本發(fā)明屬于生物材料領(lǐng)域，具體涉及一種可吸收止血材料的制備方法。

背景技術(shù)：

透明質(zhì)酸是由β-d-葡萄糖醛酸和β-n-乙?；被咸烟请p糖單位通過交替的(1→4)和(1→3)糖苷鍵連接而成的天然高分子酸性粘多糖，是人和動物皮膚、玻璃體、關(guān)節(jié)潤滑液和軟骨組織的重要成分，具有良好的理化性質(zhì)及生物相容性。

按國家藥典規(guī)定，透明質(zhì)酸或其鹽的原料外觀性狀為白色或類白色疏松纖維狀物或無定形粉末，實際應(yīng)用中透明質(zhì)酸或其鹽往往要被制備成水溶液，但由于透明質(zhì)酸或其鹽作為大分子物質(zhì)，在溶解過程中，極易在表面形成一種膠體，使得溶解過程很耗時，溶解困難，因此在一般的透明質(zhì)酸或其鹽原料、制劑和凝膠生產(chǎn)中，在溶解工序過程里，需要花費大量時間和能耗，而且容易污染。

外科手術(shù)局部出血、組織粘連是一種常見的臨床現(xiàn)象，但是沒有及時采取措施，有可能導(dǎo)致嚴重的并發(fā)癥，危及患者的生命安全。美國xomed公司生產(chǎn)的merogel為透明質(zhì)酸酯化衍生物組成的止血海綿，用于耳鼻喉科術(shù)后止血和防粘連。已經(jīng)在國外上市的產(chǎn)品，由于透明質(zhì)酸或是未經(jīng)修飾或是被修飾程度低，在體內(nèi)很容易被透明質(zhì)酸酶等降解，降解速度過快，對其防粘連效果有所影響。

經(jīng)過修飾的透明質(zhì)酸或其鹽會存在交聯(lián)劑殘留的問題，交聯(lián)劑具有潛在的致癌毒性，而且交聯(lián)劑的去除也會隨著加入量的增加而難度增加，交聯(lián)劑殘留量穩(wěn)定性差的問題也是業(yè)內(nèi)公認的。欲要得到安全有效的交聯(lián)透明質(zhì)酸或其鹽產(chǎn)品需要有效地提高交聯(lián)劑利用率，采取有效措施盡可能的降低交聯(lián)劑殘留，保證交聯(lián)劑殘留量的穩(wěn)定性，并且提高產(chǎn)品的生物相容性，諸多問題至今未得到妥善解決。

研究表明透明質(zhì)酸經(jīng)交聯(lián)劑交聯(lián)后被制成固體材料，其生物相容性好，生物可吸收性，體內(nèi)降解速率能滿足傷口愈合的需求，以及防粘連功能，能促進創(chuàng)面迅速愈合，是比較理想的止血材料。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種可吸收止血材料的制備方法。

技術(shù)方案：為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明提出的一種可吸收止血材料的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將中小分子量透明質(zhì)酸或其鹽溶于堿溶液中，加入交聯(lián)劑，在低溫間歇式超聲作用下進行交聯(lián)反應(yīng)，得到交聯(lián)凝膠；

(2)另取高分子量透明質(zhì)酸或其鹽溶于水中，經(jīng)低溫超聲處理，得到未交聯(lián)凝膠；

(3)將步驟(1)得到的交聯(lián)凝膠與步驟(2)得到的未交聯(lián)凝膠進行一定比例混合均勻，再經(jīng)低溫冷凍干燥得到的固態(tài)材料。

(4)根據(jù)臨床使用需求將步驟(3)得到的固態(tài)材料處理片狀、薄膜狀、塊狀或纖維狀等形狀。

其中，步驟(1)中所述的透明質(zhì)酸或其鹽的分子量為10萬-100萬道爾頓，步驟(2)中，所述的透明質(zhì)酸或其鹽的分子量為120-300萬道爾頓。

優(yōu)選地，步驟(1)中，所用的交聯(lián)劑為二乙烯基砜、1，2，7，8-二環(huán)氧辛烷、1.4-丁二醇二縮水甘油醚或乙二醇二縮水甘油醚中的任意一種，優(yōu)選1，4-丁二醇二縮水甘油醚。

更具體地，步驟(1)中，透明質(zhì)酸或其鹽與交聯(lián)劑的質(zhì)量比40-100∶1。

步驟(1)中，將透明質(zhì)酸或其鹽溶于0.01-0.1m無機堿性水溶液中，形成濃度為2-12％的凝膠。

步驟(1)中，低溫間歇式超聲法的條件為：低溫為0-10℃，優(yōu)選10℃，超聲頻率不大于20khz，優(yōu)選20khz，超聲反應(yīng)時間0.2-1h，靜置0.2-3h，如此為一循環(huán)，循環(huán)反應(yīng)2-5次，優(yōu)選3次。

步驟(2)中，低溫間歇式超聲法的條件為：溫度范圍0-10℃，優(yōu)選4℃，超聲頻率不大于20khz，優(yōu)選20khz，超聲時間0.2-1h，靜置0.2-3h，如此為一循環(huán)，循環(huán)1-3次，優(yōu)選2次。

所述交聯(lián)凝膠和未交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的濃度均為0.5-5％，其中，未交聯(lián)透明質(zhì)酸或其鹽凝膠與交聯(lián)凝膠質(zhì)量比為10/0-1/9，即可完全采用未交聯(lián)透明質(zhì)酸或其鹽凝膠或者與交聯(lián)凝膠按照合適的比例進行混合。

優(yōu)選地，步驟(1)的交聯(lián)反應(yīng)后將得到的交聯(lián)凝膠進行緩沖液透析純化，再用注射用水沖洗鹽離子，得到濃度為1.0～2.5％的中性交聯(lián)透明質(zhì)酸或其鹽凝膠，然后與未交聯(lián)透明質(zhì)酸或其鹽凝膠混合。

步驟(3)中，低溫冷凍干燥的條件為：慢速預(yù)凍，一次升華溫度低于-20℃，形成白色固態(tài)材料，材料厚度控制2-5mm。

透明質(zhì)酸或其鹽作為大分子物質(zhì)，在溶解過程中，容易在表面形成一層膠體，阻礙水分子進入，從而使溶解過程很耗時，在生產(chǎn)過程中，透明質(zhì)酸溶解工序需要花費大量的時間，而且產(chǎn)品也容易污染，本發(fā)明采用低溫超聲溶解法，一方面降低在溶解工序產(chǎn)品被污染的風險，又大大縮短了透明質(zhì)酸或其鹽的溶解時間，滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。

對中小分子量的透明質(zhì)酸或其鹽進行化學(xué)交聯(lián)，高起始濃度，加少量的交聯(lián)劑，交聯(lián)反應(yīng)過程采用低溫間歇超聲法，使得透明質(zhì)酸分子與交聯(lián)劑能充分反應(yīng)，減少產(chǎn)品中游離交聯(lián)劑。

高分子量的透明質(zhì)酸或其鹽在提高濃度條件下，也可以延長降解時間，但延長的時間也是有限的，而且生產(chǎn)成本會加大。本發(fā)明通過將交聯(lián)透明質(zhì)酸或其鹽凝膠與高分子量未交聯(lián)透明質(zhì)酸或其鹽凝膠按照一定比例進行充分混勻處理后經(jīng)低溫冷凍干燥得到交聯(lián)劑含量低且穩(wěn)定的可吸收止血材料，同時，又降低了生產(chǎn)成本。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

(1)低溫超聲間歇溶解法大大縮短透明質(zhì)酸溶解工序時間，降低產(chǎn)品生產(chǎn)過程被污染的幾率；

(2)粘附組織封閉傷口，減少組織出血量，止血快，效果好。

(3)體內(nèi)降解周期延長，滿足傷口愈合時間，組織粘連情況得到改善，提高防粘連功能。

(4)凍干后材料中交聯(lián)劑殘留量達到行業(yè)標準要求且能穩(wěn)定在一定范圍，可實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。

下面通過具體的實施例詳細說明本發(fā)明的技術(shù)方案。下述實施例中，低溫冷凍的條件為：慢速預(yù)凍，具體地，在0℃保持時間0.5～1.5h，達到材料共晶點時保持0.5～1h，低于共晶點以下2～3h，一次升華溫度低于-20℃，形成白色固態(tài)材料，材料厚度控制2-5mm。

實施例1

將分子量為300萬道爾頓的透明質(zhì)酸鈉溶解于注射用水中，控制溫度4℃，超聲頻率為20khz，間歇超聲0.5h，靜置1h，循環(huán)2次，制成濃度為2.5％透明質(zhì)酸鈉凝膠溶液，低溫冷凍干燥得到厚度為2mm白色材料。

實施例2

將分子量為120萬道爾頓的透明質(zhì)酸鈉溶解于注射用水中，控制溫度4℃，超聲頻率為20khz，間歇超聲0.5h，靜置1h，循環(huán)2次，制成濃度為1.0％透明質(zhì)酸鈉凝膠溶液，低溫冷凍干燥得到厚度為5mm白色材料。

實施例3

將分子量為10萬道爾頓的透明質(zhì)酸鈉加入到0.05m氫氧化鈉溶液中，加入bdde交聯(lián)劑，使bdde與透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比為1∶40，參與交聯(lián)反應(yīng)透明質(zhì)酸鈉濃度為12％，進行10℃，20khz超聲0.5小時，靜置2小時，循環(huán)反應(yīng)3次，使用透析袋對交聯(lián)凝膠進行透析，定期更換透析液，去除交聯(lián)劑，再用注射用水沖洗鹽離子，得到濃度為2.5％的中性交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠。

將中性交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠與未交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠(實施例1制備的)按照質(zhì)量比9∶1混合均勻，得到2.5％混合透明質(zhì)酸鈉凝膠，低溫冷凍干燥得到厚度為3mm白色材料。

實施例4

將分子量為10萬道爾頓的透明質(zhì)酸鈉加入到0.05m氫氧化鈉溶液中，加入bdde交聯(lián)劑，使bdde與透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比為1∶40，參與交聯(lián)反應(yīng)透明質(zhì)酸鈉濃度為12％，進行10℃，20khz超聲0.5小時，靜置2小時，循環(huán)反應(yīng)5次，使用透析袋對交聯(lián)凝膠進行透析，定期更換透析液，去除交聯(lián)劑，再用注射用水沖洗鹽離子，得到濃度為2.5％的中性交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠。

將中性交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠與未交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠(實施例1制備的)按照質(zhì)量比5∶5混合均勻，得到2.5％混合透明質(zhì)酸鈉凝膠，低溫冷凍干燥得到厚度為3mm白色材料。

實施例5

將分子量為10萬道爾頓的透明質(zhì)酸鈉加入到0.05m氫氧化鈉溶液中，加入bdde交聯(lián)劑，使bdde與透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比為1∶40，參與交聯(lián)反應(yīng)透明質(zhì)酸鈉濃度為12％，進行10℃，20khz超聲0.5小時，靜置2小時，循環(huán)反應(yīng)5次，使用透析袋對交聯(lián)凝膠進行透析，定期更換透析液，去除交聯(lián)劑，再用注射用水沖洗鹽離子，得到濃度為2.5％的中性交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠。

將中性交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠與未交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠(實施例1制備的)按照質(zhì)量比1∶9混合均勻，得到2.5％混合透明質(zhì)酸鈉凝膠，低溫冷凍干燥得到厚度為3mm白色材料。

實施例6

將分子量為100萬道爾頓的透明質(zhì)酸鈉加入到0.05m氫氧化鈉溶液中，加入bdde交聯(lián)劑，使bdde與透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比為1∶100，參與交聯(lián)反應(yīng)透明質(zhì)酸鈉濃度為4％，進行10℃，20khz超聲0.5小時，靜置2小時，循環(huán)反應(yīng)5次，使用透析袋對交聯(lián)凝膠進行透析，定期更換透析液，去除交聯(lián)劑，用注射用水沖洗鹽離子，得到濃度為1.0％的中性交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠。

將中性交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠與未交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠(實施例2制備的)按照質(zhì)量比9∶1混合均勻，得到1.0％混合透明質(zhì)酸鈉凝膠，低溫冷凍干燥得到厚度為5mm固態(tài)材料。

實施例7

將分子量為100萬道爾頓的透明質(zhì)酸鈉加入到0.05m氫氧化鈉溶液中，加入bdde交聯(lián)劑，使bdde與透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比為1∶100，參與交聯(lián)反應(yīng)透明質(zhì)酸鈉濃度為4％，進行10℃，20khz超聲0.5小時，靜置2小時，循環(huán)反應(yīng)5次，使用透析袋對交聯(lián)凝膠進行透析，定期更換透析液，去除交聯(lián)劑，用注射用水沖洗鹽離子，得到濃度為1.0％的中性交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠。

將中性交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠與未交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠(實施例2制備的)按照質(zhì)量比5∶5混合均勻，得到1.0％混合透明質(zhì)酸鈉凝膠，低溫冷凍干燥得到厚度為5mm固態(tài)材料。

實施例8

將分子量為100萬道爾頓的透明質(zhì)酸鈉加入到0.05m氫氧化鈉溶液中，加入bdde交聯(lián)劑，使bdde與透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比為1∶100，參與交聯(lián)反應(yīng)透明質(zhì)酸鈉濃度為4％，進行10℃，20khz超聲0.5小時，靜置2小時，循環(huán)反應(yīng)5次，使用透析袋對交聯(lián)凝膠進行透析，定期更換透析液，去除交聯(lián)劑，用注射用水沖洗鹽離子，得到濃度為1.0％的中性交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠。

將中性交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠與未交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠(實施例2制備的)按照質(zhì)量比1∶9混合均勻，得到1.0％混合透明質(zhì)酸鈉凝膠，低溫冷凍干燥得到厚度為5mm固態(tài)材料。

對比例1：

將分子量為300萬道爾頓的透明質(zhì)酸鈉溶解于注射用水中，室溫調(diào)件下，攪拌混合，靜止過夜，制成濃度為2.5％透明質(zhì)酸鈉凝膠溶液，低溫冷凍干燥得到厚度為2mm白色材料。

對比例2：

將分子量為10萬道爾頓的透明質(zhì)酸鈉加入到0.05m氫氧化鈉溶液中，加入bdde交聯(lián)劑，使bdde與透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比為1∶40，參與交聯(lián)反應(yīng)透明質(zhì)酸鈉濃度為12％，除不采用超聲處理其他條件都相同得到濃度為2.5％的中性交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠。

將中性交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠與未交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠(除不采用超聲處理其他條件同實施例1制備)按照質(zhì)量比5∶5混合均勻，得到2.5％混合透明質(zhì)酸鈉凝膠，低溫冷凍干燥得到厚度為5mm白色材料。

對比例3：

將分子量為100萬道爾頓的透明質(zhì)酸鈉加入到0.05m氫氧化鈉溶液中，加入bdde交聯(lián)劑，使bdde與透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比為1∶100，參與交聯(lián)反應(yīng)透明質(zhì)酸鈉濃度為12％，除不采用超聲處理其他條件都相同得到濃度為3％的中性交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠。

將中性交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠與未交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠(除不采用超聲處理其他條件同實施例2制備)按照質(zhì)量比5∶5混合均勻，得到1.0％混合透明質(zhì)酸鈉凝膠，低溫冷凍干燥得到厚度為3mm白色材料。

性能測定：

對實施例1～8及對比例1～3制備的材料進行性能測定，具體如下：

(1)初始污染菌對比：

各實施例每個進行5個樣品初始污染菌的檢測，求平均值。檢測結(jié)果如表1所示。

(2)材料對小鼠肝臟止血時間對比：

在小白鼠肝臟切除部分肝葉，形成10mm×10mm的出血創(chuàng)面，將樣品2cm×2cm大小的樣品覆蓋在出血面，開始計時，樣品覆蓋后需輕壓10s，傷口停止出血的時間為止血時間。每種止血材料平行做3例，計算其平均止血時間，結(jié)果如表1所示。

(3)材料在抗酶解性對比：

耐酶性：精密稱取實施例中得到的材料(透明質(zhì)酸含量為0.5g)加入0.1mol/l磷酸鹽緩沖液(ph7.0)5ml和透明質(zhì)酸酶液(100u/ml)5ml，混合均勻，置于37℃水浴中酶解24h，然后在100℃煮沸10min滅活。0.45μm微孔濾膜過濾，取濾液1.0ml，加水定容至10ml。采用改良咔唑顯色法測定糖醛酸含量，乘以2.07后折算為加入酶液的樣品中交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉的含量a；未加酶液樣品中的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉含量為b，計算酶降解率＝a/b×100％。酶降解率越低，表明凝膠的耐酶性越好，凝膠在體內(nèi)填充的效果維持時間長。結(jié)果如表1所示。

(4)材料中交聯(lián)劑殘留量對比：

稱取交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠材料于含有透明質(zhì)酸酶1000u/ml的生理平衡液中，37℃恒溫箱放置至透明質(zhì)酸鈉凝膠材料完全降解后，使用熒光法檢測降解液中的交聯(lián)劑含量，然后推算出凝膠中交聯(lián)劑含量。結(jié)果如表1所示。

(5)材料在動物體內(nèi)防粘連作用對比：

實驗動物為sd大鼠，體重220±40g，雌雄不分，每組動物10只。實驗大鼠均使用2％無巴比妥鈉腹腔注射進行麻醉，麻醉后開腹手術(shù)，逐層切開，暴露腹腔，距回腸部5cm處選取3cm回腸段，用干紗布來回摩擦20次，腸管充血并有點狀出血點，空白對照組不加任何材料直接關(guān)腹，試驗組在摩擦主要部位放置3cm×3cm試驗材料輕輕按壓后關(guān)腹。各組在相同條件下飼養(yǎng)，術(shù)后3周全部處死動物。

粘連程度肉眼分級：參考nair等[1]制定的5級分類法，確定粘連分級標準。完全無粘連為0級，計0分；內(nèi)臟間或內(nèi)臟與腹壁間1條粘連帶為i級，計1分；內(nèi)臟間或內(nèi)臟與腹壁間2條粘連帶為ii級，計2分；多于2條粘連帶而內(nèi)臟未直接粘連至腹壁為iii級，計3分；內(nèi)臟直接粘連到腹壁，不管粘連帶多少為iv級，計4分，總評分越高說明組織粘連程度越嚴重。結(jié)果如表1所示。

通過表1的結(jié)果可知，本發(fā)明通過低溫超聲間歇溶解法大大縮短透明質(zhì)酸溶解工序時間，降低產(chǎn)品生產(chǎn)過程被污染的幾率，另外利用本發(fā)明得到的材料粘附組織封閉傷口，減少組織出血量，止血快，效果好，通過凍干可使材料中交聯(lián)劑殘留量達到行業(yè)標準要求且能穩(wěn)定在一定范圍，可實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。

表1