本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一球懸鈴木樹皮提取物，特別涉及一球懸鈴木樹皮三萜類成分提取物及水溶性總黃酮提取物，本發(fā)明還涉及一球懸鈴木樹皮提取物的制備方法及醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用，特別是一球懸鈴木樹皮三萜類成分及水溶性總黃酮提取物的制備方法及其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
懸鈴木在植物分類學(xué)上屬懸鈴木科(Platanaceae)，科下僅有一個懸鈴木屬(Platanus)，屬下有11種，原產(chǎn)東南歐、印度及美洲。據(jù)記載我國晉代即已引種，今陜西戶縣存有古樹，叫祛汗樹或鳩摩羅什樹?，F(xiàn)我國引入栽培的僅3種，有一球懸鈴木(Platanus occidentalis L.)、二球懸鈴木(Platanus acerifolia Willd.)及三球懸鈴木(Platanus orientalis L.)，南北各地有栽培，許多地方常作為行道樹種植，素有“行道樹之王”的美稱。其中一球懸鈴木原產(chǎn)北美洲，亦俗稱美國梧桐，現(xiàn)廣泛被引種我國北部及中部，樹皮有淺溝，呈小塊狀剝落。目前國內(nèi)對懸鈴木的園林價值及其對環(huán)境的影響方面的研究較多，但對其化學(xué)成分和藥用活性方面研究較少，對懸鈴木屬二球懸鈴木樹皮中的三萜類成分有初步的提取分離研究，但對一球懸鈴木樹皮中三萜類成分的研究未見公開報道，尤其對一球懸鈴木樹皮中的水溶性總黃酮及其抗腫瘤活性未見有公開報道。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種一球懸鈴木樹皮提取物及其制備方法，一球懸鈴木樹皮提取物包括一球懸鈴木樹皮三萜類成分提取物及水溶性總黃酮提取物，本發(fā)明制備的一球懸鈴木樹皮提取物可在醫(yī)藥領(lǐng)域中應(yīng)用，一球懸鈴木樹皮三萜類成分提取物可用于制備抗菌及抗炎類醫(yī)藥，一球懸鈴木樹皮水溶性總黃酮提取物可用于制備具有抗腫瘤作用的醫(yī)藥。
本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，取一球懸鈴木樹皮，加一球懸鈴木樹皮質(zhì)量8-20倍量的50％-80％(v/v)的乙醇，置于閃式提取器中室溫提取1-5min，過濾，濾液50℃減壓回收乙醇，濃縮至比重為1.10-1.20的浸膏，加入與浸膏相同質(zhì)量的蒸餾水，然后用與浸膏相同質(zhì)量的乙酸乙酯微波萃取3次，置于間歇微波萃取裝置中進(jìn)行常壓萃取，每次萃取微波輻射1-5次，每次輻射時間2-5min，每次間歇時間5-20min，合并3次所得乙酸乙酯層萃取液，50℃減壓回收乙酸乙酯，50℃減壓干燥，即得一球懸鈴木樹皮三萜類成分提取物；乙酸乙酯萃取后的溶液60℃揮盡乙酸乙酯，冷凍干燥，加40℃蒸餾水使溶解，過濾，濾液放冷至室溫，通過大孔吸附樹脂柱，依次以蒸餾水、60％乙醇(v/v)洗脫，60％乙醇(v/v)洗脫液減壓回收溶劑，揮盡乙醇，通過聚酰胺柱層析，收集洗脫液，洗脫液冷凍干燥即得一球懸鈴木樹皮水溶性總黃酮提取物；所述大孔吸附樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂或D-101型大孔吸附樹脂。
本發(fā)明制備的一球懸鈴木樹皮三萜類成分提取物具有抗菌及抗炎的生物活性，可用于抗菌及抗炎類醫(yī)藥的開發(fā)；本發(fā)明制備的一球懸鈴木樹皮水溶性總黃酮提取物具有抗腫瘤的生物活性，可用于抗腫瘤醫(yī)藥的開發(fā)。
本發(fā)明方法簡單，科學(xué)有效，資源豐富，易于操作，可有效從一球懸鈴木樹皮中制備三萜類成分提取物及水溶性總黃酮提取物，一球懸鈴木樹皮三萜類成分提取物可有效用于制備抗菌及抗炎類藥物，一球懸鈴木樹皮水溶性總黃酮提取物可有效用于制備抗腫瘤藥物，開拓了一球懸鈴木樹皮三萜類成分及水溶性總黃酮的應(yīng)用價值，具有良好的經(jīng)濟(jì)和社會效益。
具體實施方式
以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的具體實施方式作詳細(xì)說明。
本發(fā)明在具體實施中，可由以下實施例給出。
實施例1
本發(fā)明在具體實施中，其特征在于，取一球懸鈴木樹皮1kg，加50％乙醇(v/v)8kg，置于閃式提取器中室溫提取1min，過濾，濾液50℃減壓回收乙醇，濃縮至比重為1.10的浸膏，加入與浸膏相同質(zhì)量的蒸餾水，然后用與浸膏相同質(zhì)量的乙酸乙酯微波萃取3次，置于間歇微波萃取裝置中進(jìn)行常壓萃取，每次萃取微波輻射1次，每次輻射時間2min，每次間歇時間5min，合并3次所得乙酸乙酯層萃取液，50℃減壓回收乙酸乙酯，50℃減壓干燥，即得一球懸鈴木樹皮三萜類成分提取物；乙酸乙酯萃取后的溶液60℃揮盡乙酸乙酯，冷凍干燥，加40℃蒸餾水使溶解，過濾，濾液放冷至室溫，通過AB-8型大孔吸附樹脂柱，依次以蒸餾水、60％乙醇(v/v)洗脫，60％乙醇(v/v)洗脫液減壓回收溶劑，揮盡乙醇，通過聚酰胺柱層析，收集洗脫液，洗脫液冷凍干燥即得一球懸鈴木樹皮水溶性總黃酮提取物。
實施例2
本發(fā)明還可是，取一球懸鈴木樹皮5kg，加80％乙醇(v/v)100kg，置于閃式提取器中室溫提取5min，過濾，濾液50℃減壓回收乙醇，濃縮至比重為1.20的浸膏，加入與浸膏相同質(zhì)量的蒸餾水，然后用與浸膏相同質(zhì)量的乙酸乙酯微波萃取3次，置于間歇微波萃取裝置中進(jìn)行常壓萃取，每次萃取微波輻射5次，每次輻射時間5min，每次間歇時間20min，合并3次所得乙酸乙酯層萃取液，50℃減壓回收乙酸乙酯，50℃減壓干燥，即得一球懸鈴木樹皮三萜類成分提取物；乙酸乙酯萃取后的溶液60℃揮盡乙酸乙酯，冷凍干燥，加40℃蒸餾水使溶解，過濾，濾液放冷至室溫，通過D-101型大孔吸附樹脂柱，依次以蒸餾水、60％乙醇(v/v)洗脫，60％乙醇(v/v)洗脫液減壓回收溶劑，揮盡乙醇，通過聚酰胺柱層析，收集洗脫液，洗脫液冷凍干燥即得一球懸鈴木樹皮水溶性總黃酮提取物。
實施例3
取一球懸鈴木樹皮7kg，加65％乙醇(v/v)98kg，置于閃式提取器中室溫提取2.5min，過濾，濾液50℃減壓回收乙醇，濃縮至比重為1.15的浸膏，加入與浸膏相同質(zhì)量的蒸餾水，然后用與浸膏相同質(zhì)量的乙酸乙酯微波萃取3次，置于間歇微波萃取裝置中進(jìn)行常壓萃取，每次萃取微波輻射3次，每次輻射時間2.5min，每次間歇時間12min，合并3次所得乙酸乙酯層萃取液，50℃減壓回收乙酸乙酯，50℃減壓干燥，即得一球懸鈴木樹皮三萜類成分提取物；乙酸乙酯萃取后的溶液60℃揮盡乙酸乙酯，冷凍干燥，加40℃蒸餾水使溶解，過濾，濾液放冷至室溫，通過AB-8型大孔吸附樹脂柱，依次以蒸餾水、60％乙醇(v/v)洗脫，60％乙醇(v/v)洗脫液減壓回收溶劑，揮盡乙醇，通過聚酰胺柱層析，收集洗脫液，洗脫液冷凍干燥即得一球懸鈴木樹皮水溶性總黃酮提取物。
實施例4
取一球懸鈴木樹皮11kg，加65％乙醇(v/v)88kg，置于閃式提取器中室溫提取1min，過濾，濾液50℃減壓回收乙醇，濃縮至比重為1.15的浸膏，加入與浸膏相同質(zhì)量的蒸餾水，然后用與浸膏相同質(zhì)量的乙酸乙酯于微波萃取裝置中萃取3次，置于間歇微波萃取裝置中進(jìn)行常壓萃取，每次萃取微波輻射5次，每次微波輻射5min，間隔時間12min，合并3次所得乙酸乙酯層萃取液，50℃減壓回收乙酸乙酯，50℃減壓干燥，即得一球懸鈴木樹皮三萜類成分提取物；乙酸乙酯萃取后的溶液60℃揮盡乙酸乙酯，冷凍干燥，加40℃蒸餾水使溶解，過濾，濾液放冷至室溫，通過D-101型大孔吸附樹脂柱，依次以蒸餾水、60％乙醇(v/v)洗脫，60％乙醇(v/v)洗脫液減壓回收溶劑，揮盡乙醇，通過聚酰胺柱層析，收集洗脫液，洗脫液冷凍干燥即得一球懸鈴木樹皮水溶性總黃酮提取物。
上述制備的一球懸鈴木樹皮三萜類成分提取物的總?cè)坪烤坏陀?0％(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，比色法，常規(guī)測定方法，公知技術(shù))，三萜類總成分的轉(zhuǎn)移率均不低于85％；一球懸鈴木樹皮水溶性總黃酮提取物中總黃酮含量均不低于82％(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，紫外可見分光光度法，常規(guī)測定方法，公知技術(shù))。
上述僅是給出的幾個實施例，在研制中，發(fā)明人反復(fù)多次實驗，均取得了相同或相近的結(jié)果，方法可行有效，原料豐富，產(chǎn)品應(yīng)用前景廣泛，具有較高的實際應(yīng)用價值，對一球懸鈴木樹皮三萜類成分提取物及水溶性總黃酮提取物進(jìn)行反復(fù)試驗均取得了滿意的技術(shù)效果，相關(guān)試驗資料如下：
一球懸鈴木樹皮三萜類成分提取物抗菌、抗炎活性實驗
1.實驗材料
1.1細(xì)胞和實驗用菌種：肺泡上皮細(xì)胞株(A549)購于中國上海中科院細(xì)胞所；實驗用菌株肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aurues)和大腸桿菌(Escherichia coli)均購于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。
1.2試藥：一球懸鈴木樹皮三萜類成分提取物(本發(fā)明方法制備，總?cè)坪繛?1.4％)，1640培養(yǎng)基(索萊寶公司)，胎牛血清(四季青公司)，MTT、臺盼藍(lán)、LPS(Sigma公司)，DMSO、PMA(Amresco公司)，IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-αELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，IL-23ELISA試劑盒(Elabscience)，LPS(Sigma公司，美國)。
1.3儀器設(shè)備：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)，倒置顯微鏡(ZEISS)，HS-1300-U型超凈工作臺(蘇州安泰)、紫外分光光度計(BioMate)，SG-603生物安全柜(Baker)，酶標(biāo)儀(Thermo)、超凈純水機(Milli-Q Synthesis)，洗板機(Thermo)，超低溫冰箱(SANYO)。
2.研究方法
2.1抗炎研究方法
2.1.1細(xì)胞培養(yǎng):肺泡上皮細(xì)胞A549培養(yǎng)于含10％胎牛血清，100U·mL-1青霉素，100U·mL-1鏈霉素，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2d更換一次培養(yǎng)液，約每3d按1:3比例傳代一次。
2.1.2 ELISA法檢測細(xì)胞因子：以每孔1×104肺泡上皮細(xì)胞A549，接種培養(yǎng)24小時后，以孔為單位，分為正常組(加入完全培養(yǎng)基)、模型組(加入LPS 2μg·mL-1)，加藥組(加入LPS2μg·mL-1，加一球懸鈴木樹皮三萜類成分提取物5μg·mL-1、10μg·mL-1、20μg·mL-1)每組設(shè)6個復(fù)孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)，分別于刺激后48h后收集細(xì)胞上清，3000rpm離心10分鐘，分裝，-80℃保存?zhèn)溆?。實驗重?fù)3次。利用ELISA法檢測肺泡上皮細(xì)胞培養(yǎng)基上清中TNF-α、IL-lβ、IL-8、IL-23分泌量。
2.1.3統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。組間比較采用單因素方差分析的最小顯著差法，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示。顯著性水準(zhǔn)取α＝0.05。
2.2抗菌活性試驗方法
2.2.1菌懸液的制備
將肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、和大腸桿菌(Escherichia coli)菌種接種于含無菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，37℃孵育培養(yǎng)24h；然后取該增菌培養(yǎng)物，再接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，37℃孵箱培養(yǎng)6h。抽取一定量培養(yǎng)物用無菌生理鹽水調(diào)配成含菌量約為107cfu/mL的菌懸液，用顯微鏡進(jìn)行菌落計數(shù)。
2.2.2抑菌實驗
用紙片擴散法測定提取物對肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaurues)和大腸桿菌(Escherichia coli)的抗菌活性。細(xì)菌培養(yǎng)采用滅菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。將一球懸鈴木樹皮三萜類成分提取物樣品按濃度分為6組(0μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg)，用CHCl3溶解，將每組樣品分別注射到直徑為5mm圓形濾紙上，等溶劑揮發(fā)完，將濾紙放入已接種好菌種的培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，10h后觀察抑菌圈情況，根據(jù)是否有抑菌圈及抑菌圈大小來判斷提取物抑菌活性。試驗重復(fù)3次。
3.結(jié)果
3.1抗炎實驗研究結(jié)果
與正常對照組比較，2μg/mL LPS刺激A549細(xì)胞的模型組，IL-1β、IL-6、IL-8、IL-23TNF-α分泌顯著增加(p<0.01)；與模型組比較，5μg組IL-1β分泌量降低模型組(p<0.05)，10μg和20μg組IL-1β分泌量顯著降低(p<0.01)；5μg和10μg組IL-6分泌量降低模型組(p<0.05)，20μg組IL-6分泌量顯著降低(p<0.01)；5μg組IL-1β分泌量降低模型組(p<0.05)，10μg和20μg組IL-1β分泌量顯著降低(p<0.01)；5μg、10μg和20μg組IL-8分泌量顯著降低(p<0.01)；5μg、10μg和20μg組IL-23分泌量顯著降低(p<0.01)；5μg、10μg和20μg組TNF-α分泌量顯著降低(p<0.01)。如表1。
表1一球懸鈴木樹皮三萜類成分提取物抗炎指標(biāo)結(jié)果
注：*p＜0.05，**p＜0.01
3.2抑菌實驗結(jié)果
抑菌試驗結(jié)果顯示(如表2)，在沒有加一球懸鈴木樹皮三萜類成分提取物時，三組均無抑菌圈；一球懸鈴木樹皮三萜類成分提取物對3種細(xì)菌均有一定的抑制作用。其中，對肺炎鏈球菌的抑制性最強，當(dāng)一球懸鈴木樹皮三萜類成分提取物200μg時已經(jīng)顯示出較強的抑菌性，且隨著提取物濃度增加抑菌性增強；同樣對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有較強的抑制性，而且隨著藥物濃度增加抑菌性增強。
表2一球懸鈴木樹皮三萜類成分提取物抗菌活性指標(biāo)結(jié)果
4結(jié)論
本次研究發(fā)現(xiàn)LPS刺激A549細(xì)胞，能夠使A549分泌IL-1β、IL-6、IL-8、IL-23和TNF-α增加，使細(xì)胞出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，一球懸鈴木樹皮三萜類提取物能夠較好的抑制該模型IL-1β、IL-6、IL-8、IL-23和TNF-α的分泌，具有一定的抗炎作用。細(xì)胞因子具有介導(dǎo)或促進(jìn)疾病發(fā)生發(fā)展的病理學(xué)作用。機體組織感染時，均可產(chǎn)生炎性因子，一些細(xì)胞因子促進(jìn)炎癥發(fā)展，加重炎癥癥狀。IL-1β過度分泌會加重炎癥反應(yīng)及其炎癥介質(zhì)造成的組織損傷。IL-8是炎癥性疾病的重要介質(zhì)，在感染的情況下，炎癥局部、血清和體液中IL-8水平均有顯著增加。IL-23能夠誘導(dǎo)幼稚CD4+T細(xì)胞分化成高致病性的Th17細(xì)胞并產(chǎn)生生成IL-17、IL-6和TNF-α，并引起炎癥。TNF-α是機體免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)中的重要介質(zhì)。
本研究通過對一球懸鈴木樹皮三萜類成分提取物抗菌試驗發(fā)現(xiàn)，該提取物對肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有較強的抑菌活性，且隨著提取物濃度增加抑菌性增強。
綜上所述，一球懸鈴木樹皮三萜類成分提取物能夠較好的抑制炎癥細(xì)胞炎癥因子的分泌，減輕細(xì)胞炎癥反應(yīng)；通過抑菌實驗發(fā)現(xiàn)一球懸鈴木樹皮三萜類成分提取物對肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有很好的抑菌活性。一球懸鈴木樹皮三萜類成分提取物均有抗炎和抗菌活性，具有較高的實際應(yīng)用價值，可作為抗炎及抗菌藥物進(jìn)行開發(fā)。
一球懸鈴木樹皮水溶性總黃酮提取物抗腫瘤活性實驗
1.實驗材料
1.1細(xì)胞和實驗用菌種：人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、結(jié)腸腺癌細(xì)胞(HCT-15)、子宮頸癌細(xì)胞(HeLa)購于中國上海中科院細(xì)胞所。
1.2試藥：一球懸鈴木樹皮水溶性總黃酮提取物(本發(fā)明方法制備，總黃酮含量84.6％)，1640培養(yǎng)基(索萊寶公司)，胎牛血清(四季青公司)，MTT、臺盼藍(lán)、DMSO、PMA(Amresco公司)。
1.3儀器設(shè)備：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)，倒置顯微鏡(ZEISS)，HS-1300-U型超凈工作臺(蘇州安泰)、紫外分光光度計(BioMate)，SG-603生物安全柜(Baker)，酶標(biāo)儀(Thermo)、超凈純水機(Milli-Q Synthesis)，超低溫冰箱(SANYO)。
2.研究方法
2.1細(xì)胞培養(yǎng):人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、結(jié)腸腺癌細(xì)胞(HCT-15)、子宮頸癌細(xì)胞(HeLa)培養(yǎng)于含10％胎牛血清，100U·mL-1青霉素，100U·mL-1鏈霉素，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2d更換一次培養(yǎng)液，約每3d按1:3比例傳代一次。
2.2腫瘤細(xì)胞抑制率實驗：采用MTT法測定一球懸鈴木樹皮水溶性總黃酮提取物對腫瘤細(xì)胞的抑制率。選取人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、結(jié)腸腺癌細(xì)胞(HCT-15)、子宮頸癌細(xì)胞(HeLa)三種腫瘤細(xì)胞，提取物濃度設(shè)置為10μg·mL-1、20μg·mL-1、40μg·mL-1、60μg·mL-1(以超純水為溶劑)。
將對數(shù)生長期的三種腫瘤細(xì)胞以每孔1×104個細(xì)胞分別接種于96孔板，培養(yǎng)24小時后，以每兩列為一組設(shè)置為4組，分別為正常對照組、加藥組(加一球懸鈴木樹皮水溶性總黃酮提取物使終濃度為(10μg·mL-1、20μg·mL-1、40μg·mL-1、60μg·mL-1)繼續(xù)培養(yǎng)48小時。每孔加入100μlMTT工作液(0.5mg/ml，即0.5％MTT)，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2-4h，輕輕抽走培養(yǎng)板孔內(nèi)上清，每孔加入100μL DMSO，輕輕振蕩10分鐘，使藍(lán)紫色沉淀充分溶解。用酶標(biāo)儀在570nm波長處測定吸光值，計算細(xì)胞生長抑制率。
細(xì)胞生長抑制率＝(A0-Ax)/A0×100％
以上公式中：A0為正常對照組的吸光值，Ax為實驗組的吸光值。
3.抗腫瘤實驗結(jié)果
由表3可以看出，不同濃度的一球懸鈴木樹皮水溶性總黃酮提取物對MCF-7、HCT-15、HeLa三種腫瘤細(xì)胞均有一定的抑制作用，且隨著濃度的增加，抑制作用增強。對HCT-15、HeLa的抑制作用更為明顯，當(dāng)提取物濃度達(dá)到20μg/ml時對HCT-15抑制率已經(jīng)達(dá)到48.81％，對HeLa的抑制率已經(jīng)達(dá)到51.48％已經(jīng)接近半數(shù)抑制率。
表3不同濃度一球懸鈴木樹皮水溶性總黃酮提取物對三種腫瘤細(xì)胞抑制率
4結(jié)論
本次研究發(fā)現(xiàn)一球懸鈴木樹皮水溶性總黃酮提取物能夠很好的抑制MCF-7、HCT-15、HeLa三種腫瘤細(xì)胞的增殖，抗腫瘤作用明顯，且隨著濃度增加抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用增強。
綜上所述，一球懸鈴木樹皮水溶性總黃酮提取物能夠較好的抑制MCF-7、HCT-15、HeLa三種腫瘤細(xì)胞的增殖，抗腫瘤作用明顯。一球懸鈴木樹皮水溶性總黃酮提取物有較好的抗腫瘤活性，具有較高的實際應(yīng)用價值，可作為抗腫瘤藥物進(jìn)行開發(fā)。