本發(fā)明涉及醫(yī)藥領域，具體來說，是涉及一種低毒的雷公藤新多苷，還涉及該雷公藤新多苷的制備方法，以及其醫(yī)藥用途。

背景技術：

雷公藤多苷(Tripterygium wilfordii Hook.f.)是從衛(wèi)矛科植物雷公藤的根、皮、葉中提取的一組混合苷，其主要化學成分包括二萜內(nèi)酯、生物堿、三萜等。藥理研究證明，雷公藤具有抗炎、免疫抑制或免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等作用，是目前國內(nèi)外熱點研究的免疫調(diào)節(jié)藥，可用于治療類風濕性關節(jié)炎、原發(fā)性腎小球腎病、腎病綜合征、紫瘢性及狼瘡性腎炎、紅斑狼瘡、亞急性及慢性重癥肝炎、慢性活動性肝炎；亦可用于過敏性皮膚脈管炎、皮炎和濕疹，以及銀屑病性關節(jié)炎、麻風反應、白噻氏病、復發(fā)性口瘡、強直性脊柱炎等。

雷公藤多苷投入臨床使用以來，相關的不良反應還是時有發(fā)生，累及系統(tǒng)涉及血液系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等。究其原因，一方面是雷公藤多苷中的主要有效成分如雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮等二萜類成分，雷公藤紅素、雷公藤內(nèi)酯醇等三萜類成分，雷公藤晉堿、雷公藤次堿等生物堿類成分，均具有較大的毒性；另一方面，市場上雷公藤多苷標準提取物或比例提取物往往僅以雷公藤甲素為單一評價指標，導致各種雷公藤多苷提取物魚目混雜。

早在1991年馬鵬程等人首次分離和鑒定了雷公藤內(nèi)酯三醇結構，但是，雷公藤內(nèi)酯三醇在雷公藤屬植物中的含量極低，20kg雷公藤僅可以獲得720mg雷公藤內(nèi)酯三醇。同年，鄭家潤等人同時研究了雷公藤內(nèi)酯三醇對小鼠耳腫脹實驗模型的緩解實驗和血清血容素測定實驗，其結果表明，雷公藤內(nèi)酯三醇僅具淺表的抗炎活性，而并無免疫抑制活性。因此，雷公藤內(nèi)酯三醇一直未能在醫(yī)藥領域得到推廣應用。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種全新的、低毒雷公藤多苷。

本發(fā)明的另外一個目的是提供上述雷公藤新多苷的制備方法。

本發(fā)明的另外一個目的是提供上述雷公藤新多苷在制藥上的應用。

根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種低毒雷公藤新多苷，由下述方法制備得到：

(1)在pH3.0～5.0的由磷酸二氫鈉與磷酸配置的緩沖溶液中，將雷公藤多苷(留樣，用于檢測雷公藤甲素的含量)置于90～120℃油浴中加熱回流進行水解反應18～96h(優(yōu)選30h)。

反應完成后，減壓移除溶劑(也可以通過萃取的方式移除溶劑)，加無水乙醇復溶，離心，去掉不溶物，溶液再加無水乙醇定容，取樣檢測雷公藤甲素的量，并得出雷公藤甲素的減少量。

(2)往步驟(1)的反應產(chǎn)物中添加雷公藤內(nèi)酯三醇-無水乙醇溶液，混合后揮干溶劑，得到低毒雷公藤新多苷；雷公藤內(nèi)酯三醇的添加量為雷公藤甲素減少量摩爾(mol)數(shù)的0～20倍。

步驟(1)和(2)中的無水乙醇，也可以選用其他無毒的有機溶劑來代替，如：異丙醇。

上述的雷公藤多苷通過下述方法制備得到：

以雷公藤的干燥根莖為原料，以質(zhì)量分數(shù)為95％的乙醇(乙醇與雷公藤干燥根莖的體積質(zhì)量比為4～16：1)回流提取3～12h，提取液減壓濃縮得粗浸膏，粗浸膏用中性氧化鋁吸附，揮干乙醇，再用三氯甲烷提取，減壓濃縮得到雷公藤多苷。

據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了上述低毒雷公藤新多苷的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

a)以雷公藤的干燥根莖為原料，以質(zhì)量分數(shù)為95％的乙醇(乙醇與雷公藤干燥根莖的體積質(zhì)量比4～16倍)回流提取3～12h，提取液減壓濃縮得粗浸膏，粗浸膏用中性氧化鋁吸附，揮干乙醇，再用三氯甲烷提取，減壓濃縮得到雷公藤多苷；

b)在pH3.0～5.0的由磷酸二氫鈉與磷酸配置的緩沖溶液中，將雷公藤多苷(留樣，用于檢測雷公藤甲素的含量)置于90～120℃油浴中加熱回流進行水解反應18～96h(優(yōu)選30h)。

反應完成后，減壓移除溶劑(也可以通過萃取的方式移除溶劑)，加無水乙醇復溶，離心，去掉不溶物，溶液再加無水乙醇定容，取樣計算雷公藤甲素的量，并得出雷公藤甲素的減少量。

c)往步驟b)的反應產(chǎn)物中添加雷公藤內(nèi)酯三醇-無水乙醇溶液，混合后揮干溶劑，得到低毒雷公藤新多苷；雷公藤內(nèi)酯三醇的添加量為雷公藤甲素減少量摩爾(mol)數(shù)的0～20倍。

步驟(1)和(2)中的無水乙醇，也可以選用其他無毒的有機溶劑來代替，如：異丙醇。

據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了上述低毒雷公藤新多苷在制備治療腎病綜合征、原發(fā)性腎小球腎病、紫瘢性及狼瘡性腎炎、類風濕性關節(jié)炎、紅斑狼瘡、亞急性及慢性重癥肝炎、慢性活動性肝炎；過敏性皮膚脈管炎、皮炎、濕疹、銀屑病性關節(jié)炎、強直性脊柱炎藥物中的應用。

雷公藤甲素與內(nèi)酯三醇都是雷公藤的二萜類成分，二者化學結構相似，在一定條件可相互轉化。本發(fā)明中，通過在pH3.0～5.0由磷酸二氫鈉與磷酸配置的緩沖溶液中回流反應，將雷公藤甲素轉化為雷公藤內(nèi)酯三醇的基礎上，將雷公藤多苷整體進行同上條件的化學炮制，使多苷中的雷公藤甲素含量降低，從而降低制劑的毒性。但在降低毒性的同時，制劑的藥效也相應減弱。為此，本發(fā)明補加一定量低毒有效(治療窗大)的雷公藤內(nèi)酯三醇，以增加制劑的藥效。本發(fā)明首次通過減少雷公藤甲素含量，并相應增加雷公藤內(nèi)酯三醇含量保證了相當?shù)目寡谆钚?，同時減少了因免疫抑制帶來的毒性，為其在其它藥物制劑中的應用及在臨床疾病的治療中提供物質(zhì)基礎。

本發(fā)明的低毒雷公藤新多苷，具有如下優(yōu)點：

1、雷公藤新多苷相比市售雷公藤制劑來說毒性大大降低(p<0.05)；

2、雷公藤新多苷能有效緩解腎病綜合征的腎臟病理損傷及蛋白尿的產(chǎn)生，改善機體炎癥水平，對腎病綜合征具有明顯的治療效果，具有持續(xù)的療效。

3、由于免疫相關疾病具有機理的類似性，本發(fā)明提供的雷公藤新多苷也可以對其它免疫相關疾病尤其是炎癥介導型的免疫相關疾病起到治療作用，并有減毒效果。

附圖說明

圖1為雷公藤多苷及雷公藤新多苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的色譜圖。

圖2為圖1增加對照品后的色譜圖。

圖3為雷公藤新多苷在各細胞系中的毒性結果圖。

圖4為雷公藤內(nèi)酯三醇單體抑制正常T/B淋巴細胞增值結果圖。

圖5為雷公藤內(nèi)酯三醇單體抑制誘導的T/B淋巴細胞增值結果圖。

圖6為雷公藤內(nèi)酯三醇單體抑制Raw264.7細胞炎癥因子產(chǎn)生結果圖。

圖7為雷公藤內(nèi)酯三醇單體抑制Raw264.7細胞炎癥基因產(chǎn)生結果圖。

圖8為雷公藤內(nèi)酯三醇單體抑制Raw264.7細胞NF-κB蛋白表達結果圖。

圖9為雷公藤內(nèi)酯三醇單體抑制足細胞凋亡結果圖。

圖10為足細胞標志蛋白podocin及凋亡蛋白Bax蛋白表達結果圖。

圖11為足細胞標志蛋白表達激光共聚焦結果圖。

圖12為各實驗組對NS大鼠尿蛋白的影響趨勢圖。

圖13為各實驗組對NS大鼠白蛋白的影響示意圖。

圖14為各實驗組對NS大鼠總膽固醇、甘油三酯的影響示意圖。

圖15為病理學光鏡檢查結果。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。

下述制備例中所用常用試劑，均為市售試劑，所使用的儀器為：

超高效液相色譜儀(Waters Acquity，美國Waters公司)，萬分之一天平(AL104-IC，瑞士METTLER TOLEDO公司)，十萬分之一天平(AB135-S，瑞士METTLER TOLEDO公司)，酸度計(PHS-3C，上海精科儀器有限公司)，磁力攪拌器(HS7，德國IKA公司)，旋轉薄膜蒸發(fā)儀(RV 10basic V，德國IKA公司)，臺式微量離心機(Microfuge16，美國BACKMAN公司)，全波長酶標儀(1510，賽默飛世爾科技(中國)有限公司)，Thermo Scientific移液槍，1-10μL、10-100μL、100-1000μL(Thermo Fisher Scientfic.inc)，蛋白垂直電泳轉膜系統(tǒng)(Bio-Rad)，全自動免疫分析儀(Abbott)，萊卡切片機(Leica)。

1、雷公藤新多苷的制備

以雷公藤的干燥根莖1500g為原料，以12L質(zhì)量分數(shù)為95％的乙醇回流提取10h，提取液減壓濃縮得粗浸膏，粗浸膏用中性氧化鋁吸附，揮干乙醇，再用三氯甲烷5L提取，減壓濃縮得到雷公藤多苷。

制得的雷公藤多苷，取樣檢測雷公藤甲素的含量，并同通過其指紋圖譜和特征性成分與市售的雷公藤多苷進行比較。經(jīng)比較，所得的雷公藤多苷和市場上的主流產(chǎn)品上海復旦復華藥業(yè)有限公司、湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司、華潤三九藥業(yè)有限公司的雷公藤制劑、湖南協(xié)力藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的雷公藤多苷片指紋圖譜相當。

取磷酸二氫鈉，加水溶解，在室溫下，加體積分數(shù)為1％的磷酸溶液調(diào)pH為4.0，即為pH4.0的磷酸二氫鈉/磷酸緩沖溶液。

在pH4.0的磷酸二氫鈉/磷酸緩沖溶液中，取部分制得的雷公藤多苷置于90～120℃油浴中加熱回流進行水解反應30h，減壓移除溶劑后，加無水乙醇復溶，離心，去掉不溶物，加無水乙醇定容至1L。取樣10mL，計算雷公藤甲素的減少量。再取300mL直接揮干溶劑得到雷公藤新多苷Ⅰ；另取300mL，添加10倍(mol倍數(shù))雷公藤甲素減少量的雷公藤內(nèi)酯三醇-乙醇溶液，揮干溶劑后得到雷公藤新多苷Ⅱ；另取300mL，添加20倍(mol倍數(shù))雷公藤甲素減少量的雷公藤內(nèi)酯三醇-乙醇溶液，揮干溶劑后得到雷公藤新多苷Ⅲ，于-20℃冰箱保存。通過以上方式獲得了雷公藤新多苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。具體操作流程如下：

2、雷公藤新多苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中雷公藤甲素與內(nèi)酯三醇的含量測定

HPLC檢測條件：色譜柱：BEH Shield RP18(2.1×100mm，1.7μm)；流動相：乙腈-水體系；梯度洗脫，洗脫程序見表1；流速：0.3mL/min；檢測波長：220nm；柱溫：35℃；進樣體積：3μL；結果見圖1、圖2。

表1

圖2中，對照品為雷公藤甲素和雷公藤內(nèi)酯三醇的混合品。由圖1和圖2可見，雷公藤新多苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中的雷公藤甲素都比雷公藤多苷中的要少；雷公藤新多苷Ⅰ、雷公藤多苷中的雷公藤內(nèi)酯三醇，含量極其微小，而雷公藤新多苷Ⅱ、Ⅲ中的雷公藤內(nèi)酯三醇含量較多。

以雷公藤甲素和雷公藤內(nèi)酯三醇單體為標準品，用HPLC定量分析可得雷公藤多苷與雷公藤新多苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中雷公藤甲素和雷公藤內(nèi)酯三醇的含量，具體如表2

表2雷公藤多苷與雷公藤新多苷中標志性成分的含量(n＝3)

3、細胞實驗

3.1HK-2、HL-7702、GC1、GC2、TM4細胞培養(yǎng)及毒性檢測

HK-2、HL-7702、GC1、GC2、TM4均購自ATCC；HK-2：37℃高糖DMEM+10％FBS+1％雙抗；HL-7702、GC1、GC2、TM4均為37℃DMEM+10％FBS+1％雙抗；最終均置于含5％CO₂的溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)細胞至貼壁生長80％，取處于對數(shù)生長期的細胞，0.25％胰蛋白酶消化后，調(diào)整合適的細胞密度至96孔板中，待細胞單層貼壁后，換為同步化培養(yǎng)基培養(yǎng)，同步化12h。細胞進入靜止期后加藥處理，分別為:雷公藤多苷(LGT 0、1、5、10、20、30、50、100μg/mL)、雷公藤新多苷Ⅱ(LGT-2，0、1、5、10、20、30、50、100μg/mL)、雷公藤新多苷Ⅲ(LGT-4，0、5、10、20、30、50、75、100μg/mL)、LGT-5(0、0.1、2.5、5、10、15、25、50μg/mL)、雷公藤甲素(0、1、5、15、25、40、80、150ng/mL)、雷公藤內(nèi)酯三醇(0、50、100、200、250、300、400、500μg/mL)，mix(甲素：三醇＝1：10，0、22、88、110、330、660、990、2200ng/mL)，每次給藥200μL，給藥后繼續(xù)培養(yǎng)24h，進行MTT檢測細胞活性并計算給藥24h后的IC₅₀值，其結果見圖3。

圖3中，左邊為IC₅₀值在0-200段的放大圖，右邊為IC₅₀值在0-1段的放大圖(由于活性差別大，縱軸采用兩種放大倍數(shù)截斷)。由圖3可知，雷公藤新多苷組在各個細胞系毒性顯著降低，各配比平均低于甲素毒性的近1000倍左右。其中雷公藤內(nèi)酯三醇：雷公藤甲素為10：1(接近雷公藤新多苷Ⅱ的比例)時，混合單體毒性降低近100倍左右，毒性顯著降低。

3.2免疫抑制活性檢測：

斷頸處死小鼠，浸泡于75％的乙醇中，在超凈臺中取出小鼠脾臟，將脾臟在DPBS中洗3遍，充分濕潤，將200目得紗布至于35mm的皿上，10mL注射器的活塞按一個方向均勻研磨研磨，邊研磨邊用DPBS濕潤，將收集到的淋巴細胞懸液1500rpm離心3min，每個脾臟加入7mL紅細胞裂解液，室溫作用30min，1500rpm離心3min棄去上清，再用DPBS洗滌3遍，除去多余血清，取4mL的70％Percoll加在15mL離心管的底層，4mL 40％Percoll加在15mL離心管的上層，在水平離心機上800g室溫離心20min，吸取40％percoll和70％percoll之間的細胞，用4mL DPBS洗滌3遍；接種至96孔培養(yǎng)板中，加藥處理，分別為：空白對照組(只加培養(yǎng)基)、不同濃度的雷公藤內(nèi)酯三醇(50、100、150、200ug/mL)、T淋巴細胞特異性增值誘導劑Con A(10ug/mL，對應正常抑制組)和B淋巴細胞特異性增值誘導劑LPS(10ug/mL，對應正常抑制組)，各加入200μL；于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24h后MTT方法檢測細胞活性和抑制率，結果如圖4所示。

特異性抑制實驗淋巴細胞前處理操作同上，在淋巴細胞接種至96孔培養(yǎng)板后，進行加藥處理，其中空白對照組(只加培養(yǎng)基)、T淋巴細胞特異性增值誘導劑Con A模型組(5ug/mL，對應模型組)和B淋巴細胞特異性增值誘導劑LPS模型組(5ug/mL，對應模型組)各加入200μL；Con A給藥組先分別加入T淋巴細胞特異性增值誘導劑Con A(10ug/mL，對應模型組)100μL多份，再分別加入不同濃度的雷公藤內(nèi)酯三醇(100、200、300、400ug/mL)100μL；LPS給藥組先分別加入B淋巴細胞特異性增值誘導劑LPS(10ug/mL，對應模型組)100μL多份，再分別加入不同濃度的雷公藤內(nèi)酯三醇(100、200、300、400ug/mL)100μL；各組于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24h后MTT方法檢測細胞活性和抑制率，結果如圖4和圖5所示。

由圖4可知：雷公藤內(nèi)酯三醇具有抑制體外正常T、B淋巴細胞增值的作用，并且其抑制作用呈劑量依賴性，各給藥組細胞活性顯著低于對照組和模型組p<0.05；50ug/mL雷公藤內(nèi)酯三醇與200ug/mL雷公藤內(nèi)酯三醇對細胞活性抑制程度具有顯著差異p<0.05。

由圖5可知：在分別加入T細胞特異性誘導劑ConA和B細胞特異性誘導劑Lps之后，再用不同濃度雷公藤內(nèi)酯三醇進行處理，所得結果如圖5所示，給藥組細胞活性均高于空白對照組，但均低于模型組，由此可知雷公藤內(nèi)酯三醇確實存在較低的免疫抑制作用，其中對T淋巴細胞的抑制作用顯著高于對B細胞的抑制作用p<0.05。對單獨的細胞抑制并未呈現(xiàn)劑量依賴性。

3.3抗炎活性檢測結果

Raw264.7 37℃、5％CO₂RPMI-1640+10％FBS+1％雙抗。最終置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)細胞至貼壁生長至80％，取處于對數(shù)生長期的細胞，0.25％胰蛋白酶消化后，調(diào)整合適的細胞密度至6孔板中。待細胞單層貼壁后，換為同步化培養(yǎng)基培養(yǎng)，同步化12h。細胞進入靜止期后,除空白對照組外，其它各組以LPS(1ug/mL)1mL為造模劑，誘導細胞炎癥模型，同時加藥處理：模型組加1mL培養(yǎng)基、給藥組(雷公藤內(nèi)酯三醇50、100、150、200μg/mL劑量組)分別加入1mL相應濃度藥液，而空白對照組直接加2mL培養(yǎng)基；分別用Western blot、qPCR、ELISA等方法檢測不同處理組的炎癥相關蛋白、基因、細胞因子的表達水平、NF-κB轉錄相關因子的表達及IL-6、IL-10、TNF-α等炎癥細胞因子的表達。

如圖6所示，體內(nèi)外研究表明，TNF-ɑ主要是由發(fā)炎腎小球上的系膜細胞、上皮細胞，或者單核巨噬細胞分泌，不僅刺激系膜細胞分裂增殖，同時可刺激系膜細胞分泌多種炎性細胞因子，加重系膜細胞的增殖，細胞因子TNF-ɑ具有重要致炎作用。本課題研究結果可知：雷公藤內(nèi)酯三醇具有改善由LPS誘導的小鼠巨噬細胞炎癥損傷模型中細胞因子的分泌。

如圖7、8所示，NF-κB P65通過調(diào)控TNF-ɑ、IL-6、IL-10等炎癥細胞因子基因的表達，進而影響機體的炎癥反應，調(diào)控T、B細胞的增殖、生長和分化，在體液和細胞免疫中發(fā)揮重要的作用。從圖中可知：雷公藤內(nèi)酯三醇可有效降低炎癥因子TNF-ɑ和IL-10的作用。在高濃度時可升高抑炎因子IL-10的表達。這提示：藥物可有效降低炎性因子的轉錄，并有一定的免疫調(diào)節(jié)活性。

4雷公藤內(nèi)酯三醇保護足細胞凋亡實驗

小鼠永生性足細胞系MPC5由廣東省中醫(yī)院腎病科饋贈。MCP5處理方式如下：分別用Western blot、IFC、qPCR、ELISA等方法檢測不同處理組的炎癥相關蛋白、基因、細胞因子的表達水平。其為溫度敏感性細胞，在33℃RPMI-1640+10％FBS+1％雙抗+10U/mLγ-IFN條件下增值，37℃RPMI-1640+10％FBS+1％雙抗培養(yǎng)基分化10-14天備用。MCP5處理方式如下：除空白對照組外，其它各組以ADM(0.8μg/mL)1mL為造模劑，誘導細胞凋亡模型，同時加藥處理：模型組加1mL培養(yǎng)基、給藥組(雷公藤內(nèi)酯三醇50、100、150、200μg/mL劑量組)分別加入1mL相應濃度藥液，而空白對照組直接加2mL培養(yǎng)基；分別用Western blot、IFC、qPCR、ELISA等方法檢測不同處理組炎癥相關蛋白、基因、細胞因子的表達水平。足細胞裂孔膜蛋白Podocin和凋亡相關基因Bax的表達，利用標記了FITC的AnnexinⅤ和Propidium iodide(PI)對細胞進行雙染并進行流式細胞儀檢測，以此將凋亡早期的細胞和晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來，結果見圖9、圖10、圖11。

如圖9-11所示，足細胞受到損傷后，發(fā)生凋亡、自噬、壞死，導致其數(shù)目減少，最終產(chǎn)生蛋白尿，影響腎功能。由結果可知全分化的足細胞利用0.8μg/mL的ADM造成凋亡細胞模型，再給予雷公藤內(nèi)酯三醇處理后，細胞的凋亡情況有所改善，這提示，雷公藤內(nèi)酯三醇具有保護足細胞損傷的作用，可用于臨床足細胞病的治療。由實驗結果可知：雷公藤內(nèi)酯三醇具有保護足細胞凋亡的作用，但在高濃度時有上升趨勢。

5動物實驗

5.1采用阿霉素(ADR)誘導大鼠腎病綜合癥疾病動物模型的構建

雄性健康的SD大鼠100只，飼養(yǎng)7天后，隨機抽取8只作為空白對照組，余下大鼠在非麻醉條件下一次性尾靜脈按5.0mg/kg大鼠注射阿霉素誘導阿霉素腎病綜合征動物模型。

分組：在注射阿霉素3周后，對100只大鼠進行24小時尿蛋白排泄量的測定。通過與空白組(注射等量生理鹽水)比較，確定建模成功的大鼠。選擇24小時尿蛋白排泄量在70-180mg之間的大鼠按尿蛋白排泄量隨機平均分成模型組、雷公藤多苷組、雷公藤新多苷Ⅰ組、雷公藤新多苷Ⅱ組及雷公藤新多苷Ⅲ組。含量配比結果同表2

表2雷公藤多苷與雷公藤新多苷中二者的含量(n＝3)

5.2給藥劑量的選取

藥物的制備:取雷公藤多苷0.4g，先加5mL無水乙醇溶解藥物，再將無水乙醇溶液緩慢滴加到羧甲基纖維素鈉溶液中并定容至423mL，邊加邊按順時針方向搖勻，再超聲混勻。雷公藤新多苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的藥物配制方法同雷公藤多苷,濃度均為0.95g/L。

各組于造模成功次日起，每日灌胃，空白組與模型組給予生理鹽水；雷公藤多苷組給予雷公藤多苷(0.95g/L)；雷公藤新多苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(0.95g/L)組分別給予雷公藤新多苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，連續(xù)給藥8周。每只大鼠的灌胃劑量均為1mL/(100g大鼠)

5.3觀察指標的檢測

動物情況：各組大鼠每周稱重2次，并觀察大鼠的精神狀態(tài)、體毛、浮腫、活動情況等。

尿蛋白含量的測定：各組大鼠于造模前，造模第3周及給藥后第2、4、6、8周單獨置于代謝籠中，收集24小時尿液，記錄尿量，并采用考馬斯亮藍法測定尿蛋白濃度，計算24小時尿蛋白排泄量，結果見表3、表4、圖12。

表3給藥前各組大鼠24小時尿蛋白的排泄量(mg，n＝8，)

與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01

表4給藥后各組大鼠24小時尿蛋白的排泄量(mg，n＝8，)

與空白組比較，＊P<0.05，＊＊P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

由實驗結果(表3、表4、圖12)可知：在整個試驗過程中，空白組大鼠精神狀態(tài)良好，體毛有光澤，活動、飲食正常，尿量正常。大鼠造模2周后，造模大鼠均出現(xiàn)飲水減少，尿量減少，部分大鼠還有爛尾現(xiàn)象。給藥后，模型組大鼠始終躁動不安，體毛凌亂，尿量減少，消瘦。與模型組相比，給藥各組上述表現(xiàn)有所改善。

由實驗結果可知：經(jīng)SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析，各時間點的數(shù)據(jù)都符合正態(tài)分布。造模前，各組大鼠尿蛋白排泄量無明顯差別。造模第3周，各造模組大鼠尿蛋白排泄量與空白組相比，都具有顯著性的差異(P<0.01)，提示造模成功。在治療過程中，各治療組大鼠尿蛋白排泄量均有不同程度的減少。給藥結束后，與模型組相比，雷公藤多苷組與新多苷Ⅱ組尿蛋白排泄量有顯著性減少(P<0.05)。而雷公藤多苷組與新多苷Ⅱ組之間尿蛋白排泄量無顯著性差別。

血液生化指標的檢測：在實驗第8周結束時，采用腹主動脈取血的方式取大鼠血清，用全自動生化分析儀測定血清中總蛋白、白蛋白、尿素氮、肌酐、總膽固醇、甘油三酯等血液生化指標，結果見表5、圖13、圖14。

表5各組大鼠血液生化指標的測定結果(n＝8，)

與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

由實驗結果可知：經(jīng)SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析，各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。實驗結果顯示：1)各組大鼠總蛋白水平無顯著性差異。模型組大鼠白蛋白水平顯著降低，與空白組相比，具有顯著性差異(P<0.01)；與模型組相比，新多苷Ⅱ組白蛋白含量顯著提高，具有顯著性差異(P<0.01)。2)各組大鼠血清尿素氮、肌酐水平均無顯著性差異。3)總膽固醇水平：模型組大鼠總膽固醇水平顯著升高，與空白組相比，具有顯著性差異(P<0.01)；與模型組相比，新多苷Ⅱ組總膽固醇水平顯著降低，具有顯著性差異(P<0.05)。4)甘油三酯水平：與空白組相比，模型組大鼠甘油三酯水平有顯著性的升高(P<0.01)；與模型組相比，多苷組、新多苷Ⅱ、Ⅲ組總膽固醇水平均有顯著性降低(P<0.05或P<0.01)。

組織病理學檢查：腹主動脈取血后，摘取大鼠的腎臟，用10％的福爾馬林溶液固定，石蠟包埋并切片，HE染色，進行病理學檢查。結果見圖15。由結果可知：光鏡下顯示：空白組腎小球、腎小管及腎間質(zhì)未見明顯異常。模型組可見系膜細胞和基質(zhì)增生，腎間質(zhì)纖維化，部分腎小管上皮細胞可見顆粒變性，有的腎小球出現(xiàn)萎縮。各治療組的腎臟病理情況較模型組有所改善。

綜上所述：NS大鼠由于腎小球的屏障功能受損，致使大量白蛋白滲漏到尿液中，形成大量蛋白尿。因此，對于NS疾病的治療，一個重要的指標就是降低NS大鼠的尿蛋白排泄量。而當腎小球損傷嚴重出現(xiàn)腎小球硬化的時候，尿蛋白的排泄量也可能顯著降低，從而出現(xiàn)假陽性的結果。因此，判斷藥物對NS疾病的療效，除了觀察尿蛋白的排泄量之外，還應結合血肌酐、尿素氮的水平以及腎臟的病理學檢查結果進行綜合評價。本實驗結果表明：雷公藤新多苷Ⅱ能顯著降低NS大鼠24h尿蛋白的排泄量，且肌酐、尿素氮水平并無異常，新多苷Ⅱ組大鼠腎臟病理切片中也未見明顯的腎小球硬化等病理變化。由此可知，雷公藤新多苷Ⅱ對NS大鼠具有顯著地治療作用。藥效學結果表明：給大鼠一次性尾靜脈注射5mg/kg的阿霉素可成功的建立NS動物模型。從藥物的干預情況可以看出，雷公藤多苷與雷公藤新多苷Ⅱ對NS大鼠具有顯著地治療作用，二者藥效相似，但雷公藤新多苷Ⅱ起效更快。本實驗中獲得的雷公藤新多苷Ⅱ達到了減毒持效新工藝研究中持效的目的。由此，為本發(fā)明的雷公藤的新多苷在制備治療腎病綜合征、原發(fā)性腎小球腎病、紫瘢性及狼瘡性腎炎、類風濕性關節(jié)炎、紅斑狼瘡、亞急性及慢性重癥肝炎、慢性活動性肝炎；過敏性皮膚脈管炎、皮炎、濕疹、銀屑病性關節(jié)炎、強直性脊柱炎藥物中的應用提供了基礎，并證實了其可行性。

以上所述的僅是本發(fā)明的一些實施方式。對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。