本發(fā)明涉及5α還原酶抑制劑技術(shù)領(lǐng)域，是一種矢車菊花序活性部位作為制備5α還原酶抑制劑藥物的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

矢車菊（centaureacyanusl.）系矢車菊屬(centaureal.)植物，我國新疆、青海、甘肅、陜西、河北、山東、江蘇、湖北、湖北、廣東及西藏等各地公園、花園及校園普遍栽培，供觀賞。在新疆伊犁地區(qū)已大規(guī)模種植。在歐洲為傳統(tǒng)植物藥，常用于治療眼部炎癥，主要活性成分為其多糖部分；在化妝品行業(yè)用矢車菊提取物作為護(hù)發(fā)成分。

α-還原酶的同工酶有i型和ii型，有研究發(fā)現(xiàn)鼠的非雄性目標(biāo)組織和卵巢中主要含有i型酶及其mrna，特別是肝臟中只產(chǎn)生i型酶，且雌性鼠肝臟中i型酶活性比雄性高10～20倍。ii型酶主要分布于雄性生殖組織，如睪丸、輸精管等，正常前列腺的間質(zhì)細(xì)胞和基底上皮細(xì)胞，精囊的間質(zhì)細(xì)胞，附睪的上皮細(xì)胞產(chǎn)生ii型酶，而增生的前列腺和前列腺腫瘤僅由間質(zhì)細(xì)胞合成ii型酶。

脂溢性脫發(fā)，也被稱為雄激素源性脫發(fā)或者男性型脫發(fā)，它與女性型脫發(fā)的特點(diǎn)是油膩的頭發(fā)、頭皮屑、癢、額頭區(qū)域漸進(jìn)性脫發(fā)形成斑禿。也許它不是一種威脅生命的混亂，但是它對個人的外表、自信心、心理健康和生活質(zhì)量造成很大的影響。5α還原酶將頭發(fā)毛囊中的睪酮轉(zhuǎn)化為二輕睪酮導(dǎo)致脂溢性脫發(fā)的病理過程中扮演了重要的角色，雖然雄激素通過同種的雄激素受體調(diào)節(jié)它們的活性，二氫睪酮的活性仍然較睪酮高5倍。雄激素受體屬于細(xì)胞核受體亞族，功能是作為轉(zhuǎn)錄因子。依據(jù)其配基，雄激素受體經(jīng)歷一個結(jié)構(gòu)變化，轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，與目標(biāo)基因的特定dna序列結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，表現(xiàn)出促進(jìn)頭發(fā)生長和抑制頭發(fā)生長。因此，抑制5α還原酶活性是一個研究脂溢性脫發(fā)的比較好的目標(biāo)。實(shí)際上，近幾年許多甾體或者非甾體的5α還原酶抑制劑已經(jīng)被合成。作為一種5α還原酶抑制劑的非那雄胺，非那雄胺已經(jīng)被用來治療雄激素相關(guān)的疾病，并取得顯著的效果。然而，這些合成的抑制劑經(jīng)常導(dǎo)致一些副作用，譬如勃起功能障礙、性功能異常、男性乳房發(fā)育、損害肌肉生長等等。

近幾年，研究者致力于從天然植物中尋找新的、有效的、毒性更低的5α還原酶抑制劑用于治療脂溢性脫發(fā)，這具有非凡的意義。目前對矢車菊提取物進(jìn)行抑制5α還原酶活性的研究鮮見于文獻(xiàn)報(bào)道；同時植物粗提物在使用過程中療效不夠穩(wěn)定，效果不是非常突出，目前普遍采用西藥非那雄胺作為抑制5α還原酶活性的的藥物，其效果目前處于較好水平，但是西藥副作用大。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種矢車菊花序活性部位作為制備5α還原酶抑制劑藥物的應(yīng)用，克服了上述現(xiàn)有技術(shù)之不足，其能有效解決目前對矢車菊提取物進(jìn)行抑制5α還原酶活性的研究鮮見于文獻(xiàn)報(bào)道以及植物粗提物在使用過程中療效不夠穩(wěn)定、效果不是非常突出以及西藥非那雄胺作為抑制5α還原酶活性的的藥物副作用大的問題。

本發(fā)明的技術(shù)方案是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的：一種矢車菊花序活性部位作為制備5α還原酶抑制劑藥物的應(yīng)用。

下面是對上述發(fā)明技術(shù)方案的進(jìn)一步優(yōu)化或/和改進(jìn)：

上述矢車菊花序活性部位按下述方法得到：采摘矢車菊的花，將矢車菊的花進(jìn)行干燥至含水量低于20%，干燥后的矢車菊粉碎后進(jìn)行醇提1至3次，每次醇提均用5倍至15倍量50%至100%濃度的乙醇溶液進(jìn)行提取，合并提取液，得矢車菊提取液；

第二步，將提取液濃縮至提取液初始體積的1/6至1/3得到濃縮液?。?/p>

第三步，將濃縮液ⅰ采用大孔樹脂柱進(jìn)行第一步精制，先用2倍至5倍大孔樹脂柱柱體積的純水洗脫，洗脫液棄去，然后用3倍至4倍大孔樹脂柱柱體積的60%至95%乙醇溶液進(jìn)行洗脫得到洗脫液ⅰ，將洗脫液ⅰ濃縮至洗脫液ⅰ原體積的10%至20%，將濃縮液ⅱ進(jìn)行干燥至含水量為6%至10%后得到物料a；

第四步，將物料a用甲醇溶解得到混合溶液ⅰ，用1.5倍至2倍物料a重量的100目至400目的硅膠對混合溶液ⅰ進(jìn)行硅膠拌樣并混勻后去除甲醇后得到料樣，并將料樣研磨至粒度≤200目；

第五步，取20倍至100倍物料a重量的100至400目硅膠裝填于層析柱，層析柱徑高比為1:5至1:10，將上一步所制備的料樣均勻裝填于層析柱上部；

第六步，先用2倍至3倍層析柱柱體積的低極性溶劑洗脫，再用低極性溶劑與甲醇的體積比為9:1至1:1的混合溶液ⅱ洗脫得到洗脫液ⅱ，將洗脫液ⅱ減壓濃縮至洗脫液ⅱ原體積的10%至20%得到濃縮液ⅲ，濃縮液ⅲ揮干有機(jī)溶劑后即得矢車菊花序活性部位。

上述第二步中，將提取液濃縮得到濃縮液ⅰ的方法為：采用常溫加熱濃縮，濃縮溫度為60℃至95℃；或者，采用減壓濃縮，濃縮溫度為45℃至80℃、真空度不大于50mbar；或者，采用蒸發(fā)濃縮，濃縮溫度設(shè)置為50℃至65℃，真空度26mbar至150mbar。

上述第三步中，大孔樹脂柱的型號為d101或ab-8或hpd100或hpd600或xda-6或ads17或lx27或lx28。

上述第四步中，采用水浴、自然通風(fēng)、減壓發(fā)方式去除甲醇。

上述第一步中的乙醇溶液的濃度為80%；或/和，第六步中的低極性溶劑為二氯甲烷或氯仿。

上述第六步中的低極性溶劑為二氯甲烷或氯仿。

本發(fā)明通過現(xiàn)代分離技術(shù)和活性研究方法，進(jìn)一步精制矢車菊花序活性部位，且將矢車菊花序活性部位對5α還原酶活性的抑制方面，具有較好的抑制作用，同時本發(fā)明的矢車菊花序活性部位為純綠色植物提取物，用于5α還原酶活性的抑制方面，安全無毒、作用顯著。

附圖說明

附圖1正常對照組的雌性大鼠的10×10倍鏡下毛囊生長圖。

附圖2正常對照組的雄性大鼠的10×10倍鏡下毛囊生長圖。

附圖3陽性對照組的雌性大鼠的10×10倍鏡下毛囊生長圖。

附圖4陽性對照組的雄性大鼠的10×10倍鏡下毛囊生長圖。

附圖5實(shí)驗(yàn)組的雌性大鼠的10×10倍鏡下毛囊生長圖。

附圖6實(shí)驗(yàn)組的雄性大鼠的10×10倍鏡下毛囊生長圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明不受下述實(shí)施例的限制，可根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案與實(shí)際情況來確定具體的實(shí)施方式。本發(fā)明中所提到各種化學(xué)試劑和化學(xué)用品如無特殊說明，均為現(xiàn)技術(shù)中公知公用的化學(xué)試劑和化學(xué)用品；本發(fā)明中的百分?jǐn)?shù)如沒有特殊說明，均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)；本發(fā)明中的水如沒有特殊說明，為自來水或純凈水；本發(fā)明中的溶液若沒有特殊說明，均為溶劑為水的水溶液，例如，鹽酸溶液即為鹽酸水溶液；本發(fā)明中的常溫一般指15℃到25℃的溫度，一般定義為25℃。

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述：

實(shí)施例1，該矢車菊花序活性部位作為制備5α還原酶抑制劑藥物的應(yīng)用。本發(fā)明將矢車菊花序活性部位對5a還原酶活性的抑制作用，其相對于目前的西藥非那雄胺相比，其活性抑制率大大提高，該矢車菊花序活性部位可以從現(xiàn)有技術(shù)中獲得。

實(shí)施例2，作為實(shí)施例1的優(yōu)化，矢車菊花序活性部位按下述方法得到：采摘矢車菊的花，將矢車菊的花進(jìn)行干燥至含水量低于20%，干燥后的矢車菊粉碎后進(jìn)行醇提1至3次，每次醇提均用5倍至15倍量50%至100%濃度的乙醇溶液進(jìn)行提取，合并提取液，得矢車菊提取液；

第二步，將提取液濃縮至提取液初始體積的1/6至1/3得到濃縮液??；

第三步，將濃縮液ⅰ采用大孔樹脂柱進(jìn)行第一步精制，先用2倍至5倍大孔樹脂柱柱體積的純水洗脫，洗脫液棄去，然后用3倍至4倍大孔樹脂柱柱體積的60%至95%乙醇溶液進(jìn)行洗脫得到洗脫液ⅰ，將洗脫液ⅰ濃縮至洗脫液ⅰ原體積的10%至20%，將濃縮液ⅱ進(jìn)行干燥至含水量為6%至10%后得到物料a；

第四步，將物料a用甲醇溶解得到混合溶液ⅰ，用1.5倍至2倍物料a重量的100目至400目的硅膠對混合溶液ⅰ進(jìn)行硅膠拌樣并混勻后去除甲醇后得到料樣，并將料樣研磨至粒度≤200目；

第五步，取20倍至100倍物料a重量的100至400目硅膠裝填于層析柱，層析柱徑高比為1:5至1:10，將上一步所制備的料樣均勻裝填于層析柱上部；

第六步，先用2倍至3倍層析柱柱體積的低極性溶劑洗脫，再用低極性溶劑與甲醇的體積比為9:1至1:1的混合溶液ⅱ洗脫得到洗脫液ⅱ，將洗脫液ⅱ減壓濃縮至洗脫液ⅱ原體積的10%至20%得到濃縮液ⅲ，濃縮液ⅲ揮干有機(jī)溶劑后即得矢車菊花序活性部位。

將濃縮液ⅱ進(jìn)行大孔樹脂柱層析洗脫，活性部位在樹脂柱上的吸附量最大，可以有效的利用大孔樹脂的吸附容量，單次洗脫，得率最高。

實(shí)施例3，作為實(shí)施例2的優(yōu)化，第二步中，將提取液濃縮得到濃縮液ⅰ的方法為：采用常溫加熱濃縮，濃縮溫度為60℃至95℃；或者，采用減壓濃縮，濃縮溫度為45℃至80℃、真空度不大于50mbar；或者，采用蒸發(fā)濃縮，濃縮溫度可以設(shè)置為50℃至65℃，真空度26mbar至150mbar。

實(shí)施例4，作為實(shí)施例2和實(shí)施例3的優(yōu)化，第三步中，大孔樹脂柱的型號為d101或ab-8或hpd100或hpd600或xda-6或ads17或lx27或lx28。

實(shí)施例5，作為實(shí)施例2、實(shí)施例3和實(shí)施例4的優(yōu)化，第四步中，采用水浴、自然通風(fēng)、減壓發(fā)方式去除甲醇。

實(shí)施例6，作為作為實(shí)施例2、實(shí)施例3、實(shí)施例4和實(shí)施例5的優(yōu)化，上述第一步中的乙醇溶液的濃度為80%；或/和，第六步中的低極性溶劑為二氯甲烷或氯仿。矢車菊在用乙醇提取時優(yōu)選的乙醇溶液的濃度為80%，此時可以盡可能的將有效成分提取出來，同時避免花絮中膠體、蛋白等大分子物質(zhì)對提取效率的影響。

實(shí)施例7，作為作為實(shí)施例2、實(shí)施例3、實(shí)施例4、實(shí)施例5和實(shí)施例6第六步中的低極性溶劑為二氯甲烷或氯仿。

一、將根據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施例得到的矢車菊花序活性部位進(jìn)行抑制5α還原酶活性的測定：

1、原理：通過測定反應(yīng)體系中反應(yīng)前后睪酮的消耗量表征樣品抑制5α還原酶的活性強(qiáng)弱。

、方法及結(jié)果：將根據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施例得到的矢車菊花序活性部位（以下簡稱矢車菊）100mg溶解于l0ml75%的乙醇中，得濃度為10g/l的儲備液。

根據(jù)文獻(xiàn)資料及預(yù)試，將從睪酮提取的粗酶液（ii型酶）用tris緩沖液稀釋2倍，將從肝臟中提取的粗酶液（i型酶）用tris緩沖液稀釋10倍，供試酶液（粗酶液（ii型酶）和粗酶液（i型酶））的濃度分別為4.45mg/ml、3.76mg/ml。

建立如表1的反應(yīng)體系：其中tris-hcl緩沖液濃度為1mmol/l（附睪粗酶液ph5.5、肝臟粗酶液ph7.5）、nadph濃度1mmol／l/、睪酮（t）濃度1mmol/l、非那雄胺2.5mg/ml，將矢車菊設(shè)置0.5mg／ml至10mg／ml的濃度梯度供試，其中，樣品如表2所示。

建立反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)后，測定每個反應(yīng)體系中睪酮的含量，進(jìn)而判斷矢車菊對5α還原酶活性的抑制作用。

設(shè)置睪酮濃度梯度0.02、0.04、0.08、0.20mmol/l的濃度梯度，液相色譜方法建立睪酮標(biāo)準(zhǔn)曲線。色譜條件為watersuplcbehshiledrp181.7μm，100mm*2.1mm色譜柱，柱溫30℃，流速0.2ml/min，甲醇／0.2%甲酸=65：35，242nm檢測。

在0.02mmol/l至0.20mmol/l的范圍內(nèi)，睪酮濃度與峰面積之間成線性相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)為1，相應(yīng)的回歸方程為y=9535326.5725x-1274.8359，r²=1。

配制10g/l矢車菊儲備液，將其稀釋為10.0、0.5g/l的供試液，按照上述方法進(jìn)行酶抑制活性測定，每樣品3個平行。測定結(jié)果如表3所示，其中，表3中的抑制率=[（矢車菊-陽性對照）/陽性對照]*100%。

結(jié)果表明，由表3可見，根據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施例得到的矢車菊花序活性部位對附睪ii型5α還原酶、肝臟i型5α還原酶均有較好的抑制作用，且相對于陽性藥非那雄胺，矢車菊花序活性部位對附睪ii型5α還原酶活性的抑制率提高了34.4%至62.07%，矢車菊花序活性部位對肝臟ⅰ型5α還原酶活性的抑制率提高了67.65%至73.7%。

二、將根據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施例得到的矢車菊花序活性部位進(jìn)行動物模型試驗(yàn)

2.1動物實(shí)驗(yàn)方法

試藥：實(shí)驗(yàn)組用藥：根據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施例得到的矢車菊花序活性部位1g加5ml甘油；

陽性對照組用藥：西藥：二氫神經(jīng)鞘氨醇（0.1%，m/m），該藥為目前用于治療毛發(fā)生長發(fā)面效果較好的最新藥，普遍接受度較高；

健康wistar大鼠28只，雌雄各半，普通級，體重（200±20）g；由新疆實(shí)驗(yàn)動物中心提供；

促毛發(fā)生長試驗(yàn)大鼠隨機(jī)分2組，分別為實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組，每組14只雌雄各半，在其背部先用手術(shù)剪剪毛后，再用理發(fā)器仔細(xì)將各區(qū)域雜毛去除干凈（硫化鈉脫毛效果好，但易損大鼠皮膚）。按如下方式給藥：大鼠背部選定區(qū)域用醫(yī)用棉棒適量蘸取藥液涂于該區(qū)域，每日定時涂藥1次，觀察大鼠被毛生長情況，連續(xù)給藥21d；3周后，每只大鼠各給藥區(qū)域隨機(jī)拔取一撮新生毛發(fā)，游標(biāo)卡尺測量5根毛發(fā)的長度，取其平均值，作為該給藥區(qū)域的大鼠毛發(fā)長度值（mm），結(jié)果見表4。再仔細(xì)將給藥區(qū)域毛發(fā)全部剪下，置于培養(yǎng)皿中，萬分之一電子天平稱其重量，作為該給藥區(qū)域的毛發(fā)重量值（mg），結(jié)果見表4；表4中，正常對照組為選取的各大鼠自身正常毛發(fā)。

大鼠去毛區(qū)皮膚組織中毛囊數(shù)的影響，將去毛后大鼠的各給藥區(qū)域皮膚取下，用10%的中性甲醛固定3天，其中固定液更換3次，進(jìn)行常規(guī)的組織脫水、石蠟包埋，切片，經(jīng)h-e染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察毛囊的數(shù)目和生長狀況。每張標(biāo)本隨機(jī)選取5個視野，于10×10倍鏡下計(jì)數(shù)毛囊數(shù)目，取其平均值，作為該給藥組的毛囊數(shù)，結(jié)果見表5；表5中，正常對照組為選取的各大鼠自身正常區(qū)域皮膚；分別隨機(jī)選取正常對照組、陽性對照組和實(shí)驗(yàn)組的雌性大鼠和雄性大鼠的標(biāo)本各一，于10×10倍光學(xué)顯微鏡下觀察毛囊的數(shù)目和生長狀況，正常對照組的雌性大鼠的10×10倍鏡下毛囊生長圖如附圖1所示、正常對照組的雄性大鼠的10×10倍鏡下毛囊生長圖如附圖2所示、陽性對照組的雌性大鼠的10×10倍鏡下毛囊生長圖如附圖3所示、陽性對照組的雄性大鼠的10×10倍鏡下毛囊生長圖如附圖4所示、實(shí)驗(yàn)組的雌性大鼠的10×10倍鏡下毛囊生長圖如附圖5所示、實(shí)驗(yàn)組的雄性大鼠的10×10倍鏡下毛囊生長圖如附圖6所示。

數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)中所有計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。應(yīng)用pems3.1統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

結(jié)果

2.3.1促毛發(fā)生長毛發(fā)長度及重量檢測結(jié)果（±s，n=10），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4；

由表4可以看出，陽性對照組毛發(fā)長度雄性、雌性大鼠與自身正常對照相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*p＜0.05），實(shí)驗(yàn)組毛發(fā)長度雌性大鼠與自身正常對照相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*p＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組毛發(fā)長度雄性大鼠與自身正常對照相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*p＜0.05）；陽性對照組雄性毛發(fā)長度及重量與矢車菊提取物相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（^#p＜0.01）；陽性對照組雌性性毛發(fā)長度與矢車菊提取物相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（^#p＜0.01）；表4中，雖然陽性對照組大鼠毛發(fā)長度和重量均優(yōu)于實(shí)驗(yàn)組毛發(fā)長度和重量，但是由于陽性對照組的所選用的藥為西藥，西藥為合成藥，其毒副作用大，而本發(fā)明的矢車菊花序活性部位雖然效果沒有陽性對照組的西藥的效果好，但是相對于正常組來說，仍然具有較明顯的效果，并且，本發(fā)明的矢車菊花序活性部位為純綠色植物提取物，用于5a還原酶活性的抑制方面，安全無毒。

矢車菊提取物對大鼠毛囊數(shù)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5；

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示西藥組皮膚毛囊數(shù)與自身正常對照相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*p＜0.05），矢車菊提取物大鼠皮膚毛囊數(shù)與自身正常對照相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*p＜0.05）；結(jié)合表5和附圖1至附圖6可以看出，雖然陽性對照組大鼠毛毛囊數(shù)均優(yōu)于實(shí)驗(yàn)組大鼠毛毛囊數(shù)，但是由于陽性對照組的所選用的藥為西藥，西藥為合成藥，其毒副作用大，而本發(fā)明的矢車菊花序活性部位雖然效果沒有陽性對照組的西藥的效果好，但是相對于正常組來說，仍然具有較明顯的效果，并且，本發(fā)明的矢車菊花序活性部位為純綠色植物提取物，用于5a還原酶活性的抑制方面，安全無毒。

本發(fā)明通過現(xiàn)代分離技術(shù)和活性研究方法，進(jìn)一步精制矢車菊花序活性部位，且將矢車菊花序活性部位對5α還原酶活性的抑制作用，雖然本發(fā)明相對于西藥二氫神經(jīng)鞘氨醇來說，效果沒有其好，但是其相對于目前的西藥非那雄胺相比，其活性抑制率大大提高，仍然說明本發(fā)明的矢車菊花序活性部位對5a還原酶活性具有較好的抑制作用，同時本發(fā)明的矢車菊花序活性部位為純綠色植物提取物，用于5α還原酶活性的抑制方面，安全無毒、作用顯著。

以上技術(shù)特征構(gòu)成了本發(fā)明的實(shí)施例，其具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和實(shí)施效果，可根據(jù)實(shí)際需要增減非必要的技術(shù)特征，來滿足不同情況的需求。