本發(fā)明屬于生物技術領域的細胞及組織工程技術，具體涉及一種利用mir-143抑制劑延緩小鼠失神經(jīng)后肌肉萎縮的方法。

背景技術：

骨骼肌是周圍神經(jīng)系統(tǒng)的靶器官，周圍神經(jīng)具有支配肌肉運動收縮的功能，肌肉的生長、發(fā)育及正常的功能維持都有依賴于運動神經(jīng)的支配和調節(jié)。周圍神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷后，因為神經(jīng)元不再通過軸漿運輸營養(yǎng)給相應骨骼肌纖維，從而使骨骼肌失去神經(jīng)的支配作用，失去運動收縮功能，逐漸發(fā)生萎縮。失神經(jīng)肌肉萎縮是一個復雜的過程，神經(jīng)受到損傷后會有多種蛋白和基因的表達發(fā)生改變。周圍神經(jīng)損傷后，骨骼肌會出現(xiàn)肌肉質量下降、肌纖維直徑減小等變化，發(fā)生萎縮，進而喪失運動能力。骨骼肌失神經(jīng)性萎縮是因為肌肉失神經(jīng)支配后，神經(jīng)元無法為骨骼肌提供營養(yǎng)因子，導致骨骼肌廢用、萎縮，因此骨骼肌失神經(jīng)性萎縮也稱為失營養(yǎng)性萎縮或廢用性萎縮，只有使神經(jīng)重新獲得再支配能力，才能有效防止肌肉萎縮。神經(jīng)的再生速度緩慢，而骨骼肌再生依賴于支配它的運動神經(jīng)纖維的存在，所以失神經(jīng)肌肉的再生比較困難，因此，如何延緩和防止失神經(jīng)后肌肉萎縮，并盡量保持肌肉正常功能成為目前肌肉功能和損傷修復研究的難題。

微小rna(microrna，mirna)是一類長度為22nt、可以抑制mrna翻譯的非編碼小分子rna，具有重要的生物學功能。其作為一類重要的基因表達調控因子，在細胞分裂、增殖、分化和死亡過程中起著重要的調控作用。mirna在肌肉的發(fā)生、發(fā)育和損傷修復中都發(fā)揮著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制mir-351的表達可以促進成肌前體細胞的凋亡，抑制增殖，過表達mir-351可以促進肌前體細胞進入分化狀態(tài)，抑制凋亡，這說明mir-351對肌細胞的增殖與分化發(fā)揮著重要作用。有研究顯示，骨骼肌特異性mirna(mir-1、mir-133、mir-206等)與失神經(jīng)后骨骼肌萎縮的調控密切相關，大鼠失神經(jīng)后，隨著時間的延長，mir-1和mir-133的表達先下降，之后逐漸升高。也有研究表明，在注射細胞毒素造成的肌肉損傷模型中，注射mir-675-3p和mir-675-5p可促進肌損傷的修復。mirna在神經(jīng)損傷修復過程中起著重要作用，有報道稱，切斷鼠脊神經(jīng)后，mir-21表達水平升高，而mir-21可促進軸突的生長，表明某些mirna可能對神經(jīng)損傷具有修復作用。此外，mirnas可通過對靶基因的調控作用參與到特定的信號通路中，促進受損神經(jīng)的修復與再生，研究表明mir-206可通過對fgfbp1(fgfbindingprotein1)蛋白表達的調控作用，影響神經(jīng)肌肉接頭的神經(jīng)再支配。由此可見，mirnas在成肌分化和神經(jīng)形成過程中發(fā)揮著重要的調控作用。而失神經(jīng)肌肉萎縮的修復與再生機制與神經(jīng)形成和肌細胞的自我更新有著密切的聯(lián)系，建立延緩小鼠失神經(jīng)支配肌肉萎縮過程的方法就成了本領域技術人員亟待解決的課題。

目前已有采用調控mirna表達來治療肌損傷的研究報道，但數(shù)量不多，針對的mirna種類和具體的損傷類型也各不相同，通過檢索，我們檢索到授權公告號為：101448942b，名稱為：調節(jié)肌細胞增殖和分化的microrna的相關發(fā)明專利，該專利根據(jù)細胞增殖分化的相關研究結果提出了在體內調控mirna表達水平來治療肌損傷的方法，在實施方案中該專利將mir-133和mir-1或者它們的抑制劑的組合給予肌損傷部位以改善肌損傷的康復，該專利雖然在靶向mirna的選擇上提到了mir-143，但并未對mir-143的使用方法和效果進行驗證，另外，該專利針對的肌損傷類型為機械性肌損傷及肌組織退行性疾病(肌營養(yǎng)不良或神經(jīng)元病變等)，并未對失神經(jīng)肌肉萎縮的案例進行分析。本發(fā)明專利前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)mir-143對骨骼肌衛(wèi)星細胞的體外增殖分化過程具有調控作用(前述專利并沒有mir-143對骨骼肌衛(wèi)星細胞具有調控作用的研究基礎)，mir-143在體內對肌損傷修復是否具有一定的調節(jié)作用還不清楚。

技術實現(xiàn)要素：

鑒于目前mir-143在體內對肌損傷修復是否具有一定的調節(jié)作用，且作用是否具有良好的效果還不清楚，本發(fā)明構建小鼠腓腸肌失神經(jīng)萎縮模型，通過在肌萎縮部位注射microrna-143(mir-143)抑制劑，從而延緩失神經(jīng)肌肉萎縮過程。本發(fā)明的目的在于提供一種通過抑制mir-143表達來延緩小鼠失神經(jīng)支配肌肉萎縮過程的方法，借助此方法可以為失神經(jīng)肌肉損傷修復中mirnas的利用提供一定的借鑒，并為失神經(jīng)肌萎縮機制及其臨床診治的深入研究提供新的思路和參考。

本發(fā)明的技術方案如下：

一種利用mir-143抑制劑延緩小鼠失神經(jīng)后肌肉萎縮的方法，方法步驟包括：在小鼠切除坐骨神經(jīng)后的后肢腓腸肌內注射混有10nmolmir-143抑制劑的100μlopti-mem培養(yǎng)基，注射在小鼠失神經(jīng)術后分多次進行。

而且，所述mir-143抑制劑在術后分多次進行注射的具體方法是：術后分三次分別于術后1d、5d、9d進行注射。

本發(fā)明的優(yōu)點及效果：

1、本發(fā)明小鼠腓腸肌失神經(jīng)萎縮模型的建立是通過坐骨神經(jīng)切除術建立的，而失神經(jīng)肌肉萎縮模型可以不破壞萎縮部位的肌肉形態(tài)，能更好地觀察mirnas的作用。

2、本發(fā)明通過構建小鼠腓腸肌失神經(jīng)萎縮模型，進一步研究mir-143在體內對小鼠失神經(jīng)肌肉萎縮的影響，并最終通過實驗研究證明利用混有10nmolmir-143抑制劑的100μlopti-mem培養(yǎng)基進行失神經(jīng)腓腸肌部位注射可以有效延緩小鼠失神經(jīng)支配肌肉萎縮過程。

3、本發(fā)明利用混有10nmolmir-143抑制劑的100μlopti-mem培養(yǎng)基，并分3次在術后1d、5d、9d進行失神經(jīng)腓腸肌部位注射。10nmolmir-143抑制劑為經(jīng)過實驗摸索篩選出的可有效發(fā)揮作用的抑制劑的量；在不同時間點分三次注射的方法可以有效減緩mir-143抑制劑注射對小鼠的刺激，并同時有助于在失神經(jīng)部位維持較為穩(wěn)定的mir-143抑制劑濃度。

4、利用本發(fā)明建立的通過抑制mir-143表達來延緩小鼠失神經(jīng)支配肌肉萎縮過程的方法，可以有效地延緩失神經(jīng)肌肉萎縮過程，借助此方法可以為失神經(jīng)肌肉損傷修復中mirnas的利用提供一定的借鑒，并為失神經(jīng)肌萎縮機制及其臨床診治的深入研究提供新的思路和參考。

附圖說明

圖1是失神經(jīng)小鼠模型腓腸肌mir-143表達及相關指標檢測結果圖片；

圖2是mir-143模擬物和mir-143抑制劑注射對失神經(jīng)小鼠模型腓腸肌的影響結果圖片。

具體實施方式

下面結合具體實施方案對本發(fā)明進一步說明，其具體實施方案應該理解為僅為舉例說明，不是限定性的，不能以下述舉例說明來限定本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明的設計思路是：

構建小鼠腓腸肌失神經(jīng)萎縮模型，通過在肌萎縮部位注射microrna-143(mir-143)抑制劑，從而延緩失神經(jīng)肌肉萎縮過程。首先通過對小鼠進行坐骨神經(jīng)切斷術，構建小鼠腓腸肌失神經(jīng)萎縮模型，通過實時定量pcr檢測mir-143的表達量，比較腓腸肌肌肉濕重和肌纖維直徑，然后在肌萎縮部位注射10nmolmir-143抑制劑，顯著降低了小鼠腓腸肌中mir-143的表達量，注射mir-143抑制劑后小鼠失神經(jīng)腓腸肌組織肌纖維的直徑明顯高于對照組，本發(fā)明提供一種通過抑制mir-143表達來延緩小鼠失神經(jīng)支配肌肉萎縮過程的方法，借助此方法可以為失神經(jīng)肌肉損傷修復中mirnas的利用提供一定的借鑒。

下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明：

一種由mir-143抑制劑延緩小鼠失神經(jīng)后肌肉萎縮的方法，包括以下步驟：

第一步、包含小鼠腓腸肌失神經(jīng)萎縮模型的建立：

將小鼠從右后肢大腿背側部平行于股骨切口，鈍性分離股二頭肌與股外側肌，進行坐骨神經(jīng)探查術，暴露坐骨神經(jīng)，切除距離梨狀肌下緣長約3-5mm的坐骨神經(jīng)，兩斷端翻轉180°，防止斷端發(fā)生接觸，然后按照常規(guī)外科手術進行分層縫合，左后肢進行坐骨神經(jīng)探查術后不做手術處理，建立小鼠失神經(jīng)腓腸肌萎縮模型，術后觀察切除坐骨神經(jīng)側的后肢運動能力，檢測mir-143表達量、肌肉濕重和肌纖維直徑等指標；

具體步驟是：

(1)小鼠腓腸肌失神經(jīng)萎縮模型的建立。

健康小鼠6只，清潔級，體重30±1g，均為6周齡，小鼠飼養(yǎng)時保證充足飼料，每天換水，每周更換清潔的墊料，術前禁食12h。

術前先對小鼠進行消毒，然后腹腔注射5％的水合氯醛200mg/kg，待小鼠麻醉后將其固定在手術臺上，在無菌環(huán)境下進行操作。第一組小鼠從右后肢大腿背側部平行于股骨切口，鈍性分離股二頭肌與股外側肌，進行坐骨神經(jīng)探查術，暴露坐骨神經(jīng)，切除距離梨狀肌下緣長約3-5mm的坐骨神經(jīng)，兩斷端翻轉180°，防止斷端發(fā)生接觸，然后按照常規(guī)外科手術進行分層縫合，左后肢進行坐骨神經(jīng)探查術后不做手術處理，術后觀察發(fā)現(xiàn)切除坐骨神經(jīng)相應側的后肢喪失運動能力，呈跛行狀，小鼠失神經(jīng)腓腸肌萎縮模型建立成功。

(2)小鼠腓腸肌標本的提取及rna提取。

在術后14d將實驗小鼠進行斷頸處死，將其雙側后肢皮膚切開暴露皮下組織，剝離腓腸肌肌膜，取出小鼠完整腓腸肌，然后迅速用電子天平稱重，再將腓腸肌分成兩份，一份用于組織切片染色，一份用于rna提取。

rna提取時，事先準備好用液氮預冷的研缽，然后將取下的腓腸肌快速轉移至研缽中，用研杵快速研磨肌肉組織，邊研磨邊加入適量液氮，直至研磨成粉末狀，加入1mltrizolreagent，使粉末被覆蓋，之后繼續(xù)研磨至結晶狀，將得到的rna樣品室溫靜置，直至樣品完全融化，然后將樣品轉移至ep管中，進行總rna提取，所有操作按照invitrogentrizol說明書進行。

(3)qrt-pcr檢測mir-143在腓腸肌組織中的表達變化。

提取的rna根據(jù)反轉錄試劑盒操作說明進行反轉錄，獲得第一鏈cdna后，采用light96進行實時定量pcr擴增反應檢測mir-143的表達量變化，引物序列見表1。反應體系：10μl2×all-in-onetmqpcrmix(sybrgreenfluorescence)，2μl基因特異性的mirnasqrt-pcrprimer(2μm)，2μluniversaladaptorpcrprimer(2μm)，2μlfirst-strandcdna(5倍稀釋)，加ddh2o(rnase/dnasefree)至20μl。反應條件：95℃，10min；95℃，10s；60℃，20s；72℃，15s，40個循環(huán)。5.8srrna作為定量pcr內參?；蛳鄬Ρ磉_量采用比較ct值的方法進行分析。實驗結果表明，與對照組相比，mir-143在失神經(jīng)小鼠腓腸肌組織中的表達量極顯著下降(p＜0.01，圖1-a)。

表1實時定量pcr檢測引物序列

(4)石蠟切片制作及he染色

①固定、水洗。將采集的腓腸肌放入足量的4％多聚甲醛溶液中固定24h，保證組織的完整性，水洗過夜。

②脫水、透明。將組織塊標記并依次放入70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、95％乙醇、無水乙醇中15min，進行脫水，然后迅速將組織塊取出塊放入二甲苯中，進行透明處理。

③浸蠟、包埋。將透明后的組織塊放入融化的石蠟中，充分浸蠟2h，將浸蠟后的組織塊置于包埋盒中，將融化的石蠟注入包埋盒中，待石蠟完全凝固，對蠟塊進行修整。

④切片、展片。將蠟塊固定在金屬持蠟器上，切片機的厚度調至6μm。選擇腓腸肌肌腹部的位置進行連續(xù)切片，速度要均勻，力度要相同；將切好的蠟片輕輕平鋪在45℃的水面上，待蠟片充分展平后，將蠟片撈到載玻片的中部，瀝去水分，置于60℃的烤片機上烘烤2h。

⑤he染色。將載玻片放入二甲苯(ⅰ)、二甲苯(ⅱ)中各3min透明，然后迅速取出并依次放入無水乙醇、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇中各30s進行梯度復水，之后用蒸餾水沖洗3min；蘇木素液染色10min，流水清洗，然后用1％鹽酸乙醇分色3s，pbs緩沖液清洗10min，伊紅水溶液染色10min，蒸餾水清洗；置于95％乙醇(ⅰ)、95％乙醇(ⅱ)中2s，無水乙醇(ⅰ)、無水乙醇(ⅱ)中各30s梯度脫水，最后置于二甲苯(ⅰ)、二甲苯(ⅱ)中各30s透明，中性樹膠封片。

(5)肌肉相關指標檢測

腓腸肌濕重：將腓腸肌取下后立即用電子分析天平稱量肌肉濕重。

形態(tài)觀察：將實驗組與對照組he染色的切片分別置于顯微鏡下觀察，觀察不同處理下肌纖維形態(tài)和肌纖維直徑等之間是否存在差異。

腓腸肌肌纖維直徑的測量：使用olympuscellsensstandard1.6圖像采集系統(tǒng)隨機測量實驗組與對照組經(jīng)he染色后在5個不同視野中共60根肌纖維直徑，計算平均值。

實驗結果表明，失神經(jīng)腓腸肌與對照組相比，失神經(jīng)腓腸肌濕重極顯著降低(p＜0.01，圖1-b)；失神經(jīng)腓腸肌與對照組相比，腓腸肌組織顏色較暗，肌纖維明顯萎縮，肌纖維直徑極顯著低于對照組(p＜0.01，圖1-c，圖1-d)。結果表明隨著坐骨神經(jīng)的切斷，小鼠腓腸肌出現(xiàn)了明顯萎縮。

第二步、小鼠失神經(jīng)萎縮腓腸肌的mir-143抑制劑處理：

將小鼠按第一步的方法切斷兩側后肢坐骨神經(jīng)，失神經(jīng)手術后對小鼠的創(chuàng)口進行消毒，小鼠左后肢注射100μlopti-mem培養(yǎng)基。右后肢注射混有10nmolmir-143抑制劑的100μlopti-mem培養(yǎng)基，分3次在術后1d、5d、9d進行注射，抑制mir-143的表達；

具體步驟是：

(1)小鼠失神經(jīng)萎縮腓腸肌的mir-143表達干預處理。

健康小鼠12只，清潔級，體重30±1g，均為6周齡，隨機分為兩組，每組6只小鼠，進行失神經(jīng)后的mir-143表達干預實驗，小鼠飼養(yǎng)時保證充足飼料，每天換水，每周更換清潔的墊料。術前禁食12h。兩組小鼠根據(jù)第一步中的方法切斷兩側后肢坐骨神經(jīng)，失神經(jīng)手術后對小鼠的創(chuàng)口進行消毒，第一組小鼠右后肢腓腸肌內注射混有10nmolmir-143模擬物的opti-mem培養(yǎng)基，第二組右后肢腓腸肌內注射混有10nmolmir-143抑制劑的opti-mem培養(yǎng)基，均為分3次在術后1d、5d、9d進行注射。兩組小鼠左后肢為各自的對照，注射等量opti-mem培養(yǎng)基。

(2)小鼠腓腸肌標本的提取及rna提取。

操作方法同第一步中(2)。

(3)qrt-pcr檢測mir-143在腓腸肌組織中的表達變化。

操作方法同第一步中(3)。

(4)石蠟切片制作及he染色

操作方法同第一步中(4)。實驗結果見圖2-a，雙側坐骨神經(jīng)均被切斷，注射了mir-143模擬物的小鼠腓腸肌中mir-143的表達量極顯著高于對照組(p＜0.01)，而注射了mir-143抑制劑的小鼠腓腸肌中mir-143的表達量極顯著低于對照組(p＜0.01)。

(5)肌肉相關指標檢測。

操作方法同第一步中(5)。

實驗結果表明，雙側坐骨神經(jīng)均被切斷，注射了mir-143模擬物的小鼠腓腸肌肌肉濕重略低于對照組，而注射了mir-143抑制劑的小鼠腓腸肌肌肉濕重略高于對照組，但差異不顯著(圖2-b)。注射了mir-143模擬物的小鼠腓腸肌失神經(jīng)部位肌纖維直徑極顯著低于對照組(p＜0.01，圖2-c，圖2-d)，而注射了mir-143抑制劑的小鼠腓腸肌失神經(jīng)部位肌纖維直徑極顯著高于對照組(p＜0.01，圖2-c，圖2-d)。結果表明小鼠腓腸肌失神經(jīng)部位抑制mir-143的表達可以減緩失神經(jīng)肌肉的萎縮過程。說明了mir-143在體內對肌肉的分化發(fā)育具有一定的調控作用，抑制mir-143表達可減緩由失神經(jīng)造成的肌肉萎縮，對肌損傷也有一定程度的修復作用。