本發(fā)明屬于防治口腔常見疾病的技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及一種用于防治義齒性口炎的義齒基托。

背景技術(shù)：

全口及可摘局部義齒作為傳統(tǒng)修復方式在口腔臨床中被廣泛應(yīng)用，其缺點在于易引發(fā)一些口腔疾患，老年患者尤甚。義齒佩戴患者中，70％左右的患者會發(fā)生義齒性口炎，大部分口炎與白色念珠菌相關(guān)。易于黏附微生物與生物膜、粗糙與疏水性的義齒表面及白色念珠菌對常規(guī)抗菌劑的耐藥等因素導致了義齒性口炎成為口腔治療的難點之一。為此，預防義齒性口炎最有效的方法是使用具有抑制白色念珠菌生物膜形成性能的義齒基托樹脂。

理想抗菌劑應(yīng)具有廣譜、高效、長效、穩(wěn)定及良好生物相容性等特征。無機抗菌劑因其具有良好的生物安全性、穩(wěn)定持久的抗菌性能被廣泛應(yīng)用于口腔材料中。其中銀離子作為優(yōu)良抗菌劑，抗菌譜廣，可抑制真菌、革蘭陽性菌、革蘭陰性菌甚至病毒的生長，且銀離子對哺乳動物細胞具有低毒性，不易引起微生物耐藥。而有機抗菌劑季銨鹽不僅具有良好的殺菌性能，與其他抗菌劑相比，還具有滲透性強、性能穩(wěn)定、皮膚刺激輕、低毒低腐蝕、生物學效應(yīng)持久等優(yōu)點，目前已被廣泛應(yīng)用于工業(yè)及制藥業(yè)等領(lǐng)域。近年來，季銨鹽型抗菌單體應(yīng)用于甲基丙烯酸甲脂樹脂系統(tǒng)的研究亦方興未艾。但是，兩類材料在抗菌時效、抗菌效率及對載體材料的影響等方面各有優(yōu)缺，如何研發(fā)兼具兩者優(yōu)勢的有機無機復合抗菌材料逐漸成為了學者們關(guān)注的熱點。單獨添加銀納米顆粒與樹脂基質(zhì)間無化學連接，僅簡單分散于樹脂基質(zhì)中，因此，釋出速率難以控制，抗菌活性隨時間而降低。同時，抗菌成分的釋出將影響載體材料的機械性能，且對周圍組織產(chǎn)生一系列副作用。季銨鹽單體可與樹脂基質(zhì)成分發(fā)生聚合反應(yīng)，形成化學結(jié)合，但具有不易釋出及化學性能穩(wěn)定的特點，適量添加至樹脂中不影響載體材料的機械性能，但有限的添加量限制了其抗菌活性，而添加量過大會導致化學結(jié)合不穩(wěn)定、影響載體材料整體性能及穩(wěn)定性等一系列問題的產(chǎn)生。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種用于防治義齒性口炎的義齒基托：在義齒基托中加入季銨鹽包裹溴化銀納米復合物，該材料兼具接觸抗菌和銀離子緩釋性能，通過將其添加至牙托粉中制備義齒基托，抗菌性能顯著，尤其適用于抑制白色念珠菌，用于防治義齒性口炎。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種用于防治義齒性口炎的義齒基托，所述方法操作如下：將季銨鹽包裹溴化銀復合物加入到牙托粉后制成義齒基托，從而防治義齒性口炎；

所述季銨鹽包裹溴化銀復合物通過季銨化反應(yīng)將接枝單體接枝到聚-4-乙烯吡啶側(cè)鏈上得到聚合物，隨后向聚合物中緩慢添加對甲苯磺酸銀，經(jīng)此原位沉淀方法制得。

作為優(yōu)選，所述接枝單體為溴己烷和/或2-溴乙基丙烯酸甲酯。

所述季銨鹽包裹溴化銀復合物加入到牙托粉的添加量為0.1～0.3％w/w。

所述季銨鹽包裹溴化銀復合物為AgBr/NPVP，采用溴己烷作為接枝單體制備得到。接枝單體溴己烷、對甲苯磺酸銀與聚-4-乙烯基吡啶的摩爾比為0.25～0.5：0.8～1.0：1。

所述季銨鹽包裹溴化銀復合物為AgBr/BHPVP，采用溴己烷和2-溴乙基丙烯酸甲酯作為接枝單體制備得到。溴己烷和2-溴乙基甲基丙烯酸酯作為接枝單體，提高了季銨鹽包裹溴化銀復合物的抗菌性能，對牙托材料的影響更小。

所述溴己烷、2-溴乙基丙烯酸甲酯、對甲苯磺酸銀與聚-4-乙烯基吡啶摩爾比為0.25～0.35：0.25～0.35：0.8～1.0：1。

本發(fā)明提供的防治義齒性口炎方法具體操作如下：將含有0.5％～1.5％w/w季銨鹽包裹溴化銀納米復合物的牙托粉置于球磨儀中研磨7～9h制成抗菌原母料，再于抗菌原母料內(nèi)加入不同質(zhì)量的牙托粉重新研磨，將季銨鹽包裹溴化銀納米復合物稀釋至0.1％～0.3％w/w，室溫下按粉液重量比1.5～2.5：1將上述各濃度牙托粉分別與甲基丙烯酸甲酯MMA單體混合，加蓋放至面團期早期，加壓填入模具，固化后取出，再經(jīng)600、1000、1500目水砂紙依次打磨，超聲清洗15～25分鐘后浸泡于去離子水中，36～40℃保存24h制備得到義齒基托。

本發(fā)明還提供一種含有季銨鹽包裹溴化銀復合物的牙托粉或義齒基托。

盡管很多文獻報道了將銀離子和季銨鹽抗菌單體分別添加入義齒基托樹脂的研究，但鮮有研究將銀離子與季銨鹽抗菌單體兩者復合的抗菌材料添加入義齒基托樹脂。本發(fā)明以義齒性口炎主要致病菌——白色念珠菌為代表，研究經(jīng)一種新合成的有機無機復合抗菌劑——季銨鹽包裹納米溴化銀抗菌復合物改性室溫固化義齒基托樹脂對其的抗菌效果，并檢測改性義齒基托樹脂機械性能的變化，為研制開發(fā)新型抗菌性室溫固化義齒基托樹脂提供理論依據(jù)。

本發(fā)明的機理如下：義齒性口炎形成的必要步驟是白色念珠菌粘附于義齒基托表面，繼之形成生物膜，因此，預防義齒性口炎的關(guān)鍵在于控制白色念珠菌粘附及生物膜形成。將抗菌復合物鍵合入義齒基托樹脂中，可通過銀離子與季銨鹽的雙重抗菌效應(yīng)來預防義齒性口炎的發(fā)生。其中，銀離子與病原菌接觸后，憑借庫侖引力吸附至表面帶負電荷的細菌表面，抑制細菌細胞壁表面肽聚糖的合成，破壞其完整性，穿過細胞壁后，干擾細胞膜的連續(xù)性，增加其通透性，影響細菌呼吸代謝功能，使其細胞內(nèi)容物丟失死亡。季銨鹽能夠吸引帶負電荷的細菌細胞膜，從而束縛細菌的自由活動，抑制其呼吸，即發(fā)生“接觸死亡”。此外，細菌在電場力的作用下，細胞壁和細胞膜上的負電荷分布不均造成細胞變形、破裂，使細胞內(nèi)容物如水、蛋白質(zhì)等滲出，發(fā)生“細菌溶體”現(xiàn)象而死亡，上述抗菌機制同白色念珠菌ATCC 90028與1×MBC季銨鹽包裹溴化銀后的細胞形態(tài)變化吻合，即表現(xiàn)出胞體皺縮、內(nèi)陷，內(nèi)容物泄露，部分細胞裂解成碎片。季銨鹽抗菌劑的局限性在于，死菌和唾液蛋白吸附于其表面，從而降低接觸抗菌的有效性。而季銨鹽包裹溴化銀能持續(xù)緩慢釋放銀離子，從而殺滅修復體周圍未與其直接接觸的細菌，彌補了單獨使用季銨鹽的局限性。如圖4、5所示，最初季銨鹽與銀離子同時發(fā)揮較強抗菌作用，故抗菌率及死/活菌之比值相對均較高。老化第1周，由于銀離子釋放相對較快，致抗菌率下降相對較明顯；從第2周起，銀離子釋放趨于穩(wěn)定，鍵合于義齒基托樹脂中的NPVP或BHPVP發(fā)揮穩(wěn)定抗菌作用，故抗菌效應(yīng)趨于穩(wěn)定。因此AgBr/NPVP、AgBr/BHPVP改性義齒基托樹脂不但具有接觸抑菌效應(yīng)，還顯示出遠達抑菌效應(yīng)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下創(chuàng)新點與優(yōu)越性：季銨鹽包裹溴化銀納米復合物(AgBr/NPVP或AgBr/BHPVP)屬于兼具有機無機抗菌材料兩者優(yōu)勢的復合抗菌材料，將其添加至牙托粉中制備義齒基托，可賦予義齒基托更加持久、穩(wěn)定的抗菌性能，尤其適用于抑制白色念珠菌，可有效防治義齒性口炎。

附圖說明

圖1為AgBr/NPVP的結(jié)構(gòu)圖；

圖2為AgBr/NPVP的合成路線圖；

圖3為PVP與NPVP的FTIR波譜；

圖4為AgBr/NPVP的XRD圖像；

圖5為AgBr/NPVP的TEM圖像；

圖6為白色念珠菌ATCC 90028孵育24h SEM圖像；

圖7為AgBr/NPVP改性義齒基托樹脂對白色念珠菌ATCC 90028的抗菌率圖；

圖8為AgBr/NPVP改性義齒基托樹脂白色念珠菌ATCC 90028生物膜死/活菌染色圖(×40)；

圖9為AgBr/NPVP改性義齒基托樹脂不同時間點轉(zhuǎn)化率圖；

圖10為AgBr/NPVP改性義齒基托樹脂機械性能圖；

圖11為AgBr/NPVP改性義齒基托樹脂三點彎測試斷面SEM圖像(×1000)；

圖12為季銨鹽包裹溴化銀納米復合物(AgBr/BHPVP)結(jié)構(gòu)圖；

圖13為季銨鹽包裹溴化銀納米復合物的合成路線圖；

圖14為激光共聚焦顯微鏡觀察各組樹脂試件表面黏附的變形鏈球菌(×40)圖；

圖15為各組樹脂試件撓曲強度及維氏顯微硬度的比較圖(MPa,±s，n＝9)：*與同項測試其它組相比P＜0.05。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步詳細說明，但本發(fā)明并不局限于以下技術(shù)方案。

實施例1

1AgBr/NPVP的合成與表征

合成實驗所需原料為聚乙烯吡啶，對甲苯磺酸銀，硝基甲烷，1-溴己烷，乙醚，二甲基亞砜。

合成AgBr/NPVP的方法如下：將聚-4-乙烯基吡啶[poly(4-vinylpyridine)，PVP](2.1g,20mmol)及0.3當量的1-溴己烷(0.85mL,6mmol)溶于25ml的硝基甲烷中，于60℃水浴中攪拌24h，得到淡黃色產(chǎn)物NPVP。隨后，向聚合物中緩慢添加過量的對甲苯磺酸銀(silver paratoluenesulfonate solution，AgPTS)，經(jīng)此原位沉淀方法,使其混合最終得到季銨鹽聚合物包裹溴化銀納米復合物(AgBr/NPVP)，見圖1和圖2。圖2中n表示聚-4-乙烯基吡啶的聚合度，x表示1-溴己烷的接枝量，x的值對于材料的抗菌性影響不大，本實施例中x：n-x約為0.3：0.7。

得到AgBr/NPVP后，通過傅立葉紅外光譜X線衍射及透射電子顯微鏡對AgBr/NPVP進行物相和結(jié)構(gòu)檢測。FTIR掃描次數(shù)32，分辨率4cm^-1，波數(shù)范圍4000-500cm^-1。XRD的條件為：掃描管壓36kV，管流20mA，掃描速度4°/min，掃描范圍10-80°。

FTIR、XRD及TEM表征

FTIR圖譜中(圖3)下圖譜線為PVP，上圖譜線為NPVP，其主要變化為季銨化前1596cm^-1位置的峰發(fā)生位移到了1639cm^-1位置，其余峰的位置基本相同，3400cm^-1為羥基峰，2900cm^-1為甲基亞甲基峰，1467和1417cm^-1為吡啶環(huán)碳碳雙鍵峰。AgBr/NPVP的XRD圖譜中(圖4)，由于31.10°，44.53°，55.28°等特征峰的存在，可證明AgBr的存在。圖5中清晰展現(xiàn)出的納米粒子為有機物外殼包含一個單核，即球狀AgBr嵌入陽離子聚合物NPVP中，其平均直徑在30nm左右。

2義齒基托樹脂抗菌母料及抗菌試件的制備

采用球磨法將含1％質(zhì)量分數(shù)AgBr/NPVP的牙托粉置于球磨儀中研磨8h制成抗菌原母料，再于抗菌原母料內(nèi)加入不同質(zhì)量的牙托粉重新研磨稀釋至實驗所需濃度，分別為0.1％、0.2％、0.3％(w/w)。以未添加AgBr/NPVP的牙托粉為空白對照，以直徑為10.0mm的聚乙烯薄膜片為陽性對照。室溫下，按廠商提供粉液比將上述各濃度牙托粉分別與單體混合，加蓋放至面團期早期，加壓填入模具，固化后取出。所用試件直徑10mm，高1.5mm，經(jīng)600、1000、1500目水砂紙依次打磨，超聲清洗20分鐘后浸泡于去離子水中，37℃保存24h。老化抗菌試件則將上述試件浸泡于人工唾液，37℃分別水浴1、2、3、4周,期間每天更換人工唾液。試件實驗前無菌水沖洗及70％乙醇溶液擦拭表面，1min后再次用無菌水沖洗，經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌備用。

3抗菌性能測試

3.1實驗菌液制備

復蘇白色念珠菌ATCC 90028，接種于無菌沙保羅瓊脂平板上，在37℃普通空氣培養(yǎng)箱中孵育24h，挑取單菌落再接種于無菌沙保羅瓊脂平板上孵育24h，菌懸液比濁至0.5MAC后，以沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基稀釋至所需濃度備用。

3.2最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MFC)檢測

將AgBr/NPVP以沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基為溶劑按二倍稀釋法制備成多個濃度梯度的抗菌混懸液。于96孔細胞培養(yǎng)板孔中加入抗菌混懸液50uL、濃度約2×10⁵CFU/mL白色念珠菌ATCC 90028菌懸液50uL，置空氣培養(yǎng)箱孵育24h。培養(yǎng)板孔內(nèi)液體清亮的抗菌單體最低濃度為其最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)。取培養(yǎng)板清亮孔內(nèi)培養(yǎng)物10uL，接種于無菌沙保羅瓊脂平板表面，孵育24h，無細菌生長的抗菌復合物最低濃度為其最小殺菌濃度(minimal fungicidal concentration,MFC)。同時設(shè)陰、陽性及空白對照。陰性對照只加入等量抗菌溶液和液體培養(yǎng)基；陽性對照只加入等量沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基和稀釋后的菌懸液；空白對照只加入等量液體培養(yǎng)基。將空白對照組菌懸液及濃度為1×MBC的AgBr/NPVP溶液與白色念珠菌ATCC 90028作用24h的樣本以8000rpm離心3min，2.5％戊二醛4℃過夜固定，酒精梯度脫水，沉淀物臨界點干燥，噴金后場發(fā)射掃描電鏡觀察細菌細胞形態(tài)變化。以上步驟均重復三次。

MIC及MBC測定結(jié)果

AgBr/NPVP對白色念珠菌ATCC 90028的MIC及MBC值均為250μg/ml。白色念珠菌ATCC 90028與1×MBC AgBr/NPVP混懸液接觸24h后的細胞形態(tài)變化如圖6所示。場發(fā)射掃描電鏡示，對照組細胞形態(tài)規(guī)則，胞膜完整、光滑；與AgBr/NPVP接觸后，細菌正常細胞形態(tài)喪失，細胞完整性破壞，胞體皺縮、內(nèi)陷，部分細胞裂解成碎片。

圖6中(A)正常白色念珠菌ATCC 90028細胞形態(tài)(×10000)。(B)白色念珠菌ATCC 90028與1×MBC AgBr/NPVP混懸液接觸24h后的細胞形態(tài)(×10000)。(C)正常白色念珠菌ATCC 90028細胞形態(tài)(×50000)。(D)白色念珠菌ATCC 90028與1×MBC AgBr/NPVP混懸液接觸24h后的細胞形態(tài)(×50000)。正常白色念珠菌ATCC 90028細胞形態(tài)規(guī)則，胞膜完整、光滑；與AgBr/NPVP接觸后，細菌正常細胞形態(tài)喪失，細胞完整性破壞，胞體皺縮、內(nèi)陷，部分細胞裂解成碎片。

3.3義齒基托樹脂樣本抗菌活性檢測

采用直接接觸法檢測樣本抗菌活性。未老化及老化各組，每組不同質(zhì)量分數(shù)試件各9個，置無菌瓊脂平板上并稍加壓，使樣本稍嵌入瓊脂中，并保持其上表面高于瓊脂平面，以固定樣本防止其在實驗過程中移動。分別取10μL稀釋濃度為1×10⁶CFU/ml的白色念珠菌懸液滴加于每個樣本表面(陽性對照組將菌懸液滴加于聚乙烯薄膜上)，覆蓋聚乙烯薄膜，鋪平，使細菌均勻接觸樣本，同時防止菌液揮發(fā)。在37℃培養(yǎng)箱中孵育24h，孵育結(jié)束加入10mL沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，超聲振蕩以完全洗脫附于樣本及蓋膜表面的細菌。充分混勻洗脫液，倍比稀釋后取100μL接種至瓊脂平板上，孵育24h-48h后拍照行平板菌落計數(shù)，并根據(jù)稀釋倍數(shù)計算樣本及對照組的存活菌數(shù)。根據(jù)以下公式計算抗菌率：

r(％)＝[(b－c)/b]×100％

r-抗菌率(％)，b-空白對照組樹脂樣本平均存活菌數(shù)(CFU/片)，c-添加抗菌劑的樹脂樣本平均存活菌數(shù)(CFU/片)；

AgBr/NPVP改性義齒基托樹脂抗菌率

AgBr/NPVP改性義齒基托樹脂抗菌率如圖7所示。陰性對照組及空白對照組均有大量細菌生長，表明空白對照組義齒基托樹脂無抗菌活性。統(tǒng)計結(jié)果顯示，當AgBr/NPVP添加量為0.1％、0.2％、0.3％時,未老化義齒基托樹脂對白色念珠菌的抗菌率分別為(78.22±1.90)％、(82.58±2.35)％、(97.82±2.05)％，隨著AgBr/NPVP添加量的增加，義齒基托樹脂對白色念珠菌的抗菌性增強，且各質(zhì)量分數(shù)間抗菌率有統(tǒng)計學差異(P<0.017)。不同質(zhì)量分數(shù)老化1周組較相應(yīng)未老化組抗菌率均有不同程度下降，0.3％組下降較明顯。但老化2周后，各組抗菌率均呈穩(wěn)定趨勢，且0.3％組抗菌效果最好，達80％以上。

圖7中每個值為隨著AgBr/NPVP添加量的增加，未老化義齒基托樹脂對白色念珠菌的抗菌性增強，且各質(zhì)量分數(shù)間抗菌率有統(tǒng)計學差異(P<0.017)。不同質(zhì)量分數(shù)老化1周組較相應(yīng)未老化組抗菌率均有不同程度下降，0.3％組下降較明顯。但老化2周后，各組抗菌率均呈穩(wěn)定趨勢，且0.3％組抗菌效果最好，達80％以上。

3.4白色念珠菌生物膜形成及死/活菌染色

未老化及老化各組，每組不同質(zhì)量分數(shù)試件各9個，分別置于24孔細胞培養(yǎng)板中，于孔中加入稀釋濃度為1×10⁶CFU/ml的白色念珠菌懸液各1ml，37℃孵育48h，取出后以PBS緩沖液輕柔漂洗2次，去除表面松散未附著的細菌，死/活菌熒光試劑盒避光染色后置激光共聚焦顯微鏡觀察，鏡下活菌染色后產(chǎn)生綠色熒光，細胞膜受損的細菌被含碘的試劑染色，產(chǎn)生紅色熒光，接近或重疊的活、死菌呈現(xiàn)橙、黃色，每個樣本隨機觀察3個視野。

共焦顯微鏡(CLSM)觀察

如圖8所示，空白組表面生物膜較厚，尤其是老化4周組。其中活菌染成綠色，死菌染成紅色，接近或重疊的活、死菌呈現(xiàn)橙或黃色。與空白組相比，實驗組表面菌量相對減少，呈現(xiàn)更多的紅、黃、橙染色區(qū)域。在0.3％未老化組中菌量最少，基本被染成紅色。各實驗組均隨老化時間延長，附著菌量漸增，但均以染成紅色為主。

圖9中活菌染成綠色，死菌染成紅色，接近或重疊的活、死菌呈現(xiàn)橙、黃色。橫向分別為空白、0.1％、0.2％、0.3％組，縱向分別為老化0、1、2、3、4周組。空白組表面生物膜較厚，尤其是老化4周組，均被染成綠色。實驗組表面菌量相對減少，呈現(xiàn)出更多紅、黃、橙染色區(qū)域。0.3％未老化組中菌量最少，基本被染成紅色。各實驗組均隨著老化時間延長，附著菌量漸增，但均以被染成紅色為主。

4機械及物理性能測試

4.1轉(zhuǎn)化率(Degree of Conversion,DC)

通過傅立葉紅外光譜測定義齒基托樹脂轉(zhuǎn)化率。將義齒基托樹脂粉液按比例混合后行紅外光譜掃描，分辨率4cm^-1，掃描次數(shù)24，環(huán)境溫度(22±2)℃，相對濕度55％。自粉液混合后開始計時，在5min,10min,20min,30min,1h,4h及24h時間點各掃描1次。每組9個樣本。用Omnic 8.0軟件獲取1550～1800cm^-1范圍內(nèi)的紅外圖譜，測量義齒基托樹脂固化前后1638.6cm^-1(脂肪環(huán)C＝C)和1720cm^-1(C＝O)處的峰值，根據(jù)公式計算雙鍵轉(zhuǎn)化率：

義齒基托樹脂粉液混合5分鐘至24小時轉(zhuǎn)化率如圖7所示。粉液混合10分鐘內(nèi)各組轉(zhuǎn)化率上升均較快，20分鐘后轉(zhuǎn)化率上升趨于平緩，1小時轉(zhuǎn)化率位于(61.57±1.96)％與(69.9±1.25)％之間，AgBr/NPVP添加量為0.2％、0.3％時，轉(zhuǎn)化率與空白組相比結(jié)果有統(tǒng)計學差異(p<0.05)。24小時各組轉(zhuǎn)化率均高于70％，各組間轉(zhuǎn)化率無統(tǒng)計學差異(p>0.05)。

圖9中，粉液混合后10分鐘內(nèi)各組轉(zhuǎn)化率上升較快，20分鐘后轉(zhuǎn)化率上升趨于平緩，24小時各組轉(zhuǎn)化率高于70％，各組間轉(zhuǎn)化率無統(tǒng)計學差異(p>0.05)。

4.2撓曲強度及彈性模量

根據(jù)ISO 4049:2009標準，每組試件9個，固化后600目水砂紙打磨至標準尺寸(2×2×25mm)，37℃水浴24h，精確測量試件寬(w)和高(h)。室溫下，于萬能實驗機行三點彎測試，測試速度1mm/min，記錄破壞力(F)，測量載荷-位移曲線圖直線線段斜率(k)。根據(jù)以下公式求得撓曲強度(FS)和彈性模量(FM):

FS＝3FL/2wh²

FM＝kL³/4wh³

式中L＝20mm，為下加荷臺支點距離。測試完成后，斷面噴金，場發(fā)射掃描電鏡觀察其形貌。

撓曲強度、彈性模量及維氏顯微硬度實驗結(jié)果見圖10。AgBr/NPVP添加量為0.1％、0.2％、0.3％時，改性義齒基托樹脂撓曲強度、彈性模量與空白組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，隨著添加量增加，維氏顯微硬度隨之減小，添加量為0.3％時與其他組間有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

圖10中(A)撓曲強度。(B)彈性模量。(C)維氏顯微硬度。每個值為a表示與其他組比較有統(tǒng)計學差異(p<0.05)。AgBr/NPVP添加量為0.1％、0.2％、0.3％時，改性義齒基托樹脂撓曲強度、彈性模量與其它組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，但隨著添加量增加，維氏顯微硬度隨之減小，添加量為0.3％時與空白組間有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

4.3維氏顯微硬度

以不銹鋼模具制備直徑6mm、高3mm的試件，每組9個，固化后，于拋光機上以600、1200、2000、5000目水砂紙依次打磨，形成光潔平面，37℃水浴24h。于維氏硬度計上以25g載荷對試樣表面加載15s，顯微鏡觀察，讀數(shù)。每個樣本隨機測試3個點。

場發(fā)射掃描電鏡觀察斷面形貌

三點彎試驗后，試件斷面噴金行場發(fā)射掃描電鏡觀察如圖11所示，可見各樣本斷面無明顯差異，斷面除眾多皺褶外，偶有小孔，呈現(xiàn)出具有脆性斷裂特征的鋒利邊緣裂隙。

圖11中A、B、C、D分別為空白、0.1％、0.2％、0.3％組。各樣本斷面無明顯差異，斷面除眾多皺褶外，偶有小孔，呈現(xiàn)出具有脆性斷裂特征的鋒利邊緣裂隙。

綜上，在一定范圍內(nèi)，隨著新合成的抗菌復合物AgBr/NPVP添加量的升高，室溫固化義齒基托樹脂對白色念珠菌ATCC 90028的抗菌效果不斷增強，且具有抗菌長效性、對其機械性能無顯著影響。經(jīng)新型抗菌復合物AgBr/NPVP改性的室溫固化義齒基托樹脂所行修復體將有益于義齒性口炎的預防。

實施例2

1材料和方法

1.1主要材料、試劑和儀器：季銨鹽包裹溴化銀納米復合物，變形鏈球菌UA159，腦心浸出液肉湯，人工唾液，活/死菌染色試劑盒，Bis-GMA，TEGDMA，樟腦醌，甲基丙烯酸二甲氨基乙酯，超凈工作臺，厭氧培養(yǎng)罐，Vitek細菌比濁儀，旋渦混合器，微量加樣器，24孔細胞培養(yǎng)板，激光共聚焦顯微鏡，萬能試驗機，維氏硬度計。

1.2實驗方法

1.2.1季銨鹽包裹溴化銀納米復合物的合成首先，通過季銨化反應(yīng)將溴己烷和2-溴乙基丙烯酸甲酯接枝到聚-4乙烯吡啶[poly(4-vinylpyridine)，PVP]側(cè)鏈上，硝基甲烷作為溶劑，于60℃水浴中攪拌24h，合成季銨甲基丙烯酸酯(quaternary ammonium methacrylates，BHPVP)。隨后，向聚合物中緩慢添加對甲苯磺酸銀(silver paratoluenesulfonate solution，AgPTS)，經(jīng)此原位沉淀方法，AgBr以化學配位鍵方式結(jié)合于BHPVP側(cè)鏈上，被BHPVP聚合物包裹，通過空間位阻效應(yīng)穩(wěn)定于該聚合物中。最終，真空干燥24h后即得到季銨鹽聚合物包裹溴化銀納米復合物(AgBr/BHPVP)，見圖12和圖13。溴己烷、2-溴乙基甲基丙烯酸酯、對甲苯磺酸銀和聚-4乙烯吡啶的摩爾比為0.3：0.3：1：1。

圖12和圖13中x、y、z對本發(fā)明結(jié)果沒有影響，三個化合物如何接，對于結(jié)構(gòu)會有一些影響，但對于材料的抗菌性影響不大。x為溴己烷的接枝量，z表示2-溴乙基甲基丙烯酸酯的接枝量，y＝n-x-z n為聚-4乙烯吡啶的聚合度。

1.2.2實驗菌株培養(yǎng)復蘇變形鏈球菌UA 159，于37℃厭氧培養(yǎng)罐(85％N₂+5％C0₂+10％H₂)中培養(yǎng)24h。挑取單菌落接種于無菌BHI瓊脂平板上，培養(yǎng)24h后，將菌懸液比濁至0.5MAC，以BHI(含0.2％蔗糖)將菌懸液稀釋100倍備用。

1.2.3抗菌樹脂樣本制備雙酚A-雙醚(Bis-GMA)與三乙烯乙二醇二丙烯酸酯(TEGDMA)以質(zhì)量比1：1組成樹脂基質(zhì)，避光狀態(tài)下將AgBr/BHPVP按0.5％、1.0％、1.5％質(zhì)量分數(shù)(wt.％)添加至樹脂基質(zhì)中作為改性組，未添加AgBr/BHPVP的樹脂基質(zhì)作為空白對照組，同時向樹脂體系中加入樟腦醌(引發(fā)劑)與DMAEMA(甲基丙烯酸二甲氨基乙酯，助引發(fā)劑)各0.5wt.％，磁力攪拌均勻，抽真空排氣泡。將樹脂基質(zhì)充填于內(nèi)徑10mm、厚1.5mm的聚四氟乙烯模具中，覆蓋聚乙烯薄膜，光固化。經(jīng)水砂紙逐級打磨拋光后置37℃去離子水中浸泡24h。老化3月樣本浸泡于人工唾液中老化處理3月，37℃水浴，每2天更換一次人工唾液。每組每個時間點樣本5個，實驗前以70％乙醇擦拭試件表面，無菌水沖洗，環(huán)氧乙烷消毒備用。

1.2.4菌落形成單位(colony-forming units，CFU)計數(shù)將老化處理前后樣本置無菌24孔細胞培養(yǎng)板中，加入濃度約1×10⁶CFU/ml的變形鏈球菌UA 159菌懸液1ml，置37℃厭氧培養(yǎng)罐中。24h后終止培養(yǎng)，試件經(jīng)PBS緩沖液輕柔漂洗3次，以BHI液洗脫附于樣本表面細菌生物膜，置漩渦混合器充分混勻洗脫液，梯度稀釋后接種至無菌BHI瓊脂平板表面，37℃厭氧孵育48h后拍照行平板菌落計數(shù)，根據(jù)稀釋倍數(shù)得出各樣本表面CFU，計算均值±標準差。

1.2.5激光共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope,LSCM)觀察細菌活性老化處理前后樣本與菌懸液共培養(yǎng)24h后終止培養(yǎng)，PBS緩沖液輕柔漂洗3次，活/死菌試劑避光染色15min，PBS再次漂洗?；罹旧螽a(chǎn)生綠色熒光，細胞膜受損的細菌染色后產(chǎn)生紅色熒光，接近或重疊的活/死菌顯示為橙黃色。樣本置LSCM下觀察細菌活性。

1.2.6機械性能檢測

1.2.6.1撓曲強度檢測根據(jù)ISO 4049標準，制作規(guī)格為25mm×2mm×2mm的樹脂試件，每組9個，光固化后，經(jīng)600目水砂紙打磨拋光，置37℃恒溫水浴24h。精確測量各試件的寬(w)和高(h)后，于萬能試驗機進行撓曲強度測試，測試速度1mm/min，記錄破壞載荷(F)，按照以下公式計算撓曲強度(flexural strength,FS)：FS＝3FL÷(2wh²)，其中L＝20mm,為下加荷臺支點間距離。

1.2.6.2維氏顯微硬度檢測制備直徑6mm、厚3mm的圓柱形樹脂試件，每組9個，光固化后，分別以600、1000、1500、2000目水砂紙逐級打磨，表面拋光呈鏡面，于維氏硬度計上以25g載荷對樣本表面加載15s，測試維氏顯微硬度值。每試件隨機測試3個點，計算均值。

2結(jié)果

2.1樹脂試件CFU計數(shù)

各組樹脂試件表面CFU計數(shù)見表1。老化處理前后，樹脂試件表面CFU均較空白對照組顯著降低(p＜0.05)；老化3月1.0％、1.5％組兩組之間CFU數(shù)量無顯著性差異(p＞0.05)，除此之外，老化處理前或處理后試件表面CFU數(shù)量均隨AgBr/BHPVP添加量增加而減少(p＜0.05)；老化處理3月后，0.5％、1.5％改性組CFU數(shù)量較同組別老化處理前有所增加(p＜0.05)，空白對照組、1.0％改性組同組別老化處理前后CFU數(shù)量間無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。

表1各組樹脂試件菌落形成單位的比較(×10⁷CFU，n＝5)

注：^a：與空白對照組相比P＜0.05；^b：與0.5％組相比P＜0.05；^c：與1.0％組相比P＜0.05；^*：與同組別老化處理前相比P＜0.05

2.2LSCM觀察

空白對照組樹脂試件表面覆蓋大量活細菌，呈大片綠色熒光；改性組樹脂試件表面綠色熒光減少，紅色熒光增多，即改性組樹脂試件表面黏附的活菌量明顯少于空白對照組，見圖14。

2.3機械性能的比較

各組樹脂試件撓曲強度及維氏顯微硬度的比較見圖15，0.5％、1.0％改性組樹脂試件撓曲強度值與空白對照組比較無顯著差異(p＞0.05)，當AgBr/BHPVP添加至1.5％時，撓曲強度值較空白對照組顯著降低(p＜0.05)?？瞻讓φ战M與改性組樹脂試件維氏顯微硬度值均無顯著性差異(p＞0.05)。

新合成的有機無機復合抗菌材料-季銨鹽包裹溴化銀納米復合物(AgBr/BHPVP)引入了甲基丙烯酸酯功能基團，在賦予其季銨鹽接觸抗菌及緩釋銀離子雙重抗菌性能的同時，將其添加至樹脂體系中能與樹脂基質(zhì)進行化學結(jié)合，同時，納米尺寸特性使其在樹脂體系中充分分散，發(fā)揮穩(wěn)定抗菌作用，在適量添加情況下不影響載體材料的機械性能。

樹脂修復材料在口內(nèi)行使功能時遇到的兩大挑戰(zhàn)分別是繼發(fā)齲和修復體折裂。因此，除具備抗菌活性以外，材料自身剛度需達到一定程度才能保障其在口腔中良好地行使功能。撓曲強度測試相比抗壓強度測試，前者對材料亞結(jié)構(gòu)的輕微變化敏感性更高，故本實驗選用撓曲強度作為評價改性后樹脂基質(zhì)機械性能的指標之一。該實驗中，當樹脂基質(zhì)中AgBr/BHPVP添加量為0.5％、1.0％時，撓曲強度與空白對照組間無顯著性差異(p＞0.05)，且其撓曲強度值均位于80MPa以上，符合ISO 4049標準對牙科聚合材料撓曲強度值的要求。但當添加量達1.5％時，撓曲強度下降，與空白對照組相比具統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。其原因可能在于樹脂體系中過量AgBr/BHPVP中的甲基丙烯酸酯雙鍵與樹脂基質(zhì)間無法形成化學結(jié)合，從而形成不良接觸界面，孔隙增加，受力時易導致應(yīng)力集中，材料整體強度降低。維氏顯微硬度是衡量材料軟硬程度的指標，常被用以表征材料的耐磨損性能。臨床上常用的Bis-GMA和TEGDMA樹脂基質(zhì)體系其維氏顯微硬度值介于100～200MPa之間。本實施例中實驗結(jié)果顯示，利用AgBr/BHPVP對樹脂基質(zhì)進行改性，各組維氏顯微硬度值均高于100MPa，與空白對照組接近，其差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。

綜上所述，適量AgBr/BHPVP改性樹脂基質(zhì)在體外對口腔病原菌變形鏈球菌具有持續(xù)、穩(wěn)定、長效的抗菌活性，當添加量為1.0％時，老化處理前后均表現(xiàn)出良好的抗菌活性，且對材料的撓曲強度及維氏顯微硬度均未產(chǎn)生不利影響，在口腔修復材料領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。