本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，具體的是涉及acgs的新應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1971年人們從紅豆杉植物中提取得到抗癌藥物紫杉醇后，人們開始更加關(guān)注天然抗癌化合物。1982年，jolad等在美洲植物uvariaaccuminata(番荔枝科)的根部提取物中分離得到天然化合物uvaricinin，發(fā)現(xiàn)它對小鼠白血病細(xì)胞有強烈殺傷作用，后來科學(xué)家發(fā)現(xiàn)它還具有強大細(xì)胞毒性、t細(xì)胞抑制活性、抗腫瘤、抗蟲、抗寄生蟲、殺菌等藥理活性，由此掀起了植物化學(xué)家在各種番荔枝科植物中分離這類化合物的熱潮以及科學(xué)家對acgs的這些藥理活性進(jìn)行了深層次、寬范圍、多角度的研究，被科學(xué)家們預(yù)測為繼紫杉醇之后天然化合物中的“明日抗癌之星”。天然番荔枝內(nèi)酯中活性最強的有4個分別是bullatacin，asimicin，trilobacin和trilobin，由于種類太多導(dǎo)致還無法有效分離單獨一種成分，目前主要是以番荔枝內(nèi)酯化合物類化合物(annonaceousacetogenins，acgs)來進(jìn)行研究。acgs的結(jié)構(gòu)主要是一系列含35到39個碳原子構(gòu)成的基本骨架，末端通常具有一個a，β，γ不飽和五元內(nèi)酯環(huán)，有時異構(gòu)成酮式五元內(nèi)酯環(huán)，分子鏈中具有0到3個四氫呋喃環(huán)，并常有多個如羥基，乙?；?，酮基等含氧取代基團，分子中含有多個手性碳[yanghj,lix,zhangn,etal.twonewcytotoxicacetogeninsfromannonasquamosa[j].jasiannatprodres,2009.11(3):p.250-6.]

[kojiman,tanakat.medicinalchemistryofannonaceousacetogenins:

design,synthesis,andbiologicalevaluationofnovelanalogues[j].

molecules,2009.14(9):p.3621-61.]。在過去20多年，有更多的證據(jù)證明acgs在不同的腫瘤中都有抗癌作用。acgs中aa005能夠?qū)е麓竽c癌細(xì)胞生長抑制并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還可以導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞的自噬。同樣，acgs中desacetyluvaricin抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞系sw480的增長。在異種移植小鼠試驗中，acgs模擬藥thiophene-3-carboxamide強烈抑制人肺癌細(xì)胞株nci-h23的生長。在番荔枝屬graviola葉子提取的黃酮類化合物對前列腺癌具有保護(hù)作用]。從番荔枝屬annonamuricata果實中提取的三種新的acgs對人的前列腺癌pc-3細(xì)胞具有抑制增殖作用，a.muricata在hela細(xì)胞中具有相同的作用。等等。

與makp,stat,pi3k等信號通路一樣，notch信號通路是細(xì)胞乃至人體中關(guān)鍵的信號通路之一，參與了細(xì)胞增殖、凋亡和分化等決定細(xì)胞命運的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。notch信號通路中包含5個配體(dll1、dll3、dll4、jagged1和jagged2)和4個受體(notch1/2/3/4)，配受體的相互作用可以促使受體釋放胞內(nèi)段，胞內(nèi)段進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與相關(guān)蛋白結(jié)合進(jìn)而促使下游基因hes1和hey1等表達(dá)。已有研究表明通路內(nèi)相關(guān)蛋白編碼基因的突變常常會導(dǎo)致各種腫瘤的發(fā)生和惡性發(fā)展。然而，在不同腫瘤中，notch信號通路所起的作用并不完全相同，比如，在結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤中notch信號通路起致癌作用，而在皮膚鱗狀細(xì)胞癌、宮頸癌、肝細(xì)胞癌、肺癌、胃腸道癌和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中notch表現(xiàn)出腫瘤抑制作用。所以，notch信號通路的多面性特征提示檢測其在特定腫瘤類型中的特定激活模式和潛在的作用方式是必要的。

gc指發(fā)生在胃粘膜上皮細(xì)胞發(fā)生的惡性腫瘤，它是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一。胃癌發(fā)病率在全球癌癥發(fā)病中位居第五，死亡率位居第三，約占全球癌癥7％的病例和9％的死亡數(shù)，其發(fā)病在發(fā)展中國家更為常見。由此可見，胃癌的情況依然不容樂觀，而這很大程度上是由于胃癌在早期診斷中并無明顯的特異癥狀，確診狀態(tài)下已經(jīng)是晚期甚至出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。目前胃癌的主要治療方法包括手術(shù)切除、化療和放療，但這些傳統(tǒng)治療方式效果并不理想。因此，人們正在積極探索新的治療方法。

目前，已經(jīng)有大量的研究探討了notch信號通路和gc之間的聯(lián)系，據(jù)一篇meta分析報道，相對于正常胃組織，gc細(xì)胞中notch1，notch2，dll4和hes1的表達(dá)均有所上升，而相關(guān)研究多數(shù)集中于notch1和notch2蛋白。notch1和notch2受體胞內(nèi)域能促進(jìn)人胃腺癌細(xì)胞sc-m1的增殖，在gc細(xì)胞mkn-45中下調(diào)notch2能增強腫瘤細(xì)胞侵襲能力。有研究發(fā)現(xiàn)在gc中過表達(dá)notch2蛋白引起的下游蛋白hes1核轉(zhuǎn)移效果要比notch1蛋白顯著，這表明notch2信號在gc致癌作用和發(fā)展更重要。還有研究發(fā)現(xiàn)notch1和notch2的高表達(dá)與gc早期階段有著親密的聯(lián)系，高表達(dá)notch1的早期gc生存率顯著增加，而高表達(dá)notch2的早期腸胃型腫瘤能夠更好的生存。notch2信號通路還有可能通過抑制pi3k-akt信號通路來負(fù)調(diào)控gc細(xì)胞侵襲，抑制notch2信號通路使得gc細(xì)胞侵襲力增強。很多文獻(xiàn)都表明notch2與gc有著緊密聯(lián)系，但其作用機制卻還未闡明。

直到現(xiàn)在，對acgs的抗腫瘤作用機制尚不十分清楚，acgs是否可以用于防治胃癌，目前更是未知。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種acgs在制藥中的新應(yīng)用。

實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。

acgs在制備防治胃癌的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一目的是提供一種治療胃癌的藥物。

具體技術(shù)方案如下。

一種治療胃癌的藥物，其活性成份包括有acgs。

我們的研究表明，acgs抑制gc細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期停留在g0-g1期。隨著acgs濃度升高對gc的增殖抑制，促進(jìn)凋亡和阻滯細(xì)胞周期停留在g0-g1期效果越明顯，這說明acgs對gc的作用具有劑量依賴性。我們首次證明了acgs通過作notch2信號通路發(fā)揮作用，acgs提高gc中notch2的表達(dá)，過表達(dá)notch2促進(jìn)acgs誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，notch2-sirna干擾則降低了acgs誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。通過上述研究發(fā)現(xiàn)，acgs可用于防治胃癌。

附圖說明

圖1為q-pcr檢測gc細(xì)胞中notch2的表達(dá)。

圖2mts檢測acgs對gc細(xì)胞增殖的抑制作用，其中，a：acgs作用ags、mkn-4524h后，mts檢測細(xì)胞增殖；b：由mts結(jié)果換算出的抑制率結(jié)果。

圖3acgs對gc細(xì)胞的增殖抑制能力呈時間和劑量依賴性，其中，a：2.5、5、10ug/mlacgs刺激ags細(xì)胞12、24、36hmts檢測細(xì)胞增殖；b：2.5、5、10ug/mlacgs刺激mkn-45細(xì)胞12、24、36hmts檢測細(xì)胞增殖。

圖4顯微鏡下觀察acgs抑制gc細(xì)胞的增殖，其中，2.5、5、10ug/mlacgs刺激ags、mkn-45細(xì)胞36h顯微鏡下細(xì)胞狀態(tài)結(jié)果。

圖5acgs對gc細(xì)胞凋亡的影響，其中，a：5ug/mlacgs分別作用ags、mkn-45細(xì)胞12、24、36h后流式細(xì)胞技術(shù)檢測凋亡；b：2.5、5、10ug/mlacgs分別作用ags、mkn-45細(xì)胞36h后流式細(xì)胞技術(shù)檢測凋亡。

圖6acgs對gc細(xì)胞細(xì)胞周期的影響，其中，a：2.5、5、10ug/mlacgs作用ags細(xì)胞36h后流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期；b：2.5、5、10ug/mlacgs作用mkn-45細(xì)胞36h后流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期。

圖7westernblot檢測acgs刺激gc細(xì)胞后notch2蛋白表達(dá)，其中，通過westernblot以β-actin為內(nèi)控對gc細(xì)胞notch2蛋白進(jìn)行分析，直方圖表示每組細(xì)胞notch2蛋白相對量。

圖8westernblot檢測acgs刺激gc細(xì)胞后hes1的表達(dá)，其中，通過westernblot以β-actin為內(nèi)控對gc細(xì)胞hes1蛋白進(jìn)行分析，直方圖表示每組細(xì)胞notch2蛋白相對量。

圖9acgs對轉(zhuǎn)染notch2-cdna的gc細(xì)胞的影響，其中，a：westernblot檢測notch2的表達(dá)；b：過表達(dá)notch2對gc細(xì)胞增殖影響。

圖10acgs對轉(zhuǎn)染notch2-sirna的gc細(xì)胞的影響，其中，a：westernblot檢測notch2的表達(dá)；b：notch2-sirna對gc細(xì)胞增殖影。

具體實施方式

為了便于理解本發(fā)明，下面將參照相關(guān)附圖對本發(fā)明進(jìn)行更全面的描述。附圖中給出了本發(fā)明的較佳實施例。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來實現(xiàn)，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。

除非另有定義，本文所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與屬于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中在本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實施例的目的，不是旨在于限制本發(fā)明。本文所使用的術(shù)語“和/或”包括一個或多個相關(guān)的所列項目的任意的和所有的組合。

實施例

1、實驗材料

1.1細(xì)胞株

胃正常上皮細(xì)胞ges-1，gc細(xì)胞株ags、sgc-7901、mgc-803、mkn-28、mkn-45。(所有細(xì)胞株均為本科室存種)

3.1.2主要試劑盒儀器

1.3主要試劑的配制

1.3.1acgs母液的配制

秤取32mgacgs固體溶于3.2mldmso中配成濃度為10mg/ml的母液，過濾后分裝-20℃保存。

1.3.20.2medta.na2溶液配制

秤取74.448mgedta.na2用去離子水溶解定容至1ml，過濾后4℃保存。

1.3.32mg/mlpi溶液配制

將10mgpi用去離子水溶解定容至5ml，-20℃保存。

1.3.410％tritonx-100溶液配制

將1mltritonx-100溶于9ml去離子水中，4℃保存。

1.3.550mg/mlpi工作液配制

1.3.55mg/mlmts溶液的配制

秤取5mgmts粉末，用pbs溶解定容至1ml，過濾-20℃避光保存。

2、實驗方法

1)q-pcr檢測notch2在gc細(xì)胞中的表達(dá)

為了評估notch2在gc中的作用，我們篩選5株gc細(xì)胞系通過q-pcr技術(shù)檢測gc細(xì)胞中notch2的mrna水平。用10％fbs的高糖dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)6株細(xì)胞，待細(xì)胞長滿10cm培養(yǎng)皿后，pbs洗3遍加0.25％胰蛋白酶消化，然后用完全培養(yǎng)基終止胰酶消化，吹打下來細(xì)胞，1000rcf/min、5min離心，去除上清，再用pbs清洗3遍，用rnaisoplus試劑按照說明書步驟提取細(xì)胞總rna。

第一鏈cdna合成按照primescriptrtreagentkitwithgdnaeraser試劑盒說明書完成及real-timequantitativepcr按照primescriptⅱreversetranscriptase試劑操作進(jìn)行，以β-actin為內(nèi)參(nm_001101.3)，q-pcr引物見(表2)：

表2real-timequantitativepcr特異引物

去除rna中dna，10ul反應(yīng)體系如下：

混勻，42℃，2分鐘，4℃儲存。

逆轉(zhuǎn)錄20ul反應(yīng)體系如下：

混勻，37℃、15min，85℃、5s，4℃保存。

q-pcr反應(yīng)，20ul體系配制方法如下：

混勻，反應(yīng)程序為95℃30s，95℃5s、60℃34s40個循環(huán)，95℃15s，60℃1min，95℃15s。定量方法參照，以2^-δδct值表示目的基因mrna的相對擴增量。

2)mts檢測gc細(xì)胞增殖

為了探索acgs是否抑制gc細(xì)胞的生長，用mts實驗檢測細(xì)胞的增殖。培養(yǎng)gc細(xì)胞，待細(xì)胞長滿后消化鋪96孔板，每個空3000個gc細(xì)胞，37℃培養(yǎng)過夜，將acgs用高糖dmem培養(yǎng)基稀釋為0、0.15625、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10μg/ml8個濃度，每個濃度組設(shè)有96孔板中5個孔gc細(xì)胞，10個濃度組acgs同時作用24小時后加20ulmts試劑37℃孵育30min，酶標(biāo)儀490nm讀值。同時，通過mts實驗數(shù)據(jù)計算出細(xì)胞增殖的抑制率，由抑制率檢測acgs對gc細(xì)胞抑制作用效果(抑制率＝1-實驗組/對照組)。另外，以2.5、5、10μg/ml低、中、高3個濃度的acgs(用10％fbs的高糖dmem培養(yǎng)基稀釋)刺激gc細(xì)胞12、24、36h后，用mts檢測acgs作用于gc細(xì)胞是否具有時間依賴性，并鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。

3)流式細(xì)胞技術(shù)檢測gc細(xì)胞凋亡

為了探索acgs抑制gc細(xì)胞生長是否伴隨著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以5μg/ml的acgs刺激gc細(xì)胞12、24、36h，用不含edta的胰蛋白酶消化細(xì)胞后annexinⅴ/pi染色流式細(xì)胞術(shù)分析。此外，以2.5、5、10μg/ml的acgs刺激gc細(xì)胞36h，進(jìn)行上述分析。流式細(xì)胞技術(shù)檢測gc細(xì)胞周期

為了探索acgs對gc細(xì)胞的生長抑制是否伴隨著細(xì)胞周期阻滯，以2.5、5、10μg/ml的acgs刺激gc細(xì)胞36h，用不含edta的胰蛋白酶消化細(xì)胞后pi染色流式細(xì)胞術(shù)分析。

4)westernblot檢測acgs作用gc細(xì)胞后notch2的表達(dá)

為了確定acgs對gc細(xì)胞的作用是否通過notch2信號通路，以2.5、5、10μg/ml的acgs刺激gc細(xì)胞36h，消化收集細(xì)胞后用ripa裂解液裂解細(xì)胞，westernblot檢測gc細(xì)胞中notch2蛋白水平。

5)westernblot檢測下游蛋白hes1的表達(dá)

為了確定acgs對gc細(xì)胞的作用是否影響notch2信號通路的下游蛋白hes1對3.2.6中獲取的細(xì)胞蛋白通過westernblot檢測gc細(xì)胞中hes1蛋白水平。

6)過表達(dá)n2icd對gc細(xì)胞增殖的影響

構(gòu)建n2icd/pcmv-tag4質(zhì)粒：notch2蛋白胞內(nèi)區(qū)基因的擴增根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫中的notch2的基因序列(af308601.1)，設(shè)計擴增蛋白胞內(nèi)區(qū)基因n2icd的引物(表1)，下劃線為酶切位點；以hela細(xì)胞的總rna為模板，rt-pcr擴增n2icd，反應(yīng)為50℃30min，94℃2min，94℃30s、57℃30s、72℃2.5min，35個循環(huán)，72℃5min。rt-pcr產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定并切膠回收。

n2icd引物

n2icd與pmd-18t載體連接與鑒定將切膠回收的n2icd與克隆載體pmd-18t在16℃下連接3h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α中，從含有青霉素、iptg、x-gal的lb固體培養(yǎng)板挑取白色單菌落過夜培養(yǎng)和提取質(zhì)粒，經(jīng)pcr、雙酶切及測序鑒定。

真核表達(dá)重組體n2icd/pcmv-tag4的構(gòu)建和鑒定用xhoⅰ和notⅰ雙酶切n2icd/pmd-18t和真核載體pcmv-tag4，將酶切過后的pcmv-tag4和n2icd分別進(jìn)行切膠回收。將純化的pcmv-tag4和n2icd在t4連接酶的作用下16℃連接過夜，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，從含有卡那霉素的lb固體培養(yǎng)板挑取單菌落過夜培養(yǎng)和提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切及測序鑒定無誤。

為了進(jìn)一步證實notch2在acgs中的作用，n2icd/pcmv-tag4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染gc細(xì)胞24h后，空載體pcmv-tag4轉(zhuǎn)染gc細(xì)胞作為對照，一部分細(xì)胞加5μg/mlacgs刺激36h，收集細(xì)胞westernblot檢測gc細(xì)胞中notch2的蛋白水平，另一部分消化下來鋪96孔板，10％fbs高糖dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后加5μg/mlacgs刺激12、24、36h后，通過mts實驗獲取od490nm值統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。

7)notch2-sirna干擾對gc細(xì)胞增殖的影響

通過notch2-sirna下調(diào)gc細(xì)胞中notch2的表達(dá)，以notch2-sirna和control-sirna轉(zhuǎn)染gc細(xì)胞24h后，一部分細(xì)胞加5μg/mlacgs刺激36h，收集細(xì)胞westernblot檢測gc細(xì)胞中notch2的蛋白水平，另一部分消化下來鋪96孔板，10％fbs高糖dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后加5μg/mlacgs刺激12、24、36h后，通過mts實驗獲取od490nm值統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。

8)統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用spss20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，兩組間數(shù)據(jù)的比較采用獨立樣本t檢驗的方法，三組或三組以上數(shù)據(jù)的比較，采用one-wayanova分析。

3.2實驗結(jié)果

1)在基因水平上，notch2在gc細(xì)胞中呈高或低的表達(dá)

q-pcr結(jié)果顯示，與正常胃粘膜上皮細(xì)胞ges-1相比，notch2在gc細(xì)胞株ags、sgc-7901中的表達(dá)高，而在gc細(xì)胞株mgc-803、mkn-28、mkn-45中的表達(dá)低。因此，我們從表達(dá)高低組中分別選出一株代表性細(xì)胞ags、mkn-45做后續(xù)實驗研究。參見圖1。

2)acgs抑制gc細(xì)胞的增殖

利用不同濃度的acgs分別作用ags和mnk-45后，通過mts實驗檢測acgs對gc細(xì)胞增殖的影響。由圖2a可知，隨著acgs濃度的升高，其對ags和mkn-45的生長抑制作用越強。從圖2b可知acgs對ags和mkn-45的抑制率折線圖趨勢大體一致，經(jīng)計算得知acgs對ags的ic50＝5.02μg/ml對mkn-45的ic50＝6.25μg/ml。

3)acgs對gc細(xì)胞增殖的抑制作用呈時間和劑量依賴性

以2.5、5、10μg/ml的acgs分別作用于ags和mkn-45胃癌細(xì)胞株12h、24h、36h后，通過mts實驗檢測不同濃度和不同時間作用下acgs對胃癌細(xì)胞的增殖抑制作用。從圖3可知acgs對ags、mkn-45的生長抑制作用具有時間和劑量依賴性，隨著時間的增加和acgs濃度的升高對細(xì)胞生長的抑制越明顯。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)(圖4)隨著acgs濃度的升高，細(xì)胞數(shù)及密度逐漸降低。

4)acgs誘導(dǎo)gc細(xì)胞的凋亡

以2.5、5、10μg/ml的acgs分別刺激ags、mkn-4536h和以5μg/ml的acgs分別刺激ags、mkn-4512、24、36h后，流式細(xì)胞檢測細(xì)胞凋亡。從圖5可知acgs刺激ags、mkn-45后使凋亡細(xì)胞比例增加。實驗結(jié)果是acgs可以導(dǎo)致ags、mkn-45細(xì)胞凋亡。

5)acgs對gc細(xì)胞周期影響

以2.5、5、10μg/mlacgs刺激gc細(xì)胞36h后，利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期。從圖6可知，細(xì)胞周期阻滯在g0-g1期，從而阻止細(xì)胞有絲分裂影響細(xì)胞增殖。

6)acgs上調(diào)notch2的表達(dá)

以2.5、5、10μg/mlacgs刺激gc細(xì)胞36h后，用westernblot檢測notch2蛋白的表達(dá)水平，從圖7可知，acgs作用后notch2蛋白表達(dá)升高，且隨著acgs濃度升高而升高。

7)acgs作用于gc細(xì)胞對下游蛋白hes1的影響

通過westernblot結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖8)acgs刺激ags、mkn-45后對notch2下游蛋白hes1的表達(dá)與notch2的表達(dá)趨勢并不十分一致，acgs刺激ags和mkn-45后(圖7、圖8)其notch2表達(dá)升高，而notch2下游蛋白hes1表達(dá)降低。這種偏差可能由于notch基因的表達(dá)是一個復(fù)雜的細(xì)胞調(diào)控過程。

8)過表達(dá)n2icd促進(jìn)acgs對gc細(xì)胞生長的抑制作用

westernblot結(jié)果(圖9)可知，與空載體轉(zhuǎn)染對照組相比，轉(zhuǎn)染n2icd/pcmv-tag4后的gc細(xì)胞notch2的表達(dá)升高，并且轉(zhuǎn)染n2icd/pcmv-tag4組與同時加acgs組相比，后者notch2的表達(dá)比前者高。mts實驗表明，與空載體轉(zhuǎn)染對照組相比，轉(zhuǎn)染n2icd/pcmv-tag4后的gc細(xì)胞生長受到抑制，并且轉(zhuǎn)染n2icd/pcmv-tag4組與同時加acgs組相比，后者gc細(xì)胞的生長比前者受到的抑制作用強。結(jié)果表明，過表達(dá)notch2和acgs聯(lián)合應(yīng)用對gc細(xì)胞的生長抑制作用更明顯。

9)notch2-sirna下調(diào)n2icd降低acgs對gc細(xì)胞的生長抑制作用

westernblot結(jié)果(圖10)可知，與對照組相比，轉(zhuǎn)染notch2-sirna后的gc細(xì)胞notch2的表達(dá)有明顯降低，并且轉(zhuǎn)染notch2-sirna組與同時加acgs組相比，后者notch2的表達(dá)比前者高。mts實驗表明，與對照組相比，轉(zhuǎn)染notch2-sirna后的gc細(xì)胞增殖能力升高，并且轉(zhuǎn)染notch2-sirna組與同時加acgs組相比，后者gc細(xì)胞的增殖比前者受到的抑制作用強。結(jié)果表明，notch2-sirna干擾抑制了acgs誘導(dǎo)的對gc細(xì)胞的生長抑制作用。

在本發(fā)明中，與正常胃粘膜細(xì)胞相比，notch2在ags、sgc-7901中表達(dá)高，在mgc-803、mkn-28、mkn-45中表達(dá)低，我們選擇ags和mkn-45做后續(xù)實驗。我們首次證明了acgs能夠上調(diào)gc細(xì)胞中notch2且存在劑量依賴性，還能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期在g0-g1期，說明notch2在gc細(xì)胞中是抑癌基因，并且過表達(dá)notch2和notch2-sirna干擾實驗也證明了這一點。與單獨應(yīng)用acgs相比，過表達(dá)notch2與acgs聯(lián)合應(yīng)用更能抑制gc細(xì)胞的增殖。相反，notch2-sirna干擾與acgs聯(lián)合應(yīng)用則降低了acgs誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用。綜上所述，acgs誘導(dǎo)notch2上調(diào)與gc細(xì)胞生長抑制和凋亡存在一定聯(lián)系。然而，在本實驗中發(fā)現(xiàn)hes1與notch2沒有關(guān)聯(lián)性，這正表明基因表達(dá)的調(diào)節(jié)是個復(fù)雜的過程。

總之，在體外實驗中，acgs抑制gc細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)凋亡、阻滯細(xì)胞周期在g0-g1期和上調(diào)notch2的表達(dá)，且具有劑量依賴性。因此，acgs可能是通過notch2直接或間接發(fā)揮作用。據(jù)目前所知，本發(fā)明是第一個研究acgs通過notch2信號通路發(fā)揮抑制gc細(xì)胞的增殖作用。正如結(jié)果所示，acgs通過上調(diào)notch2發(fā)揮抑癌作用，抑制gc細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期具有劑量依賴性。另外，聯(lián)合應(yīng)用acgs和過表達(dá)notch2會產(chǎn)生協(xié)同作用，會比單獨高劑量acgs用藥效果好，這對減輕藥物副作用和研制新的治療gc的方案提供了可能性。這為研制新的治療gc方法提供了理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

以上所述實施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。

以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。

sequencelisting

<110>南方醫(yī)科大學(xué)、珠海南醫(yī)大生物醫(yī)藥公共服務(wù)平臺有限公司

<120>acgs的新應(yīng)用

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