本發(fā)明屬于動物模型制備技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種臂叢根性損傷閉合動物模型裝置及臂叢根性損傷檢測方法。

背景技術(shù)：

目前，常用的臂叢根性損傷動物模型均為開放制作，即分別通過背側(cè)和腹側(cè)入路暴露臂叢神經(jīng)根，然后用顯微器械將其逐一向外拔出，所撕脫的神經(jīng)根連同神經(jīng)干一起剪除。然而，兩種方法均采用了手術(shù)切開的方式，損傷較大，從而會影響對實驗動物進(jìn)行準(zhǔn)確的功能學(xué)及神經(jīng)形態(tài)學(xué)評價；其次，模型制作過程中牽拉神經(jīng)根力量的大小和作用時間難以定量，很難達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化。除此之外，開放手術(shù)造模不能模擬人類臂叢根性損傷的受傷機(jī)制，一種快速、高能量暴力導(dǎo)致的頸-肩分離。narakas在一項超過1000例臂叢損傷患者的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)70％的創(chuàng)傷性臂叢損傷是由機(jī)動車車禍引起的，除此之外還有牽拉傷及壓砸傷?？傮w來說，人類臂叢根性損傷的受傷機(jī)制主要是頭部固定撞擊肩部，或肩部固定撞擊頭部而造成頭頸之間的頸部筋膜、斜方肌、臂叢神經(jīng)椎間孔韌帶結(jié)構(gòu)的分離，最后腦脊膜的抗張強(qiáng)度也被超越，則臂叢根絲失去保護(hù)，從而導(dǎo)致椎間孔神經(jīng)根損傷。

為了模擬人類臂叢根性損傷的受傷機(jī)制，spinner等設(shè)計了一種模型制作裝置，通過對實驗大鼠前肢被動牽拉的方法制作臂叢根性撕脫傷模型，研究發(fā)現(xiàn)撕脫神經(jīng)根的數(shù)量與牽拉力的大小顯著相關(guān)，而與實驗動物的體重?zé)o明顯相關(guān)。然而，在此方法中只有一個方向的牽拉力可以傳遞至實驗大鼠的前肢，即肩關(guān)節(jié)外展90°，這也導(dǎo)致了該模型制作裝置不能模擬臨床特定的神經(jīng)根損傷類型。另外，證明一個動物模型是否符合實驗研究的要求，全面而詳細(xì)的功能及組織學(xué)評估是必要的，而該研究并沒有對此模型進(jìn)行有效的評估，故很難將其作為動物模型應(yīng)用于臂叢根性損傷的實驗研究。

因此，建立可靠、準(zhǔn)確的模擬人類臂叢根性損傷受傷機(jī)制的動物模型，并在此模型基礎(chǔ)上進(jìn)行臂叢根性損傷修復(fù)及重建的實驗研究極為必要，而現(xiàn)有技術(shù)中尚無此種技術(shù)的公開報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種臂叢根性損傷閉合動物模型裝置及臂叢根性損傷檢測方法，旨在建立模擬臂叢根性損傷受傷機(jī)制、符合臨床神經(jīng)根損傷病理特點的動物模型。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種臂叢根性損傷閉合動物模型裝置，包括固定座、用于放置所述動物軀干的容器、用于放置所述動物肘關(guān)節(jié)的可移動的容器附屬器及對所述動物肘關(guān)節(jié)施加不同大小、不同方向作用力的施力裝置；所述容器固定在所述固定座上所述容器上具有孔洞，所述容器附屬器具有供所述動物肘關(guān)節(jié)伸入的入口。

具體地，所述施力裝置包括多個不同重量的配重塊、滑輪及繩索，所述滑輪能上、下活動地安裝在所述平面板上，并且位于所述容器的側(cè)邊位置；所述繩索的繞置于所述滑輪上，其一端伸入所述容器附屬器并與所述動物的肘關(guān)節(jié)連接，另一端與某一重量的所述配重塊連接。

具體地，所述施力裝置還包括導(dǎo)桿以及螺絲，多個不同重量的配重塊上分別開設(shè)有螺紋孔，所述導(dǎo)桿的上端與所述繩索連接，其下端通過所述螺絲與某一重量的所述配重塊連接。

具體地，所述固定座為一豎向放置的平面板。

具體地，所述配重塊為砝碼。

具體地，容器附屬器為一兩端具有開口的中空套筒。

本發(fā)明還提供了一種臂叢根性損傷檢測方法，采用上述所述的臂叢根性損傷閉合動物模型裝置進(jìn)行檢測，所述臂叢根性損傷檢測方法包括以下步驟：

將實驗動物置于容器中，并將其前肢從所述孔道內(nèi)伸出，將所述實驗動物的肘關(guān)節(jié)置于容器附屬器中，并通過鋼絲及滑輪與導(dǎo)桿連接；

固定所述實驗動物前肢的外展角度，利用滑輪及砝碼對實驗動物的前肢進(jìn)行牽拉；

對損傷后的實驗動物立即進(jìn)行臂叢的解剖觀察、功能學(xué)評估、脊髓取材及組織學(xué)評估；

更換新的實驗動物，僅改變所述外展角度，對實驗動物進(jìn)行相同操作。

具體地，所述解剖觀察包括：

采用前、后入路分別對臂叢的椎管內(nèi)外結(jié)構(gòu)進(jìn)行探查，并記錄臂叢神經(jīng)根的損傷特點及其對應(yīng)牽拉力的大小及方向。

具體地，所述功能學(xué)評估包括：

利用groomingtest檢查實驗動物的前肢肩關(guān)節(jié)外展及肘關(guān)節(jié)屈曲功能和利用graspingtest用于評估實驗動物正中神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生的功能，均從實驗后l周開始每周觀察一次持續(xù)到12周；利用footprinttest檢查實驗動物行走時步態(tài)的異常，損傷后3周進(jìn)行觀察。

具體地，所述脊髓取材及組織學(xué)評估包括：

在不同時間點灌注實驗動物取脊髓，進(jìn)行nissl染色，染色后在200倍顯微鏡下計數(shù)脊髓前角運動神經(jīng)元，記錄存活運動神經(jīng)元百分比；所述存活運動神經(jīng)元百分比為損傷側(cè)陽性的運動神經(jīng)元與正常側(cè)陽性運動神經(jīng)元數(shù)目的比值。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有益效果在于：本發(fā)明實施例提供的臂叢根性損傷閉合動物模型裝置，改良以往的動物實驗造模方式，通過將實驗動物軀干置于容器中、前肢置于容器附屬器中，利用施力裝置對實驗動物的肘關(guān)節(jié)施加力作用。通過所述臂叢根性損傷閉合動物模型裝置，可以很好地控制影響神經(jīng)再生和功能恢復(fù)的因素，并對這些影響因素分別進(jìn)行研究。

本發(fā)明實施例提供的新的模擬臂叢根性撕脫的閉合動物實驗造模裝置，前期結(jié)果表明可有效制作的神經(jīng)根性撕脫模型，為臨床上臂叢根性撕脫的研究提供新的動物模型。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例提供的臂叢根性損傷閉合動物模型裝置示意圖；

圖2為本發(fā)明實施例1提供的實驗大鼠牽拉傷后臂叢神經(jīng)根損傷的解剖圖片；

圖3為本發(fā)明實施例1提供的實驗大鼠的groomingtest(美容測試)評估結(jié)果示意圖；

圖4為本發(fā)明實施例1提供的實驗大鼠的graspingtest評估結(jié)果示意圖；

圖5為本發(fā)明實施例1提供的實驗大鼠的footprinttest(足跡測試)評估結(jié)果示意圖；

圖6為本發(fā)明實施例1提供的實驗大鼠的脊髓組織學(xué)評估結(jié)果示意圖，其中圖6a是實驗組牽拉傷后1天、7天和28天脊髓(c5、6)橫切面的nissl染色示意圖；圖6b是不同時間點存活運動神經(jīng)元百分比柱狀示意圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

參見圖1，本發(fā)明第一實施例提供了一種臂叢根性損傷閉合動物模型裝置100，包括固定座1、用于放置所述動物軀干的容器2、用于放置所述動物肘關(guān)節(jié)的可移動的容器附屬器3及對所述動物肘關(guān)節(jié)施加不同大小、不同方向作用力的施力裝置5；容器2固定在固定座1上，容器2上具有孔洞4，容器附屬器3具有供所述動物肘關(guān)節(jié)伸入的入口(圖中未示出)。

本發(fā)明第一實施例提供的臂叢根性損傷閉合動物模型裝置100，改良以往的動物實驗造模方式，通過將實驗動物軀干置于容器2中、前肢置于容器附屬器3中，利用施力裝置5對實驗動物的肘關(guān)節(jié)施加力作用。通過所述臂叢根性損傷閉合動物模型裝置，可以很好地控制影響神經(jīng)再生和功能恢復(fù)的因素，并對這些影響因素分別進(jìn)行研究。

本發(fā)明第一實施例提供的新的模擬臂叢根性撕脫的閉合動物實驗造模裝置，前期結(jié)果表明可有效制作的神經(jīng)根性撕脫模型，為臨床上臂叢根性撕脫的研究提供新的動物模型。

具體地，施力裝置5包括多個不同重量的配重塊8、滑輪6及繩索7，滑輪6能上、下活動地安裝在固定座1上，并且位于容器2的側(cè)邊位置；繩索7的繞置于滑輪6上，其一端伸入容器附屬器3并與所述動物的肘關(guān)節(jié)連接，另一端與某一重量的配重塊8連接。

具體地，施力裝置5還包括導(dǎo)桿9以及螺絲10，多個不同重量的配重塊8上分別開設(shè)有螺紋孔(圖中未示出)，導(dǎo)桿9的上端與繩索7連接，其下端通過所述螺絲與某一重量的配重塊8連接。其中，配重塊8可在導(dǎo)桿9上移動。

具體地，固定座1為一豎向放置的平面板。

具體地，配重塊8為砝碼。

具體地，容器2為圓筒，容器附屬器3為一兩端具有開口的中空套筒。

本發(fā)明第二實施例提供了一種臂叢根性損傷檢測方法，采用上述所述的臂叢根性損傷閉合動物模型裝置100進(jìn)行檢測，所述臂叢根性損傷檢測方法包括以下步驟：

將實驗動物置于容器2中，并將其前肢從所述孔道內(nèi)伸出，將所述實驗動物的肘關(guān)節(jié)置于容器附屬器3中，并通過鋼絲及滑輪與導(dǎo)桿連接；

固定所述實驗動物前肢的外展角度，利用滑輪及砝碼對實驗動物的前肢進(jìn)行牽拉；

對損傷后的實驗動物立即進(jìn)行臂叢的解剖觀察、功能學(xué)評估、脊髓取材及組織學(xué)評估；

更換新的實驗動物，僅改變所述外展角度，對實驗動物進(jìn)行相同操作。

本發(fā)明第二實施例提供的臂叢根性損傷檢測方法中，所用的實驗動物造模裝置就是建立臂叢根性損傷模型最關(guān)鍵和最基礎(chǔ)的一步。通過該動物模型，可以使用客觀的方法評價損傷的早期階段及神經(jīng)再生的過程，并可以在此基礎(chǔ)上進(jìn)行細(xì)胞和分子水平的研究，這在臨床研究中是很難做到的。

具體地，所述解剖觀察包括：

采用前、后入路分別對臂叢的椎管內(nèi)外結(jié)構(gòu)進(jìn)行探查，并記錄臂叢神經(jīng)根的損傷特點及其對應(yīng)牽拉力的大小及方向。

具體地，所述功能學(xué)評估包括：

利用groomingtest檢查實驗動物的前肢肩關(guān)節(jié)外展及肘關(guān)節(jié)屈曲功能和利用graspingtest用于評估實驗動物正中神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生的功能，均從實驗后l周開始每周觀察一次持續(xù)到12周，利用footprinttest檢查實驗動物行走時步態(tài)的異常，損傷后3周進(jìn)行觀察。

具體地，所述脊髓取材及組織學(xué)評估包括：

在不同時間點灌注實驗動物取脊髓，進(jìn)行nissl染色(尼氏染色)，染色后在200倍顯微鏡下計數(shù)脊髓前角運動神經(jīng)元，記錄存活運動神經(jīng)元百分比；所述存活運動神經(jīng)元百分比為損傷側(cè)陽性的運動神經(jīng)元與正常側(cè)陽性運動神經(jīng)元數(shù)目的比值。

以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明。

實施例1

制作動物造模裝置并對實驗?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行評估，包括以下步驟：

第一步：模型制作裝置

目的：模擬臨床上臂叢根性損傷機(jī)制，進(jìn)行動物造模。

模擬人類臂叢根性損傷受傷機(jī)制設(shè)計動物模型制作裝置，將直徑為5cm的圓筒固定在50cm×100cm的鋼板上，可將實驗大鼠置于其中。圓筒外側(cè)做一直徑為2cm的圓孔可將實驗大鼠的前肢伸出，肘關(guān)節(jié)置于尺寸匹配的套筒中并通過鋼絲及滑輪與導(dǎo)桿連接。鋼絲及導(dǎo)桿通過一個可拆卸的螺絲相連以便放入不同重量的砝碼。滑輪系統(tǒng)可以上下移動改變牽拉力的方向。

第二步：進(jìn)行動物實驗驗證

根據(jù)前肢外展角度的不同(30°，90°，150°)分為3組，每組36只，利用滑輪系統(tǒng)對實驗大鼠前肢使用不同重量的砝碼(0.5，1，2kg)進(jìn)行牽拉；對照組12只，僅將實驗大鼠置于圓筒中1min，不對前肢進(jìn)行牽拉。

其中，表1為測試重量及方向與神經(jīng)根損傷的類型。其中，a：神經(jīng)根撕脫；r：神經(jīng)根斷裂；—：無明顯神經(jīng)根撕脫及斷裂。

第三步：大體解剖觀察

目的：驗證裝置造模后實驗動物的功能狀態(tài)，以此驗證動物模型的有效性。

對實驗中的所有實驗大鼠在損傷后立即行臂叢的解剖觀察，采用前、后入路分別對臂叢的椎管內(nèi)外結(jié)構(gòu)進(jìn)行仔細(xì)探查，并記錄臂叢神經(jīng)根的損傷特點及其對應(yīng)牽拉力的大小(測試重量)及方向。

圖2為實驗大鼠牽拉傷后臂叢神經(jīng)根損傷的病理特點，其中，(a)為大鼠正常臂叢結(jié)構(gòu)；(b)中神經(jīng)根從椎孔內(nèi)撕脫至椎孔外，蜷曲在鎖骨下；(c)中c8、t1神經(jīng)根撕脫，可見撕脫的脊神經(jīng)節(jié)及前后根絲；(d)中c6～8神經(jīng)根撕脫，c6、7神經(jīng)根可見神經(jīng)節(jié)及根絲；(e)中椎管內(nèi)見c7神經(jīng)根撕脫，c8神經(jīng)根看似連續(xù)，而打開外層根袖后發(fā)現(xiàn)內(nèi)部為凝血塊，無神經(jīng)組織(箭頭示)；(f)中c7、8神經(jīng)根節(jié)前撕脫。

第四步：功能學(xué)評估

groomingtest：用于檢查實驗大鼠前肢肩關(guān)節(jié)外展及肘關(guān)節(jié)屈曲功能，從實驗后第1周開始每周觀察一次持續(xù)到12周。用1-3ml生理鹽水淋濕大鼠鼻部，在5min內(nèi)觀察實驗大鼠的理毛行為，正常大鼠的雙前肢會同時舉起至耳后，然后向口鼻部進(jìn)行重復(fù)性梳理動作以去除頭面部的水。使用數(shù)碼錄像機(jī)將整個過程記錄，并放慢播放速度對患肢功能進(jìn)行評分。圖3為groomingtest評估情況，驗證接受牽拉傷處理后大鼠的肩肘功能狀態(tài)。從圖3中可以看出，對照組實驗大鼠可以正常舉起雙側(cè)前肢并能達(dá)到耳后方區(qū)域。而接受牽拉傷處理的實驗大鼠(上臂叢損傷)幾乎不能或很難抬起損傷側(cè)前肢，特別是肩外展功能幾乎完全喪失。與對照組相比，實驗組大鼠的terzis評分從第一周開始顯著降低(p<0.05)，并且在觀察周期內(nèi)都沒有明顯的恢復(fù)(p<0.05)。所以，實驗組大鼠在接受牽拉傷處理后存在長期的肩肘功能障礙。

graspingtest：用于評估實驗大鼠正中神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生的功能，從實驗后l周開始每周觀察一次持續(xù)到12周。輕輕提起鼠尾，讓其前爪去抓網(wǎng)格板(50cm×40cm×10cm)，網(wǎng)格孔大小為(1.5cm×l.5cm)，底部連接于電子秤，記錄牽拉鼠尾患肢前爪松開網(wǎng)格時的最大拉力。每只大鼠測試3次，記錄最大值。圖4為graspingtest評估情況，驗證大鼠在牽拉傷后腕關(guān)節(jié)及前爪的主動屈曲活動狀態(tài)。從圖4中可以看出，實驗組大鼠在牽拉傷后2d內(nèi)無明顯腕關(guān)節(jié)及前爪的主動屈曲活動，然而在3d后其活動明顯增加。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因我們認(rèn)為可能是牽拉傷造成患肢劇烈疼痛，從而影響了實驗大鼠腕關(guān)節(jié)及前爪的主動屈曲活動。實驗組大鼠患肢的抓握力較對照組輕度減弱，但兩者之間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。所以，實驗組大鼠在接受牽拉傷處理后不存在患側(cè)腕關(guān)節(jié)及前爪的功能障礙。

footprinttest：用于檢查實驗大鼠行走時步態(tài)的異常，損傷后3周進(jìn)行觀察。損傷后3周在實驗大鼠的前肢和后肢分別涂上紅色和藍(lán)色的染料，然后把實驗大鼠放進(jìn)一個長50cm，寬10cm的密閉的盒子里讓其行走，每走一次更換一張記錄紙，觀察對比足印的變化。

圖5為footprinttest評估結(jié)果圖片，驗證大鼠前肢牽拉傷后的步態(tài)情況。從圖5中可以看出，實驗組大鼠前肢牽拉傷后3周，步態(tài)明顯異常，患側(cè)前肢存在明顯的拖拽現(xiàn)象(箭頭所示)，而對照組實驗大鼠步態(tài)正常。

第五步：脊髓取材及組織學(xué)評估

目的：驗證動物臂叢根性損傷后脊髓神經(jīng)元存活情況，進(jìn)一步驗證模型有效性。

在不同時間點灌注大鼠取脊髓，進(jìn)行nissl染色，染色后在200倍顯微鏡下計數(shù)脊髓前角運動神經(jīng)元，以胞體清晰，尼氏體染成藍(lán)色并可見胞核為計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，存活運動神經(jīng)元百分比為損傷側(cè)陽性的運動神經(jīng)元與正常側(cè)陽性運動神經(jīng)元數(shù)目的比值。

具體過程如下：按不同時間點(1、2、3、7、14、28d)每組隨機(jī)選取實驗大鼠5只，4％多聚甲醛固定液灌注，切開實驗大鼠背部皮膚，分離肌肉，打開椎板，顯露脊髓，分別切取c5-7及c8，t1節(jié)段脊髓，進(jìn)行脊髓nissl染色。

圖6為脊髓組織學(xué)評估結(jié)果，驗證大鼠前肢牽拉傷后脊髓前角存活神經(jīng)元的存活情況。從圖6a中可以看出，實驗組大鼠牽拉傷側(cè)c5～7節(jié)段脊髓前角存活神經(jīng)元明顯減少，存活神經(jīng)元百分比在損傷后1、2、3、7、14和28d分別為91.29±2.81％，89.31±3.47％，88.67±2.63％，77.80±3.38％，67.10±3.73％和43.92±5.85％(如圖6b所示)。對照組損傷側(cè)存活神經(jīng)元百分比在各時間點均顯著高于實驗組(p<0.05)，在損傷后1、2、3、7、14和28d分別為98.49±1.69％,97.23±3.21％,103.00±4.97％，97.47±3.81％，101.81±4.90％和104.02±5.33％(如圖6b所示)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。