本發(fā)明涉及一種實(shí)驗(yàn)動物過敏模型的制備方法，尤其涉及一種氣管內(nèi)霧化致豚鼠主動全身過敏模型的制備方法。
背景技術(shù)：
：肺部給藥由于藥物直接以較高濃度到達(dá)肺部靶器官，作用直接，起效迅速，且用藥量少，能有效減少全身給藥所產(chǎn)生的不良反應(yīng)，是治療呼吸系統(tǒng)疾病或全身疾病理想的給藥途徑，在臨床上應(yīng)用已久。因此經(jīng)呼吸道給藥或通過呼吸道染毒是針對吸入制劑藥效及進(jìn)行安全性評價(jià)不可或缺的手段。目前，針對臨床常用的水霧劑或粉霧劑等吸入制劑的安全性研究較為缺乏，多采用口鼻暴露和全身暴露，此種方法雖然無創(chuàng)但無法精確定量給藥劑量，藥物容易沉降于暴露塔內(nèi)損耗較大，另一方面相關(guān)儀器及配套發(fā)生器價(jià)格不菲。傳統(tǒng)暴露式氣管插管方式需手術(shù)暴露氣管，不適于長期給藥。由此可見針對吸入制劑的安全性評價(jià)需要開創(chuàng)一種無創(chuàng)且精確的給藥方式。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題提出的一種精確定量且無浪費(fèi)的氣管內(nèi)霧化致豚鼠主動全身過敏模型的制備方法。為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施為：一種氣管內(nèi)霧化致豚鼠主動全身過敏模型的制備方法，包括以下步驟：步驟一，借助喉鏡使用霧化針頭經(jīng)氣管內(nèi)插管，霧化給予卵白蛋白，隔日一次，共三次，使豚鼠致敏；步驟二，在所述步驟一末次致敏后第14和21天，分別經(jīng)氣管內(nèi)霧化給予卵白蛋白，從而激發(fā)豚鼠產(chǎn)生主動全身過敏，即得豚鼠主動全身過敏模型。為了優(yōu)化上述制備方法，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括：進(jìn)一步地，所述步驟一為采用MicroSprayer霧化針頭經(jīng)氣管內(nèi)插管，霧化給予卵白蛋白生理鹽水溶液；所述步驟一中霧化給予卵白蛋白生理鹽水溶液中卵白蛋白濃度為1～4mg/ml，更優(yōu)選為2mg/ml；霧化給予卵白蛋白生理鹽水溶液的劑量為0.2-0.8ml，更優(yōu)選為0.5ml。進(jìn)一步地，所述步驟二為在步驟一末次致敏后第14和21天，采用MicroSprayer霧化針頭經(jīng)氣管內(nèi)插管霧化給予卵白蛋白生理鹽水溶液。進(jìn)一步地，所述步驟二中霧化給予卵白蛋白生理鹽水溶液中卵白蛋白濃度為2～6mg/ml，更優(yōu)選為4mg/ml；霧化給予卵白蛋白生理鹽水溶液的劑量為0.2-1.0ml，更優(yōu)選為0.5ml。同時，本發(fā)明還可以采用HRH-MAG6型粉塵霧化針頭實(shí)施，故步驟一為采用HRH-MAG6型粉塵霧化針頭經(jīng)氣管內(nèi)插管，霧化給予卵白蛋白干粉。進(jìn)一步地，所述步驟一中霧化給予卵白蛋白干粉的劑量為1～3mg/只，更優(yōu)選為2mg/只。進(jìn)一步地，所述步驟二為在步驟一末次致敏后第14和21天，采用HRH-MAG6型粉塵霧化針頭經(jīng)氣管內(nèi)插管霧化給予卵白蛋白干粉；所述步驟二中霧化給予卵白蛋白干粉的劑量為2-6mg/只，更優(yōu)選為4mg/只。本發(fā)明中實(shí)施氣管內(nèi)插管給予霧化時，借助小動物喉鏡在視野內(nèi)暴露會咽部位，將霧化針頭插入氣管中，快速并用力推注注射器針芯，使液體呈霧狀。注意操作時動作輕柔、迅速，所有器械注意及時消毒。本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果：本方法動物處于清醒狀態(tài)，避免手術(shù)創(chuàng)傷，模擬吸入制劑進(jìn)入動物氣管內(nèi)給藥，靶器官唯一，針對性強(qiáng)，重復(fù)性好。而且該法可以精確定量藥物進(jìn)入呼吸道是否引起過敏，同時沒有多余藥物浪費(fèi)。實(shí)驗(yàn)證明效果良好，以氣管內(nèi)霧化OVA生理鹽水溶液進(jìn)行致敏激發(fā)，成功地誘發(fā)了豚鼠主動全身過敏癥狀，建立了豚鼠主動全身過敏模型。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供了一種氣管內(nèi)霧化致豚鼠主動全身過敏模型的制備方法，包括以下步驟：步驟一，借助喉鏡使用霧化針頭經(jīng)氣管內(nèi)插管，霧化給予卵白蛋白，隔日一次，共三次，使豚鼠致敏；步驟二，在所述步驟一末次致敏后第14和21天，分別經(jīng)氣管內(nèi)霧化給予卵白蛋白，從而激發(fā)豚鼠產(chǎn)生主動全身過敏，即得豚鼠主動全身過敏模型。下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)和具體的介紹，以使更好的理解本發(fā)明，但是下述實(shí)施例并不限制本發(fā)明范圍。實(shí)施例1氣管內(nèi)霧化制備豚鼠主動全身過敏模型實(shí)驗(yàn)動物：采用豚鼠16只，雌雄各半。Hartley，SPF級，體重300～350g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)用卵白蛋白(OVA)：購買自SIGMA公司，氯化鈉注射液購買自華裕(無錫)制藥有限公司。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度：20～25℃；濕度：40～70％。光照：自動光照，每12小時明暗交替。氣管內(nèi)霧化致豚鼠主動全身過敏模型制備方法主要分為致敏期和激發(fā)期兩個階段。致敏期間：OVA組霧化給予2mg/ml的OVA生理鹽水溶液，0.5ml/只，隔日一次，給藥時間為D1、D3、D5天，共三次；陰性對照組(n.s.)以氯化鈉注射液代替OVA生理鹽水溶液。激發(fā)期間：上述動物末次致敏后第14天(D19)和第21(D26)天，各取半數(shù)豚鼠氣管內(nèi)霧化激發(fā)：仍借助小動物喉鏡采用霧化針頭經(jīng)氣管內(nèi)插管，分別霧化給予4mg/ml的OVA生理鹽水溶液或氯化鈉注射液，0.5ml/只進(jìn)行攻擊。致敏和激發(fā)途徑均為氣管內(nèi)霧化：借助小動物喉鏡壓住舌頭，在視野內(nèi)可見暴露的會咽部位，根據(jù)動物呼吸頻率觀察到動物氣管口有節(jié)律的開合，當(dāng)動物吸氣即氣管打開時，小心并迅速將霧化針頭插入氣管中，快速并用力推注注射器針芯，使液體呈霧狀。給藥成功后，動物可見一過性咳嗽，濕羅音。注意操作時動作輕柔、迅速，所有器械注意及時消毒。所得結(jié)果為：致敏期間每日對各組豚鼠進(jìn)行大體觀察，均無異常表現(xiàn)。激發(fā)期間：激發(fā)后立即觀察動物表現(xiàn)，觀察是否出現(xiàn)顫抖、豎毛、咳嗽、呼吸困難、步態(tài)不穩(wěn)、痙攣、休克以及死亡等反應(yīng)癥狀，按表1記錄每日動物的反應(yīng)以及過敏癥狀出現(xiàn)的時間并按表2的標(biāo)準(zhǔn)對過敏反應(yīng)的強(qiáng)度進(jìn)行判斷。表1.主動全身過敏反應(yīng)癥狀a正常h呼吸急促o步態(tài)不穩(wěn)b躁動i排尿p跳躍c豎毛j排糞q喘息d發(fā)抖k流淚r痙攣e搔鼻l呼吸困難s旋轉(zhuǎn)f噴嚏m嘯鳴音t潮式呼吸g咳嗽n紫癜u死亡表2.全身致敏性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)癥狀程度評分a過敏反應(yīng)陰性0b-e過敏反應(yīng)弱陽性1f-k過敏反應(yīng)陽性2l-t過敏反應(yīng)強(qiáng)陽性3u過敏反應(yīng)極強(qiáng)陽性4本發(fā)明中，u癥狀(死亡)是最嚴(yán)重的現(xiàn)象，故給予4分；a癥狀：0分；b-e癥狀：每一個癥狀各給予1分；f-k癥狀：每一個癥狀各給予2分；l-t癥狀：每一個癥狀各給予3分。豚鼠過敏發(fā)生率結(jié)果見表3。表3豚鼠過敏反應(yīng)發(fā)生率組別劑量(mg/kg)發(fā)生率(％)時間(s)評分n.s.0.0000OVA1.010032.2±6.74從上述結(jié)果中可以看出，本發(fā)明中陰性對照組動物未出現(xiàn)過敏反應(yīng)癥狀，OVA生理鹽水溶液組動物出現(xiàn)過敏反應(yīng)癥狀，本發(fā)明的試驗(yàn)系統(tǒng)成立。計(jì)算過敏反應(yīng)率(每組發(fā)生過敏反應(yīng)的動物數(shù)/該組動物總數(shù))，根據(jù)過敏反應(yīng)發(fā)生率和發(fā)生程度綜合評價(jià)過敏反應(yīng)情況，判定OVA生理鹽水溶液組動物過敏反應(yīng)率為100％。以氣管內(nèi)霧化形式給予OVA可導(dǎo)致豚鼠過敏。分析豚鼠血清組胺含量，發(fā)現(xiàn)氣管內(nèi)霧化OVA生理鹽水溶液致敏可致組胺含量明顯升高，測定結(jié)果如表4所示，末次致敏后第14天和21天，OVA組血清組胺含量較n.s.組相比有明顯升高(p＜0.05)。表4末次致敏后第14天和21天OVA對血清組胺含量的影響(n＝8)組別OVA劑量血清組胺含量(ng/ml)n.s.0.098.56±43.75OVA1.0269.45±137.06*注：與n.s.組相比，*P＜0.05；n＝8。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明利用氣管內(nèi)霧化吸入給予OVA作為建立豚鼠主動全身過敏模型的給藥方式，在末次致敏后第14天(D19)和第21天(D26)進(jìn)行激發(fā)，OVA組動物均出現(xiàn)了不同程度的過敏反應(yīng)，甚至出現(xiàn)死亡。分析豚鼠血清組胺含量，發(fā)現(xiàn)吸入霧化OVA致敏原可致組胺含量顯著升高。上述結(jié)果證明經(jīng)氣管內(nèi)霧化給予OVA生理鹽水溶液成功建立了豚鼠主動全身過敏模型，為進(jìn)行吸入制劑的安全性評價(jià)或完成吸入制劑治療氣道過敏性哮喘等各種疾病模型奠定了基礎(chǔ)。實(shí)施例2氣管內(nèi)霧化制備豚鼠主動全身過敏模型實(shí)驗(yàn)動物的準(zhǔn)備方法和飼養(yǎng)環(huán)境請參見實(shí)施例1記載的技術(shù)內(nèi)容。氣管內(nèi)霧化制備豚鼠主動全身過敏模型分為致敏期和激發(fā)期兩個階段。致敏期為：豚鼠氣管內(nèi)霧化1mg/mlOVA生理鹽水溶液0.5ml/只致敏，隔日1次，給藥時間為D1、D3和D5，共給藥3次。激發(fā)期為：末次致敏后第14天(D19)和第21天(D26)，分別取一半的動物氣管內(nèi)霧化給予2mg/ml的OVA生理鹽水溶液0.5ml/只激發(fā)，通過實(shí)施例1所述鑒定方法確定成功建立豚鼠主動全身過敏模型。實(shí)施例3氣管內(nèi)霧化制備豚鼠主動全身過敏模型實(shí)驗(yàn)動物的準(zhǔn)備方法和飼養(yǎng)環(huán)境請參見實(shí)施例1記載的技術(shù)內(nèi)容。樣品要求：由于粉塵霧化器要求樣品為粒徑小于100μm的干燥粉末，故研磨一定量的卵白蛋白，使其能夠通過國家標(biāo)準(zhǔn)篩孔內(nèi)徑為75μm±4.1μm的九號篩，稱取一定量的卵白蛋白干粉進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。氣管內(nèi)霧化制備豚鼠主動全身過敏模型分為致敏期和激發(fā)期兩個階段。致敏期為：豚鼠氣管內(nèi)霧化1mg/只OVA干粉致敏，隔日1次，給藥時間為D1、D3和D5，共給藥3次。激發(fā)期為：末次致敏后第14天(D19)和第21天(D26)，分別取一半的動物氣管內(nèi)霧化2mg/只OVA干粉激發(fā)，通過實(shí)施例1所述鑒定方法確定成功建立豚鼠主動全身過敏模型。通過上述實(shí)施例能夠知道，本發(fā)明的制備方法使得動物處于清醒狀態(tài)，避免手術(shù)創(chuàng)傷，模擬吸入制劑進(jìn)入動物氣管內(nèi)給藥，靶器官唯一，針對性強(qiáng)，重復(fù)性好。而且本發(fā)明可以精確定量藥物進(jìn)入呼吸道是否引起過敏，同時沒有多余藥物浪費(fèi)。實(shí)驗(yàn)證明效果良好，以氣管內(nèi)霧化OVA生理鹽水溶液進(jìn)行致敏激發(fā)，成功地誘發(fā)了豚鼠主動全身過敏癥狀，建立了豚鼠主動全身過敏模型。以上對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3