本發(fā)明涉及生物與新醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說(shuō)，是一種加強(qiáng)型人乳頭瘤病毒hpv-16/18的二價(jià)dc疫苗。

背景技術(shù)：

人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，hpv)是一種屬于乳多空病毒科的乳頭瘤空泡病毒a屬，易于感染人類表皮和粘膜鱗狀上皮，是導(dǎo)致宮頸癌和生殖器濕疣以及部分肛門癌、口腔癌的主要因素。持續(xù)性感染高危型hpv-16，hpv-18可能引起宮頸癌、直腸癌、口腔癌、扁桃體癌等惡性腫瘤。宮頸癌是目前唯一病因明確的惡性腫瘤，99.7％的宮頸癌病例因hpv感染造成，世界衛(wèi)生組織及國(guó)際癌癥中心也確認(rèn)高危型hpv病毒持續(xù)感染是宮頸癌的主要病因，因此，hpv疫苗又被人們習(xí)慣性成為子宮頸癌疫苗。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，每年全世界有50萬(wàn)女性因感染hpv而患宮頸癌，其中20萬(wàn)死于該腫瘤，hpv病毒與艾滋病、癌癥被世界衛(wèi)生組織列為人類三大絕癥。

hpv-16/18可導(dǎo)致70％的宮頸癌病例，還可能造成男性和女性的生殖器濕疣,性生活是其傳播的主要渠道，常規(guī)的保護(hù)措施，比如說(shuō)避孕套，并不能完全阻斷hpv病毒的傳播，所以說(shuō)注射疫苗就成了預(yù)防hpv最好的方式。

hpv病毒基因組是閉合環(huán)狀的雙鏈dna分子，長(zhǎng)約7.2-8kb，編碼8個(gè)開放閱讀框(openreadingframe)，分為早期轉(zhuǎn)錄區(qū)(earlyregion，e區(qū))、晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)(lateregion，l區(qū))和控制區(qū)(longcontrolregion)3個(gè)功能區(qū)，早期轉(zhuǎn)錄區(qū)長(zhǎng)約4.5kb，編碼六個(gè)非結(jié)構(gòu)性早期蛋白：e1，e2，e4-e7，參與病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)控和細(xì)胞轉(zhuǎn)化等功能；晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)長(zhǎng)約2.5kb，編碼核心衣殼蛋白l1和次要衣殼蛋白l2，組成病毒的衣殼；控制區(qū)長(zhǎng)約800-900bp，位于e8和l1之間，該區(qū)含有hpv基因組dna的復(fù)制起點(diǎn)和hpv基因表達(dá)所需的調(diào)控元件，負(fù)責(zé)調(diào)控dna的復(fù)制和表達(dá)。病毒顆粒由l1、l2衣殼蛋白組成，直徑約45-55nm，呈無(wú)包膜的20面體對(duì)稱的核衣殼結(jié)構(gòu)，表面有72個(gè)殼微粒。

dc俗稱樹突狀細(xì)胞(dendriticcells，dcs)，因成熟時(shí)伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名，是體內(nèi)功能最強(qiáng)、唯一能活化靜息t細(xì)胞的專職抗原呈遞細(xì)胞(antigenpresentingcells，apc)，能攝取、加工及呈遞抗原，是啟動(dòng)、調(diào)控和維持t細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)。

目前dc疫苗已應(yīng)用于部分腫瘤的監(jiān)視和治療，以dc為基礎(chǔ)的疫苗制備方式主要有以下幾種：(1)抗原多肽致敏的dc，如利用純化或重組的腫瘤特異性抗原多肽致敏dc，這種方法靶向性良好。但目前已經(jīng)確定的抗原多肽有限，單一的抗原多肽只限定于特定的hla類型，且腫瘤細(xì)胞很容易通過(guò)抗原突變逃脫機(jī)體針對(duì)單一抗原標(biāo)為的免疫作用。(2)全部抗原致敏的dc，使用病毒感染細(xì)胞(或腫瘤細(xì)胞)的裂解產(chǎn)物、蛋白提取物、凋亡產(chǎn)物刺激dc，這類疫苗包括了所有的病毒抗原，也易于制備，能夠引發(fā)多克隆的ctl免疫應(yīng)答。但是該方案需要感染組織量較大，而且最佳刺激量難以確定。此外，病毒感染細(xì)胞也含有機(jī)體自身的抗原，有誘發(fā)自身免疫反應(yīng)的危險(xiǎn)。(3)基因轉(zhuǎn)染dc，即利用編碼病毒抗原的rna/dna致敏dc。此方法通過(guò)pcr擴(kuò)增病毒抗原的全部或者部分dna序列，而后將核酸以病毒或非病毒介導(dǎo)的方法導(dǎo)入dc內(nèi)，目的抗原可在細(xì)胞內(nèi)形成持久的表達(dá)。此法可客服抗原刺激dc后，因抗原-mhc復(fù)合物解離或者mhc分子降解對(duì)其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答所產(chǎn)生的不利影響。

dc疫苗不僅能誘導(dǎo)產(chǎn)生大量效應(yīng)t細(xì)胞遷移至病毒感染部位，還能保持效應(yīng)t細(xì)胞在易感染部位的長(zhǎng)期存在，起到免疫監(jiān)視的作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種加強(qiáng)型人乳頭瘤病毒hpv-16/18的二價(jià)dc疫苗以解決上述背景技術(shù)問(wèn)題的不足之處。

本發(fā)明的方案是：

一種加強(qiáng)型人乳頭瘤病毒hpv-16/18的二價(jià)dc疫苗，包括經(jīng)基因修飾的樹突狀細(xì)胞，所述經(jīng)基因修飾的樹突狀細(xì)胞中的重組基因序列由粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子、人乳頭瘤病毒hpv-16與hpv-18的l1轉(zhuǎn)錄區(qū)串聯(lián)。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子為序列表seqidno.1所示的核苷酸序列。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述hpv16的l1抗原序列為序列表seqidno.2所示的核苷酸序列。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述hpv18的l1抗原序列為序列表seqidno.3所示的核苷酸序列。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案，還包括將dc細(xì)胞負(fù)載人源化重組基因的方法：將所述重組基因序列插入到慢病毒表達(dá)載體plent-c-gfp中，得到plent-(gm-csf)-(hpv16-l1)-(hpv18-l1)-gfp載體；同時(shí)，將臍帶血單個(gè)核細(xì)胞在gmp實(shí)驗(yàn)室，所述臍帶血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)成imdc，將包裝于慢病毒的hpv16/18-l1序列感染imdc，并將imdc經(jīng)成熟因子誘導(dǎo)成熟得到dc疫苗。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案，還包括所述臍帶血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)成imdc的制備方法：收集健康產(chǎn)婦臍帶血50ml，利用淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)基中，37℃,5％的co2條件下培養(yǎng)2-3小時(shí)后，倒掉懸浮死細(xì)胞，留取貼壁細(xì)胞，并加入細(xì)胞因子rhil-4，終濃度：50ng/ml，rhgm-gsf的終濃度100ng/ml，誘導(dǎo)單個(gè)核細(xì)胞分化成dc，每隔48小時(shí)更換新培養(yǎng)基，培養(yǎng)第5天得到imdc。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述imdc經(jīng)成熟因子誘導(dǎo)得到成熟的dc疫苗，所述imdc第6天加入成熟因子tnf-α，誘導(dǎo)得到成熟的dc細(xì)胞。

一種加強(qiáng)型人乳頭瘤病毒hpv-16/18的二價(jià)dc疫苗用于制備預(yù)防疾病的二價(jià)dc疫苗的用途。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述預(yù)防疾病為宮頸癌，但并不局限于宮頸癌，好包括預(yù)防直腸癌、口腔癌、扁桃體癌等高危型hpv感染引起的其它惡性腫瘤。

由于采用了上述技術(shù)方案，一種加強(qiáng)型人乳頭瘤病毒hpv-16/18的二價(jià)dc疫苗，包括經(jīng)基因修飾的樹突狀細(xì)胞，所述經(jīng)基因修飾的樹突狀細(xì)胞中的重組基因序列由粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子、人乳頭瘤病毒hpv-16與hpv-18的l1轉(zhuǎn)錄區(qū)串聯(lián)；本發(fā)明用hpv-16、hpv-18的l1區(qū)抗原負(fù)載于成熟的dc細(xì)胞，并以粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子作為導(dǎo)引子增強(qiáng)l1序列的表達(dá)；該dc細(xì)胞可將抗原與mhc分子結(jié)合，形成l1多肽—mhc分子復(fù)合物，并遞呈給t細(xì)胞，從而啟動(dòng)mhc-i類特異性ctl反應(yīng)和mhc-ii類特異性cd4+thl反應(yīng)，對(duì)hpv16和hpv18進(jìn)行精確性、特異性、靶向性、主動(dòng)性地?fù)魵?。同時(shí)，dc還通過(guò)其高表達(dá)的共刺激分子(cd80/b7-1、cd86/b7-2、cd40等)提供t細(xì)胞活化所必須的第二信號(hào)，從而徹底打破hpv感染者的免疫耐受狀態(tài)，使患者的免疫系統(tǒng)像正常人感染細(xì)胞病毒一樣，產(chǎn)生針對(duì)hpv的特異性抗體，來(lái)對(duì)抗、攻擊并最終清除hpv；由于減掉了dc細(xì)胞對(duì)抗原的攝取、加工過(guò)程，該dc疫苗提高了t淋巴細(xì)胞對(duì)hpv感染細(xì)胞的吞噬效率，并能對(duì)hpv的再次入侵提供保護(hù)性的長(zhǎng)期免疫記憶功能。

附圖說(shuō)明：

圖1是本發(fā)明所述hpv16/18重組基因模塊示意圖；

圖2是本發(fā)明所述的慢病毒表達(dá)載體plent-(gm-csf)-(hpv16-l1)-(hpv18-l1)-gfp的示意圖，其中，順時(shí)針序列為正向基因片段，逆時(shí)針序列為逆向基因片段；

圖3是本發(fā)明所述的臍帶血誘導(dǎo)的imdc體式顯微鏡下視野圖；

圖4是本發(fā)明成熟dc細(xì)胞體式顯微鏡下視野圖；

圖5是本發(fā)明臍帶血誘導(dǎo)的imdc表面分子標(biāo)記cd83+表達(dá)的量流式圖；

圖6是本發(fā)明成熟dc細(xì)胞表面分子標(biāo)記cd83+表達(dá)的量流式圖；

圖7是本發(fā)明臍帶血誘導(dǎo)的imdc表面分子標(biāo)記cd86+表達(dá)量的流式圖；

圖8是本發(fā)明成熟dc細(xì)胞表面分子標(biāo)記cd86+表達(dá)量的流式圖；

圖9是本發(fā)明通過(guò)qpcr測(cè)得的plent-(hpv16-l1)-(hpv18-l1)-gfp和plent-(gm-csf)-(hpv16-l1)-(hpv18-l1)-gfp分別作為慢病毒表達(dá)載體使得dc細(xì)胞表面hpv16-l1和hpv18-l1的相對(duì)表達(dá)量，其中，*代表具有數(shù)據(jù)具有顯著差異，**代表數(shù)據(jù)具有極顯著差異。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。

實(shí)施例一：imdc的誘導(dǎo)

(1)收集健康產(chǎn)婦臍帶血50ml，利用淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)基(購(gòu)自takara公司，gt-t551)中，37℃,5％的co2條件下培養(yǎng)2-3小時(shí)后，倒掉懸浮死細(xì)胞，留取貼壁細(xì)胞，并加入細(xì)胞因子rhil-4(終濃度：50ng/ml)，rhgm-gsf(終濃度100ng/ml)，誘導(dǎo)單個(gè)核細(xì)胞分化成dc，每隔48小時(shí)更換新培養(yǎng)基，培養(yǎng)第5天得到imdc，通過(guò)倒置顯微鏡觀察dc成熟前細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分子標(biāo)記cd83+和cd86+的表達(dá)，綜合鑒定誘導(dǎo)的imdc。

實(shí)施例二：hpv-16，hpv-18的l1序列修飾成熟dc細(xì)胞

(1)慢病毒的包裝制備：應(yīng)用基因克隆技術(shù)，pcr擴(kuò)增hpv-16，hpv-18的l1基因全長(zhǎng)cdna序列，連接入慢病毒表達(dá)載體plent-c-gfp中，構(gòu)建l1抗原的慢病毒表達(dá)載體，通過(guò)pcr和核酸測(cè)序鑒定。進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。

(2)將構(gòu)建的l1慢病毒載體感染imdc，將感染的imdc培養(yǎng)6h后加入成熟因子tnf-α，誘導(dǎo)得到成熟的dc細(xì)胞，通過(guò)倒置顯微鏡觀察dc成熟后細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分子標(biāo)記cd83+和cd86+的表達(dá)，綜合鑒定誘導(dǎo)的mdc。該mdc可直接注射作為預(yù)防hpv16和hpv18的疫苗。

為驗(yàn)證有無(wú)gm-csf對(duì)dc細(xì)胞表面hpv16-l1和hpv18-l1表達(dá)，qpcr測(cè)定plent-(hpv16-l1)-(hpv18-l1)-gfp和plent-(gm-csf)-(hpv16-l1)-(hpv18-l1)-gfp分別作為慢病毒表達(dá)載體對(duì)dc細(xì)胞內(nèi)hpv16/18的mrna相對(duì)表達(dá)的影響。hpv16-l1的qpcr引物為：hpv16-fw：5’-gaattcatttgccagatcca-3’，hpv16-rv：5’-ataccaacacccaatggttg-3’；hpv18-l1的qpcr引物為：hpv18-fw：5’-gggtgcagttacctgaccca3’,hpv18-rv:5’-aggccaacacctaaaggctg-3’。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征及本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界。

序列表

gm-csf信號(hào)肽核酸人工序列

seqidno.1

<110>山東興瑞生物科技有限公司

<120>一種加強(qiáng)型人乳頭瘤病毒hpv-16/18的二價(jià)dc疫苗

<130>2016

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>2

<211>75

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

atgctgctgctggtgaccagcctgctgtgcgagctggagccccaccccgcctttctgctg60

atccccgacatccag75

hpv-16-l1的核苷酸序列

seqidno.2

<110>山東興瑞生物科技有限公司

<120>一種加強(qiáng)型人乳頭瘤病毒hpv-16/18的二價(jià)dc疫苗

<130>2016

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1416

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atgtcattatggcttccttcagaggctaccgtatacttacctcctgttccagttagtaaa60

gtcgtttctacagatgaatacgttgctagaactaatatttattatcatgctggtacttct120

agattgttggctgttggtcatccatattttccaattaaaaaaccaaataataataaaatt180

ttggttccaaaagtttctggtttgcaatatagagtttttagaattcatttgccagatcca240

aataaatttggttttccagatacttctttttataatccagatactcaaagattggtttgg300

gcttgtgttggtgttgaagttggtagaggtcaaccattgggtgttggtatttctggtcat360

ccattgttgaataaattggatgatactgaaaatgcttctgcttatgctgctaatgctggt420

gttgataatagagaatgtatttctatggattataaacaaactcaattgtgtttgattggt480

tgtaaaccaccaattggtgaacattggggtaaaggttctccatgtactaatgttgctgtt540

aatccaggtgattgtccaccattggaattgattaatactgttattcaagatggtgatatg600

gttgatactggttttggtgctatggattttactactttgcaagctaataaatctgaagtt660

ccattggatatttgtacttctatttgtaaatatccagattatattaaaatggtttctgaa720

ccatatggtgattctttgtttttttatttgagaagagaacaaatgtttgttagacatttg780

tttaatagagctggtgctgttggtgaaaatgttccagatgatttgtatattaaaggttct840

ggttctactgctaatttggcttcttctaattattttccaactccatctggttctatggtt900

acttctgatgctcaaatttttaataaaccatattggttgcaaagagctcaaggtcataat960

aatggtatttgttggggtaatcaattgtttgttactgttgttgatactactagatctact1020

aatatgtctttgtgtgctgctatttctacttctgaaactacttataaaaatactaatttt1080

aaagaatatttgagacatggtgaagaatatgatttgcaatttatttttcaattgtgtaaa1140

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gttacttctcaagctattgcttgtcaaaaacatactccaccagctccaaaagaagatcca1320

ttgaaaaaatatactttttgggaagttaatttgaaagaaaaattttctgctgatttggat1380

caatttccattgggtagaaaatttttgttgcaagcttag1419

hpv-18-l1的核酸序列

seqidno.3

<110>山東興瑞生物科技有限公司

<120>一種加強(qiáng)型人乳頭瘤病毒hpv-16/18的二價(jià)dc疫苗

<130>2016

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>2

<211>1416

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

atggctttgtggcggcctagtgacaataccgtatatcttccacctccttctgtggcaaga60

gttgtaaataccgatgattatgtgactcgcacaagcatattttatcatgctggcagctct120

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