本發(fā)明涉及藥學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是枳椇皮提取物在制備治療腎結(jié)石藥物中的應(yīng)用及制備方法。

背景技術(shù)：

腎結(jié)石是泌尿系統(tǒng)的一種常見病、多發(fā)病，其發(fā)病率高。西醫(yī)多以碎石或手術(shù)取石方法治療腎結(jié)石，需經(jīng)過多次手術(shù)，這會增加腎臟損害和感染發(fā)生率，且治愈后復(fù)發(fā)率高。中醫(yī)治療尿路結(jié)石的特色在于把改善體質(zhì)、消除產(chǎn)生結(jié)石的病理狀態(tài)與促進(jìn)排石相結(jié)合，因此中醫(yī)藥辨治和預(yù)防腎結(jié)石具有廣闊前景。枳椇(Hovenia acerba Lindl)是鼠李科枳椇屬下的一個(gè)種，高大喬木，別名拐棗、雞爪樹，桔扭子、雞腳爪等，主產(chǎn)于貴州、河北、河南、浙江、安徽、云南等地^[6]。枳椇子是藥食兩用的中藥材之一，具有較高的醫(yī)療價(jià)值，其種子可清涼利尿，止咳除煩，解酒毒。其皮可活血，舒筋解毒。其果?？山∥?，補(bǔ)血。食用可用于釀酒、制醋、生食和熬糖等。目前中藥治療腎結(jié)石研究方興未艾。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是：提供一種枳椇皮提取物在制備治療腎結(jié)石藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是：以枳椇皮提取物作為有效成分制備治療腎結(jié)石藥物的方法。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：枳椇皮提取物在制備治療腎結(jié)石藥物中的應(yīng)用。

枳椇皮提取物的制備方法將鮮枳椇皮粉碎，過100目篩，以水為溶劑，料液比為1：10，單位為g/ml，加熱回流提取3小時(shí)，再經(jīng)過濃縮干燥，使產(chǎn)品的含水量降低至10％以下，即得枳椇皮提取物。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明的技術(shù)效果，申請人進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)：

1試驗(yàn)材料

1.1SD大鼠體重180～220g，雄性，購于重慶騰鑫生物技術(shù)有限責(zé)任公司，合格證號：SCXK(軍)2012-0011。

1.2提取物排石顆粒(批號:同藥準(zhǔn)字Z20044192，江西南昌濟(jì)生制藥廠)；枳椇皮，采于貴州花溪，經(jīng)貴州大學(xué)熊源新教授鑒定為鼠李科植物枳椇Hovenia acerba Lindl的樹皮部分。

1.3試劑乙二醇(批號：201405185，成都金山化學(xué)試劑有限公司)，氯化銨(批號：(津)XK13-011-00011，天津市永大化學(xué)試劑有限公司)。

1.4儀器Uv-5200型紫外可見分光光度計(jì)：上海元橋儀器有限公司生產(chǎn)；脫水機(jī)：PELORIS型，德國萊卡公司產(chǎn)品；包埋機(jī)：YB-9LF型，德國LEICA公司產(chǎn)品；切片機(jī)：RM2235，德國LEICA公司產(chǎn)品；電熱恒溫干燥箱：202-1AB型，天津市泰斯特儀器有限公司；顯微鏡：BX41型，日本Olympus公司產(chǎn)品；病理圖文分析系統(tǒng)：HPIAS-1000型，華海公司產(chǎn)品；全自動生化分析儀：長春迪瑞CS-600B。

2試驗(yàn)方法

2.1大鼠腎結(jié)石模型制備及治療給藥方法

取SD大鼠42只，在適應(yīng)性環(huán)境飼養(yǎng)2周后隨機(jī)均分為5組，每組8只(模型組開始時(shí)為10只，其中2只另行標(biāo)記，兩周后為8只)，分別為正常組、模型組、枳椇皮高、低劑量組和排石顆粒組。除正常組每天自由飲自來水外，其余4組給大鼠造模，每天均用1％乙二醇冷開水飲水+1.25％氯化銨溶液30mL/只自由飲，再給30ml自來水自由飲，模型組每天灌胃2ml蒸餾水，陽性藥(排石顆粒)組、枳椇皮高、低劑量組分別按100、100、25mg/kg灌胃給藥，4周后結(jié)束實(shí)驗(yàn)。

2.2測定指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1d用代謝籠分別收集各大鼠24h空腹尿液，測定24h排尿量及用甲基百里香酚藍(lán)比色法測24h尿鈣(Ca²⁺)分泌量。大鼠心臟采血，離心取血清用于全生化自動測定：除蛋白法測肌酐(Crea)含量、二乙酰-肟比色法測血清尿素氮(BUN)含量^[12]。大鼠處死后取兩側(cè)腎稱重，計(jì)算其腎臟系數(shù)。右腎用10％甲醛溶液固定，用于腎組織病理學(xué)檢查，左腎超低溫(-85℃)保存，用于測定腎組織總鈣(Ca²⁺)含量。

2.3腎組織病理組織學(xué)檢查

病理切片組織學(xué)觀察：實(shí)驗(yàn)大鼠腎皮質(zhì)、髓質(zhì)分界是否清晰，腎小球、腎小管等有無異常改變，腎間質(zhì)內(nèi)有無炎細(xì)胞浸潤及變性、出血等癥狀，重點(diǎn)觀測腎小管內(nèi)的草酸鈣結(jié)晶形成情況，以及周圍組織的病變、壞死等。觀測指標(biāo)為腎組織內(nèi)草酸鈣結(jié)晶的形成情況，炎性滲出及壞死物的出現(xiàn)情況。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以表示，并采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)分析，各組間比較采用單因素方差分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異非常顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3試驗(yàn)結(jié)果

3.1腎結(jié)石模型建立結(jié)果

經(jīng)造模2周后，各造模組大鼠已變得無神，活動減少，食欲減退，毛色已變黃，此時(shí)將模型組另行標(biāo)記的2只大鼠處死解剖后，取其腎臟，經(jīng)切片染色觀察或肉眼及體視顯微鏡檢查確認(rèn)已經(jīng)有明顯的結(jié)晶形成，見圖1，證明造模大鼠腎結(jié)石形成明顯。

3.2枳椇皮提取物對腎結(jié)石大鼠重量、腎臟系數(shù)和24h尿量的影響

各實(shí)驗(yàn)組大鼠在飲用乙二醇加氯化銨溶液2周后，與之前正常大鼠相比體重減輕；給藥后各組的上述情況明顯減輕(P<0.05)，并出現(xiàn)尿量增加，精神、飲食活動明顯改善等。與模型組比較，枳椇皮提取物組大鼠的體重顯著增加(P<0.05)，腎臟系數(shù)也有變緩趨勢。陽性藥排石顆?？墒菇Y(jié)石大鼠24h排尿量顯著增加(P<0.01)，體重也基本恢復(fù)接近正常動物水平。結(jié)果見表1。

表1對大鼠體重、腎臟系數(shù)和24h尿量的影響(n＝8,)

注：與模型組比較，*p<0.05，**p<0.01

3.3枳椇皮提取物對結(jié)石大鼠血清尿素氮、肌酐、鈣含量及腎組織鈣含量、24h尿鈣分泌量的影響

模型組大鼠比正常組大鼠血清尿素氮、肌酐、尿酸、腎組織鈣含量顯著增加(P<0.05)，血清鈣含量未見顯著變化。與模型組比較，枳椇皮提取物組大鼠的血清鈣含量和腎組織鈣含量明顯降低(P<0.01)，24h尿鈣有增加趨勢，陽性藥(排石顆粒)組大鼠的腎組織鈣含量也明顯下降(P<0.01)。給藥組大鼠其他相關(guān)指標(biāo)均有不同程度的改善趨勢。結(jié)果見表2。

表2對血清尿素氮、肌酐、尿酸、鈣、腎鈣、尿鈣的影響(n＝8,)

注：與模型組比較，*p<0.05，**p<0.01

3.4枳椇皮提取物對結(jié)石大鼠腎組織病理學(xué)影響

病理切片組織學(xué)觀察：模型組可見腎組織內(nèi)大量急、慢性炎細(xì)胞浸潤，管內(nèi)充滿塊狀半透明藍(lán)綠色的草酸鈣結(jié)晶，腎小管擴(kuò)張不明顯，周圍腎小球被擠壓，面積減小，腎皮、髓質(zhì)內(nèi)可見多處腎小管內(nèi)有炎性滲出物及壞死，與正常組比較，上述觀測指標(biāo)的差異均具有顯著影響。給藥組的腎組織內(nèi)草酸鈣結(jié)晶較碎小，比模型組明顯減少，腎小管內(nèi)壞死及炎性滲出物較模型組均明顯減輕，幾乎接近無。與模型組相比，給藥組大鼠腎結(jié)石情況有不同程度的減少；枳椇皮提取物及陽性藥(排石顆粒)組大鼠腎小管內(nèi)壞死及炎性滲出物顯著減輕，結(jié)晶減少，零碎散亂。結(jié)果見圖1。

3.5大鼠24h尿液中草酸鈣結(jié)晶觀察情況

實(shí)驗(yàn)結(jié)束前一天，收集大鼠24h空腹尿量，測定尿鈣，在顯微鏡下觀察草酸鈣結(jié)晶情況。草酸鈣結(jié)晶表現(xiàn)為無色方形閃爍發(fā)光的八面體，有時(shí)呈現(xiàn)菱形，偶為餅形或啞鈴型^[13]。

結(jié)果顯示，枳椇皮提取物組和陽性對照組(排石顆粒組)尿中結(jié)晶顯著增多。陽性對照組(排石顆粒組)和枳椇提皮取物組能促進(jìn)大鼠結(jié)晶的排泄，減少腎臟結(jié)石疾病的發(fā)生率。結(jié)果見圖2。

4討論

枳椇常用于清涼利尿，止咳除煩，解酒毒等，但用于結(jié)石尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立大鼠腎結(jié)石模型，對其抗結(jié)石作用進(jìn)行了初步研究。結(jié)果顯示其能緩解大鼠腎結(jié)石癥狀，表明枳椇皮提取物對大鼠腎結(jié)石有治療作用。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)I結(jié)石模型大鼠同步灌服一定劑量的枳椇皮提取液后，其可能通過促進(jìn)腎臟組織和血液中Ca²+的排泄和代謝，降低腎組織Ca²+；同時(shí)改善腎組織病變情況，促進(jìn)結(jié)石排出體外，減少腎組織中結(jié)石的形成。但其確切的機(jī)制尚待進(jìn)一步的研究。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)枳椇的提取物能作為治療腎結(jié)石的有效成分，并且經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證明，枳椇的提取物能對治療腎結(jié)石具有較好作用，使用該藥物對腎結(jié)石進(jìn)行治療，不僅能緩解腎結(jié)石癥狀，還能降低對腎臟的損害和感染發(fā)生率。

附圖說明

附圖1為病理切片組織學(xué)觀察(放大倍數(shù)：60x 10)；

附圖1中，a為正常組；b為排石顆粒組；c為模型組；d為枳椇皮高劑量組；e為枳椇皮低劑量組；

附圖2為尿中草酸鈣結(jié)晶檢測(放大倍數(shù)：60x 10)

附圖2中，a為排石顆粒組；b為模型組；c為枳椇皮高劑量組；d為枳椇皮低劑量組。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的實(shí)施例1：枳椇皮提取物在制備治療腎結(jié)石藥物中的應(yīng)用。

枳椇皮提取物的制備方法，將鮮枳椇皮粉碎，過100目篩，以水為溶劑，料液比為1：10，單位為g/ml，加熱回流提取3小時(shí)，再經(jīng)過濃縮干燥，使產(chǎn)品的含水量降低至10％以下，即得枳椇皮提取物。

本發(fā)明的實(shí)施例2：將實(shí)施例1制備得到的醇提物進(jìn)一步加工，加入藥學(xué)上可接受的輔劑制溶液劑。