬酸鈉、30ug鞣花酸、20ug維生素e、20×106ug水混合均勻，得到溶媒液。3、步驟1制備的凍干粉取800ug單獨(dú)包裝，步驟2制備的溶媒液?jiǎn)为?dú)包裝。4、使用時(shí)，將凍干粉和溶媒液進(jìn)行混合。實(shí)施例4采用腺病毒介導(dǎo)的干細(xì)胞因子表達(dá)1、凍干粉的制備：1.1、分別將表皮生長因子(egf)、血小板源生長因子(pdgf)、轉(zhuǎn)化生長因子(tgf)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(b-fgf)、胰島素樣生長因子(igf)和神經(jīng)生長因子(ngf)、人角質(zhì)細(xì)胞生長因子(kgf－2)、白介素－1受體拮抗劑(il－1r)基因5’端分別與透膜肽tat基因系列融合，并將融合后的基因分別克隆到腺病毒載體pdc315中并命名為pdc315-egf、pdc315-pdgf、pdc315-tgf、pdc315-b-fgf、pdc315-igf、pdc315-ngf、pdc315-kgf-2、pdc315-il-1r。腺病毒表達(dá)載體包括pdc315、pdc316、pdc311、pdc312，以及admaxtm腺病毒載體系統(tǒng)與admaxtmhi-iq腺病毒載體系統(tǒng)等。1.2、分別將pdc315-egf、pdc315-pdgf、pdc315-tgf、pdc315-b-fgf、pdc315-igf、pdc315-ngf、pdc315-kgf-2、pdc315-il-1r與載體pbghloxp△e3通過lipo2fectamine2000共轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞。共轉(zhuǎn)染后9～14天出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過3次病毒空斑純化，應(yīng)用qiaampdnabloodminikit提取重組腺病毒dna，經(jīng)鑒定正確的增殖缺陷型腺病毒命名為pdc-egf、pdc-pdgf、pdc-tgf、pdc-b-fgf、pdc-igf、pdc-ngf、pdc-kgf-2、pdc-il-1r，進(jìn)行大量擴(kuò)增和純化，并進(jìn)行滴度測(cè)定。1.3、腺病毒對(duì)干細(xì)胞的感染貼壁細(xì)胞干細(xì)胞轉(zhuǎn)移至八瓶75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，至轉(zhuǎn)化前使細(xì)胞匯合度約50-70％。此時(shí)細(xì)胞數(shù)約為2-10x106。每一瓶分別感染pdc-egf、pdc-pdgf、pdc-tgf、pdc-b-fgf、pdc-igf、pdc-ngf、pdc-kgf-2、pdc-il-1r。加入干細(xì)胞培養(yǎng)基后培養(yǎng)72小時(shí)。1.4、參照實(shí)施例1收集和處理，得到凍干粉。2、將2.5×106ug甘油、3×106ug檸檬酸鈉、10ug鞣花酸、10ug維生素e、10×106ug水混合均勻，得到溶媒液。3、步驟1制備的凍干粉取300ug單獨(dú)包裝，步驟2制備的溶媒液?jiǎn)为?dú)包裝。4、使用時(shí)，將凍干粉和溶媒液進(jìn)行混合。當(dāng)前第1頁12