本發(fā)明涉及一種促進(jìn)成年海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖復(fù)合物的制備方法，尤其是涉及一種促進(jìn)成年海馬神經(jīng)干細(xì)胞增值的瓜子金提取物制備方法。

背景技術(shù)：

海馬神經(jīng)干細(xì)胞位于海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下層區(qū)域，其可以在一生中持續(xù)分裂增殖。神經(jīng)干細(xì)胞分裂產(chǎn)生新的神經(jīng)細(xì)胞，遷移進(jìn)入海馬齒狀回區(qū)，少數(shù)新生細(xì)胞轉(zhuǎn)化為膠質(zhì)細(xì)胞，絕大多數(shù)轉(zhuǎn)化為神經(jīng)細(xì)胞，大約4-6周后神經(jīng)細(xì)胞成熟，并入已有的神經(jīng)回路這個(gè)過(guò)程被稱為神經(jīng)發(fā)生。成年后海馬神經(jīng)發(fā)生在維護(hù)大腦可塑性具有重要的作用。在成人中，大約一天可以產(chǎn)生700個(gè)新神經(jīng)細(xì)胞，替換35%的海馬齒狀回細(xì)胞。目前研究表明絕大多數(shù)的神經(jīng)系統(tǒng)的疾病均合神經(jīng)發(fā)生改變相關(guān)。包括抑郁癥，阿耳茨海默氏病，帕金森病以及因衰老可引起的認(rèn)知能力下降等疾病。因此，增強(qiáng)海馬成年神經(jīng)發(fā)生是潛在神經(jīng)系統(tǒng)的疾病治理方法。

瓜子金作為一種具有悠久歷史的中草藥，具有多種生物學(xué)功能，是一種優(yōu)良的促進(jìn)海馬成年神經(jīng)干細(xì)胞增加的天然產(chǎn)物。因此具有巨大的開(kāi)發(fā)潛力和應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于以植物瓜子金根為原料，提供一種促進(jìn)成年海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖的瓜子金提取物制備方法，得到促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生作用的提取物，利用該提取物再加入藥物或食品載體可以制備促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生作用試劑。

本發(fā)明所述方法包括以下工藝步驟：

（1）粉碎：將干燥瓜子金根粉碎至20~50目；

（2）粗提?。喊凑罩亓颗c體積比，1g上述瓜子金粉中加入10ml的水，煮沸2小時(shí)后過(guò)濾，得到濾液，再在過(guò)濾后的渣中加入第1次加水量的一半，煮沸2小時(shí)后過(guò)濾；

（3）乙醇沉淀：收集步驟（2）得到的濾液，在濾液中加入4倍于濾液的濃度為100％的乙醇，1-4℃攪拌過(guò)夜，離心收集上清液，濃縮，真空冷凍干燥，即得到瓜子金提取物。

本發(fā)明所制備復(fù)合物用于促海馬神經(jīng)發(fā)生作用：

本復(fù)合物作用物作用很多，但是其突出作用是促海馬神經(jīng)發(fā)生作用，瓜子金提取物溶于生理鹽水中配制100 ug/ml溶度瓜子金溶液，腹腔注射小鼠體內(nèi)，連續(xù)7天，每天1ml；對(duì)照小鼠每日注射1ml生理鹽水，或者將瓜子金溶于水中（100 mg/ml），連續(xù)7天喂食小鼠（5 ml/天）；對(duì)照小鼠每天正常飲水，為了統(tǒng)計(jì)瓜子金提取物促海馬神經(jīng)發(fā)生的作用，在第六天，腹腔注射5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）。BrdU能夠在細(xì)胞增殖時(shí)期代替胸腺嘧啶（T）滲入正在復(fù)制的DNA分子，而后利用抗Brdu抗體，免疫染色，顯示增殖細(xì)胞；第七天取腦，切片，利用免疫組化技術(shù)分析大腦中海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下層區(qū)域BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，用以計(jì)算海馬神經(jīng)干細(xì)胞分裂行成新生神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目；結(jié)果顯示，瓜子金提取物可以提高50%的海馬神經(jīng)干細(xì)胞分裂。

本發(fā)明的有益效果是：制備工藝簡(jiǎn)單易行，非常適合推廣應(yīng)用。制備方法中有效的移除大分子化合物，盡量的保存了小分子兩性化合物，這些小分子兩性化合物可穿越血腦屏障，進(jìn)入腦部。因此相對(duì)于普通水提取物，該提取物促神經(jīng)發(fā)生作用明顯。瓜子金提取物可加入到藥物載體，混合，制粒，干燥，然后按照常規(guī)的藥劑制備方法制成顆粒劑、或膠囊劑、或片劑、或口服液、或注射劑；或者加入載體，按照常規(guī)方法制成保健飲料或保健食品。

附圖說(shuō)明

圖1為瓜子金增加了海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下層區(qū)域；

圖中：箭頭為BrdU陽(yáng)性細(xì)胞，A、C為對(duì)照小鼠，B、D為瓜子金喂食小鼠，箭頭為BrdU陽(yáng)性細(xì)胞；

圖2海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下層區(qū)域BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果；

圖中：PJ為瓜子金，control為對(duì)照鼠，***P<0.01。

具體實(shí)施方式

所述瓜子金提取物的制備方法

1）將瓜子金根洗凈干燥后粉碎，過(guò)20目篩，稱取100g瓜子金粉，加入1000mL水，煮沸2h，過(guò)濾得到濾液；再在過(guò)濾后的渣中加入500ml水，煮沸提取2h，過(guò)濾得到濾液；

2）收集兩次濾液，再加入4倍于濾液的乙醇，4℃攪拌過(guò)夜，離心，過(guò)濾取濾液，濃縮后冷凍真空干燥，即得促神經(jīng)發(fā)生作用瓜子金提取物。

瓜子金提取物的應(yīng)用實(shí)例：

1）將瓜子金溶于生理鹽水配制100ug/ml溶液，每天腹腔注射1ml瓜子金溶液，連續(xù)7天，對(duì)照小鼠每天注射生理鹽水1ml；在第6天注射Brdu（50mg/kg），第7天，取腦，切片，PBS溶液洗3次，每次5分鐘，加入Brdu一抗4℃孵育過(guò)夜，移除一抗，PBS溶液洗3次，每次5分鐘，加入二抗，孵育一個(gè)小時(shí)后，移除二抗，PBS溶液洗3次，每次5分鐘，加入Dapi（細(xì)胞核染料）孵育5分鐘；PBS溶液洗3次，每次5分鐘，封片，在熒光顯微鏡下觀察海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下層區(qū)域BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目

2）將瓜子金溶于生理鹽水配制100mg/ml溶液。每天喂食5ml瓜子金溶液，連續(xù)7天，對(duì)照小鼠每天喂食水，在第6天注射Brdu（50mg/kg），第7天，取腦，切片，PBS溶液洗3次，每次5分鐘，加入Brdu一抗4℃孵育過(guò)夜；移除一抗，PBS溶液洗3次，每次5分鐘；加入二抗，孵育一個(gè)小時(shí)后，移除二抗，PBS溶液洗3次，每次5分鐘，加入Dapi（細(xì)胞核染料）孵育5分鐘；PBS溶液洗3次，每次5分鐘，封片，在熒光顯微鏡下觀察海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下層區(qū)域BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，圖1為拍攝的海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下層熒光照片，箭頭所指的熒光細(xì)胞為BrdU細(xì)胞，代表新分裂產(chǎn)生的細(xì)胞；圖2為海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下層區(qū)域BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果，結(jié)果顯示正常對(duì)照鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下層區(qū)域BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目大約有2200個(gè)，瓜子金提取物處理小鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下層區(qū)域BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目大約有3500個(gè)，新生的細(xì)胞數(shù)目增加了59%。