技術(shù)領(lǐng)域：
本公開涉及具有降低的聚集的改良免疫球蛋白。
背景技術(shù)：
：了解和控制蛋白質(zhì)穩(wěn)定性已成為生物學(xué)家、化學(xué)家和工程師渴望的努力。氨基酸取代和疾病之間的第一個(gè)聯(lián)系(Ingram.Nature.1957,180(4581):326-8.)提供了健康和疾病中對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的新的和重要的看法?；诘鞍踪|(zhì)的藥物——尤其基于免疫球蛋白的藥物——的近來巨大增長已產(chǎn)生了新的挑戰(zhàn)。將治療用蛋白質(zhì)以非常高的濃度在液體中貯藏幾個(gè)月。非單體種類的百分比隨著時(shí)間增加。隨著聚集體形成，不但產(chǎn)品的效力降低，而且副作用諸如對(duì)給藥的免疫應(yīng)答可能發(fā)生。保證蛋白質(zhì)藥物的穩(wěn)定性對(duì)于產(chǎn)品的貯存期限是必要的。由于抗體在各種疾病治愈中的潛能，抗體目前構(gòu)成人類治療學(xué)中增長最快速的種類(Carter.NatureReviewsImmunology.2006,6(5),343)。自從2001年，抗體市場(chǎng)一直在以35％的平均年增長率——所有種類生物技術(shù)藥物之中最高的速率——增長(S.Aggarwal.Nature.BioTech.2007,25(10)1097)。如疾病治療所需要的，治療用免疫球蛋白以高濃度在水溶液中制備和貯藏。然而，這些免疫球蛋白在這些條件下在熱力學(xué)上是不穩(wěn)定的，并由于聚集而降解。這種聚集進(jìn)而導(dǎo)致抗體活性的降低，使藥物無效，甚至能產(chǎn)生免疫應(yīng)答。因此，存在迫切的需要來產(chǎn)生較少傾向于聚集的治療用免疫球蛋白。許多現(xiàn)存的用于防止免疫球蛋白聚集的方法采用蛋白制劑中添加劑的使用。這與本文描述的直接方法不同，在該直接方法中免疫球蛋白本身基于從分子模擬預(yù)測(cè)的易聚集區(qū)域被修飾。在抗體穩(wěn)定中通常使用的添加劑是含氮堿基的鹽諸如精氨酸、胍或咪唑(EP0025275)的鹽。用于穩(wěn)定的其它合適的添加劑是聚醚(EPA0018609)、甘油、白蛋白和硫酸葡聚糖(美國專利號(hào)4808705)、去垢劑和表面活性劑諸如基于聚山梨酯的表面活性劑(公布文本DA2652636和公布文本GB2175906(英國專利申請(qǐng)?zhí)朑B8514349))、蛋白伴侶諸如GroEL(Mendoza.Biotechnol.Tech.1991,(10)535-540)、檸檬酸鹽緩沖劑(WO9322335)或螯合劑(WO9115509)。盡管這些添加劑在一定程度上使蛋白在溶液中變得穩(wěn)定，但是它們?cè)馐艿侥承┤秉c(diǎn)諸如用于添加劑去除的另外處理步驟的必要性。已經(jīng)產(chǎn)生了最佳免疫球蛋白變體以提高其它特性諸如Fc受體的結(jié)合。舉例來說，產(chǎn)生了260種抗體變體的屬(包括L234和L235突變種類)并測(cè)試其對(duì)FcγRIIIa和FcγRIIb的結(jié)合的影響，如美國專利公布號(hào)2004/0132101(Lazaretal.)中所公開。然而，Lazaretal.沒有測(cè)試任何抗體變體的聚集傾向。因此，需要改良免疫球蛋白組合物，諸如抗體治療，其為直接穩(wěn)定的，不需要添加劑的使用。概述本文描述的是顯示降低的聚集和/或增加的穩(wěn)定性的改良免疫球蛋白，其滿足了該需要。因此，一方面包括具有降低的聚集傾向的修飾和/或分離的免疫球蛋白，其包括在免疫球蛋白的保守區(qū)域中的殘基上的至少一個(gè)降低聚集的突變，所述殘基(i)具有至少0.15的空間聚集傾向(半徑球)，或者(ii)具有大于0.0的空間聚集傾向(半徑球)并且在具有至少0.15的空間聚集傾向(半徑球)的殘基的之內(nèi)，其中所述至少一個(gè)降低聚集的突變是用相比未突變的免疫球蛋白降低該殘基的空間聚集傾向(半徑球)的氨基酸殘基的取代，并且被降低的聚集傾向是濃縮的液體溶液中免疫球蛋白分子之間的聚集。在某些實(shí)施方式中，所述至少一個(gè)降低聚集的突變基于與IgG1序列的比對(duì)不在與IgG1中Kabat殘基234(鉸鏈)或235(鉸鏈)對(duì)應(yīng)的殘基上。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白在這樣的殘基上具有第二降低聚集的突變，所述殘基(i)具有至少0.15的空間聚集傾向(半徑球)，或者(ii)具有大于0.0的空間聚集傾向(半徑球)并且在具有至少0.15的空間聚集傾向(半徑球)的殘基的之內(nèi)，其中所述第二降低聚集的突變是用氨基酸殘基的取代，其是用相比未突變的免疫球蛋白降低該殘基的空間聚集傾向(半徑球)的氨基酸殘基的取代。在可與具有第二降低聚集的突變的前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變和第二降低聚集的突變相隔至少至少至少或至少在可與具有第二降低聚集的突變的前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變和第二降低聚集的突變?cè)诓煌木奂ｓw里。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變是用疏水性比未修飾的免疫球蛋白中的殘基小的氨基酸殘基的取代。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變是用選自賴氨酸、精氨酸、組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺的氨基酸殘基的取代。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變是用選自賴氨酸、精氨酸和組氨酸的氨基酸殘基的的取代。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變是用賴氨酸殘基的取代。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，空間聚集傾向(半徑球)是利用經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化以使甘氨酸等于0的BlackMould疏水性標(biāo)度計(jì)算的。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白是IgG1。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有人CH1結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有人CH2結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有人CH3結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有人CL結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有對(duì)靶抗原的結(jié)合親合力并且對(duì)靶抗原的結(jié)合親合力是未突變的免疫球蛋白對(duì)靶抗原的結(jié)合親合力的至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、或至少105％。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，濃縮的液體溶液濃度為至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。另一方面包括具有降低的聚集傾向的修飾或分離的免疫球蛋白，其包括在這樣的殘基上的至少一個(gè)降低聚集的突變，所述殘基選自來自聚集模體1：174(CH1)、175(CH1)和181(CH1)；聚集模體2：226(鉸鏈)、227(鉸鏈)、228(鉸鏈)、229(鉸鏈)、230(鉸鏈)、231(鉸鏈)和232(鉸鏈)；聚集模體3：234(鉸鏈)和235(鉸鏈)；聚集模體4：252(CH2)和253(CH2)；聚集模體5：282(CH2)；聚集模體6：291(CH2)；聚集模體7：296(CH2)；聚集模體8：308(CH2)和309(CH2)；聚集模體9：328(CH2)、329(CH2)、330(CH2)和331(CH2)；聚集模體10：395(CH3)、396(CH3)、397(CH3)、398(CH3)和404(CH3)；聚集模體11：443(CH3)；聚集模體12：110(CL)和111(CL)；聚集模體13：153(CL)和154(CL)；以及聚集模體14：201(CL)的殘基，其中所述至少一個(gè)降低聚集的突變是用疏水性比未修飾的免疫球蛋白中的殘基小的氨基酸殘基的取代并且被降低的聚集傾向是濃縮的液體溶液中免疫球蛋白分子之間的聚集；并且其中殘基編號(hào)基于與IgG1序列的比對(duì)是IgG1中相應(yīng)的Kabat殘基編號(hào)。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)降低聚集的突變殘基選自來自聚集模體1：175(CH1)；聚集模體2：227(鉸鏈)、228(鉸鏈)和230(鉸鏈)；聚集模體3：234(鉸鏈)和235(鉸鏈)；聚集模體4：253(CH2)；聚集模體5：282(CH2)；聚集模體6：291(CH2)；聚集模體7：296(CH2)；聚集模體8：309(CH2)；聚集模體9：329(CH2)和330(CH2)；聚集模體10：395(CH3)和398(CH3)；聚集模體11：443(CH3)；聚集模體12：110(CL)；聚集模體13：154(CL)；和聚集模體14：201(CL)的殘基。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變不是殘基234(鉸鏈)或235(鉸鏈)。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變殘基是234(鉸鏈)、235(鉸鏈)、253(CH2)或309(CH2)。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變殘基是253(CH2)或309(CH2)。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有在疏水性殘基上的第二降低聚集的突變，所述疏水性殘基(i)具有至少0.15的空間聚集傾向，或者(ii)在具有至少0.15的空間聚集傾向的殘基的之內(nèi)，其中至少一個(gè)降低聚集的突變是用疏水性比未修飾的免疫球蛋白中的殘基小的氨基酸殘基的取代。在可與具有第二降低聚集的突變的前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變和第二降低聚集的突變相隔至少至少至少或至少在可與任何一種具有第二降低聚集的突變的前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變和第二降低聚集的突變?cè)诓煌木奂ｓw里。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有至少十四個(gè)降低聚集的突變，其中每個(gè)降低聚集的突變選自不同的聚集模體。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變是用選自賴氨酸、精氨酸、組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺的氨基酸殘基的取代。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變是用選自賴氨酸、精氨酸和組氨酸的氨基酸殘基的取代。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變是用賴氨酸殘基的取代。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，空間聚集傾向(半徑球)是利用經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化以使甘氨酸等于0的BlackMould疏水性標(biāo)度計(jì)算的。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白包括IgG1。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有人CH1結(jié)構(gòu)域。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有人CH2結(jié)構(gòu)域。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有人CH3結(jié)構(gòu)域。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有人CL結(jié)構(gòu)域。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有對(duì)靶抗原的結(jié)合親合力并且對(duì)靶抗原的結(jié)合親合力是未突變的免疫球蛋白對(duì)靶抗原的結(jié)合親合力的至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、或至少105％。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，濃縮的液體溶液濃度為至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。另一方面包括修飾的免疫球蛋白制劑，其可由濃度為至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml的前述方面中任一個(gè)和前述實(shí)施方式的任一組合和所有組合的免疫球蛋白構(gòu)成的。在某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白濃度大于相同條件下未突變的免疫球蛋白在濃縮的液體溶液中與自身聚集時(shí)的濃度。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，修飾的免疫球蛋白至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％是未聚集的單體。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，制劑包括藥學(xué)上可接受的賦形劑。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白制劑與相同條件下的未突變的免疫球蛋白相比在24小時(shí)加速聚集之后顯示少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、或至少50％的聚集體。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，聚集通過SEC-HPLC進(jìn)行測(cè)量。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白制劑基本上不含任何降低免疫球蛋白聚集的添加劑。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白制劑基本上不含游離的組氨酸、糖類和多元醇。又一方面包括分離的或重組的多核苷酸，其編碼前述修飾的免疫球蛋白方面的任何一個(gè)和前述實(shí)施方式的任意和所有組合的免疫球蛋白。在某些實(shí)施方式中，多核苷酸在載體中。在某些實(shí)施方式中，載體是表達(dá)載體。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子可操作地連接到多核苷酸上。另一方面包括具有前述實(shí)施方式中任何一種的載體的宿主細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞能表達(dá)通過多核苷酸編碼的免疫球蛋白。另一方面包括產(chǎn)生具有降低的聚集傾向的免疫球蛋白的方法，所述方法包括提供包含前述方面的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基和將培養(yǎng)基置于免疫球蛋白被表達(dá)的條件下。在某些實(shí)施方式中，方法包括分離表達(dá)的免疫球蛋白的另外步驟。另一方面包括降低高濃藥物制劑中免疫球蛋白的聚集傾向的方法，所述方法包括提供易于聚集的免疫球蛋白；用降低空間聚集傾向(半徑球)的氨基酸殘基取代免疫球蛋白的保守結(jié)構(gòu)域中的殘基——其(i)具有至少0.15的空間聚集傾向(半徑球)，或者(ii)具有大于0.0的空間聚集傾向(半徑球)并且在具有至少0.15的空間聚集傾向的殘基的之內(nèi)；和產(chǎn)生修飾的免疫球蛋白的高濃液體制劑，其中所述修飾的免疫球蛋白濃度為至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml，并且其中降低的聚集傾向是濃縮的液體溶液中免疫球蛋白分子之間的聚集。另一方面包括前述修飾的免疫球蛋白方面的任一個(gè)和前述實(shí)施方式的任意和所有組合在包含高濃液體制劑的藥物的制備中的用途，其中所述修飾的免疫球蛋白濃度為至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。在某些實(shí)施方式中，該藥物的用途是用于治療自身免疫疾病、免疫學(xué)疾病、傳染病、炎性疾病、神經(jīng)學(xué)疾病以及包括癌癥在內(nèi)的腫瘤學(xué)和瘤性疾病。在某些實(shí)施方式中，該藥物的用途是用于治療充血性心力衰竭(CHF)、血管炎、紅斑痤瘡、痤瘡、濕疹、心肌炎和心肌的其他病癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、脊椎病、滑液成纖維細(xì)胞和骨髓基質(zhì)；骨丟失；佩吉特病、破骨細(xì)胞瘤；乳腺癌；廢用性骨量減少、營養(yǎng)不良、牙周病、高歇病、朗格罕細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥、脊髓損傷、急性膿毒性關(guān)節(jié)炎、骨軟化癥、庫興綜合征、單骨纖維性骨發(fā)育不良、多骨纖維性骨發(fā)育不良、牙周重建和骨折；肉樣瘤??；溶骨性骨癌、乳腺癌、肺癌、腎癌和直腸癌；骨轉(zhuǎn)移、骨痛處理、和體液惡性高鈣血癥、強(qiáng)直性脊柱炎和其他脊椎關(guān)節(jié)病；移植排斥、病毒性感染、血液學(xué)瘤形成和瘤樣病癥，例如，何杰金淋巴瘤；非何杰金淋巴瘤(伯基特淋巴瘤、小淋巴細(xì)胞淋巴瘤/慢性淋巴細(xì)胞白血病、蕈樣霉菌病、套細(xì)胞淋巴瘤、巨濾泡性淋巴瘤、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、邊緣區(qū)淋巴瘤、毛細(xì)胞白血病和淋巴漿細(xì)胞性白血病)、淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞的腫瘤，其包括B細(xì)胞急性成淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤、和T細(xì)胞急性成淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤、胸腺瘤、成熟T和NK細(xì)胞的腫瘤，其包括周邊T細(xì)胞白血病、成人T細(xì)胞白血病/T細(xì)胞淋巴瘤和大粒狀淋巴細(xì)胞白血病、朗格罕細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥、骨髓瘤形成諸如急性骨髓性白血病，包括成熟的AML、沒有分化的AML、急性早幼粒細(xì)胞白血病、急性骨髓單核細(xì)胞性白血病和急性單核細(xì)胞性白血病、骨髓增生異常綜合征和慢性骨髓增生疾病，包括慢性骨髓性白血病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，例如，腦瘤(神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、室管膜瘤和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤)、實(shí)體瘤(鼻咽癌、基底細(xì)胞癌、胰腺癌、膽管癌、卡波西肉瘤、睪丸癌、子宮癌、陰道癌或?qū)m頸癌、卵巢癌、原發(fā)性肝癌或子宮內(nèi)膜癌、和血管系統(tǒng)的腫瘤(血管肉瘤和血管外皮細(xì)胞瘤)、骨質(zhì)疏松癥、肝炎、HIV、AIDS、(脊)椎關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病(IBD)、膿毒病和敗血癥性休克、克羅恩病、牛皮癬、硬皮病(schleraderma)、移植物抗宿主病(GVHD)、異源胰島移植物排斥、血液學(xué)惡性腫瘤，諸如多發(fā)性骨髓瘤(MM)、骨髓增生異常綜合征(MDS)和急性骨髓性白血病(AML)、與腫瘤相關(guān)的炎癥、周圍神經(jīng)損傷或脫髓鞘病。在某些實(shí)施方式中，該藥物的用途是用于治療菌斑牛皮癬、潰瘍性大腸炎、非何杰金淋巴瘤、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、黃斑變性、呼吸道合胞病毒、克羅恩病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、骨質(zhì)疏松癥、治療誘導(dǎo)的骨丟失、骨轉(zhuǎn)移、多發(fā)性骨髓瘤、阿爾茨海默病、青光眼和多發(fā)性硬化癥。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，該藥物的用途進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的賦形劑。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，該藥物中的免疫球蛋白與相同條件下的未突變的免疫球蛋白相比在24小時(shí)加速聚集之后顯示少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、或至少50％的聚集體。在某些實(shí)施方式中，聚集通過SEC-HPLC進(jìn)行測(cè)量。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，該藥物基本上不含任何降低免疫球蛋白聚集的添加劑。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，該藥物基本上不含游離的組氨酸、糖類和多元醇。另一方面包括前述修飾的免疫球蛋白方面的任一個(gè)和前述實(shí)施方式的任意和所有組合作為非聚集的藥物活性成分的用途。另一方面包括藥物組合物，其包括前述方面中任一個(gè)和前述實(shí)施方式的任意和所有組合的免疫球蛋白以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。在某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白濃度為至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。在某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白濃度大于相同條件下未突變的免疫球蛋白在濃縮的液體溶液中與自身聚集時(shí)的濃度。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，修飾的免疫球蛋白至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％是未聚集的單體。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白制劑與相同條件下的未突變的免疫球蛋白相比在24小時(shí)加速聚集之后顯示少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、或至少50％的聚集體。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，聚集通過SEC-HPLC進(jìn)行測(cè)量。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白制劑基本上不含任何降低免疫球蛋白聚集的添加劑。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白制劑基本上不含游離的組氨酸、糖類和多元醇。另一方面包括具有降低的聚集傾向的修飾或分離的免疫球蛋白，其包括在選自235(鉸鏈)、241(CH2)、243(CH2)、282(CH2)和309(CH2)的殘基上的至少一個(gè)降低聚集的突變，其中如果殘基235被選擇，它被突變成谷氨酸或絲氨酸，如果殘基282被選擇，它被突變成賴氨酸，以及如果殘基309被選擇，它被突變成賴氨酸，并且其中至少一個(gè)降低聚集的突變是用疏水性比未修飾的免疫球蛋白中的殘基小的氨基酸殘基的取代，并且被降低的聚集傾向是濃縮的液體溶液中免疫球蛋白分子之間的聚集；并且其中殘基編號(hào)基于與IgG1序列的比對(duì)是IgG1中相應(yīng)的Kabat殘基編號(hào)。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)降低聚集的突變是殘基241向絲氨酸的突變，并且修飾或分離的免疫球蛋白進(jìn)一步包括殘基243向絲氨酸的第二降低聚集的突變。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)降低聚集的突變是殘基241向酪氨酸的突變，并且修飾或分離的免疫球蛋白進(jìn)一步包括殘基243向酪氨酸的第二降低聚集的突變。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)降低聚集的突變是殘基282向賴氨酸的突變，并且修飾或分離的免疫球蛋白進(jìn)一步包括第二和第三降低聚集的突變，其中第二降低聚集的突變是殘基235向賴氨酸的突變并且第三降低聚集的突變是殘基309向賴氨酸的突變。在某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有在疏水性殘基上的第二降低聚集的突變，其中至少一個(gè)降低聚集的突變是用疏水性比未修飾的免疫球蛋白中的殘基小的氨基酸殘基的取代。在可與具有第二降低聚集的突變的前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，第二降低聚集的突變(i)具有至少0.15的空間聚集傾向，或者(ii)在具有至少0.15的空間聚集傾向的殘基的之內(nèi)。在可與具有第二降低聚集的突變的前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有第三降低聚集的突變，其(i)具有至少0.15的空間聚集傾向，或者(ii)在具有至少0.15的空間聚集傾向的殘基的之內(nèi)，其中第三降低聚集的突變是用疏水性比未修飾的免疫球蛋白中的殘基小的氨基酸殘基的取代。在可與具有第二降低聚集的突變的前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變和第二降低聚集的突變相隔至少至少至少或至少在可與任何一種具有第二降低聚集的突變的前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變和第二降低聚集的突變?cè)诓煌木奂ｓw里。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有至少十四個(gè)降低聚集的突變，其中每個(gè)降低聚集的突變選自不同的聚集模體。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變是用選自賴氨酸、精氨酸、組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、酪氨酸和絲氨酸的氨基酸殘基的取代。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變是用選自賴氨酸、絲氨酸、谷氨酸和酪氨酸的氨基酸殘基的取代。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，空間聚集傾向(半徑球)是利用經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化以使甘氨酸等于0的BlackMould疏水性標(biāo)度計(jì)算的。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白包括IgG1。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有人CH1結(jié)構(gòu)域。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有人CH2結(jié)構(gòu)域。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有人CH3結(jié)構(gòu)域。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有人CL結(jié)構(gòu)域。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有對(duì)靶抗原的結(jié)合親合力并且對(duì)靶抗原的結(jié)合親合力是未突變的免疫球蛋白對(duì)靶抗原的結(jié)合親合力的至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、或至少105％。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，濃縮的液體溶液濃度為至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。另一方面包括修飾的免疫球蛋白制劑，其可由濃度為至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml的前述方面中任一個(gè)和前述實(shí)施方式的任意和所有組合的免疫球蛋白構(gòu)成。在某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白濃度大于相同條件下未突變的免疫球蛋白在濃縮的液體溶液中與自身聚集時(shí)的濃度。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，修飾的免疫球蛋白至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％是未聚集的單體。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，制劑包括藥學(xué)上可接受的賦形劑。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白制劑與相同條件下的未突變的免疫球蛋白相比在24小時(shí)加速聚集之后顯示至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、或至少50％較少的聚集體。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，聚集通過SEC-HPLC進(jìn)行測(cè)量。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白制劑基本上不含任何降低免疫球蛋白聚集的添加劑。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白制劑基本上不含游離的組氨酸、糖類和多元醇。又一方面包括分離的或重組的多核苷酸，其編碼前述修飾的免疫球蛋白方面的任一個(gè)和前述實(shí)施方式的任意和所有組合的免疫球蛋白。在某些實(shí)施方式中，多核苷酸在載體中。在某些實(shí)施方式中，載體是表達(dá)載體。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子可操作地連接到多核苷酸上。另一方面包括具有前述實(shí)施方式中任何一種的載體的宿主細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞能表達(dá)通過多核苷酸編碼的免疫球蛋白。另一方面包括產(chǎn)生具有降低的聚集傾向的免疫球蛋白的方法，所述方法包括提供包含前述方面的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基和將培養(yǎng)基置于免疫球蛋白被表達(dá)的條件下。在某些實(shí)施方式中，方法包括分離表達(dá)的免疫球蛋白的另外步驟。另一方面包括前述修飾的免疫球蛋白方面的任一個(gè)和前述實(shí)施方式的任意和所有組合在包含高濃液體制劑的藥物的制備中的用途，其中所述修飾的免疫球蛋白濃度為至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。在某些實(shí)施方式中，該藥物的用途是用于治療自身免疫疾病、免疫學(xué)疾病、傳染病、炎性疾病、神經(jīng)學(xué)疾病以及包括癌癥在內(nèi)的腫瘤學(xué)和瘤性疾病。在某些實(shí)施方式中，該藥物的用途是用于治療充血性心力衰竭(CHF)、血管炎、紅斑痤瘡、痤瘡、濕疹、心肌炎和心肌的其他病癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、脊椎病、滑液成纖維細(xì)胞、和骨髓基質(zhì)；骨丟失；佩吉特病、破骨細(xì)胞瘤；乳腺癌；廢用性骨量減少、營養(yǎng)不良、牙周病、高歇病、朗格罕細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥、脊髓損傷、急性膿毒性關(guān)節(jié)炎、骨軟化癥、庫興綜合征、單骨纖維性骨發(fā)育不良、多骨纖維性骨發(fā)育不良、牙周重建和骨折；肉樣瘤??；溶骨性骨癌、乳腺癌、肺癌、腎癌和直腸癌；骨轉(zhuǎn)移、骨痛處理、和體液惡性高鈣血癥、強(qiáng)直性脊柱炎和其他脊椎關(guān)節(jié)?。灰浦才懦?、病毒性感染、血液學(xué)瘤形成和瘤樣病癥，例如，何杰金淋巴瘤；非何杰金淋巴瘤(伯基特淋巴瘤、小淋巴細(xì)胞淋巴瘤/慢性淋巴細(xì)胞白血病、蕈樣霉菌病、套細(xì)胞淋巴瘤、巨濾泡性淋巴瘤、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、邊緣區(qū)淋巴瘤、毛細(xì)胞白血病和淋巴漿細(xì)胞性白血病)、淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞的腫瘤，其包括B細(xì)胞急性成淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤、和T細(xì)胞急性成淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤、胸腺瘤、成熟T和NK細(xì)胞的腫瘤，其包括周邊T細(xì)胞白血病、成人T細(xì)胞白血病/T細(xì)胞淋巴瘤和大粒狀淋巴細(xì)胞白血病、朗格罕細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥、骨髓瘤形成諸如急性骨髓性白血病，包括成熟的AML、沒有分化的AML、急性早幼粒細(xì)胞白血病、急性骨髓單核細(xì)胞性白血病和急性單核細(xì)胞性白血病、骨髓增生異常綜合征和慢性骨髓增生疾病，包括慢性骨髓性白血病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，例如，腦瘤(神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、室管膜瘤和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤)、實(shí)體瘤(鼻咽癌、基底細(xì)胞癌、胰腺癌、膽管癌、卡波西肉瘤、睪丸癌、子宮癌、陰道癌或?qū)m頸癌、卵巢癌、原發(fā)性肝癌或子宮內(nèi)膜癌、和血管系統(tǒng)的腫瘤(血管肉瘤和血管外皮細(xì)胞瘤)、骨質(zhì)疏松癥、肝炎、HIV、AIDS、(脊)椎關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病(IBD)、膿毒病和敗血癥性休克、克羅恩病、牛皮癬、硬皮病、移植物抗宿主病(GVHD)、異源胰島移植物排斥、血液學(xué)惡性腫瘤，諸如多發(fā)性骨髓瘤(MM)、骨髓增生異常綜合征(MDS)和急性骨髓性白血病(AML)、與腫瘤相關(guān)的炎癥、周圍神經(jīng)損傷或脫髓鞘病。在某些實(shí)施方式中，該藥物的用途是用于治療菌斑牛皮癬、潰瘍性大腸炎、非何杰金淋巴瘤、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、黃斑變性、呼吸道合胞病毒、克羅恩病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、骨質(zhì)疏松癥、治療誘導(dǎo)的骨丟失、骨轉(zhuǎn)移、多發(fā)性骨髓瘤、阿爾茨海默病、青光眼和多發(fā)性硬化癥。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，該藥物的用途進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的賦形劑。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，該藥物中的免疫球蛋白與相同條件下的未突變的免疫球蛋白相比在24小時(shí)加速聚集之后顯示少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少50％的聚集體。在某些實(shí)施方式中，聚集通過SEC-HPLC進(jìn)行測(cè)量。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，該藥物基本上不含任何降低免疫球蛋白聚集的添加劑。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，該藥物基本上不含游離的組氨酸、糖類和多元醇。另一方面包括前述修飾的免疫球蛋白方面的任一個(gè)和前述實(shí)施方式的任意和所有組合作為非聚集的藥物活性成分的用途。另一方面包括藥物組合物，其包括前述方面中任一個(gè)和前述實(shí)施方式的任意和所有組合的免疫球蛋白以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。在某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白濃度為至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。在某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白濃度大于相同條件下未突變的免疫球蛋白在濃縮的液體溶液中與自身聚集時(shí)的濃度。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，修飾的免疫球蛋白至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％是未聚集的單體。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白制劑與相同條件下的未突變的免疫球蛋白相比在24小時(shí)加速聚集之后顯示少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、或至少50％少的聚集體。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，聚集通過SEC-HPLC進(jìn)行測(cè)量。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白制劑基本上不含任何降低免疫球蛋白聚集的添加劑。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白制劑基本上不含游離的組氨酸、糖類和多元醇。貫穿說明書可發(fā)現(xiàn)本發(fā)明另外的方面和實(shí)施方式。優(yōu)選實(shí)施方式的詳述本公開涉及改良免疫球蛋白，尤其是人抗體，其具有降低的聚集。在某些實(shí)施方式中，本公開的免疫球蛋白在該免疫球蛋白的重鏈或輕鏈的恒定區(qū)之內(nèi)的特定疏水性殘基上被修飾。本公開提供修飾的免疫球蛋白，制備這樣的免疫球蛋白的方法，包含這樣的免疫球蛋白的免疫連接物和多價(jià)或多特異性分子以及包含本公開的免疫球蛋白、免疫連接物或雙特異性分子的藥物組合物。定義本文所談及的術(shù)語“抗體”包括整個(gè)抗體和其任何抗原結(jié)合片段(即，“結(jié)合抗原部分”)或單鏈。天然存在的“抗體”是包含通過二硫鍵相互連接的至少兩個(gè)重鏈(H)和兩個(gè)輕鏈(L)的糖蛋白。每個(gè)重鏈由重鏈可變區(qū)(本文縮寫為VH)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個(gè)結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3組成。每個(gè)輕鏈由輕鏈可變區(qū)(本文縮寫為VL)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域CL組成。VH和VL區(qū)能被進(jìn)一步細(xì)分成稱作互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的高度可變區(qū)，散布著稱作框架區(qū)(FR)的更保守的區(qū)域。每個(gè)VH和VL由三個(gè)CDR和四個(gè)FR組成，以下面的順序從氨基末端至羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。抗體的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白對(duì)宿主組織或因子的結(jié)合，其包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(如，效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一成分(Clq)。如本文所用，術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡稱“抗原部分”)是指全長抗體或保留特異性結(jié)合抗原能力的抗體的一個(gè)或多個(gè)片段以及重鏈或輕鏈的恒定區(qū)的至少一部分。已經(jīng)顯示抗體結(jié)合抗原的功能可以通過全長抗體的片段執(zhí)行。在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”內(nèi)包含的結(jié)合片段的實(shí)例包括Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；F(ab)2片段，包括由鉸鏈區(qū)上的二硫鍵連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；Fd片段，由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成；和Fv片段，由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成。此外，盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，VL和VH，由分開的基因編碼，但是它們可采用重組方法通過合成連接體進(jìn)行連接，所述合成連接體能使它們形成單條蛋白鏈，其中VL和VH區(qū)域成對(duì)以形成單價(jià)分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見，例如Birdetal.,1988Science242:423-426；和Hustonetal.,1988Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883)。這種單鏈抗體也意欲包括在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”之內(nèi)。這些抗體片段利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的傳統(tǒng)技術(shù)獲得，并且抗體被篩選用于以與完整抗體相同的方式使用。如本文所用，“分離的”抗體或免疫球蛋白是指基本上不含其它成分的抗體或免疫球蛋白，其中這樣的抗體或免疫球蛋白是天然發(fā)現(xiàn)的。此外，分離的抗體或免疫球蛋白可基本上不含其它細(xì)胞物質(zhì)和/或化學(xué)品。如本文所用，術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體成分”是指單分子成分的抗體分子制備物。單克隆抗體成分一般顯示對(duì)特定表位的單一結(jié)合特異性和親和力。如本文所用，術(shù)語“人抗體”意欲包括具有可變區(qū)的抗體，其中框架和CDR區(qū)域來自人來源的序列。此外，如果抗體包含恒定區(qū)，恒定區(qū)也來自這樣的人序列，例如，人種系序列、或突變形式的人種系序列或抗體，其包含從人框架序列分析導(dǎo)出的共有框架序列，如Knappik,etal.(2000.JMolBiol296,57-86)中所述的。本公開的人抗體可包括不是由人序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外隨機(jī)或位點(diǎn)特異性誘變或者通過體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)。然而，如本文所用，術(shù)語“人抗體”沒有意欲包括這樣的抗體，其中來自另一哺乳動(dòng)物種類諸如小鼠的種系的CDR序列已經(jīng)被接枝到人框架序列。如本文所用，術(shù)語“人結(jié)構(gòu)域”意欲包括來自人來源的序列的免疫球蛋白恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，人來源的序列例如，人種系序列、或突變形式的人種系序列或抗體，其包含從人框架序列分析——如Knappik,etal.(2000.JMolBiol296,57-86)中所述的——導(dǎo)出的共有框架序列。如本文所用，術(shù)語“重組人抗體”包括通過重組方式制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的所有人抗體，諸如，從對(duì)于人免疫球蛋白基因來說是轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體的動(dòng)物(例如小鼠)或由其制備的雜種細(xì)胞分離的抗體，從轉(zhuǎn)化以表達(dá)人抗體的宿主細(xì)胞例如從轉(zhuǎn)染瘤分離的抗體，從重組組合人抗體文庫分離的抗體，以及通過涉及將人免疫球蛋白基因——序列——的全部或一部分拼接到其它DNA序列的任何其它方式制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。這樣的重組人抗體具有可變區(qū)，其中框架和CDR區(qū)域來自人種系免疫球蛋白序列。在某些實(shí)施方式中，然而，這樣的重組人抗體可經(jīng)歷體外誘變(或者，當(dāng)使用對(duì)人Ig序列是轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物時(shí)，體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，并且因此重組抗體的VH和VL區(qū)域的氨基酸序列是這樣的序列，其當(dāng)來自人種系VH和VL序列或涉及人種系VH和VL序列時(shí)，可不天然存在于體內(nèi)人抗體種系清單之內(nèi)。“嵌合抗體”是這樣的抗體分子，其中(a)恒定區(qū)或其部分被改變、替代或交換，從而抗原結(jié)合位點(diǎn)(可變區(qū))被連接到不同或改變的種類的恒定區(qū)、效應(yīng)功能和/或種類、或者授予嵌合抗體新特性的完全不同分子，例如，酶、毒素、激素、生長因子、藥物等；或者(b)可變區(qū)或其部分用具有不同或改變的抗原特異性的可變區(qū)改變、替代或交換。例如，小鼠抗體可通過用包含本文公開的修飾的人免疫球蛋白的恒定區(qū)替代其恒定區(qū)而進(jìn)行修飾。由于用人恒定區(qū)替代，嵌合抗體可保留其特異性同時(shí)相比原小鼠抗體或者沒有本文公開的修飾的嵌合抗體整體具有降低的人中抗原性和降低的聚集?！叭嗽椿笨贵w是保留非人抗體的反應(yīng)性同時(shí)具有較少的人中免疫原性的抗體。這可例如通過保留非人CDR區(qū)域并用其人對(duì)應(yīng)物替代抗體剩余部分(即恒定區(qū)以及可變區(qū)的框架部分)來實(shí)現(xiàn)。參見例如Morrisonetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855,1984；MorrisonandOi,Adv.Immunol.,44:65-92,1988；Verhoeyenetal.,Science,239:1534-1536,1988；Padlan,Molec.Immun.,28:489-498,1991；和Padlan,Molec.Immun.,31:169-217,1994。人工程化技術(shù)的其它實(shí)例包括但不限于US5,766,886中公開的Xoma技術(shù)。如本文所用，術(shù)語“人性化(Humaneering)”是指將非人抗體轉(zhuǎn)化成工程化人抗體的方法(參見例如KaloBios的HumaneeringTM技術(shù))。如本文所用，“同種型”是指由具有本文公開的易聚集模體(并且因此順從于本文公開的降低聚集的修飾)的重鏈恒定區(qū)基因提供的任何抗體種類(例如，IgM、IgE、IgG如IgG1或IgG2)。如本文所用，術(shù)語“親和力”是指在單個(gè)抗原位點(diǎn)抗體和抗原之間相互作用的強(qiáng)度。在每個(gè)抗原位點(diǎn)內(nèi)，抗體“臂”的可變區(qū)通過弱的非共價(jià)力與抗原在許多位點(diǎn)相互作用；相互作用越多，親和力越強(qiáng)。本文公開的修飾優(yōu)選地不降低本文公開的免疫球蛋白或抗體的親和力或者親和力被降低30％以下、20％以下、10％以下、或5％以下。如本文所用，當(dāng)測(cè)定本文公開的修飾是否降低親和力時(shí)，在具有該修飾的免疫球蛋白或抗體與缺乏該修飾但包括任何不相關(guān)突變的相同免疫球蛋白之間進(jìn)行比較。舉例來說，具有本文公開的L234K突變的人源化抗體將與具有除野生型L234之外完全相同序列的人源化抗體進(jìn)行比較。如本文所用，術(shù)語“對(duì)象(subject)”包括任何人或非人動(dòng)物。術(shù)語“非人動(dòng)物”包括所有脊椎動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物，諸如非人靈長類、羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲類、爬行類等。如本文所用，術(shù)語“優(yōu)化的”意指核苷酸序列已經(jīng)被改變以利用生產(chǎn)細(xì)胞或有機(jī)體中優(yōu)選的密碼子編碼氨基酸序列，生產(chǎn)細(xì)胞一般地為真核細(xì)胞，例如畢赤酵母(Pichia)細(xì)胞、中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)或人細(xì)胞。優(yōu)化的核苷酸序列被工程改造以完全或盡可能多地保留由開始核苷酸序列原始編碼的氨基酸序列，其也被稱為“親本”序列。本文也預(yù)期了這些序列在其它真核細(xì)胞中優(yōu)化的表達(dá)。由優(yōu)化的核苷酸序列編碼的氨基酸序列也被稱為被優(yōu)化的。術(shù)語“表位(epitope)”意指能特異性結(jié)合抗體的蛋白質(zhì)決定子。表位通常由分子諸如氨基酸或糖側(cè)鏈的化學(xué)活性表面小組組成并且通常具有特異性的三維結(jié)構(gòu)特性以及特異性的電荷特性。構(gòu)象和非構(gòu)象表位的區(qū)別在于與前者而不是后者的結(jié)合在變性溶劑的存在下被丟失。術(shù)語“保守修飾的變體(conservativelymodifiedvariant)”適用于氨基酸和核酸序列兩者。關(guān)于特定核酸序列，保守修飾的變體是指那些核酸，其編碼同一或基本同一的氨基酸序列，或者其中核酸不將氨基酸序列編碼成基本同一的序列。由于遺傳密碼的簡并性，大量功能相同的核酸編碼任何給定的蛋白質(zhì)。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密碼子規(guī)定的每個(gè)位置，密碼子可被改變成所述的相應(yīng)密碼子中任何一個(gè)而不改變所編碼的多肽。這種核酸變異是“沉默變異”，其是保守修飾的變異的一種。本文編碼多肽的每個(gè)核酸序列也描述該核酸的每個(gè)可能的沉默變異。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，核酸中的各個(gè)密碼子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密碼子，和TGG，其通常是色氨酸的唯一密碼子)都可被修飾以產(chǎn)生功能相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的各個(gè)沉默變異在各個(gè)所述序列中是隱式的。對(duì)于多肽序列，“保守修飾的變體”包括對(duì)于多肽序列的各個(gè)取代、缺失或添加，其導(dǎo)致氨基酸用化學(xué)上類似的氨基酸的取代。提供功能類似的氨基酸的保守取代表在本領(lǐng)域中是熟知的。這種保守修飾的變體是除本公開的多態(tài)變體、種間同系物和等位基因之外的，并且沒有排除本公開的多態(tài)變體、種間同系物和等位基因。下列八組包含互相為保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、絲氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(參見例如,Creighton,Proteins(1984))。在兩個(gè)或多個(gè)核酸或多肽序列的上下文，術(shù)語“同一的(identical)”或％“同一性(identity)”是指相同的兩個(gè)或多個(gè)序列或子序列。如采用下列序列比較算法之一或者通過手工比對(duì)和視覺觀察所測(cè)，當(dāng)在比較窗或指定區(qū)上比較和比對(duì)為最大對(duì)應(yīng)時(shí)，如果兩個(gè)序列具有指定百分?jǐn)?shù)的相同氨基酸殘基或核苷酸(即在指定區(qū)域，或者，當(dāng)未指定時(shí)，在整個(gè)序列上，60％同一性，任選地65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性)，兩個(gè)序列是“基本同一的”。任選地，在長度為至少大約50個(gè)核苷酸(或10個(gè)氨基酸)的區(qū)域上，或者更優(yōu)選地在長度為100至500或1000或更多個(gè)核苷酸(或20、50、200或更多個(gè)氨基酸)的區(qū)域上存在同一性。對(duì)于序列比較，一般地一個(gè)序列作為參考序列，測(cè)試序列與其比較。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，將測(cè)試和參考序列輸入計(jì)算機(jī)，指定子序列坐標(biāo)，如果必要的話，并且指定序列算法程序參數(shù)?？梢允褂媚J(rèn)程序參數(shù)，或者可以指定可選的參數(shù)。序列比較算法然后基于程序參數(shù)計(jì)算測(cè)試序列相對(duì)于參考序列的百分?jǐn)?shù)序列同一性。當(dāng)比較兩個(gè)序列的同一性時(shí)，序列沒有必要是鄰接的，但是任何空位將隨其攜帶一個(gè)將會(huì)降低整體百分?jǐn)?shù)同一性的罰分。對(duì)于blastn，默認(rèn)參數(shù)是空位開放罰分＝5和空位延伸罰分＝2。對(duì)于blastp，默認(rèn)參數(shù)是空位開放罰分＝11和空位延伸罰分＝1。如本文所用，“比較窗(comparisonwindow)”包括參考任意數(shù)目的鄰接位置的區(qū)段，其包括但不限于20至600個(gè)，通常約50至約200個(gè)，更通常地約100至約150個(gè)鄰接位置，其中可以將一個(gè)序列與相同數(shù)目的鄰接位置的參考序列在兩個(gè)序列最佳比對(duì)后進(jìn)行比較。用于比較的序列比對(duì)方法在本領(lǐng)域中是熟知的。用于比較的序列的最佳比對(duì)可以例如通過下列進(jìn)行：SmithandWaterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法；NeedlemanandWunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970的同源性比對(duì)算法；PearsonandLipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA85:2444,1988的搜索相似性方法；這些算法的計(jì)算機(jī)執(zhí)行(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，在WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI)；或者手工比對(duì)和視覺觀察(參見，例如Brentetal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Inc.(ringboued.,2003))。適于測(cè)定序列同一性百分?jǐn)?shù)和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法的兩個(gè)實(shí)例是BLAST和BLAST2.0算法，其被分別描述在Altschuletal.,Nuc.AcidsRes.25:3389-3402,1977；和Altschuletal.,J.Mol.Biol.215:403-410,1990。執(zhí)行BLAST分析的軟件可以通過NationalCenterforBiotechnologyInformation(國家生物技術(shù)信息中心)公開獲得。該算法涉及首先通過在查詢序列中識(shí)別長度W的短字串識(shí)別高得分序列對(duì)(HSPs)，其當(dāng)與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字串對(duì)齊時(shí)或者匹配或者滿足一些正值閥分值T。T被稱為相鄰字串分值閥(Altschuletal.,同上)。這些初始相鄰字串命中(hit)作為啟動(dòng)搜尋以尋找包含它們的更長HSPs的種子。字串命中沿著各個(gè)序列在兩個(gè)方向延伸直到可以增加累積對(duì)齊分值。對(duì)于核苷酸序列，采用參數(shù)M(對(duì)于一對(duì)匹配殘基，賞分值是>0)和N(對(duì)于錯(cuò)配殘基，罰分值總是<0)計(jì)算累計(jì)分值。對(duì)于氨基酸序列，得分矩陣被用于計(jì)算累計(jì)分值。當(dāng)下列情況時(shí)各方向上字串命中的延長停止：累積對(duì)齊分值從其獲得的最大值下降量X；由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)得分殘基對(duì)齊累積，累計(jì)分值達(dá)到零或以下；或者達(dá)到任意序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定比對(duì)的靈敏度和速度。BLASTN程序(對(duì)于核苷酸序列)采用默認(rèn)字長(W)11，期望值(E)或10，M＝5，N＝-4以及兩條鏈的比較。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序采用默認(rèn)字長3，期望值(E)10，BLOSUM62得分矩陣(參見HenikoffandHenikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915,1989)對(duì)齊(B)50，期望值(E)10，M＝5，N＝-4以及兩條鏈的比較。BLAST算法也執(zhí)行兩序列之間相似性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(參見，例如KarlinandAltschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5787,1993)。BLAST算法所提供的相似性的一種度量是最小加和概率(P(N))，其提供了兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間的匹配將偶然發(fā)生的概率表示。例如，如果測(cè)試核酸和參考核酸的比較中最小加和概率小于約0.2，更優(yōu)選地小于約0.01以及最優(yōu)選地小于約0.001，核酸被認(rèn)為與參考序列相似。除了上面提到的序列同一性百分?jǐn)?shù)，兩個(gè)核酸或多肽基本同一的另一表示是由第一核酸編碼的多肽與針對(duì)由第二核酸編碼的多肽引起的抗體免疫學(xué)交叉反應(yīng)，如下所述。因此，舉例來說，在兩肽區(qū)別僅在于保守取代的情況下，多肽與第二多肽一般基本上同一。兩核酸序列基本同一的另一表示是兩分子或它們的互補(bǔ)體在嚴(yán)格條件下相互雜交，如下所述。兩核酸序列基本同一的又一表示是可用相同的引物擴(kuò)增序列。術(shù)語“可操作地連接”是指兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸(例如DNA)區(qū)段之間的功能關(guān)系。一般地，它是指轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列和轉(zhuǎn)錄序列的功能關(guān)系。舉例來說，啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列被可操作地連接到編碼序列，如果它激勵(lì)或調(diào)節(jié)編碼序列在合適的宿主細(xì)胞或其他表達(dá)系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)錄的話。一般，被可操作地連接到轉(zhuǎn)錄序列的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列與轉(zhuǎn)錄序列在物理上是鄰接的，即它們是順式作用的。然而，一些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列如增強(qiáng)子不需要與它們?cè)鰪?qiáng)其轉(zhuǎn)錄的編碼序列物理鄰接或位于其附近。術(shù)語“載體”意欲指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)另一多核苷酸的多核苷酸分子，該另一多核苷酸與該多核苷酸分子連接。一種載體是“質(zhì)?！?，其是指另外的DNA區(qū)段可被連接到其中的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種載體是病毒載體，其中另外的DNA區(qū)段可被連接到病毒基因組。某些載體能在它們被引入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動(dòng)物載體)。其他載體(例如，非附加型哺乳動(dòng)物載體)可在引入到宿主細(xì)胞中后被整合到宿主細(xì)胞的基因組，并且因此與宿主基因組一起被復(fù)制。此外，某些載體能指導(dǎo)與它們可操作連接的基因表達(dá)。這樣的載體在本文被稱為“重組表達(dá)載體”(或者簡單地，“表達(dá)載體”)。一般而言，在重組DNA技術(shù)中有用的表達(dá)載體通常是以質(zhì)粒的形式。在本說明書中，當(dāng)質(zhì)粒是最常用的載體形式時(shí)，“質(zhì)粒”和“載體”可交換使用。然而，本公開意欲包括這種其他形式的表達(dá)載體，諸如病毒載體(例如，復(fù)制缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)，其起到等同的功能。術(shù)語“重組宿主細(xì)胞”(或者簡單地，“宿主細(xì)胞”)是指重組表達(dá)載體被引入的細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解，這樣的術(shù)語意欲不僅指特定對(duì)象細(xì)胞而且指這種細(xì)胞的后代。因?yàn)槟承┬揎椨捎谕蛔兓颦h(huán)境影響可發(fā)生在后代，這種后代事實(shí)上可能與親代細(xì)胞不相同，但仍被包括在如本文所用的術(shù)語“宿主細(xì)胞”的范圍內(nèi)。術(shù)語“靶抗原”是指針對(duì)其引起或另外產(chǎn)生(例如通過噬菌體展示)親代免疫球蛋白的抗原。術(shù)語“未突變的免疫球蛋白”是指不包括至少一個(gè)降低聚集的突變的免疫球蛋白。如本文所用，未突變的免疫球蛋白可以是為了比較具有和不具有降低聚集的突變的免疫球蛋白的聚集傾向或結(jié)合親合力的目的的假設(shè)構(gòu)建物。舉例來說，包含人源化突變以及降低聚集的突變的鼠科抗體不是未突變的免疫球蛋白。未突變的免疫球蛋白將是具有人源化突變但不具有降低聚集的突變的抗體。在突變意欲起到包括聚集降低在內(nèi)的一個(gè)以上目的的情況下，未突變的免疫球蛋白不包括這樣的突變。術(shù)語“聚集模體(aggregationmotif)”是指根據(jù)下列方法歸類在一起的一組殘基。首先，識(shí)別SAP(半徑)大于0.15的殘基。然后識(shí)別在SAP(半徑)大于0.15的各個(gè)殘基的之內(nèi)的所有殘基。那么模體是SAP(半徑)大于0.15的殘基以及SAP(半徑)大于0.0在SAP(半徑)大于0.15的殘基的之內(nèi)的所有殘基。任何這種具有共同至少一個(gè)殘基的模體被反復(fù)合并成較大的模體直到?jīng)]有具有共同殘基的剩余模體。這些剩余模體或者殘基組構(gòu)成聚集模體。下面表2列出IgG恒定結(jié)構(gòu)域的聚集模體。因此本發(fā)明的目的是提供具有降低的聚集傾向的修飾或分離的免疫球蛋白，其包括在這樣的殘基上的至少一個(gè)降低聚集的突變，所述殘基選自來自聚集模體1：174(CH1)、175(CH1)和181(CH1)；聚集模體2：226(鉸鏈)、227(鉸鏈)、228(鉸鏈)、229(鉸鏈)、230(鉸鏈)、231(鉸鏈)和232(鉸鏈)；聚集模體3：234(鉸鏈)和235(鉸鏈)；聚集模體4：252(CH2)和253(CH2)；聚集模體5：282(CH2)；聚集模體6：291(CH2)；聚集模體7：296(CH2)；聚集模體8：308(CH2)和309(CH2)；聚集模體9：328(CH2)、329(CH2)、330(CH2)和331(CH2)；聚集模體10：395(CH3)、396(CH3)、397(CH3)、398(CH3)和404(CH3)；聚集模體11：443(CH3)；聚集模體12：110(CL)和111(CL)；聚集模體13：153(CL)和154(CL)；以及聚集模體14：201(CL)的殘基，其中所述至少一個(gè)降低聚集的突變是用疏水性比未修飾的免疫球蛋白中的殘基小的氨基酸殘基的取代，并且被降低的聚集傾向是濃縮的液體溶液中免疫球蛋白分子之間的聚集；并且其中殘基編號(hào)基于與IgG1序列的比對(duì)是IgG1中相應(yīng)的Kabat殘基編號(hào)。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)降低聚集的突變殘基選自來自聚集模體1：175(CH1)；聚集模體2：227(鉸鏈)、228(鉸鏈)和230(鉸鏈)；聚集模體3：234(鉸鏈)和235(鉸鏈)；聚集模體4：253(CH2)；聚集模體5：282(CH2)；聚集模體6：291(CH2)；聚集模體7：296(CH2)；聚集模體8：309(CH2)；聚集模體9：329(CH2)和330(CH2)；聚集模體10：395(CH3)和398(CH3)；聚集模體11：443(CH3)；聚集模體12：110(CL)；聚集模體13：154(CL)；和聚集模體14：201(CL)的殘基。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變不是殘基234(鉸鏈)或235(鉸鏈)。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變殘基是234(鉸鏈)、235(鉸鏈)、253(CH2)或309(CH2)。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變殘基是253(CH2)或309(CH2)。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有在疏水性殘基上的第二降低聚集的突變，所述疏水性殘基(i)具有至少0.15的空間聚集傾向，或者(ii)在具有至少0.15的空間聚集傾向的殘基的之內(nèi)，其中至少一個(gè)降低聚集的突變是用疏水性比未修飾的免疫球蛋白中的殘基小的氨基酸殘基的取代。在可與具有第二降低聚集的突變的前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變和第二降低聚集的突變相隔至少至少至少或至少在可與任何一種具有第二降低聚集的突變的前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變和第二降低聚集的突變?cè)诓煌木奂ｓw里。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有至少十四個(gè)降低聚集的突變，其中每個(gè)降低聚集的突變選自不同的聚集模體。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變是用選自的賴氨酸、精氨酸、組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、和天冬酰胺的氨基酸殘基的取代。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變是用選自賴氨酸、精氨酸和組氨酸的氨基酸殘基的取代。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變是用賴氨酸殘基的取代。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，空間聚集傾向(半徑球)是利用經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化以使甘氨酸等于0的BlackMould疏水性標(biāo)度計(jì)算的。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白包括IgG1。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有人CH1結(jié)構(gòu)域。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有人CH2結(jié)構(gòu)域。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有人CH3結(jié)構(gòu)域。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有人CL結(jié)構(gòu)域。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有對(duì)靶抗原的結(jié)合親合力并且對(duì)靶抗原的結(jié)合親合力是未突變的免疫球蛋白對(duì)靶抗原的結(jié)合親合力的至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、或至少105％。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，濃縮的液體溶液濃度為至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。因此本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供具有降低的聚集傾向的修飾或分離的免疫球蛋白，其包括在選自下列的殘基上的至少一個(gè)降低聚集的突變：235(鉸鏈)、241(CH2)、243(CH2)、282(CH2)和309(CH2)，其中如果殘基235被選擇，它被突變成谷氨酸或絲氨酸，如果殘基282被選擇，它被突變成賴氨酸，以及如果殘基309被選擇，它被突變成賴氨酸，并且其中至少一個(gè)降低聚集的突變是用疏水性比未修飾的免疫球蛋白中的殘基小的氨基酸殘基的取代并且被降低的聚集傾向是濃縮的液體溶液中免疫球蛋白分子之間的聚集；并且其中殘基編號(hào)基于與IgG1序列的比對(duì)是IgG1中相應(yīng)的Kabat殘基編號(hào)。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)降低聚集的突變是殘基241向絲氨酸的突變，并且修飾或分離的免疫球蛋白進(jìn)一步包括殘基243向絲氨酸的第二降低聚集的突變。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)降低聚集的突變是殘基241向酪氨酸的突變，并且修飾或分離的免疫球蛋白進(jìn)一步包括殘基243向酪氨酸的第二降低聚集的突變。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)降低聚集的突變是殘基282向賴氨酸的突變，并且修飾或分離的免疫球蛋白進(jìn)一步包括第二和第三降低聚集的突變，其中第二降低聚集的突變是殘基235向賴氨酸的突變并且第三降低聚集的突變是殘基309向賴氨酸的突變。在某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有在疏水性殘基上的第二降低聚集的突變，其中至少一個(gè)降低聚集的突變是用疏水性比未修飾的免疫球蛋白中的殘基小的氨基酸殘基的取代。在可與具有第二降低聚集的突變的前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，第二降低聚集的突變(i)具有至少0.15的空間聚集傾向，或者(ii)在具有至少0.15的空間聚集傾向的殘基的之內(nèi)。在可與具有第二降低聚集的突變的前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有第三降低聚集的突變，其(i)具有至少0.15的空間聚集傾向，或者(ii)在具有至少0.15的空間聚集傾向的殘基的之內(nèi)，其中第三降低聚集的突變是用疏水性比未修飾的免疫球蛋白中的殘基小的氨基酸殘基的取代。在可與具有第二降低聚集的突變的前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變和第二降低聚集的突變相隔至少至少至少或至少在可與任何一種具有第二降低聚集的突變的前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變和第二降低聚集的突變?cè)诓煌木奂ｓw里。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有至少十四個(gè)降低聚集的突變，其中每個(gè)降低聚集的突變選自不同的聚集模體。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變是用選自賴氨酸、精氨酸、組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、酪氨酸和絲氨酸的氨基酸殘基的取代。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變是用選自賴氨酸、絲氨酸、谷氨酸和組氨酸的氨基酸殘基的取代。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，空間聚集傾向(半徑球)是利用經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化以使甘氨酸等于0的BlackMould疏水性標(biāo)度計(jì)算的。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白包括IgG1。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有人CH1結(jié)構(gòu)域。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有人CH2結(jié)構(gòu)域。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有人CH3結(jié)構(gòu)域。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有人CL結(jié)構(gòu)域。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有對(duì)靶抗原的結(jié)合親合力并且對(duì)靶抗原的結(jié)合親合力是未突變的免疫球蛋白對(duì)靶抗原的結(jié)合親合力的至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、或至少105％。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，濃縮的液體溶液濃度為至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。在免疫球蛋白殘基以本文的編號(hào)被指代的情況下，殘基編號(hào)是指當(dāng)目標(biāo)免疫球蛋白序列與人IgG1免疫球蛋白比對(duì)時(shí)IgG1分子中相應(yīng)殘基的Kabat編號(hào)。通過參考的方式，人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恒定結(jié)構(gòu)域被比對(duì)：CH1結(jié)構(gòu)域:IgG1(SEQIDNO:1)IgG2(SEQIDNO:2)IgG4(SEQIDNO:3)IgG3(SEQIDNO:4)鉸鏈:IgG1(SEQIDNO:5)IgG2(SEQIDNO:6)IgG4(SEQIDNO:7)IgG3(SEQIDNO:8)CH2結(jié)構(gòu)域:IgG1(SEQIDNO:9)IgG2(SEQIDNO:10)IgG4(SEQIDNO:11)IgG3(SEQIDNO:12)CH3結(jié)構(gòu)域:IgG1(SEQIDNO:13)IgG2(SEQIDNO:14)IgG4(SEQIDNO:15)IgG3(SEQIDNO:16)空間聚集傾向本發(fā)明涉及識(shí)別蛋白質(zhì)表面上的易聚集區(qū)域以及阻止或減少蛋白質(zhì)聚集的方法。本發(fā)明可用于產(chǎn)生具有降低的聚集傾向的免疫球蛋白，即，濃縮溶液中的免疫球蛋白保持基本上單體形式而不是較高有序聚集的多聚體。本文的方法顯示了計(jì)算的方法識(shí)別蛋白質(zhì)區(qū)域的能力中的進(jìn)步，該蛋白質(zhì)區(qū)域可被修飾以減少蛋白質(zhì)聚集的傾向。特別地，這些方法至少部分基于SAA(溶劑可及面積)的計(jì)算，其用于表征蛋白質(zhì)的表面是本領(lǐng)域已知的。SAA給出與溶劑接觸的每個(gè)氨基酸或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的表面積。當(dāng)探針球在蛋白質(zhì)表面，即蛋白結(jié)構(gòu)模型的表面上翻滾時(shí)，可典型地通過計(jì)算探針球體的中心軌跡計(jì)算SAA。探針球體具有與水分子相同的半徑，下面描述的計(jì)算SAA的可選方法是本領(lǐng)域已知的并與本文描述的方法一致。盡管SAA對(duì)表征蛋白質(zhì)的表面非常有用，但是由于下面的缺點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)它不足以表征蛋白質(zhì)表面上潛在的易聚集的疏水補(bǔ)丁(patch)，1.SAA不區(qū)分疏水和親水區(qū)域2.SAA與殘基的疏水性不成正比(例如，MET具有較LEU更多的表面面積，但是較不疏水)3.SAA沒有表明幾個(gè)疏水殘基是否是鄰近的，并因此能增強(qiáng)某一區(qū)域的疏水性。這些殘基在一級(jí)序列或三級(jí)結(jié)構(gòu)——即使它們?cè)谝患?jí)序列上很遠(yuǎn)——可為鄰近的。不管怎樣，它們能增強(qiáng)抗體表面上某一補(bǔ)丁的疏水性。通過根據(jù)下面的公式計(jì)算暴露的氨基酸部分的疏水性產(chǎn)生本文描述的一個(gè)度量，有效SAA：有效SAA的另外實(shí)施方式進(jìn)一步包括合計(jì)在一級(jí)蛋白質(zhì)序列中相鄰的至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)或至少六個(gè)(例如，二個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)等)氨基酸殘基的有效SAA。盡管有效SAA代表超過基本SAA的提高，但是它還是缺乏完全地說明折疊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和說明在蛋白質(zhì)序列中不相鄰的氨基酸可以是在蛋白質(zhì)折疊的二級(jí)、三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)中互相靠近的事實(shí)的能力。這樣的蛋白質(zhì)折疊可形成易聚集區(qū)域，其不單獨(dú)出現(xiàn)在一級(jí)結(jié)構(gòu)中，或只可通過更堅(jiān)定地分析折疊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)而被檢測(cè)。本發(fā)明提供新的、更先進(jìn)的稱作空間聚集傾向的度量，其將突出蛋白質(zhì)表面上的某一補(bǔ)丁或區(qū)域的有效疏水性。針對(duì)在蛋白結(jié)構(gòu)模型的原子上或附近的限定的空間區(qū)域計(jì)算空間聚集傾向。在該上下文中，“限定的空間區(qū)域”是選擇的用以在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上或附近捕獲局部物理結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)環(huán)境的三維空間或體積。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，針對(duì)集中在蛋白質(zhì)中的原子(例如蛋白結(jié)構(gòu)模型中的原子)上的具有半徑R的球形區(qū)域計(jì)算空間聚集傾向。還可針對(duì)集中在化學(xué)鍵或定位在接近結(jié)構(gòu)模型的空間中的具有半徑R的球形區(qū)域計(jì)算空間聚集傾向。相應(yīng)地，在另一實(shí)施方式中，可針對(duì)集中在原子附近，例如集中在空間上距特定原子或化學(xué)鍵的中心之間，更優(yōu)選地之間，更優(yōu)選地之間的點(diǎn)上的限定的空間區(qū)域計(jì)算SAP。在某些實(shí)施方式中，選擇的半徑R在和之間。在特定的實(shí)施方式中，選擇的半徑是至少至少至少至少至少至少至少至少至少至少至少至少至少至少或至少在某些實(shí)施方式中，選擇的半徑在和之間，在和之間，或在和之間。在特定的實(shí)施方式中，選擇的半徑是或在其他的實(shí)施方式中，空間聚集傾向計(jì)算針對(duì)的區(qū)域不是球形的。該區(qū)域的可能的形狀可進(jìn)一步包括立方體、圓柱體、圓錐體、橢圓的球狀體、錐體、半球或可用于封閉空間部分的任何其它形狀。在這樣的實(shí)施方式中，可使用除了半徑外的測(cè)量，例如從形狀的中心到面或頂點(diǎn)的距離選擇區(qū)域的大小。在某個(gè)實(shí)施方式中，可使用SAP選擇蛋白質(zhì)尤其抗體或免疫球蛋白中可被取代的殘基，因此增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。在先前的研究中體外穩(wěn)定蛋白質(zhì)的兩個(gè)主要方法已是：(1)改造蛋白質(zhì)序列自身，和(2)包括液體制劑中的添加劑。已研究了這兩個(gè)方法，并已獲得了顯著的結(jié)果。第一個(gè)方法已依賴經(jīng)由電腦模擬(insilico)或以實(shí)驗(yàn)篩選隨機(jī)變體的廣泛文庫。在第二個(gè)方法中，針對(duì)穩(wěn)定添加劑的高通量的篩選以及添加劑的合理設(shè)計(jì)允許用于治療用蛋白質(zhì)的最佳制劑的鑒別。本發(fā)明期望通過計(jì)算地識(shí)別存在的聚集熱點(diǎn)和在實(shí)驗(yàn)上分析具有那些位點(diǎn)的取代的變體來使穩(wěn)定性增強(qiáng)的過程有效率。因此，一般地說，針對(duì)蛋白質(zhì)中的特定原子計(jì)算空間聚集傾向的方法包括(a)識(shí)別代表該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)模型中的一個(gè)或多個(gè)原子，其中一個(gè)或多個(gè)原子位于集中于特定原子上或其附近的限定空間區(qū)域內(nèi)；(b)針對(duì)限定空間區(qū)域中的一個(gè)或多個(gè)原子中的每一個(gè)，計(jì)算原子的溶劑可及面積(SAA)與完全暴露的同一殘基中原子的SAA的比；(c)用一個(gè)或多個(gè)原子的原子疏水性乘以每個(gè)比；和(d)合計(jì)步驟(c)的乘積；借此該和是針對(duì)特定原子的SAP。在相關(guān)的實(shí)施方式中，根據(jù)一種不同的方法可計(jì)算SAP，所述方法包括(a)識(shí)別代表蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)模型中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基具有集中于特定原子上或其附近的限定空間區(qū)域內(nèi)的至少一個(gè)原子；(b)針對(duì)識(shí)別的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中的每一個(gè)，計(jì)算氨基酸中原子的溶劑可及面積(SAA)與完全暴露的同一殘基中原子的SAA的比；(c)用如通過氨基酸疏水性標(biāo)度所測(cè)定的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的疏水性乘以每個(gè)比；和(d)合計(jì)步驟(c)的乘積；借此該和是針對(duì)特定原子的SAP。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在步驟(a)之前通過允許結(jié)構(gòu)模型與分子動(dòng)力學(xué)模擬中的溶劑相互作用處理結(jié)構(gòu)模型。當(dāng)氨基酸被識(shí)別為具有限定的空間區(qū)域內(nèi)的至少一個(gè)原子時(shí)，可能需要至少一個(gè)原子是氨基酸側(cè)鏈中專有的原子?？蛇x地它可以是需要成為主鏈原子的原子。在其它實(shí)施方式中，該方法可進(jìn)一步包括任選地在步驟(a)之前進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬和重復(fù)步驟(a)-(d)，每次在許多時(shí)間步驟進(jìn)行進(jìn)一步的分子動(dòng)力學(xué)模擬，由此產(chǎn)生多個(gè)如步驟(d)中的和，和計(jì)算這些和的平均數(shù)；借此該計(jì)算的平均數(shù)是針對(duì)特定原子的SAP。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解使用分子動(dòng)力學(xué)模擬計(jì)算的值的平均數(shù)的本發(fā)明實(shí)施方式將是計(jì)算上更強(qiáng)化的。這樣的實(shí)施方式在某些情況下也將提供空間聚集傾向的更精確或高度分辨的圖。然而，本文討論的實(shí)驗(yàn)已顯示當(dāng)不使用分子動(dòng)力學(xué)平均技術(shù)時(shí)，該方法仍然是高度準(zhǔn)確的。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，可針對(duì)數(shù)據(jù)庫例如蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)中的所有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)計(jì)算空間聚集傾向值，由此很快識(shí)別所有已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上的疏水殘基和補(bǔ)丁。該方法允許大批蛋白質(zhì)的快速篩選以識(shí)別潛在的易聚集區(qū)域和/或蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)。在優(yōu)選的應(yīng)用中，空間聚集傾向被描述通過下面的公式：SAP原子＝Σ模擬平均值(Σ原子的R內(nèi)的原子((SAA-R/SAA-fe)*原子-hb)其中：1)SAA-R是在每個(gè)模擬快照上計(jì)算的半徑R內(nèi)側(cè)鏈原子的SAA。優(yōu)選地通過計(jì)算當(dāng)在蛋白質(zhì)表面上翻滾時(shí)探針球體中心的軌跡而在模擬模型中計(jì)算SAA。探針球體具有與水分子相同的半徑，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，計(jì)算SAA的其它方法將與這里描述的計(jì)算SAP的方法一致。例如，可只在氨基酸側(cè)鏈原子上計(jì)算SAA。也可只在氨基酸主鏈原子(即肽主鏈的那些原子和結(jié)合的氫)上計(jì)算SAA。可選地，可只在氨基酸主鏈原子上計(jì)算SAA，排除結(jié)合的氫；2)SAA-fe是在優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過計(jì)算完全伸展的三肽‘Ala-X-Ala’構(gòu)象中中間殘基的側(cè)鏈SAA，獲得的完全暴露的殘基(說的是氨基酸‘X’)的側(cè)鏈SAA；和3)原子-hb是如上所述使用Black和Mould(BlackandMould,Anal.Biochem.1991,193,72-82)的疏水性標(biāo)度獲得的原子疏水性。該標(biāo)度被標(biāo)準(zhǔn)化以使甘氨酸疏水性為零。因此，在疏水性標(biāo)度上，疏水性比甘氨酸大的氨基酸為正并且疏水性比甘氨酸小的氨基酸為負(fù)?！巴耆┞兜摹睔埢侨腁la-X-Ala的完全伸展構(gòu)象中的殘基X。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解該排列被設(shè)計(jì)，以至于在這樣的殘基X上的SAA的計(jì)算將產(chǎn)生可利用的最大溶劑可及面積。相應(yīng)地，考慮可在計(jì)算中使用除丙氨酸外的其它殘基而沒有完全破壞或改變結(jié)果。如上所述，可將本發(fā)明的方法應(yīng)用于任何蛋白結(jié)構(gòu)模型，其包括利用上述相同公式的X射線結(jié)構(gòu)。相似地，如果得不到X射線結(jié)構(gòu)，可將相同的空間聚集傾向參數(shù)應(yīng)用到通過同源建模產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)，并且SAP參數(shù)可利用上述相同公式計(jì)算。在某些實(shí)施方式中，對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)模型中的所有原子計(jì)算空間聚集傾向。在一些實(shí)施方式中，可對(duì)每個(gè)單個(gè)蛋白質(zhì)殘基或小群體殘基進(jìn)行原子空間聚集傾向值平均化。SAP方法的用途一方面，本發(fā)明可如上面所描述的用于識(shí)別蛋白質(zhì)中疏水的氨基酸殘基、區(qū)域或補(bǔ)丁。沒有想保持特定的閾值，認(rèn)為具有空間聚集傾向>0的原子或氨基酸殘基是疏水的或位于易聚集區(qū)域中。根據(jù)蛋白質(zhì)的類型、特定的結(jié)構(gòu)和其存在的溶劑，可期望使用稍微低于零的截止值，例如通過選擇具有大于-0.1、-0.15、-0.2等的空間聚集傾向的原子或殘基，識(shí)別原子或殘基?？蛇x地，為了選擇最強(qiáng)的疏水的原子、殘基或補(bǔ)丁，可期望使用更嚴(yán)格的截止值，例如0、0.05、0.1、0.15、0.2等。此外，因?yàn)樗惴▽⒏叩臄?shù)給予補(bǔ)丁中心處的殘基，因此滿足截止值的殘基的3A、4A、5A、7.5A或10A內(nèi)的殘基也可被選擇用于突變成更小疏水性殘基以降低聚集。在另一個(gè)實(shí)施方式中，只是選擇具有大于連續(xù)地(即沿著蛋白質(zhì)序列)或在優(yōu)選實(shí)施方式中，空間上(即在三維結(jié)構(gòu)中)附近的原子或殘基的空間聚集傾向的原子或殘基可以是有利的。選擇疏水補(bǔ)丁中的原子或殘基的一個(gè)優(yōu)選的方法是將計(jì)算的空間聚集傾向值，例如使用彩色編碼或數(shù)字編碼，繪制到它們所來源的蛋白結(jié)構(gòu)模型上，因此使跨過蛋白質(zhì)表面的空間聚集傾向中的差別可視化，并因此允許疏水補(bǔ)丁或殘基容易選擇。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用選擇的用于半徑的兩個(gè)值分開進(jìn)行空間聚集傾向的計(jì)算，這兩個(gè)值一個(gè)具有較高的分辨率，例如5A，一個(gè)具有較低的分辨率，例如10A。在這樣的實(shí)施方式中，可在具有較低分辨率的圖的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上看到較大或較寬的疏水補(bǔ)丁。一旦在低分辨率圖上選擇感興趣的疏水補(bǔ)丁，可在較高分辨率的圖中更詳細(xì)地觀察那些補(bǔ)丁，這可在一些實(shí)施方式中允許本領(lǐng)域的技術(shù)人員更容易地或更準(zhǔn)確地選擇殘基以突變或修飾。例如，當(dāng)在較高分辨率的圖中觀察疏水補(bǔ)丁時(shí)，可期望為突變選擇具有最高SAP得分的殘基或是最疏水的殘基(例如根據(jù)Black和Mould,Anal.Biochem.1991,193,72-82的標(biāo)度，補(bǔ)丁中最疏水的殘基)。在具體的實(shí)施方式中，識(shí)別蛋白上的易聚集區(qū)域的方法包括：(a)將如根據(jù)本文描述的方法中的任何一個(gè)所計(jì)算的針對(duì)蛋白質(zhì)中原子的SAP繪制到結(jié)構(gòu)模型上；和(b)識(shí)別具有SAP>0的許多原子的蛋白質(zhì)內(nèi)的區(qū)域；其中易聚集區(qū)域包括，包含所述許多原子的氨基酸。在這樣的實(shí)施方式中，可針對(duì)蛋白質(zhì)中的所有原子或部分原子計(jì)算SAP。考慮一個(gè)人可只針對(duì)感興趣的特定殘基或許多組殘基計(jì)算SAP。在相似的實(shí)施方式中，繪制原子的SAP得分(或者在氨基酸殘基上進(jìn)行平均的SAP得分)可以是有教益的。這種顯示沿著蛋白質(zhì)的原子或殘基的SAP得分的繪圖允許峰容易識(shí)別，這可表明用于代替的候選物。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，將沿著蛋白質(zhì)中的原子或殘基的SAP得分繪制在曲線圖中，針對(duì)圖中的峰計(jì)算曲線下面積(AUC)。在這樣的實(shí)施方式中，具有較大AUC的峰代表較大或較疏水的易聚集區(qū)域。在特定的實(shí)施方式中，將期望選擇用于替代的一個(gè)或多個(gè)殘基，該殘基被識(shí)別為存在于峰中，或更優(yōu)選地在具有大AUC的峰中。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明可用于制備顯示減少的聚集傾向的免疫球蛋白變體，這是通過用較被替代的殘基更親水的氨基酸殘基替代通過本文描述的方法中的任何一個(gè)識(shí)別的免疫球蛋白中易聚集區(qū)域內(nèi)至少一個(gè)氨基酸殘基，以至于減少了變體的聚集傾向。如本文所用，當(dāng)氨基酸殘基被稱為“更”親水或疏水或“更不”親水或疏水時(shí)，熟練的技術(shù)人員應(yīng)理解這表示根據(jù)本領(lǐng)域已知的疏水性(親水性)的測(cè)量，例如Black和Mould的疏水性標(biāo)度與另一個(gè)氨基酸相比更疏水或更不疏水。在相似的實(shí)施方式中，本發(fā)明可用于制備顯示減少的聚集傾向的免疫球蛋白變體，這是通過替代每個(gè)變體中免疫球蛋白中易聚集區(qū)域內(nèi)至少一個(gè)氨基酸殘基產(chǎn)生多個(gè)免疫球蛋白變體，其中使用根據(jù)本文描述的任何方法計(jì)算的SAP得分識(shí)別易聚集區(qū)域，其中在每個(gè)變體中替代一個(gè)或不同的殘基或殘基的不同組合，其中用更親水的殘基替代至少一個(gè)殘基；和(b)選擇如(a)中所制備的顯示減少的聚集傾向的免疫球蛋白變體。此外，可缺失而不是替代易聚集區(qū)域中的氨基酸殘基。在多個(gè)氨基酸殘基被選擇用于替代的一些免疫球蛋白中，可替代一些殘基，同時(shí)缺失其它的殘基。在另外的實(shí)施方式中，通過上面描述的方法(例如通過使用空間聚集傾向截止值——在其之上，殘基被選擇)可在最初的免疫球蛋白中識(shí)別多個(gè)易聚集區(qū)域或殘基。隨后，通過用更親水的氨基酸殘基替代所述最初的免疫球蛋白中一個(gè)或多個(gè)選擇的氨基酸殘基(或落進(jìn)選擇的補(bǔ)丁中的一個(gè)或多個(gè)殘基)可產(chǎn)生許多免疫球蛋白變體，這樣產(chǎn)生了代表許多種不同的氨基酸替代的許多免疫球蛋白變體。然后可篩選該群體以選擇具有減少的聚集傾向的一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白變體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解可識(shí)別多個(gè)易聚集區(qū)域，可在一個(gè)或多個(gè)易聚集區(qū)域進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)替代和/或缺失。通過上面描述的Black和Mould的疏水性標(biāo)度可測(cè)定氨基酸的相對(duì)疏水性。在特定的實(shí)施方式中，將被替代的氨基酸選自包括Phe、Leu、Ile、Tyr、Trp、Val、Met、Pro、Cys、Ala或Gly的組或由其構(gòu)成的組。在相關(guān)的實(shí)施方式中，將被替代進(jìn)免疫球蛋白中的更親水的氨基酸將選自包括Thr、Ser、Lys、Gln、Asn、His、Glu、Asp和Arg的組或由其構(gòu)成的組。因此本發(fā)明的目的是提供具有降低的聚集傾向的修飾和/或分離的免疫球蛋白，其包括在免疫球蛋白的保守區(qū)域中的殘基上的至少一個(gè)降低聚集的突變，所述殘基(i)具有至少0.15的空間聚集傾向(半徑球)，或者(ii)具有大于0.0的空間聚集傾向(半徑球)并且在具有至少0.15的空間聚集傾向(半徑球)的殘基的之內(nèi)，其中所述至少一個(gè)降低聚集的突變是用相比未突變的免疫球蛋白降低該殘基的空間聚集傾向(半徑球)的氨基酸殘基的取代，并且被降低的聚集傾向是濃縮的液體溶液中免疫球蛋白分子之間的聚集。在某些實(shí)施方式中，所述至少一個(gè)降低聚集的突變基于與IgG1序列的比對(duì)不在與IgG1中Kabat殘基234(鉸鏈)或235(鉸鏈)對(duì)應(yīng)的殘基上。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白在這樣的殘基上具有第二降低聚集的突變，所述殘基(i)具有至少0.15的空間聚集傾向(半徑球)，或者(ii)具有大于0.0的空間聚集傾向(半徑球)并且在具有至少0.15的空間聚集傾向(半徑球)的殘基的之內(nèi)，其中所述第二降低聚集的突變是用氨基酸殘基的取代，其是用相比未突變的免疫球蛋白降低該殘基的空間聚集傾向(半徑球)的氨基酸殘基的取代。在可與具有第二降低聚集的突變的前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變和第二降低聚集的突變相隔至少至少至少或至少在可與具有第二降低聚集的突變的前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變和第二降低聚集的突變?cè)诓煌木奂ｓw里。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變是用疏水性比未修飾的免疫球蛋白中的殘基小的氨基酸殘基的取代。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變是用選自賴氨酸、精氨酸、組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺的氨基酸殘基的取代。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變是用選自賴氨酸、精氨酸和組氨酸的氨基酸殘基的的取代。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，降低聚集的突變是用賴氨酸殘基的的取代。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，空間聚集傾向(半徑球)是利用標(biāo)準(zhǔn)化以使甘氨酸等于0的BlackMould疏水性標(biāo)度計(jì)算的。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白是IgG1。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有人CH1結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有人CH2結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有人CH3結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有人CL結(jié)構(gòu)域。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有對(duì)靶抗原的結(jié)合親合力并且對(duì)靶抗原的結(jié)合親合力是未突變的免疫球蛋白對(duì)靶抗原的結(jié)合親合力的至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、或至少105％。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，濃縮的液體溶液濃度為至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。可通過本領(lǐng)域已知的任何方法制備免疫球蛋白變體，包括位點(diǎn)定向誘變和其它的重組DNA技術(shù)，例如參見本文通過引用并入的美國專利號(hào)5284760；5556747；5789166；6878531；5932419和6391548。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明可用于制備顯示減少的聚集傾向的免疫球蛋白變體，這是通過用較被替代的殘基更親水的天然氨基酸殘基、修飾的氨基酸殘基、稀有的氨基酸殘基、非天然氨基酸殘基或氨基酸類似物或衍生物替代通過本文描述的方法中的任何一個(gè)識(shí)別的免疫球蛋白中易聚集區(qū)域內(nèi)至少一個(gè)氨基酸殘基，這樣減少了變體的聚集傾向。非天然氨基酸的合成是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并進(jìn)一步在，例如美國專利公布號(hào)2003-0082575中被描述。一般而言，可使用將非天然的、修飾的或稀有的氨基酸合成或摻入進(jìn)蛋白質(zhì)的本領(lǐng)域已知的任何方法，包括但并不限于本文通過引用并入的出版物L(fēng)iaoJ.BiotechnolProg.2007Jan-Feb；23(1):28-31；Rajesh,andIqbal.CurrPharmBiotechnol.2006Aug；7(4):247-59；Cardilloetal.MiniRevMedChem.2006Mar；6(3):293-304；Wangetal.AnnuRevBiophysBiomolStruct.2006；35:225-49；Chakrabortyetal.,andGlycoconjJ.2005Mar；22(3):83-93中描述或引用的那些方法。作為進(jìn)一步的例子，可使用AmbrxReCODETM技術(shù)來如本文描述的方法所示將非天然氨基酸或稀有氨基酸形成和摻入到蛋白質(zhì)中。根據(jù)本發(fā)明的免疫球蛋白變體能顯示，例如，如通過加速的穩(wěn)定性研究所測(cè)定的提高的或改進(jìn)的穩(wěn)定性。示例性的加速的穩(wěn)定性研究包括但并不限于以增加的貯存溫度為特征的研究。與野生型或最初的蛋白質(zhì)相比，觀察到的針對(duì)免疫球蛋白變體的聚集體形成的降低表明增加的穩(wěn)定性。還可通過測(cè)量與野生型或最初的免疫球蛋白相比變體的熔解溫度轉(zhuǎn)換的變化測(cè)試免疫球蛋白變體的穩(wěn)定性。在這樣的實(shí)施方式中，當(dāng)變體中的熔解溫度轉(zhuǎn)換增加時(shí)，增加的穩(wěn)定性將是明顯的。在美國專利申請(qǐng)?zhí)?0/176,809中描述了測(cè)量蛋白質(zhì)聚集的另外的方法。因此本發(fā)明的目的是提供分離的或重組的多核苷酸，其編碼如在段落[0059]、[0060]或[0089]以及他們的實(shí)施方式的任意和所有組合中所討論的修飾免疫球蛋白。在某些實(shí)施方式中，多核苷酸在載體中。在某些實(shí)施方式中，載體是表達(dá)載體。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子可操作地連接到多核苷酸上。另一方面包括具有前述實(shí)施方式中任何一種的載體的宿主細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞能表達(dá)通過多核苷酸編碼的免疫球蛋白。因此本發(fā)明的目的是提供產(chǎn)生具有降低的聚集傾向的免疫球蛋白的方法，所述方法包括提供包含前述段落的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基和將該培養(yǎng)基置于免疫球蛋白被表達(dá)的條件下。在某些實(shí)施方式中，方法包括分離表達(dá)的免疫球蛋白的另外步驟。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，計(jì)算的空間聚集傾向可用于識(shí)別蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)表面上的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)。蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)常常含有疏水殘基或疏水補(bǔ)丁，這是本領(lǐng)域已知的。期望本文描述的方法在通過識(shí)別疏水補(bǔ)丁定位結(jié)合位點(diǎn)中將是有用的。這樣的疏水補(bǔ)丁然后將是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-配體識(shí)別位點(diǎn)的候選物。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于根據(jù)本發(fā)明方法測(cè)定SAP的計(jì)算機(jī)編碼。在其它的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及致力于執(zhí)行本發(fā)明的方法的計(jì)算機(jī)、超級(jí)計(jì)算機(jī)或計(jì)算機(jī)集群。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于測(cè)定蛋白質(zhì)上的易聚集區(qū)域的基于網(wǎng)絡(luò)的、基于服務(wù)器的或基于互聯(lián)網(wǎng)的服務(wù)，該服務(wù)包括接收來自用戶(例如通過互聯(lián)網(wǎng))的關(guān)于蛋白質(zhì)(例如蛋白結(jié)構(gòu)模型)的數(shù)據(jù)或從數(shù)據(jù)庫取回這樣的數(shù)據(jù)，這樣該服務(wù)供給者能產(chǎn)生、取回或存取蛋白質(zhì)的靜態(tài)結(jié)構(gòu)，任選地包括蛋白質(zhì)的分子動(dòng)力學(xué)建模以提供蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，基于這樣產(chǎn)生的靜態(tài)或動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)測(cè)定針對(duì)蛋白質(zhì)的原子或殘基的SAP，和將SAP數(shù)據(jù)，例如，作為服務(wù)供給者用所述SAP數(shù)據(jù)繪制的結(jié)構(gòu)模型，返回給用戶。在一些實(shí)施方式中，用戶是人。在其它的實(shí)施方式中，用戶是計(jì)算機(jī)系統(tǒng)或自動(dòng)化的計(jì)算機(jī)算法。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供SAP計(jì)算系統(tǒng)，包括：用于將用于計(jì)算SAP的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)通過互聯(lián)網(wǎng)提供給用戶終端的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器；用于貯存關(guān)于計(jì)算方法、氨基酸疏水性等一般信息的數(shù)據(jù)庫和用于基于數(shù)據(jù)庫中的信息和用戶通過互聯(lián)網(wǎng)提供或傳輸?shù)男畔?zhí)行SAP計(jì)算的計(jì)算服務(wù)器。在一些實(shí)施方式中，網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器和計(jì)算服務(wù)器是相同的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。在一些實(shí)施方式中，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)是超級(jí)計(jì)算機(jī)、集群計(jì)算機(jī)或單個(gè)的工作站或服務(wù)器。在相關(guān)的實(shí)施方式中，SAP計(jì)算系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器進(jìn)一步包括用于控制全部操作的控制器、用于連接互聯(lián)網(wǎng)的網(wǎng)絡(luò)連接單元和用于將用于計(jì)算SAP的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)通過互聯(lián)網(wǎng)提供給用戶終端的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器單元。此外，本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)一步涉及具有計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)的計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器產(chǎn)品，該產(chǎn)品含有用于執(zhí)行各種計(jì)算機(jī)執(zhí)行的操作的程序編碼，所述計(jì)算機(jī)執(zhí)行的操作例如計(jì)算針對(duì)結(jié)構(gòu)模型的SAP、計(jì)算SAA、計(jì)算有效SAA、操縱結(jié)構(gòu)模型、實(shí)現(xiàn)分子動(dòng)力學(xué)模擬、組織和儲(chǔ)存相關(guān)數(shù)據(jù)、或執(zhí)行本文描述的其它操作。計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)是能儲(chǔ)存數(shù)據(jù)的任何數(shù)據(jù)存儲(chǔ)設(shè)備，該數(shù)據(jù)此后能被計(jì)算機(jī)系統(tǒng)讀取。計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)的例子包括但并不限于硬盤、軟盤、閃存驅(qū)動(dòng)器、光盤(例如CD、DVD、HD-DVD、藍(lán)光光盤等)和專門配置的硬件裝置諸如特定用途集成電路(ASICs)或可編程邏輯器件(PLDs)。還能將計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)分布為包括在遍及偶聯(lián)的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)的載波中的數(shù)據(jù)信號(hào)，以便使計(jì)算機(jī)可讀代碼以分布的形式儲(chǔ)存和執(zhí)行。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解上面描述的硬件和軟件組件是具有標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)和構(gòu)造的。上面描述的計(jì)算機(jī)、互聯(lián)網(wǎng)、服務(wù)器和服務(wù)相關(guān)的實(shí)施方式可進(jìn)一步應(yīng)用到SAA和有效SAA以及SAP。包含免疫球蛋白和免疫球蛋白變體的藥物組合物在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種組合物，例如藥物組合物，其含有與藥學(xué)上可接受的載體一起配制的、通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的一種或多種免疫球蛋白變體。本發(fā)明的藥物組合物還能在聯(lián)合治療中施用，例如與其它藥劑結(jié)合。例如，聯(lián)合治療能包括與至少一種其它抗癌藥劑結(jié)合的本發(fā)明的免疫球蛋白。如本文所用，“藥學(xué)上可接受的載體”包括生理學(xué)上相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲的和吸收延遲劑等。優(yōu)選地，載體適于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、腸胃外、脊椎或表皮施用(例如，通過注射或輸注)。根據(jù)給藥途徑，可將活性化合物，即本發(fā)明的免疫球蛋白或其變體，包在材料中以保護(hù)化合物免受酸的作用和可使化合物失活的其它天然條件。本發(fā)明的藥物組合物可包括一種或多種藥學(xué)上可接受的鹽。“藥學(xué)上可接受的鹽”指保留母體化合物的期望生物學(xué)活性和不賦予任何不期望的毒理學(xué)作用的鹽(參見，例如Berge,S.M.,etal.(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。這樣的鹽的例子包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括來自無毒的無機(jī)酸，諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸等，以及來自無毒的有機(jī)酸諸如脂肪族的一羧酸和二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳香酸、脂肪族和芳香族的磺酸等的那些鹽。堿加成鹽包括來自堿土金屬，諸如鈉、鉀、鎂、鈣等，以及來自無毒的有機(jī)胺，諸如N,N'-二芐乙烯二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等的那些鹽。本發(fā)明的藥物組合物還可包括藥學(xué)上可接受的抗氧化劑。藥學(xué)上可接受的抗氧化劑的實(shí)例包括：(1)水溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶的抗氧化劑，諸如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁基化羥基苯甲醚(BHA)、丁化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、棓酸丙酯、α生育酚等；和(3)金屬螯合劑，諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。可在本發(fā)明的藥物組合物中使用的合適的水性和非水性載體的實(shí)例包括水、乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合適的混合物、植物油，諸如橄欖油，和可注射的有機(jī)酯，諸如油酸乙酯。例如，通過包衣材料，諸如卵磷脂的使用，通過分散的情況下需要的粒度的維持和通過表面活性劑的使用能維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。這些組合物還可含有佐劑諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑?？赏ㄟ^滅菌操作和通過包含各種抗菌劑和抗真菌劑，例如對(duì)羥苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等確保阻止微生物的存在。還可期望將等滲劑，諸如糖、氯化鈉等包括進(jìn)組合物。此外，通過包含延遲吸收的藥劑諸如單硬脂酸鋁和明膠可帶來可注射的藥物形式的延長的吸收。藥學(xué)上可接受的載體包括無菌的水溶液或分散體和用于無菌可注射的溶液或分散體的臨時(shí)制備的無菌粉劑。用于藥學(xué)上有活性的物質(zhì)的這樣的介質(zhì)和藥劑的使用是本領(lǐng)域已知的。除了在任何常規(guī)的介質(zhì)或藥劑與活性化合物不相容的情況下，考慮其在本發(fā)明的藥物組合物中的使用。也能將補(bǔ)充的活性化合物摻入進(jìn)組合物。示例性的制劑包括至少一種本發(fā)明的免疫球蛋白變體和能包括較低濃度的穩(wěn)定(或解聚)劑，除了本文公開的方法，其能用于阻止或減少免疫球蛋白的聚集。相應(yīng)地，在含有通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的免疫球蛋白變體的藥物組合物的開發(fā)中可使用用于阻止聚集的常規(guī)方法。例如，許多種穩(wěn)定或解聚化合物可根據(jù)它們的預(yù)期的用途和它們的生物學(xué)毒性包括在本發(fā)明的藥物組合物中。這樣的穩(wěn)定化合物可包括，例如環(huán)糊精及其衍生物(美國專利號(hào)5730969)、烷基葡糖苷組合物(美國專利申請(qǐng)?zhí)?1/474,049)、蛋白伴侶分子的使用(例如LEA(Goyaletal.,BiochemJ.2005,388(Pt1):151-7；美國專利號(hào)5688651的方法)、甜菜堿化合物(Xiao,Burn,Tolbert,BioconjugChem.2008May23)、表面活性劑(例如PluronicF127、PluronicF68、Tween20(Weietal.InternationalJournalofPharmaceutics.2007,338(1-2):125-132))和美國專利號(hào)5696090、5688651和6420122中描述的方法。此外，使用不同種類的賦形劑的組合在制劑中穩(wěn)定蛋白質(zhì)，特別是抗體，例如(1)二糖(例如蔗糖、海藻糖)或多元醇(例如山梨醇、甘露醇)通過優(yōu)先的排除充當(dāng)穩(wěn)定劑并且還能在凍干期間充當(dāng)冷凍保護(hù)劑，(2)表面活性劑(例如Polysorbat80、Polysorbat20)通過最小化界面象液體/冰、液體/材料表面和/或液體/氣體界面上蛋白質(zhì)的相互作用起作用，和(3)緩沖液(例如磷酸鹽-、檸檬酸鹽-、組氨酸)有助于控制和維持制劑pH。因此，除了本發(fā)明的方法外可以使用這樣的二糖多元醇、表面活性劑和緩沖液以進(jìn)一步穩(wěn)定免疫球蛋白和防止它們的聚集。治療組合物典型地在制造和貯存條件下必須是無菌的和穩(wěn)定的。能將組合物配制為溶液、微乳劑、脂質(zhì)體或適于高藥物濃度的其它規(guī)則結(jié)構(gòu)。載體可以是含有，例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液態(tài)聚乙二醇等)及其合適的混合物的溶劑或分散介質(zhì)。例如，通過包衣諸如卵磷脂的使用、通過分散的情況下需要的粒度的維持和通過表面活性劑的使用能維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。在許多情況下，在組合物中包括等滲劑，例如糖，多元醇諸如甘露醇、山梨醇，或氯化鈉將是優(yōu)選的。通過將延遲吸收的藥劑，例如單硬脂酸鹽和明膠包括在組合物中能帶來可注射組合物的延長的吸收。能通過將活性化合物以需要的量摻入到具有如所需要的、上面列舉的一個(gè)成分或成分組合的適當(dāng)溶劑，接下來通過滅菌微濾來制備無菌可注射的溶液。一般地，通過將活性化合物摻入進(jìn)含有基本的分散介質(zhì)和需要的來自上面列舉的那些其它成分的無菌載體中制備分散體。在用于無菌可注射的溶液制備的無菌粉劑的情況下，制備的優(yōu)選方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，其生產(chǎn)活性成分加上任何另外期望的來自其先前無菌過濾的溶液的成分的粉末。能與載體材料結(jié)合以產(chǎn)生單個(gè)劑量形式的活性成分的量將根據(jù)被治療的受試者和施用的特定方式而變化。能與載體材料結(jié)合以產(chǎn)生單個(gè)劑量形式的活性成分的量將通常是產(chǎn)生療效的組合物的量。一般地，100％中，這個(gè)量的范圍將是約0.01％至約99％的活性成分，優(yōu)選地約0.1％至約70％，最優(yōu)選地約1％至約30％的與藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合的活性成分。因此本發(fā)明的目的是提供修飾的免疫球蛋白制劑，其可由濃度為至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml的段落[0059]、[0060]或[0089]和它們的實(shí)施方式中任意和所有組合中討論的修飾免疫球蛋白構(gòu)成。在某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白濃度大于相同條件下未突變的免疫球蛋白在濃縮的液體溶液中與自身聚集時(shí)的濃度。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，修飾的免疫球蛋白至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％是未聚集的單體。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，制劑包括藥學(xué)上可接受的賦形劑。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白制劑與相同條件下的未突變的免疫球蛋白相比在24小時(shí)加速聚集之后顯示少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、或至少50％的聚集體。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，聚集通過SEC-HPLC進(jìn)行測(cè)量。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白制劑基本上不含任何降低免疫球蛋白聚集的添加劑。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白制劑基本上不含游離的組氨酸、糖類和多元醇。因此本發(fā)明的目的是提供段落[0059]、[0060]或[0089]和它們的實(shí)施方式中任意和所有組合中討論的修飾免疫球蛋白作為非聚集藥物活性成分的用途。因此本發(fā)明的目的是提供包括段落[0059]、[0060]或[0089]和它們的實(shí)施方式中任意和所有組合中討論的修飾免疫球蛋白以及藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物組合物。在某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白濃度為至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。在某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白濃度大于相同條件下未突變的免疫球蛋白在濃縮的液體溶液中與自身聚集時(shí)的濃度。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，修飾的免疫球蛋白至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％是未聚集的單體。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白制劑與相同條件下的未突變的免疫球蛋白相比在24小時(shí)加速聚集之后顯示少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、或至少50％的聚集體。在可與前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，聚集通過SEC-HPLC進(jìn)行測(cè)量。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白制劑基本上不含任何降低免疫球蛋白聚集的添加劑。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，免疫球蛋白制劑基本上不含游離的組氨酸、糖類和多元醇。調(diào)節(jié)劑量方案以提供最佳期望的反應(yīng)(例如治療反應(yīng))。例如，可施用單個(gè)大丸劑(bolus)，可隨著時(shí)間施用幾個(gè)分次劑量或可如治療情形的緊急所指示的按比例地減少或增加劑量。配制以劑量單位形式的胃腸外組合物用于使施用容易和劑量均勻是尤其有利的。如本文所用的劑量單位形式指適合用作用于將被治療的受試者的單一劑量的物理離散單位；每個(gè)單位含有計(jì)算的預(yù)定數(shù)量的活性化合物以與需要的藥物載體聯(lián)合地產(chǎn)生期望的療效。針對(duì)本發(fā)明的劑量單位形式的說明受指示于并直接依賴于：(a)活性化合物的獨(dú)特特性和將要達(dá)到的特定療效，和(b)在復(fù)合這樣的活性化合物進(jìn)行治療的領(lǐng)域中固有的、個(gè)體中靈敏度的限制。對(duì)于免疫球蛋白的施用，劑量范圍是每kg宿主體重約0.0001至100mg，更通常地0.01至5mg。例如劑量可以是0.3mg/kg體重、1mg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/kg體重或10mg/kg體重或1-10mg/kg范圍內(nèi)。示例性的治療方案需要每周一次、每兩周一次、每三周一次、每四周一次、一個(gè)月一次、每3個(gè)月一次或每3至6個(gè)月一次施用。用于本發(fā)明的免疫球蛋白的優(yōu)選劑量方案包括通過靜脈內(nèi)施用1mg/kg體重或3mg/kg體重，其中采用以下的給藥方案之一給予抗體：(i)每四周，進(jìn)行六個(gè)劑量，然后每三個(gè)月；(ii)每三周；(iii)3mg/kg體重一次，接下來每三周1mg/kg體重?？蛇x地，本發(fā)明的免疫球蛋白作為持續(xù)釋放制劑施用，在這種情況下需要較少頻率的施用。劑量和頻率可根據(jù)患者中施用的物質(zhì)的半衰期而變化。一般而言，人類抗體顯示最長的半衰期，接下來是人源化抗體、嵌合抗體和非人類抗體。劑量和頻率可根據(jù)治療是否是預(yù)防性的或治療性的而變化。在預(yù)防性應(yīng)用中，在長時(shí)期內(nèi)以相對(duì)不頻繁的間隔施用相對(duì)低的劑量。一些患者連續(xù)接受治療持續(xù)他們生命的剩余部分。在治療性應(yīng)用中，有時(shí)需要以相對(duì)短的間隔的相對(duì)高的劑量直到疾病的進(jìn)展被降低或終止，優(yōu)選地直至患者顯示疾病癥狀的部分或完全改善。之后，可給患者施用預(yù)防性方案。本發(fā)明的藥物組合物中的活性成分的實(shí)際劑量水平可變化以獲得活性成分的量，該量對(duì)達(dá)到針對(duì)特定患者、組合物和施用方式的期望的治療反應(yīng)是有效的，對(duì)患者沒有毒性。選擇的劑量水平將依賴許多種藥物代謝動(dòng)力學(xué)因素，包括使用的本發(fā)明的特定組合物、或其酯、鹽或酰胺的活性、施用途徑、施用時(shí)間、正在使用的特定化合物的排泄速度、治療的持續(xù)時(shí)間、與使用的特定組合物結(jié)合使用的其它藥物、化合物和/或材料、正被治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、一般健康狀態(tài)和以前的病史和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中眾所周知的相似因素。本發(fā)明的免疫球蛋白的“治療上有效的劑量”優(yōu)選地導(dǎo)致疾病癥狀嚴(yán)重性的降低、無疾病癥狀周期的頻率和持續(xù)時(shí)間的增加、或由于疾病折磨的損害或殘疾的阻止。例如，對(duì)于腫瘤的治療，相對(duì)于未治療的受試者，“治療上有效的劑量”優(yōu)選地抑制細(xì)胞生長或腫瘤生長至少約20％，更優(yōu)選地至少約40％，甚至更優(yōu)選地至少約60％，更優(yōu)選地至少約80％。能在預(yù)示人類腫瘤中效能的動(dòng)物模型系統(tǒng)中評(píng)價(jià)化合物抑制腫瘤生長的能力?？蛇x地，能通過熟練的實(shí)施者所知的試驗(yàn)檢查化合物抑制例如體外抑制的能力來評(píng)價(jià)組合物的這種性質(zhì)。治療有效量的治療化合物能減小腫瘤大小或另外改善受試者中的癥狀。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將能基于諸如受試者的大小、受試者癥狀的嚴(yán)重性和特定的組合物或選擇的施用途徑這樣的因素測(cè)定這樣的量。能使用本領(lǐng)域已知的許多種方法中的一個(gè)或多個(gè)通過一個(gè)或多個(gè)施用途徑施用本發(fā)明的組合物。如熟練的技術(shù)人員所將理解的，施用的途徑和/或方式將根據(jù)期望的結(jié)果而變化。用于本發(fā)明的結(jié)合部分的優(yōu)選的施用途徑包括靜脈內(nèi)的、肌肉內(nèi)的、真皮內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、皮下的、脊椎的或其它腸胃外的施用途徑，例如通過注射或輸注。短語“胃腸外施用”如本文所用指除了腸的和局部施用的施用方式，通常通過注射，并且包括，沒有限制，靜脈內(nèi)的、肌肉內(nèi)的、動(dòng)脈內(nèi)的、鞘內(nèi)的、囊內(nèi)的、眶內(nèi)的、心內(nèi)的、真皮內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、經(jīng)氣管的、皮下的、表皮下的、關(guān)節(jié)內(nèi)的、囊下的、蛛網(wǎng)膜下的、脊柱內(nèi)的、硬膜外的和胸骨內(nèi)的注射和輸注。可選地，能通過非胃腸外途徑諸如局部的、表皮的或粘膜的施用途徑施用本發(fā)明的免疫球蛋白，例如鼻內(nèi)地、經(jīng)口地、陰道地、直腸地、舌下地或局部地。能將活性化合物與載體一起制備，該載體將保護(hù)該化合物抵抗快速釋放，諸如控制釋放制劑，包括埋植劑、透皮貼片和微型膠囊遞送系統(tǒng)。能使用可生物降解的、生物相容的聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。這樣的制劑的制備的許多方法是取得專利權(quán)的或通常是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。參見，例如SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems,J.R.Robinson,ed.,MarcelDekker,Inc.,NewYork,1978。治療組合物能與本領(lǐng)域已知的醫(yī)療器材一起施用。例如，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的治療組合物能與無針皮下注射裝置，諸如美國專利號(hào)5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824或4,596,556中公開的裝置一起施用。眾所周知的埋植劑和在本發(fā)明中有用的模塊的例子包括：美國專利號(hào)4,487,603，其公開了用于以控制的速度分配藥的可植入的微量輸注泵；美國專利號(hào)4,486,194，其公開了用于通過皮膚施用藥物的治療裝置；美國專利號(hào)4,447,233，其公開了用于以精確的輸注速度遞送藥物的藥物輸注泵；美國專利號(hào)4,447,224，其公開了用于連續(xù)的藥物遞送的變速流可植入的輸液器；美國專利號(hào)4,439,196，其公開了具有多腔小室的滲透性藥物遞送系統(tǒng)；和美國專利號(hào)4,475,196，其公開了滲透性藥物遞送系統(tǒng)。因此本發(fā)明的目的是提供降低高濃藥物制劑中免疫球蛋白的聚集傾向的方法，所述方法包括提供易于聚集的免疫球蛋白；用降低空間聚集傾向(半徑球)的氨基酸殘基取代免疫球蛋白的保守結(jié)構(gòu)域中的殘基——其(i)具有至少0.15的空間聚集傾向(半徑球)，或者(ii)具有大于0.0的空間聚集傾向(半徑球)并且在具有至少0.15的空間聚集傾向的殘基的之內(nèi)；和產(chǎn)生修飾的免疫球蛋白的高濃液體制劑，其中所述修飾的免疫球蛋白濃度為至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml，并且其中被降低的聚集傾向是濃縮的液體溶液中免疫球蛋白分子之間的聚集。因此本發(fā)明的目的是提供段落[0059]、[0060]或[0089]和它們的實(shí)施方式中任意和所有組合中討論的修飾免疫球蛋白在包含高濃液體制劑的藥物的制備中的用途，其中所述修飾的免疫球蛋白濃度為至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、或至少150mg/ml。在某些實(shí)施方式中，該藥物的用途是用于治療自身免疫疾病、免疫學(xué)疾病、傳染病、炎性疾病、神經(jīng)學(xué)疾病以及包括癌癥在內(nèi)的腫瘤學(xué)和瘤性疾病。在某些實(shí)施方式中，該藥物的用途是用于治療充血性心力衰竭(CHF)、血管炎、紅斑痤瘡、痤瘡、濕疹、心肌炎和心肌的其他病癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、糖尿病、脊椎病、滑液成纖維細(xì)胞和骨髓基質(zhì)；骨丟失；佩吉特病、破骨細(xì)胞瘤；乳腺癌；廢用性骨量減少、營養(yǎng)不良、牙周病、高歇病、朗格罕細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥、脊髓損傷、急性膿毒性關(guān)節(jié)炎、骨軟化癥、庫興綜合征、單骨纖維性骨發(fā)育不良、多骨纖維性骨發(fā)育不良、牙周重建和骨折；肉樣瘤病；溶骨性骨癌、乳腺癌、肺癌、腎癌和直腸癌；骨轉(zhuǎn)移、骨痛處理和體液惡性高鈣血癥、強(qiáng)直性脊柱炎和其他脊椎關(guān)節(jié)??；移植排斥、病毒性感染、血液學(xué)瘤形成和瘤樣病癥，例如，何杰金淋巴瘤；非何杰金淋巴瘤(伯基特淋巴瘤、小淋巴細(xì)胞淋巴瘤/慢性淋巴細(xì)胞白血病、蕈樣霉菌病、套細(xì)胞淋巴瘤、巨濾泡性淋巴瘤、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、邊緣區(qū)淋巴瘤、毛細(xì)胞白血病和淋巴漿細(xì)胞性白血病)、淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞的腫瘤，其包括B細(xì)胞急性成淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤、和T細(xì)胞急性成淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤、胸腺瘤、成熟T和NK細(xì)胞的腫瘤，其包括周邊T細(xì)胞白血病、成人T細(xì)胞白血病/T細(xì)胞淋巴瘤和大粒狀淋巴細(xì)胞白血病、朗格罕細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥、骨髓瘤形成諸如急性骨髓性白血病，包括成熟的AML、沒有分化的AML、急性早幼粒細(xì)胞白血病、急性骨髓單核細(xì)胞性白血病和急性單核細(xì)胞性白血病、骨髓增生異常綜合征和慢性骨髓增生疾病，包括慢性骨髓性白血病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，例如，腦瘤(神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、室管膜瘤和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤)、實(shí)體瘤(鼻咽癌、基底細(xì)胞癌、胰腺癌、膽管癌、卡波西肉瘤、睪丸癌、子宮癌、陰道癌或?qū)m頸癌、卵巢癌、原發(fā)性肝癌或子宮內(nèi)膜癌、和血管系統(tǒng)的腫瘤(血管肉瘤和血管外皮細(xì)胞瘤)、骨質(zhì)疏松癥、肝炎、HIV、AIDS、(脊)椎關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病(IBD)、膿毒病和敗血癥性休克、克羅恩病、牛皮癬、硬皮病、移植物抗宿主病(GVHD)、異源胰島移植物排斥、血液學(xué)惡性腫瘤，諸如多發(fā)性骨髓瘤(MM)、骨髓增生異常綜合征(MDS)和急性骨髓性白血病(AML)、與腫瘤相關(guān)的炎癥、周圍神經(jīng)損傷或脫髓鞘病。在某些實(shí)施方式中，該藥物的用途是用于治療菌斑牛皮癬、潰瘍性大腸炎、非何杰金淋巴瘤、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、黃斑變性、呼吸道合胞病毒、克羅恩病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、骨質(zhì)疏松癥、治療誘導(dǎo)的骨丟失、骨轉(zhuǎn)移、多發(fā)性骨髓瘤、阿爾茨海默病、青光眼和多發(fā)性硬化癥。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，該藥物的用途進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的賦形劑。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，該藥物中的免疫球蛋白與相同條件下的未突變的免疫球蛋白相比在24小時(shí)加速聚集之后顯示少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、或至少50％的聚集體。在某些實(shí)施方式中，聚集通過SEC-HPLC進(jìn)行測(cè)量。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，該藥物基本上不含任何降低免疫球蛋白聚集的添加劑。在可與任何一種前述實(shí)施方式組合的某些實(shí)施方式中，該藥物基本上不含游離的組氨酸、糖類和多元醇。實(shí)施例用于預(yù)測(cè)易聚集區(qū)域和研究聚集機(jī)制的分子模擬技術(shù)已主要使用相對(duì)簡單的模擬模型(MaandNussinov.Curr.Opin.Chem.Biol.2006,10,445–452；Cellmer,etal.,TRENDSinBiotechnology2007,25(6),254)，其與可在本發(fā)明中使用的詳細(xì)的原子論模型不同。使用的最不詳細(xì)的模擬模型是點(diǎn)陣模型，其在為數(shù)眾多的蛋白質(zhì)聚集研究中使用(Harrisonetal.J.MoLBiol.1999,286,593-606；DimaandThirumalai.ProteinSci.2002,11,1036-1049；Leonhardetal.ProteinSci.2004,13,358-369；PatroandPrzybycien.Biophys.J.1994,66,1274-1289；PatroandPrzybycien.Biophys.J.1996,70,2888-2902；Brogliaetal.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1998,95,12930-12933；Istrailetal.Comput.Biol.1999,6,143-162；Giugliarellietal.Chem.Phys.2000,113,5072-5077；Bratkoetal.J.Chem.Phys.2001,114,561-569；BratkoandBlanchJ.Chem.Phys.2003,118,5185-5194；CombeandFrenkelChem.Phys.2003,118,9015-9022；TomaandToma.Biomacromolecules2000,1,232-238；Guptaetal.ProteinSci.1998,7,2642-2652；和NguyenandHallBiotechnol.Bioeng.2002,80,823-834)。這里每個(gè)殘基被表示為在三維點(diǎn)陣中占據(jù)單一位點(diǎn)的珠子。由于其簡單性，點(diǎn)陣模型是計(jì)算上要求較少的，并已用于模擬針對(duì)長期規(guī)模的大系統(tǒng)。盡管這些點(diǎn)陣模型提供蛋白聚集之下的基本物理學(xué)的洞察，但是它們未準(zhǔn)確地表示二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，并不能充分地解釋不同原子論水平的相互作用諸如氫鍵合。與點(diǎn)陣模型相比更詳細(xì)的模型是中間分辨率模型，其中通常將幾個(gè)原子結(jié)合進(jìn)單個(gè)珠子中，有時(shí)引入假鍵以保持主鏈鍵角和異構(gòu)化狀態(tài)(SmithandHall,Mol.Biol.2001,312,187-202；SmithandHall.Proteins:Struct.,Funct.,Genet.2001,44,344-360；SmithandHall.Proteins:Struct.,Funct.,Genet.2001,44,376-391；Nguyen,etal.,ProteinSci.2004,13,2909-2924；NguyenandHall,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2004,101(46),16180–16185；NguyenandHall.J.Am.Chem.Soc.,2006,128,1890-1901；Jang,etal.,Biophys.J.2004,86,31-49；Jang,etal.,ProteinSci.2004,13,40-53)。該模型被成功地用于從任意的狀態(tài)開始從含有12和96個(gè)之間的聚丙氨酸肽(每個(gè)16個(gè)殘基)的系統(tǒng)模擬原纖維的形成(NguyenandHall,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2004,101(46),16180–16185；NguyenandHall,J.Am.Chem.Soc.,2006,128,1890-1901)。Dokholyan和同事應(yīng)用這樣的模型來通過八個(gè)模型SrcSH3結(jié)構(gòu)域蛋白(Ding,etal.,Mol.Biol.2002,324,851-857)或通過28個(gè)模型Aβ(1-40)肽(Peng,etal.,Phys.Rev.E:Stat.Ph.Interdiscip.Top.2004,69,41908-41914.)研究原纖維的β-折疊結(jié)構(gòu)的形成。與較簡單的模型不同，原子論模型包括所有的原子論細(xì)節(jié)諸如氫鍵合，因此較點(diǎn)陣模型或中間分辨率模型更準(zhǔn)確。這樣的原子論模型已與顯式溶劑或隱式溶劑一起使用，其中將溶劑處理為連續(xù)體。顯式模型比隱式模型更準(zhǔn)確但在計(jì)算上也要求更多。將這樣的具有隱式溶劑的原子論模型用于七肽GNNQQNY(SEQIDNO:17)聚集的早期階段的研究，該肽是酵母蛋白Sup35的一部分(Gsponer,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2003,100,5154-5159.)。將相似的模型用于Ab16–22淀粉狀肽(KLVFFAE(SEQIDNO:18))聚集成反向平行的β折疊(KlimovandThirumalai,Structure2003,11,295-307)。Dokholyan和同事(Khare,etal.,Proteins.2005,61,617–632.)使用顯式原子論模型來研究沿著酶Cu、Zn超氧化物歧化酶(SOD1)序列的規(guī)則聚集傾向。他們已將SOD1序列分解成重疊的七肽并進(jìn)行了單體、二聚體和四聚體區(qū)段的大量顯式水分子動(dòng)力學(xué)模擬(每個(gè)0.5ns)。用這個(gè)他們識(shí)別了在SOD1序列中淀粉狀蛋白生成的區(qū)域是：兩個(gè)末端，β鏈4和7，和兩個(gè)交叉環(huán)。發(fā)展了相似的分子動(dòng)力學(xué)模擬方案以獲得關(guān)于淀粉狀蛋白生成多肽的規(guī)則β聚集的結(jié)構(gòu)信息(Cecchinietal.,JMolBiol.2006,357,1306–1321.)。該方法是基于多肽鏈分解成重疊的區(qū)段和小拷貝數(shù)的每個(gè)區(qū)段的平衡分子動(dòng)力學(xué)(MD)模擬。發(fā)現(xiàn)沿著阿爾茨海默爾的Aβ(1–42)肽序列的β-聚集傾向是高度異源的，其中最大值在區(qū)段V12HHQKLVFFAE22(SEQIDNO:19)和最小值在四個(gè)轉(zhuǎn)角樣二肽。使用該技術(shù)，使用硫代黃素T結(jié)合試驗(yàn)體外檢驗(yàn)酵母朊病毒Ure2p的N末端結(jié)構(gòu)域的雙點(diǎn)突變體的聚集傾向的預(yù)測(cè)改變。由于它們的巨大尺寸，將多肽鏈分解成重疊區(qū)段的這樣的方法對(duì)系統(tǒng)諸如抗體將是非常具有挑戰(zhàn)性的。由于抗體的巨大尺寸，甚至顯式溶劑中的單個(gè)完全抗體的原子論模擬在計(jì)算上也要求多。因此，在文獻(xiàn)中似乎沒有完全抗體的原子論模擬。然而，已有抗體的小部分的原子論模擬，大部分是針對(duì)Fab片段(Noon,etal.,PNAS.2002,99,6466；SinhaandSmith-Gill,CellBiochemistryandBiophysics.2005,43,253)。在本文公開的工作中，用顯式溶劑進(jìn)行完全抗體分子的原子論模擬?；谶@些模擬，使用本文描述的‘空間聚集傾向’參數(shù)識(shí)別抗體上的易聚集區(qū)域。然后將這些易聚集區(qū)域突變以設(shè)計(jì)具有增加的穩(wěn)定性的抗體。本文描述的實(shí)施例參考本發(fā)明的非限制性實(shí)施方式。實(shí)施例1：分子動(dòng)力學(xué)模擬方法學(xué)使用所有原子模型針對(duì)完全抗體進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。從單獨(dú)的Fab和Fc片段的X射線結(jié)構(gòu)獲得用于針對(duì)完全抗體的模擬的最初結(jié)構(gòu)。選擇概念驗(yàn)證(proof-of-concept)(POC)Fab片段的X射線結(jié)構(gòu)用于在從IgGl抗體1HZH獲得的Fc的X射線結(jié)構(gòu)上做模型(Saphireetal.,Science.2001,293,1155)。由于對(duì)于完全抗體，X射線結(jié)構(gòu)是已知的，并且由于Fc結(jié)構(gòu)對(duì)抗體的所有IgGl類是相同的，所以選擇1HZH。然后通過使用1HZH結(jié)構(gòu)作為模型模板校準(zhǔn)Fab和Fc片段而獲得完全POC抗體的結(jié)構(gòu)。為了在正確的距離和方向校準(zhǔn)片段，將片段的共同CYS殘基和完全抗體模板(1HZH)之間的RMSD(均方根偏差)減到最小。選擇CYS殘基是因?yàn)槊總€(gè)抗體亞域(CH1、CH2等)含有二硫鍵，以及因此CYS殘基廣泛分布于整個(gè)抗體結(jié)構(gòu)。然后將所得的完全抗體結(jié)構(gòu)用于進(jìn)行針對(duì)30ns的顯式原子模擬。由于G0糖基化模型是在抗體中觀察到的最普通的糖基化模型，所以將其用于模擬。CHARMM模擬程序包(Brooksetal.J.Comput.Chem.,1983,4,187)用于建立和分析，NAMD程序包(Phillipsetal.JournalofComputationalChemistry.2005,26,1781)用于進(jìn)行模擬。CHARMM完全地原子論力場(chǎng)(MacKerelletal.J.PhysChem.B.1998,102,3586)用于針對(duì)水的蛋白質(zhì)和TIP3P(Jorgensenetal.J.Chem.Phys.,1983,79,926)溶劑模型。在NPT系綜中的298K和latm進(jìn)行模擬。取得針對(duì)參與Fc片段糖基化的糖基的參數(shù)，與CHARMM力場(chǎng)一致，接下來來自CSFF力場(chǎng)(Kutteletal.J.Comput.Chem.,2002,23,1236)?；陔娯?fù)性基團(tuán)的空間接近度，選擇在pH-7的組氨酸殘基的質(zhì)子化狀態(tài)。將完全抗體在正交晶系盒中形成溶劑化物，由于這使需要的水分子數(shù)目減到最小，因此使計(jì)算時(shí)間減到最少。在所有3個(gè)方向使用周期邊界條件。在正交晶系盒的每個(gè)方向使用的水溶劑化層。所得的總系統(tǒng)大小是202130個(gè)原子。加入足夠的離子以中和系統(tǒng)的總電荷。用以計(jì)算系統(tǒng)中靜電相互作用的貢獻(xiàn)的Ewald求和技術(shù)需要電中性。將抗體形成溶劑化之后，通過固定蛋白以允許水在蛋白質(zhì)周圍松弛，用SD(最速下降)使能量最初減到最小。然后去除限制，用SD和ABNR(牛頓-拉菲森法(AdoptedBasisNewton-Raphson))將結(jié)構(gòu)進(jìn)一步減小。然后使用lfs的時(shí)間步驟每0.5ps5℃的增加量將系統(tǒng)緩慢地加熱到室溫。然后在計(jì)算來自模擬的感興趣的性質(zhì)之前將該系統(tǒng)平衡1ns。模擬期間每0.1ps保存構(gòu)型用于進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)施例2：空間聚集傾向(SAP)的計(jì)算為了克服SAA的缺點(diǎn)，將新的參數(shù)定義，稱作如上面所描述的‘空間聚集傾向’。在這個(gè)實(shí)施例中，為集中在實(shí)施例1描述的抗體中的每個(gè)原子上的具有半徑R的球形區(qū)域計(jì)算‘空間聚集傾向’。因此用針對(duì)抗體的Fc片段的30ns模擬平均數(shù)對(duì)兩個(gè)不同的補(bǔ)丁半徑評(píng)價(jià)空間聚集傾向的值(本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解根據(jù)可用的計(jì)算資源和期望的結(jié)果分辨率可選擇用于模擬的各個(gè)時(shí)間步驟)。在兩種情況下，注意到多個(gè)數(shù)值是負(fù)的，表示最暴露的區(qū)域是親水的。這如同所期望的，由于多數(shù)暴露的蛋白質(zhì)表面通常是親水的。還觀察到有具有針對(duì)空間聚集傾向的正峰的幾個(gè)區(qū)域，其表示高暴露的疏水性。從補(bǔ)丁的較低的半徑進(jìn)行到較高的半徑除去一些峰，而提高了一些其它的峰。除去了一些峰因?yàn)樵谶@些區(qū)域中親水補(bǔ)丁包圍著小的疏水補(bǔ)丁(具有小于的半徑)；因此，將超過的平均化導(dǎo)致針對(duì)該區(qū)域的疏水性有效的降低。而在一些其它區(qū)域，由于包圍相似的疏水補(bǔ)丁的疏水補(bǔ)丁，在的空間聚集傾向提高了。在上面，在30ns模擬運(yùn)行期間將空間聚集傾向計(jì)算為平均數(shù)。然后將使用模擬計(jì)算的結(jié)果與僅僅X射線結(jié)構(gòu)空間聚集傾向比較，而沒有分子模擬。空間聚集傾向(X射線)因此針對(duì)和計(jì)算。空間聚集傾向(X射線)與平均化的模擬值的空間聚集傾向相似，在相同的位置具有峰，但是在峰的大小上有差別。在補(bǔ)丁的較大半徑，下，這些差別更高。這可能是因?yàn)楫?dāng)看大的補(bǔ)丁大小時(shí)，差別是累積的。由于動(dòng)力學(xué)模擬運(yùn)行中殘基的不斷改變的表面暴露，這些差別出現(xiàn)了。盡管如此，該比較顯示從X射線結(jié)構(gòu)本身能獲得空間聚集傾向的好的最初評(píng)價(jià)，尤其是針對(duì)補(bǔ)丁R的低半徑。將來自模擬的針對(duì)和的空間聚集傾向值繪制到抗體結(jié)構(gòu)上。在兩種情況下，根據(jù)空間聚集傾向的值給抗體表面賦予顏色。在空間聚集傾向的計(jì)算中使用的兩個(gè)半徑(和)下觀察到，表面主要是親水的。這再次如所期望的，由于多數(shù)蛋白質(zhì)表面通常是親水的。然而，幾個(gè)疏水性區(qū)域是令人注目的。疏水性和親水性區(qū)域之間的對(duì)比在SAP的計(jì)算中使用的補(bǔ)丁的較高半徑，下，更顯著。某些識(shí)別的疏水性區(qū)域與已知與其它蛋白質(zhì)相互作用的抗體的區(qū)域具有極好的相關(guān)性。鉸鏈區(qū)中殘基234和235周圍的一個(gè)補(bǔ)丁是Fc-受體相互作用的地方。殘基253周圍的第二補(bǔ)丁與Fc片段中蛋白A和蛋白G相互作用的區(qū)域?qū)?yīng)。在Fab片段末端觀察到顯著疏水的補(bǔ)丁對(duì)應(yīng)于抗體結(jié)合抗原的區(qū)域。為和分別繪制空間聚集傾向的圖，其中可觀察到峰與相互作用區(qū)域的相同的相關(guān)性。從蛋白復(fù)合體，PDB條目1T89、1FC2和1FCC的X射線結(jié)構(gòu)獲得蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)(Radaev,J.Biol.Chem.2001,276(19)16469；Deisenhoferetal.Hoppe-Seyler'sZPhysiolChem.1978.359,975-985；Deisenhofer,J.Biochemistry.1981,20,2361-2370；Sauer-Erikssonetal.Structure.1995,3,265)。疏水的相互作用與空間聚集傾向正峰相關(guān)聯(lián)非常好，親水的相互作用與空間聚集傾向負(fù)峰相關(guān)聯(lián)好。因此，同樣能將空間聚集傾向參數(shù)用于預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)。在幾乎沒有的例外中，其中具有低的空間聚集傾向(即接近零，正的或負(fù)的)的殘基也相互作用，觀察到相互作用實(shí)際上是與主骨架鏈自身的原子，而不是與側(cè)鏈。除了已顯示與上述其它蛋白質(zhì)相互作用的疏水性補(bǔ)丁，還識(shí)別了抗體表面上另外的疏水性補(bǔ)丁(區(qū)域4至6)。在Fc底部的區(qū)域5是顯著疏水的，但是它被稍微埋在內(nèi)部，親水區(qū)域在其邊緣上。相似地，區(qū)域4和6是疏水的和溶劑暴露的，但是它們面對(duì)抗體的內(nèi)部。如果由于抗體的顯著的構(gòu)象變化或解折疊，區(qū)域4和6被暴露的話，它們?nèi)匀荒軡撛诘貐⑴c與其它蛋白質(zhì)的相互作用。還能在較小的補(bǔ)丁半徑下觀察到所有的疏水補(bǔ)丁(區(qū)域1至6)，盡管與較高的補(bǔ)丁半徑相比具有較小的差異。也將基于僅僅X射線結(jié)構(gòu)的空間聚集傾向(X射線)值繪制到抗體表面上以比較它們與模擬平均值。比較通過模擬或使用僅僅X射線結(jié)構(gòu)計(jì)算的空間聚集傾向顯示：識(shí)別的疏水性區(qū)域非常相似。當(dāng)然存在一些差別，諸如蛋白A相互作用補(bǔ)丁的強(qiáng)度。盡管如此，這種比較顯示基于僅僅X射線結(jié)構(gòu)的空間聚集傾向(X射線)能用于獲得表面上疏水補(bǔ)丁分布的良好描述。這是重要的，原因在于完全抗體的原子論模擬在計(jì)算上要求多。對(duì)于缺少X射線結(jié)構(gòu)模型的蛋白，能將相同的空間聚集傾向參數(shù)應(yīng)用于通過同源建?；驈念^開始的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)。觀察到同源結(jié)構(gòu)與X射線結(jié)構(gòu)非常相似，其空間聚集傾向值也與X射線結(jié)構(gòu)相似。因此空間聚集傾向識(shí)別抗體表面上的疏水補(bǔ)丁。這些補(bǔ)丁能固有地暴露或由于抗體的動(dòng)態(tài)波動(dòng)或局部的解折疊而暴露。這些疏水補(bǔ)丁中的一些也與同其它蛋白質(zhì)相互作用的區(qū)域良好地相關(guān)聯(lián)。為了檢測(cè)通過空間聚集傾向預(yù)測(cè)的這些疏水補(bǔ)丁是否同樣參與聚集，在這些具體區(qū)域中進(jìn)行突變以將疏水的殘基改變成親水的殘基。所得的抗體顯示較少的聚集行為和提高的穩(wěn)定性。除了識(shí)別易聚集殘基，還觀察到SAP方法正確地識(shí)別易于與其它蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體區(qū)域。因此，該方法能廣闊地應(yīng)用于所有蛋白質(zhì)以識(shí)別易聚集區(qū)域或與其它蛋白質(zhì)的結(jié)合區(qū)域。實(shí)施例3：用于穩(wěn)定性工程改造的抗體位點(diǎn)的選擇識(shí)別為具有高空間聚集傾向(并且因此在本發(fā)明人識(shí)別的易聚集模體的中心處)的殘基顯示在表1中?？紤]到這些在模體的中心，這些殘基以及那些在(或如果在計(jì)算中使用窗口的話)之內(nèi)的殘基可以被修飾成疏水性較低的殘基，以降低聚集和/或增加穩(wěn)定性。殘基被識(shí)別為人IgG1抗體(具有κ輕鏈)，并且不同IgG種類中的相應(yīng)殘基被顯示在表1中。表1顯示模體在不同IgGs之間大部分是保守的，稍有差別。然而，大部分差別是從疏水性氨基酸至另一疏水性氨基酸。因此，模體的疏水性甚至在這些差別下也保持完好，因此在相同位置具有疏水性殘基的其他種類也是易聚集模體。對(duì)于此有幾個(gè)例外(A330S、V110K，和L201的缺失)，其不是易聚集模體。除了這些例外，這里識(shí)別的模體對(duì)于所有IgG種類的抗體具有類似暴露的疏水性和較高的SAP值。表2顯示組織成易聚集模體的疏水性殘基。表2：IgG1分子的恒定區(qū)的十四個(gè)模體實(shí)施例4–用于穩(wěn)定性工程改造的抗體位點(diǎn)的選擇為了證實(shí)由其SAP識(shí)別的易聚集模體涉及聚集和/或不穩(wěn)定性，在識(shí)別的區(qū)域產(chǎn)生突變以將疏水性殘基變成親水性殘基。這里所選的殘基都被變成賴氨酸。一般地，形成一般模體的氨基酸可被Black和Mould標(biāo)度中更親水的氨基酸，尤其Thr、Ser、Lys、Gln、Asn、His、Glu、Asp和Arg取代。所選的區(qū)域如下：A1(L235K)、A2(I253K)、A3(L309K)、A4(L309K、L235K)和A5(L234K、L235K)。所得突變抗體顯示較小的聚集行為和提高的穩(wěn)定性，如實(shí)施例6中所述。實(shí)施例5–抗體變體的表達(dá)和純化上面實(shí)施例4中討論的所選殘基被突變，并且所得抗體變體被表達(dá)和純化。攜帶人IgG1抗體A的輕鏈或重鏈基因的載體通過將基因從專有載體(Novartis)亞克隆到gWIZ載體(Genlantis)獲得，從瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(transienttransfection)優(yōu)化以獲得高表達(dá)。按照位點(diǎn)定向誘變的Stratagene方案產(chǎn)生抗體變體。所有構(gòu)建物通過DNA測(cè)序進(jìn)行證實(shí)。mg規(guī)模的質(zhì)粒DNA用DNAMaxiPrep柱(Invitrogen)從細(xì)菌培養(yǎng)基中進(jìn)行純化。按照廠商的方案進(jìn)行FreeStyleHEK293細(xì)胞(Invitrogen)的生長和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。簡單而言，對(duì)于1L培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)染，1mg總DNA(HC和LC載體各0.5mg)用20mlOptiPro溶液溫育15分鐘；同時(shí)2mg轉(zhuǎn)染試劑聚乙烯亞胺(PEI(Polysciences)，1mg/ml)用20mlOptiPro溶液溫育15分鐘。然后將PEI溶液加入到DNA溶液，旋轉(zhuǎn)混合，并且被溫育另外15分鐘。將20mlPEI/DNA混合物的等分試樣以1.0×106細(xì)胞數(shù)/ml加入到500ml的細(xì)胞培養(yǎng)物中。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞于37℃下在CO2恒溫箱中溫育7-9天。抗體野生型和變體利用FPLCAKTAPurifier系統(tǒng)(GEHealthcare)在蛋白A柱(GEHealthcare)上從組織培養(yǎng)物上清液中進(jìn)行純化。抗體利用50mM檸檬酸鹽緩沖液pH3.5從柱中洗脫，并且用1MTris-HClpH9.0平衡至pH6.6-7.0。該洗出液經(jīng)過Q瓊脂糖柱(GEHealthcare)以去除帶負(fù)電的雜質(zhì)。在pH7.0及以下，抗體帶正電并且保留在流通液中，而帶負(fù)電的雜質(zhì)結(jié)合到Q瓊脂糖柱的帶正電的基質(zhì)。具有純化的抗體的溶液用30KMWCO(Millipore,VWR)過濾器濃縮，并且緩沖液用20mMHis緩沖液pH6.5交換至最終濃度150mg/ml。作為質(zhì)量控制，通過SDS-PAGE在非還原和還原條件下分析被純化并濃縮的樣品的等分試樣。每個(gè)樣品4μg的蛋白質(zhì)等分試樣在具有和不具有DTT的變性緩沖液中進(jìn)行溫育，并且被在10％聚丙烯酰胺凝膠(Pierce)上解析。通過圓二色性比較了變體A1和野生型抗體，其中光譜實(shí)質(zhì)相同，表明兩蛋白質(zhì)具有實(shí)質(zhì)相同等級(jí)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。實(shí)施例6–抗體變體的生物物理學(xué)表征抗體變體的穩(wěn)定性用三種不同的分析方法進(jìn)行分析。濁度試驗(yàn)濁度試驗(yàn)在65℃下進(jìn)行達(dá)4小時(shí)。抗體A和變體在20mMHis,pH6.5中濃度為150mg/ml，并且在15mM磷酸鉀緩沖液,pH6.5中稀釋15倍至10mg/ml用于濁度評(píng)價(jià)。除了定性觀察外，在進(jìn)一步將樣品稀釋至1mg/ml并且記錄如表3中所示的320nm下吸光度值后量化濁度。表3：抗體A野生型和變體的濁度試驗(yàn)比較。150mg/ml的樣品在65℃下溫育達(dá)4小時(shí)。星號(hào)表示10mg/ml的溶液的狀態(tài)，或者如果樣品已經(jīng)凝膠化，如下：*表示稀釋后液體，混濁的；**表示稀釋后凝膠，清澈的；以及***表示稀釋后凝膠，混濁的。不帶有星號(hào)的值是稀釋后液體，清澈的。數(shù)值表示樣品進(jìn)一步稀釋至1mg/ml后320nm下的吸光度。變體0HRS1HR2HRS4HRSWT0.020.060.27****A10.010.030.040.19*A20.010.040.07**A30.010.030.05**A40.010.040.040.13*A50.010.040.090.14*尺寸排阻-高效液相色譜(SEC-HPLC)作為第二優(yōu)選的試驗(yàn)，SEC-HPLC被用于測(cè)定在加速聚集實(shí)驗(yàn)中單體隨著時(shí)間的減少?？贵wA野生型和變體于58℃下以150mg/ml在熱循環(huán)器(BioRad)中溫育達(dá)24小時(shí)。對(duì)于各時(shí)間點(diǎn)，2μl樣品等分試樣在15mM磷酸鉀緩沖液,pH6.5中稀釋15倍至最終濃度10mg/ml。單體通過SEC-HPLC從非單體種類解析在TSKgelSuperSW3000柱(TOSOHBioscience)，其保持在22℃，流動(dòng)相為150mM磷酸鉀,pH6.5，流速為0.2ml/min。單體百分?jǐn)?shù)被計(jì)算為在280nm下檢測(cè)的單體峰的面積除以所有峰的總面積。差示掃描量熱法第三，抗體A野生型和變體的熱力學(xué)穩(wěn)定性通過差示掃描量熱法(DSC,Microcal)進(jìn)行比較。MAbs具有典型的DSC熱圖，具有三個(gè)熔解轉(zhuǎn)變，如果不重疊：Fab、CH2和CH3(Ionescuetal.,JPharmSci,v.97,1414,2008；Mimuraetal.,JBiolChem,v.276,45539,2001)。在這里所用的實(shí)驗(yàn)條件下，抗體AFab在77℃下具有熔解轉(zhuǎn)變。CH2和CH3熔解溫度分別在73℃和83℃。因此，在抗體A中，CH2是具有最低熔解溫度的抗體結(jié)構(gòu)域。抗體A野生型和變體A1-A5以濃度2mg/ml在20mMHispH6.5緩沖液和加熱速度1.0℃/min下進(jìn)行分析。通過減去參考數(shù)據(jù)、標(biāo)準(zhǔn)化到蛋白濃度和DSC細(xì)胞體積，和立方基線的插入而分析樣本數(shù)據(jù)。峰利用MicrocalOrigin5.0軟件通過非-2-態(tài)(non-2-state)擬合被解卷積。熱圖的比較表明變體中CH2熔解轉(zhuǎn)變相比野生型增加了1至3℃，其中兩個(gè)變體A4和A5差別最顯著(下面表4)。表4：Tm1是CH2結(jié)構(gòu)域的熔化轉(zhuǎn)變點(diǎn)。Tm2是Fab結(jié)構(gòu)域的熔化轉(zhuǎn)變點(diǎn)。Tm3是CH3結(jié)構(gòu)域的熔化轉(zhuǎn)變點(diǎn)。實(shí)施例7–總結(jié)抗體A野生型和變體的濁度、SEC-HPLC和DSC實(shí)驗(yàn)的結(jié)果被總結(jié)在表5中。表5：抗體A野生型和變體的總結(jié)結(jié)果。圖例：+最不穩(wěn)定；++如WT一樣穩(wěn)定；+++較穩(wěn)定；++++最穩(wěn)定。三種單個(gè)突變體A1、A2和A3中每一個(gè)通過三種分析方法中每一種顯示提高的穩(wěn)定性。在濁度試驗(yàn)中，抗體Awt野生型樣品的稀釋在65℃下應(yīng)力2小時(shí)導(dǎo)致溶液發(fā)混，而所有變體的溶液保持清澈。樣品的SEC-HPLC結(jié)果在58℃下應(yīng)力24小時(shí)，顯示單體從野生型91％增加至變體93-95％。當(dāng)初始單體群為99％時(shí)，變體中非單體種類相比野生型相比下降了達(dá)一半。DSC分析表明CH2熔化轉(zhuǎn)變(抗體A中具有最低熔解轉(zhuǎn)變的結(jié)構(gòu)域)從野生型的73℃增至變體的75-76℃。替代變體A1中另外高SAP殘基進(jìn)一步提高了穩(wěn)定性，如變體A4和A5的濁度結(jié)果和DSC熱圖所證明。SEC-HPLC結(jié)果顯示僅僅變體A4相對(duì)于變體A1的提高(24小時(shí)應(yīng)力后96％單體)，而不是變體A5(24小時(shí)應(yīng)力后93％單體，像變體A1一樣)。經(jīng)過證實(shí)，在第二抗體中產(chǎn)生類似的突變，其中在抗體的CDR區(qū)域中添加了殘基的突變。所測(cè)試的突變中除了一個(gè)突變外都提高了穩(wěn)定性和/或降低了聚集。CDR區(qū)域中一個(gè)殘基上的突變沒有如所預(yù)測(cè)得進(jìn)行，然而，這可能是因?yàn)樵撟凅w沒有良好地表達(dá)，其可能是由于折疊缺陷并且因此具有比野生型更大程度的聚集，甚至在加速聚集分析之前。因此，在框架和保守區(qū)域中測(cè)試的所有突變產(chǎn)生所預(yù)測(cè)的結(jié)果，因此證明SAP算法是強(qiáng)大的，唯一可能的例外是不能正確折疊的突變。然而，考慮到突變都是對(duì)于表面暴露的殘基并且包括用更親水性殘基的取代，這種折疊問題期望是稀有的。實(shí)施例8–另外抗體變體的穩(wěn)定性分析設(shè)計(jì)了另外的變體并且分析了其在第一和第二抗體中提高的穩(wěn)定性。突變的位點(diǎn)基于SAP預(yù)測(cè)。各個(gè)變體中的突變被列在表6中。表6：另外變體中突變位點(diǎn)的位置SEC-HPLC被用于測(cè)定在加速聚集實(shí)驗(yàn)中單體隨時(shí)間的減少。對(duì)于第一抗體，野生型和變體抗體于58℃下以150mg/ml在熱循環(huán)器(BioRad)中溫育達(dá)24小時(shí)。對(duì)于第二抗體，野生型和變體抗體于52℃下以60mg/ml在熱循環(huán)器(BioRad)中溫育達(dá)36小時(shí)。對(duì)于各時(shí)間點(diǎn)，2μl樣品等分試樣在15mM磷酸鉀緩沖液，pH6.5中稀釋15倍至最終濃度10mg/ml。單體通過SEC-HPLC從非單體種類解析在TSKgelSuperSW3000柱(TOSOHBioscience)，其保持在22℃，流動(dòng)相為150mM磷酸鉀，pH6.5，流速為0.2ml/min。單體百分?jǐn)?shù)被計(jì)算為在280nm下檢測(cè)的單體峰的面積除以所有峰的總面積。變體A6顯示在12小時(shí)從野生型的95.5％增加至96％單體并且在24小時(shí)從野生型的91％增加至92％單體。變體A7顯示在12小時(shí)從野生型的96.5％增加至97.5％單體并且在24小時(shí)從野生型的91％增加至94％單體。變體A8顯示在12小時(shí)從野生型的96.5％增加至98.5％單體并且在24小時(shí)從野生型的91％增加至97％單體。變體B6顯示在12小時(shí)單體百分?jǐn)?shù)沒有明顯差別，顯示在24小時(shí)從野生型的97.5％增加至98％單體，并且在36小時(shí)從野生型的96％增加至97％單體。實(shí)施例9–蛋白質(zhì)-碳水化合物相互作用在SAP和穩(wěn)定性方面的作用在該實(shí)施例中我們測(cè)定了抗體的糖基化對(duì)SAP值的作用。在下測(cè)定具有和不具有糖基化的完整抗體的SAP。從具有G0-糖基化的完整抗體的30ns分子動(dòng)力學(xué)模擬測(cè)定具有糖基化的抗體的SAP。不具有糖基化的抗體的SAP采用相同的模擬進(jìn)行測(cè)定，但是其中我們?cè)赟AP分析中去除了糖基化。高SAP區(qū)域是最易聚集的區(qū)域。觀察到糖基化的去除顯著增加了被糖基化覆蓋的區(qū)域中的SAP，尤其對(duì)于殘基F241和F243。因此，糖基化的去除或取代導(dǎo)致易聚集區(qū)域的顯著增加。這些區(qū)域可能直接引起聚集或者降低未折疊的自由能壘，使非糖基化形式相比糖基化形式更不穩(wěn)定。為了通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)-碳水化合物相互作用的作用，產(chǎn)生了兩種抗體突變，F(xiàn)241SF243S(變體FS)和F241YF243Y(變體FY)。變體FS具有已知與碳水化合物部分相互作用的苯丙氨酸殘基，其被具有較小非芳族側(cè)鏈的極性絲氨酸殘基取代(Deisenhofer,Biochem,1981,20,2361-70；Krappetal.,JMolBiol,2003,325,979-89)。在變體FY中，相同的苯丙氨酸殘基被Tyr殘基——其已經(jīng)表明具有較高的糖界面傾向——取代(Taronietal.,ProteinEng,2000,13,89-98)。同時(shí)，其他疏水性殘基例如Val264在該區(qū)域保持未修飾。野生型和變體FY具有非常少的——如果有的話——其碳水化合物的唾液酸化作用，而變體FS分子的接近50％具有至少一個(gè)唾液酸殘基。在加速聚集實(shí)驗(yàn)中和通過差示掃描微量熱法(DSC)比較野生型和變體FS和FY的穩(wěn)定性。150mg/ml的樣品被誘導(dǎo)成在58℃下聚集達(dá)36小時(shí)，并且單體水平被解析并且通過尺寸排阻-高效液相色譜(SEC-HPLC)量化。野生型單體水平對(duì)于0、12、24和36小時(shí)時(shí)間點(diǎn)逐漸從100降至96、91和87％。比較起來，變體FY在較早的時(shí)間點(diǎn)已將單體水平降低1-3％但在36小時(shí)保持在88％，其在野生型的統(tǒng)計(jì)學(xué)誤差之內(nèi)。變體FS在該溫度下明顯不穩(wěn)定，顯示在12小時(shí)單體從99％降至39％，以及在24小時(shí)降至20％。36小時(shí)樣品由于不存在大量可見聚集體而沒有在SEC-HPLC上運(yùn)行。DSC結(jié)果也區(qū)分變體和野生型。CH2結(jié)構(gòu)域的熔解溫度(Tm)從野生型的73℃降至變體FS的59℃。對(duì)于Fab和CH3的熔解轉(zhuǎn)變也觀察到變體FS中微小的差別，不大于1℃。盡管變體FY的CH2熔解轉(zhuǎn)變肩部與野生型重疊，但是軟件擬合顯示CH2Tm降至71℃，而其他兩個(gè)Tm's保持不變。進(jìn)行了許多另外的實(shí)驗(yàn)以比較變體FS與野生型和更好地理解所觀察到的穩(wěn)定性下降。變體FS保持與野生型相同的富含β折疊的結(jié)構(gòu)。變體相比起野生型在還原以及天然凝膠電泳上具有不同的遷移模式。還進(jìn)行了蛋白酶處理實(shí)驗(yàn)以比較變體FS和野生型中的蛋白表面暴露。對(duì)于變體FS，用Glu-C消化抗體比野生型更有效(更小的片段)；在變體和野生型脫糖基化的對(duì)應(yīng)物中效率在很大程度上相等，盡管有一些差別。此外，變體FS保持完全FcRn和部分FcγRIa結(jié)合功能但失去對(duì)FcγRII和FcγRIII受體的結(jié)合。序列表<110>諾華公司麻省理工學(xué)院V?沃諾夫N?陳納姆塞蒂V?卡瑟爾B?海爾克B?L?垂奧特<120>具有降低的聚集的免疫球蛋白<130>61967-2000140<140>還未指定<141>與此同時(shí)<150>US61/074,466<151>2008-06-20<150>US61/151,368<151>2009-02-10<160>19<170>FastSEQforWindowsVersion4.0<210>1<211>101<212>PRT<213>智人（Homosapiens）<400>1AlaSerThrLysGlyProSerValPheProLeuAlaProSerSerLys151015SerThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyr202530PheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSer354045GlyValHisThrPheProAlaValLeuGlnSerSerGlySerLeuSer505560SerValValThrValProSerSerSerLeuGlyThrGlnThrTyrIle65707580CysAsnValAsnHisLysProSerAsnThrLysValAspLysArgVal859095GluProLysSerCys100<210>2<211>101<212>PRT<213>智人<400>2AlaSerThrLysGlyProSerValPheProLeuAlaProCysSerArg151015SerThrSerGluSerThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyr202530PheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSer354045GlyValHisThrPheProAlaValLeuGlnSerSerGlySerLeuSer505560SerValValThrValProSerSerAsnPheGlyThrGlnThrTyrThr65707580CysAsnValAspHisLysProSerAsnThrLysValAspLysThrVal859095GluArgLysCysCys100<210>3<211>101<212>PRT<213>智人<400>3AlaSerThrLysGlyProSerValPheProLeuAlaProCysSerArg151015SerThrSerGluSerThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyr202530PheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSer354045GlyValHisThrPheProAlaValLeuGlnSerSerGlySerLeuSer505560SerValValThrValProSerSerSerLeuGlyThrLysThrTyrThr65707580CysAsnValAspHisLysProSerAsnThrLysValAspLysArgVal859095GluSerLysTyrGly100<210>4<211>101<212>PRT<213>智人<400>4AlaSerThrLysGlyProSerValPheProLeuAlaProCysSerArg151015SerThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyr202530PheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSer354045GlyValHisThrPheProAlaValLeuGlnSerSerGlySerLeuSer505560SerValValThrValProSerSerSerLeuGlyThrGlnThrTyrThr65707580CysAsnValAsnHisLysProSerAsnThrLysValAspLysArgVal859095GluProLysThrPro100<210>5<211>17<212>PRT<213>智人<400>5AspLysThrHisThrCysProProCysProAlaProGluLeuLeuGly151015Gly<210>6<211>13<212>PRT<213>智人<400>6ValGluCysProProCysProAlaProProValAlaGly1510<210>7<211>14<212>PRT<213>智人<400>7ProProCysProSerCysProAlaProGluPheLeuGlyGly1510<210>8<211>26<212>PRT<213>智人<400>8LeuGlyThrThrHisThrCysProArgCysProGluProLysCysPro151015ArgCysProAlaProGluLeuLeuGlyGly2025<210>9<211>106<212>PRT<213>智人<400>9ProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetIle151015SerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHisGlu202530AspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHis354045AsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerTyrValVal505560SerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyr65707580LysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAlaProIleGluLysThr859095IleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGlu100105<210>10<211>108<212>PRT<213>智人<400>10ProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetIle151015SerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHisGlu202530AspProGluValGlnPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHis354045AsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnPheAsnSerThrPheArg505560ValValSerValLeuThrValValHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLys65707580GluTyrLysCysLysValSerAsnLysGlyLeuProAlaProIleGlu859095LysThrIleSerLysThrLysGlyGlnProArgGlu100105<210>11<211>106<212>PRT<213>智人<400>11ProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetIle151015SerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerGlnGlu202530AspProGluValGlnPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHis354045AsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnPheAsnSerTyrValVal505560SerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyr65707580LysCysLysValSerAsnLysGlyLeuProSerSerIleGluLysThr859095IleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGlu100105<210>12<211>106<212>PRT<213>智人<400>12ProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetIle151015SerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHisGlu202530AspProGluValGlnPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHis354045AsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerTyrValVal505560SerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyr65707580LysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAlaProIleGluLysThr859095IleSerLysThrLysGlyGlnProArgGlu100105<210>13<211>100<212>PRT<213>智人<400>13ProGlnValTyrThrLeuProProSerArgGluGluMetThrLysAsn151015GlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIle202530AlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThr354045ThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLysLysLeuThr505560ValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerVal65707580MetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeu859095SerProGlyLys100<210>14<211>100<212>PRT<213>智人<400>14ProGlnValTyrThrLeuProProSerArgGluGluMetThrLysAsn151015GlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIle202530AlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThr354045ThrProProMetLeuAspSerAspGlySerPhePheLysLysLeuThr505560ValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerVal65707580MetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeu859095SerProGlyLys100<210>15<211>100<212>PRT<213>智人<400>15ProGlnValTyrThrLeuProProSerGlnGluGluMetThrLysAsn151015GlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIle202530AlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThr354045ThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLysArgLeuThr505560ValAspLysSerArgTrpGlnGluGlyAsnValPheSerCysSerVal65707580MetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeu859095SerLeuGlyLys100<210>16<211>100<212>PRT<213>智人<400>16ProGlnValTyrThrLeuProProSerArgGluGluMetThrLysAsn151015GlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIle202530AlaValGluTrpGluSerSerGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThr354045ThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLysLysLeuThr505560ValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnIlePheSerCysSerVal65707580MetHisGluAlaLeuHisAsnHisPheThrGlnLysSerLeuSerLeu859095SerProGlyLys100<210>17<211>7<212>PRT<213>釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)<400>17GlyAsnAsnGlnGlnAsnTyr15<210>18<211>7<212>PRT<213>智人<400>18LysLeuValPhePheAlaGlu15<210>19<211>11<212>PRT<213>智人<400>19ValHisHisGlnLysLeuValPhePheAlaGlu1510當(dāng)前第1頁1 2 3