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抗凝緩釋材料及其制備方法和應(yīng)用與流程

文檔序號:11605413閱讀:196來源:國知局
抗凝緩釋材料及其制備方法和應(yīng)用與流程
本發(fā)明涉及抗體領(lǐng)域,特別地,涉及一種抗凝緩釋材料。此外,本發(fā)明還涉及一種抗凝緩釋材料的制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)
:近年來,由于體外循環(huán)管路和人工心肺的發(fā)展和改進,抗凝緩釋涂層技術(shù)備受關(guān)注。華法林涂層是利用物理或者化學(xué)的方式,將華法林牢固的結(jié)合在管路的內(nèi)表面或者人工心肺的表面??鼓繉拥膽?yīng)用能明顯提高材料的生物和血液相容性,減低炎癥反應(yīng),降低血液及血流損害,可降低心臟外科手術(shù)術(shù)后住院時間和死亡率,提高了危重心肺疾病的治愈率,為材料的推廣提供了基礎(chǔ)和條件。目前臨床上使用的抗凝涂層依賴進口,價格昂貴,病人負擔(dān)重,也限制了使用。我們亟需開發(fā)自己的抗凝緩釋涂層。技術(shù)實現(xiàn)要素:本發(fā)明提供了一種氧化石墨烯修飾的華法林,以解決現(xiàn)有的抗凝涂層價格昂貴的技術(shù)問題。本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:本發(fā)明一方面提供了一種抗凝緩釋材料,抗凝緩釋材料包括氧化石墨烯修飾的華法林,氧化石墨烯修飾的華法林包括華法林和氧化石墨烯,華法林和氧化石墨烯通過非共價鍵連接,氧化石墨烯為二維納米氧化石墨烯或膜狀氧化石墨烯。進一步地,氧化石墨烯和華法林的質(zhì)量比為1:5~20。進一步地,氧化石墨烯為粒徑小于0.22μm的二維納米氧化石墨烯。本發(fā)明另一方面提供了一種上述的抗凝緩釋材料的制備方法,包括以下步驟:將華法林、氧化石墨烯加入體積百分數(shù)為10~50%的水中,在4~40℃下震蕩搖勻,反應(yīng)8~12小時得到抗凝緩釋材料。進一步地,水的體積百分數(shù)為10%,水的用量為1mg氧化石墨烯加入0.5~1.5ml水,優(yōu)選為1ml水。進一步地,反應(yīng)溫度為37℃,反應(yīng)時間為12~24小時,優(yōu)選為12小時。進一步地,氧化石墨烯為粒徑小于0.22μm的二維納米氧化石墨烯,二維納米氧化石墨烯的制備包括以下步驟:將氧化石墨烯原材料在0~4℃的條件下,通過超聲波破碎,經(jīng)過孔徑0.22μm的濾網(wǎng)過濾,得到氧化石墨烯。進一步地,超聲波破碎的操作包括以下步驟:將氧化石墨烯原材料配置為1~2mg/ml,在超聲波的強度為3.5的條件下,超聲2小時,超聲模式為工作10秒,休息5秒。本發(fā)明還提供了一種抗凝緩釋材料在生物材料中的應(yīng)用。進一步地,抗凝緩釋材料形成抗凝緩釋層,并設(shè)置于人工心肺的表面或體外循環(huán)管路的內(nèi)表面。本發(fā)明具有以下有益效果:上述抗凝緩釋材料,華法林和氧化石墨烯通過非共價鍵連接,可大幅度的增強抗凝血性能,同時原料成本低廉,因此抗凝緩釋材料價格便宜。除了上面所描述的目的、特征和優(yōu)點之外,本發(fā)明還有其它的目的、特征和優(yōu)點。下面將參照圖,對本發(fā)明作進一步詳細的說明。附圖說明構(gòu)成本申請的一部分的附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解,本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明,并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當限定。在附圖中:圖1是二維納米氧化石墨烯/華法林與膜狀氧化石墨烯/華法林的大體觀對比圖;圖2是二維納米氧化石墨烯的不同組別負載時實物圖片。a:ti+二維納米氧化石墨烯/華法林,b:ti+二維納米氧化石墨烯,c:ti+華法林,d:ti+水;圖3是二維納米氧化石墨烯的不同組別孵育時實物圖片。a:ti+水,b:ti+華法林,c:ti+二維納米氧化石墨烯,d:ti+二維納米氧化石墨烯/華法林;圖4是不同濃度華法林對pt的影響的操作過程;圖5是各組中的血清凝固相;圖6是華法林的濃度-凝血酶原時間(pt)曲線圖;圖7是不同組別的凝血酶原時間(pt)柱狀圖;圖8是膜狀氧化石墨烯/華法林負載時實物圖片;圖9是膜狀氧化石墨烯/華法林孵育后實物圖片;圖10是經(jīng)過不同洗滌次數(shù)后的各組凝血酶原時間(pt)曲線圖;圖11是經(jīng)過不同洗滌次數(shù)后的各組鈦板實物圖片;a:3次,b:6次;c:9次,d:12次;e:15次。具體實施方式以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施例進行詳細說明,但是本發(fā)明可以由權(quán)利要求限定和覆蓋的多種不同方式實施。本發(fā)明的優(yōu)選實施例提供了本發(fā)明一方面提供了一種抗凝緩釋材料,抗凝緩釋材料包括氧化石墨烯修飾的華法林,氧化石墨烯修飾的華法林包括華法林和氧化石墨烯,華法林和氧化石墨烯通過非共價鍵連接,氧化石墨烯為二維納米氧化石墨烯或膜狀氧化石墨烯。氧化石墨烯(go)含有sp2雜化帶羥基和羧基的苯環(huán),不僅性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性好,還可以通過π鍵、疏水作用、氫鍵和離子鍵與抗體、藥物分子、金屬離子、熒光基團或者細胞非共價結(jié)合。go是其他石墨材料的基本構(gòu)建塊,可以裹成零維的球體,滾成一維的碳納米管,層疊成三維結(jié)構(gòu)的石墨。納米材料的概念是指,任何三維結(jié)構(gòu)中,只要有一維達到納米級就可以稱為納米材料。通常購買(如sigma貨號為763705的產(chǎn)品;蘇州碳豐石墨烯科技有限公司,單層膜狀氧化石墨烯)或一般方法制備的氧化石墨烯,厚度符合納米級,但是直徑較大,不符合納米級要求。為區(qū)別二維納米氧化石墨烯,將該種氧化石墨烯命名為氧化石墨烯原材料。在氧化石墨烯原材料的基礎(chǔ)上,對其進行一步加工,進行破碎,使其厚度及直徑均符合納米級,則得到二維納米氧化石墨烯。膜狀氧化石墨烯為片徑為小于200微米,厚度符合納米級,如sigma貨號為763705的氧化石墨烯。膜狀氧化石墨烯可作為制備二維納米氧化石墨烯的原料使用。盡管go可分散于水中,如生理鹽水,然而由于鹽的電荷屏蔽作用使得go易發(fā)生聚集。因此,go的表面修飾勢在必行,目前主要分兩種:共價和非共價,前者通常是通過氧化石墨烯的非飽和結(jié)構(gòu)破壞而形成的原子摻雜或反應(yīng)的技術(shù);后者不改變go的自然結(jié)構(gòu),只通過非共價鍵,范德華力,電荷吸引,結(jié)合更加靈活。本申請中的氧化石墨烯/華法林中,華法林和氧化石墨烯通過非共價鍵連接,結(jié)合靈活,并且可增強華法林的抗凝血性能。本發(fā)明具有以下有益效果:上述抗凝緩釋材料,華法林和氧化石墨烯通過非共價鍵連接,可大幅度的增強抗凝血性能,同時原料成本低廉,因此抗凝緩釋材料價格便宜??蛇x地,氧化石墨烯和華法林的質(zhì)量比為1:5~20。可選地,氧化石墨烯為粒徑小于0.22μm的二維納米氧化石墨烯。二維結(jié)構(gòu)的go的表面比任何其他納米材料都高出至少4個量級,它的每個原子都暴露在表面,適合于運載藥物。因為納米材料的概念是指,任何三維結(jié)構(gòu)中,只要有一維達到納米級就可以稱為納米材料。比如未經(jīng)改良的石墨烯(可購買于sigma),雖然厚度符合納米級,但是直徑較大,不符合納米級要求,容易聚集產(chǎn)生沉淀,穩(wěn)定性較差。二維納米氧化石墨烯,使得氧化石墨烯/華法林更加適合體外實驗和體內(nèi)試驗,尤其是體內(nèi)試驗。二維納米氧化石墨烯的粒徑小于0.22μm。顆粒較大的氧化石墨烯在生理鹽溶液下容易發(fā)生聚集,生成沉淀,性質(zhì)不穩(wěn)定。采用粒徑小于0.22μm的氧化石墨烯可在人血清中穩(wěn)定均勻分散。粒徑小于0.22μm的氧化石墨烯可直接購買或?qū)⒋箢w粒的氧化石墨烯破碎制取,如通過超聲波破碎制取。二維納米氧化石墨烯修飾的華法林相比膜狀氧化石墨烯修飾的華法林性質(zhì)更均一,抗凝效果更穩(wěn)定。本發(fā)明另一方面提供了一種抗凝緩釋材料的制備方法,包括以下步驟將華法林、氧化石墨烯加入水中,在4~40℃下震蕩搖勻,反應(yīng)8~12小時得到抗凝緩釋材料。華法林、氧化石墨烯在振蕩搖勻的條件下反應(yīng),二者通過非共價鍵結(jié)合得到氧化石墨烯/華法林。制備得到的抗凝緩釋材料可從作為溶劑的水中分離出來,也可不予分離仍在水中保持。在上述條件得到的氧化石墨烯/華法林在稀釋一倍之后仍具有一定的殺傷效果。反應(yīng)時間過短,華法林和氧化石墨結(jié)合時間不夠,導(dǎo)致二者結(jié)合量較小,結(jié)合不穩(wěn)定。而反應(yīng)時間過長,則增加了抗體變異的風(fēng)險。因此反應(yīng)時間可優(yōu)選為2~24小時。可選地,水的用量為1mg氧化石墨烯加入0.5~1.5ml所述水,優(yōu)選為1ml水??蛇x地,反應(yīng)溫度為37℃,反應(yīng)時間為12~24小時,優(yōu)選為12小時。反應(yīng)溫度選擇37℃。該溫度也是生理溫度,有利于保障體外和體內(nèi)實驗結(jié)果的穩(wěn)定,并為得到體外和體內(nèi)一致的結(jié)果奠定了基礎(chǔ)。反應(yīng)時間為12~24小時,華法林和氧化石墨量大,結(jié)合穩(wěn)定,繼續(xù)增加反應(yīng)時間,華法林和氧化石墨結(jié)合數(shù)量并不會明顯增加??紤]到時間成本,反應(yīng)時間可選優(yōu)為12小時。可選地,氧化石墨烯為粒徑小于0.22μm的二維納米氧化石墨烯,粒徑小于0.22μm的二維納米氧化石墨烯的制備包括以下步驟:將氧化石墨烯原材料在0~4℃的條件下,通過超聲波破碎,經(jīng)過孔徑0.22μm的濾網(wǎng)過濾,得到氧化石墨烯。氧化石墨烯的制備很重要,嚴格控制大小和厚度。可從sigma購得氧化石墨烯原材料,透析純化去除酒精。將氧化石墨烯原材料在超聲儀下破碎成細小顆粒。然后將經(jīng)過孔徑0.22μm的濾網(wǎng)過濾??刹捎萌淘诒旌衔镏羞M行操作以保證反應(yīng)溫度在0~4℃的條件??蛇x地,超聲波破碎的操作包括以下步驟:將氧化石墨烯原材料配置為1~2mg/ml,在超聲波的強度為3.5的條件下,超聲2小時,超聲模式為工作10秒,休息5秒。在美國misonix超聲波破碎儀sonicator3000,強度3.5,持續(xù)超聲2小時,模式工作10秒,休息5秒。在該條件下,氧化石墨烯的粒徑小于50nm,厚度為1~3nm。未處理的氧化石墨烯原材料和處理后得到的二維納米氧化石墨烯10μl的區(qū)別可參考申請?zhí)枮?01611203531.6的專利申請文件。本發(fā)明還提供了一種氧化石墨烯/華法林在生物材料中的應(yīng)用。如可利用在人工心肺或者其他臟器或者組織的表面、體外循環(huán)管路或血管支架上。進一步地,抗凝緩釋材料形成抗凝緩釋層,并設(shè)置于人工心肺的表面或體外循環(huán)管路的內(nèi)表面??鼓忈尣牧峡赏ㄟ^涂制的方法在人工心肺的表面或體外循環(huán)管路的內(nèi)表面上形成抗凝緩釋涂層,也可采用其它方法形成抗凝緩釋層。實施例1購得氧化石墨烯原材料(sigma貨號為763705的氧化石墨烯),透析純化去除酒精,配制為濃度1mg/ml,在美國misonix超聲波破碎儀sonicator3000強度3.5的條件下,持續(xù)超聲2小時,模式工作10秒,休息5秒。注意全程在冰水混合物中進行。超聲結(jié)束后,用0.22μm的過濾器過濾,制得二維納米氧化石墨烯,nanodrop測量最終濃度,冷藏備用。將1mg華法林、0.2mg二維納米氧化石墨烯加入1ml水中,在4℃下震蕩搖勻,反應(yīng)12小時,得到氧化石墨烯/華法林,參照圖1中離心管內(nèi)懸濁液,即抗凝緩釋材料。實施例2和實施例1的區(qū)別在于,制備氧化石墨烯/華法林時的溫度為37℃。實施例3和實施例1的區(qū)別在于,制備氧化石墨烯/華法林時的溫度為40℃。實施例4和實施例1的區(qū)別在于,制備氧化石墨烯/華法林時的反應(yīng)時間為2小時。實施例5和實施例1的區(qū)別在于,制備氧化石墨烯/華法林時的反應(yīng)時間為24小時。實施例6實施例6和實施例1的區(qū)別在于,sigma購得貨號為763705的膜狀氧化石墨烯未經(jīng)破碎處理,直接與華法林進行反應(yīng),并且反應(yīng)過程中未經(jīng)震蕩處理。實施例6的膜狀氧化石墨烯/華法林溶液凝固后如圖1培養(yǎng)皿中所示。實驗數(shù)據(jù)1、凝血酶原時間檢測如圖2和圖8所示,分別取100μl的氧化石墨烯溶液、實施例1的二維納米氧化石墨烯/華法林溶液、實施例6的膜狀氧化石墨烯/華法林溶液、華法林溶液和水均勻地涂抹在相應(yīng)的5mm的鈦板上,各組在37℃下干燥過夜。再用100μl的雙蒸水洗滌,共3次,干燥備用。涂抹過程中,確保涂抹均勻,以確保最終測量時,最大程度地減少干擾和誤差。另取鈦板不負載任何試劑,進行相同處理,作為空白對照。其中,氧化石墨烯溶液、二維納米氧化石墨烯/華法林溶液、膜狀氧化石墨烯/華法林溶液、華法林溶液的濃度相同,均為華法林為2μg/ml,納米氧化石墨烯為2μg/ml,膜狀氧化石墨烯為2μg/ml。如圖3和9所示,各組的鈦板中,隨著水分蒸發(fā),鈦板表面的液體收縮,藥物逐步負載至鈦板上形成膜狀形態(tài)得到抗凝緩釋層,即為孵育過程。各組的鈦板干燥后,在37℃預(yù)熱3分鐘,分別先后加入100μl的新鮮血清,和50μl的pt測試液,混勻,及時,并觀察凝固發(fā)生的時間。血清凝固后的狀態(tài)如圖4和圖5所示。參照圖6、7以及表1。表1不同組別的凝血酶原時間表圖4和5中為血清凝固狀態(tài)。從表1中可看出,在ti組(空白對照組)、ti+h2o組(鈦板上負載水)、ti+go組(鈦板上負載二維納米氧化石墨烯)、ti+華法林組(鈦板上負載華法林)的pt時長相近,在20秒左右。ti+go+華法林組(鈦板上負載二維納米氧化石墨烯/華法林)和ti+膜狀go+華法林(鈦板上負載膜狀氧化石墨烯/華法林)的時長相近,在25秒左右??梢妴渭冊阝伆迳县撦d水、氧化石墨烯和華法林并不能延長pt時間。ti+華法林組不能延長pt時間的原因是華法林與鈦板結(jié)合不牢固,華法林處于游離狀態(tài),在雙蒸水洗滌過程中被沖走,導(dǎo)致其不能發(fā)揮延長pt時間的作用。二維納米氧化石墨烯/華法林、膜狀氧化石墨烯/華法林不僅明顯延長pt時間,增強療效,更重要的是,上述兩組材料的pt時間在安全范圍之內(nèi),沒有超過30,當pt時間超過30時,使用者會有自發(fā)出血的風(fēng)險,本發(fā)明的抗凝緩釋材料可以安全有效的使用。上述兩組在雙蒸水洗滌3次后,仍可起到延長pt時間的作用,這一方面說明華法林已牢固的負載在鈦板上,另一方面也可在一定程度上說明二維納米氧化石墨烯/華法林、膜狀氧化石墨烯/華法林具有緩釋性。如華法林釋放很快,則在雙蒸水洗滌過程中,華法林已釋放完全,沒有華法林可與血清結(jié)合發(fā)揮作用;如氧化石墨烯將華法林緊密包裹,華法林釋放很慢,沒有游離的華法林與血清結(jié)合發(fā)揮作用,也無法達到延長pt時間的作用。2、單純?nèi)A法林的濃度-凝血酶原時間(pt)曲線取100μl華法林配置7個梯度的華法林溶液,各梯度的華法林溶液的溶度為0.0002μg/ml、0.002μg/ml、0.02μg/ml、0.2μg/ml、2μg/ml、20μg/ml、200μg/ml。分別取不同梯度濃度的華法林溶液,均勻地覆蓋在相應(yīng)的鈦板上。另取一鈦板不負載任何試劑,進行相同處理,作為空白對照。用100μl的雙蒸水洗滌,共3次,干燥。干燥后,在37℃預(yù)熱3分鐘,分別先后加入100μl的新鮮血清,和50μl的pt測試液,混勻,及時,并觀察凝固發(fā)生的時間。為保證全程在37℃的條件下進行,將96孔板置于37℃的水浴溫箱中。實驗結(jié)果如圖7和表1所示。表1華法林的濃度和凝血酶原時間表濃度(μg/ml)00.00020.0020.020.2220200pt(秒)14.1215.4418.9418.9321.7921.720.7919.5可見隨著華法林濃度的增加,凝血酶原時間(pt)延長。但是,當華法林濃度超過10μg/ml時,pt反而有下降的趨勢。這與臨床觀察到的現(xiàn)象相吻合,華法林必須從低劑量開始逐漸加量,直接給大劑量反而導(dǎo)致血液高凝狀態(tài),目前還沒有公認的解釋??梢姴荒芡ㄟ^單純提高華法林的濃度來提高抗凝效果。3、緩釋性能考察分別取100μl的實施例1的二維納米氧化石墨烯/華法林溶液均勻地涂抹在相應(yīng)的5mm的鈦板上,在37℃下干燥過夜。參照圖11,將處理后的鈦板分為不同組別,各組別再分別用100μl的雙蒸水洗滌3、6、9、12、15次,干燥備用。涂抹過程中,確保涂抹均勻,以確保最終測量時,最大程度地減少干擾和誤差。另取一鈦板不負載任何試劑,進行相同處理,作為空白對照。其中,二維納米氧化石墨烯/華法林溶液和膜狀氧化石墨烯/華法林溶液為2μg/ml。實驗結(jié)果參照圖10和表2。表2華法林的緩釋實驗結(jié)果顯示隨著洗滌的次數(shù)增加,具有二維納米氧化石墨烯/華法林抗凝緩釋材料的鈦板pt時間逐步縮短,但是相比空白鈦板,仍有延長,提示二維納米氧化石墨烯/華法林溶液負載至鈦板后華法林緩慢釋放,具有較好的緩釋效果。同時,在后續(xù)清洗過程中發(fā)現(xiàn),二維納米氧化石墨烯/華法林形成的膜狀結(jié)構(gòu)與鈦板結(jié)合牢固,普通水洗難以將其從鈦板上分離,只有通過超聲清洗才可將其分離。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已,并不用于限制本發(fā)明,對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說,本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi),所作的任何修改、等同替換、改進等,均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁12
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