本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種肉桂多酚組合物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：病毒是人和動物體的重要病原體。據(jù)統(tǒng)計，目前80％以上的傳染病是由病毒引起的。許多非傳染性疾病也與病毒感染有關(guān)。目前針對病毒性傳染病的防治主要以抗病毒藥物及特異性疫苗的應(yīng)用為主。然而多數(shù)病毒性疾病至今尚無特效藥物，能夠應(yīng)用疫苗進(jìn)行防治的病毒性疾病也非常有限。病毒的變異也使有些疫苗的臨床效果受到一定影響。迄今為止，病毒性疾病仍然是醫(yī)學(xué)界感到棘手的一類疾病。中醫(yī)藥對某些病毒性疾病的治療(如艾滋病、病毒性感冒與麻疹、皰疹、乙型病毒性肝炎等等)顯示出一定的優(yōu)勢。在2003年的SARS治療過程中，中醫(yī)藥以其獨特的療效引起世界的關(guān)注，并得到世界衛(wèi)生組織(WHO)專家的肯定(羅云堅、羅翌、李際強，廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2005，22(3)：246-249)。因此，開發(fā)一種能解決上述問題的產(chǎn)品是非常必要的。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種肉桂多酚組合物的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的，所述的肉桂多酚組合物在制備預(yù)防和/或治療病毒感染疾病藥物或藥械中的應(yīng)用。肉桂是我國常用中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，歷代重要本草均有記載。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，肉桂性辛、甘、熱，歸腎、脾心、肝經(jīng)，具有補火助陽、散寒止痛、溫通經(jīng)脈之功效。桂皮為少常用中藥，功用同肉桂，唯藥力較小，作為香料和調(diào)味品廣泛應(yīng)用。此外，肉桂的嫩枝(桂枝)亦供藥用。《中國藥典》規(guī)定肉桂為樟科(Lauraceae)樟屬(Cinnamomum)植物肉桂(C.cassia)的干燥樹皮。但由于各地用藥習(xí)慣不同，許多地區(qū)將多種植物的枝皮代肉桂使用。桂皮的基源則更多。據(jù)調(diào)查，市場上肉桂及桂皮類商品藥材還涉及同屬的大葉清化桂(C.cassiavar.macrophyllum)、錫蘭肉桂(C.zeylanicum)、華南桂(C.austrosinense)、鈍葉桂(C.bejolghota)、陰香(C.burmanni)、天竺桂(C.japonicum)、銀葉桂(C.mairei)、香桂(C.subavenium)、柴桂(C.tamala)、川桂(C.wilsonii)等多種植物(樓之岑、秦波，常用中藥材品種整理和質(zhì)量研究北方編第1冊，北京醫(yī)科大學(xué)、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1995，203-251)。由于藥材性狀相似，鑒別較為困難，實際常有混用的情況。研究表明肉桂中主要含有揮發(fā)油、單萜、倍半萜、二萜、皂苷、香豆素、多酚等多種類型的化合物。肉桂及其所含的成分具有多方面的藥理作用。研究多集中于抗菌、抗氧化、降血糖、抗醛糖還原酶、抗炎、抗補體、抗腫瘤活性，以及對消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、中樞神經(jīng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用(趙凱，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文，肉桂的化學(xué)成分及其質(zhì)量控制研究，2013)。本發(fā)明公開了肉桂多酚組合物的抗病毒活性?；谥屑t外光譜指紋圖譜和總鞣質(zhì)、總糖含量測定技術(shù)建立了肉桂多酚組合物的質(zhì)量控制方法。經(jīng)研究證實，符合本發(fā)明質(zhì)量控制要求的肉桂多酚組合物具有顯著的抗病毒活性。本發(fā)明中的肉桂多酚組合物，具有藥效物質(zhì)基本明確，質(zhì)量可控，藥效更強的特點，適應(yīng)現(xiàn)代制造業(yè)的工藝技術(shù)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化要求。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例4中12批肉桂多酚組合物樣品紅外指紋圖譜疊加示意圖；圖2為肉桂多酚組合物對照指紋圖譜；圖3為小鼠28天存活水平示意圖。具體實施方式下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明肉桂多酚組合物的應(yīng)用為所述的肉桂多酚組合物在制備預(yù)防和/或治療病毒感染疾病藥物或藥械中的應(yīng)用。所述的病毒為副黏液病毒、皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和流感病毒。所述的藥械為空氣濾器。所述的肉桂多酚組合物由以下方法測定紅外光譜指紋圖譜，其指紋圖譜與肉桂多酚組合物對照圖譜的相似度不低于0.90，測定方法如下：取2mg干燥的肉桂多酚組合物樣品和100mg溴化鉀(Kbr)，充分研磨均勻，壓制成均勻透明的樣品片，采用德國布魯克(Bruker)TENSOR27紅外光譜儀，以溴化鉀為空白背景進(jìn)行中紅外光譜檢測，測定范圍4000～400cm-1，掃描次數(shù)10次，光譜分辨率4cm-1。采用Excel對導(dǎo)出的紅外光譜數(shù)據(jù)(dpt格式)進(jìn)行處理，以肉桂多酚組合物對照指紋圖譜為參照，相關(guān)系數(shù)法計算2000～400cm-1范圍的相似度，相似度計算公式：式中，xi，yi為2組光譜數(shù)據(jù)的對應(yīng)點；分別代表2組光譜數(shù)據(jù)的平均值。所述的肉桂多酚組合物中的總鞣質(zhì)量含量不低于15％；其測定方法如下：對照品溶液的配制：精密稱取沒食子酸50mg置100mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，取5mL溶液置50mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得(C＝0.05mg/mL)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密量取對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，分別置25mL棕色量瓶中，各加入磷鉬鎢酸溶液1mL，再分別加水11、10、9、8、7、6mL，用20％碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30min，以相應(yīng)的試劑為空白，在760nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。總酚：精密量取供試品溶液2mL，置25mL棕色量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項下的方法，自“加入磷鉬鎢酸試液1mL”起，加水10mL，依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量(mg)，計算，即得。不被吸附的多酚：精密量取供試品溶液25mL，加至已盛有干酪素400mg的100mL具塞錐形瓶中，密塞，置30℃水浴中保溫1小時，時時振搖，取出，放冷，搖勻，濾過，棄去初濾液，同時用水做一份干酪素空白實驗。精密量取續(xù)濾液2mL，置25mL棕色量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項下的方法，自“加入磷鉬鎢酸試液1mL”起，加水10mL，依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量(mg)，計算，即得。按下式計算鞣質(zhì)的含量：鞣質(zhì)含量＝總酚量-不被吸附的多酚量所述的肉桂多酚組合物中的總糖含量不低于25％；其測定方法如下：對照品溶液的配制：精密稱取10mg葡萄糖對照品置100mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，溶解，即得0.1mg/mL的對照品溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密量取對照品溶液0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL，分別置20ml刻度試管中，各加水至2.0mL，搖勻，加5％的苯酚溶液1mL，室溫下快速加入濃硫酸5mL，冷卻10min，混勻后放置20min，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見分光光度法，在490nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取肉桂多酚組合物供試品溶液1mL置20mL刻度試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項下的方法，自“加水至2.0mL”起，依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中含無水葡萄糖的重量(mg)，計算總糖含量，即得。所述的肉桂多酚組合物中總鞣質(zhì)量含量不低于15％，總糖含量不低于25％。所述的肉桂多酚組合物是以樟屬植物為原料經(jīng)前處理、提取、后處理制備得到，具體包括以下步驟：A、前處理：將原料樟屬植物進(jìn)行干燥、粉碎過篩得到物料a備用；B、提取：將物料a置入提取罐，加入物料a重量2～30倍水，于4～80℃提取1～3次，每次1～24h，濾過，濾液濃縮得到濃縮液b；C、后處理：將濃縮液b加入到酸性磷酸鹽緩沖液中，以鹽酸調(diào)pH值為1～5，靜置，取沉淀部分得到目標(biāo)物肉桂多酚組合物。所述的樟屬植物為肉桂(C.cassia)、大葉清化桂(C.cassiavar.macrophyllum)、錫蘭肉桂(C.zeylanicum)、華南桂(C.austrosinense)、鈍葉桂(C.bejolghota)、陰香(C.burmanni)、天竺桂(C.japonicum)、銀葉桂(C.mairei)、香桂(C.subavenium)、柴桂(C.tamala)、川桂(C.wilsonii)中的一種或幾種。所述的樟屬植物為肉桂(C.cassia)、大葉清化桂(C.cassiaVar.macrophyllum)、錫蘭肉桂(C.zeylanicum)。所述的樟屬植物為肉桂、大葉清化桂和錫蘭肉桂，其重量配比為0～3∶0～3∶0～3。所述的樟屬植物為肉桂、大葉清化桂和錫蘭肉桂，其重量配比為1～3∶1～3∶0～3。所述的樟屬植物為肉桂、大葉清化桂和錫蘭肉桂，其重量配比為1～3∶1～3∶1～3。所述的原料樟屬植物為肉桂、大葉清化桂和錫蘭肉桂，其重量配比為1∶1∶1。所述的原料樟屬植物為肉桂和大葉清化桂，其重量配比為1∶1。所述的原料樟屬植物為肉桂和錫蘭肉桂，其重量配比為1∶1。所述的原料樟樹植物為大葉清化桂和錫蘭肉桂，其重量配比為1∶1。所述的原料為樟屬植物的樹皮和/或枝條。本發(fā)明所述的肉桂多酚組合物的應(yīng)用中的肉桂多酚組合物的藥物制劑為所述的肉桂多酚組合物中加入藥學(xué)上可接受的輔料制備成片劑、膠囊劑、軟膠囊劑、顆粒劑、滴丸、分散片、口腔崩解片、微丸劑、噴劑、膜劑、軟膏劑或凝膠劑。下面以具體實施案例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明：實施例1肉桂多酚組合物的制備肉桂多酚組合物1的制備：將肉桂樹皮粉碎，以10倍量水，常溫浸泡提取3次，每次2小時。濾過，取濾液，濃縮，濃縮液加入pH為6的酸性磷酸鹽緩沖液中，以鹽酸調(diào)pH值至3，靜置。取沉淀部分，即得肉桂多酚組合物1。肉桂多酚組合物2～12的制備：分別取大葉清化桂、錫蘭肉桂、華南桂、鈍葉桂、陰香、天竺桂、銀葉桂、香桂、柴桂、川桂的樹皮以及肉桂的枝條，粉碎，以10倍量水常溫浸泡提取3次，每次2小時。濾過，取濾液，濃縮，濃縮液加入pH為6的酸性磷酸鹽緩沖液中，以鹽酸調(diào)pH值至3，靜置。取沉淀部分，分別得肉桂多酚組合物2～12。肉桂多酚組合物13的制備：將肉桂樹皮粉碎，以2倍量水，4℃冷浸提取1小時。取濾液，濃縮，濃縮液加入pH為6的酸性磷酸鹽緩沖液中，以鹽酸調(diào)pH值至5，濾過。取沉淀部分，即得肉桂多酚組合物13。肉桂多酚組合物14的制備：將肉桂樹皮粉碎，以30倍量水，80℃攪拌提取3次，每次24小時。取濾液，濃縮，濃縮液加入pH為3的酸性磷酸鹽緩沖液中，以鹽酸調(diào)pH值至1，離心。取沉淀部分，即得肉桂多酚組合物13。肉桂多酚組合物15的制備：將肉桂樹皮粉碎，以石油醚回流脫脂，脫脂后的肉桂粉以30倍量60％乙醇70℃提取2.5小時，提取液回收乙醇，以配成濃度為1.2mg/mL的水溶液，調(diào)pH值4.0，過AB-8大孔樹脂柱，先用水洗除雜質(zhì)，再用80％乙醇洗滌，收集80％乙醇洗脫液，回收溶劑，干燥，得肉桂多酚組合物15。肉桂多酚組合物16的制備：將肉桂樹皮、大葉青化桂樹皮按質(zhì)量1∶1比例混合，粉碎，以10倍量水，常溫浸泡提取3次，每次2小時。濾過，取濾液，濃縮，濃縮液加入pH為6的酸性磷酸鹽緩沖液中，以鹽酸調(diào)pH值至3，靜置。取沉淀部分，即得肉桂多酚組合物16。肉桂多酚組合物17的制備：將肉桂樹皮、錫蘭肉桂樹皮按質(zhì)量1∶1比例混合，粉碎，以10倍量水，常溫浸泡提取3次，每次2小時。濾過，取濾液，濃縮，濃縮液加入pH為6的酸性磷酸鹽緩沖液中，以鹽酸調(diào)pH值至3，靜置。取沉淀部分，即得肉桂多酚組合物17。肉桂多酚組合物18的制備：將肉桂樹皮、大葉青化桂樹皮、錫蘭肉桂樹皮按質(zhì)量1∶1∶1比例混合，粉碎，以10倍量水，常溫浸泡提取3次，每次2小時。濾過，取濾液，濃縮，濃縮液加入pH為6的酸性磷酸鹽緩沖液中，以鹽酸調(diào)pH值至3，靜置。取沉淀部分，即得肉桂多酚組合物18。以上肉桂多酚組合物1～18經(jīng)測定，紅外指指紋圖譜與肉桂多酚組合物對照指紋圖譜的相似度均大于0.90，且總鞣質(zhì)含量大于15％，總糖含量大于25％。肉桂多酚組合物為肉桂的主要活性成分，針對其多方面的物理化學(xué)性質(zhì)(如酚羥基的弱酸性，大孔樹脂柱的保留行為等)，可以由不同的方法提取純化。實施例2肉桂多酚組合物總鞣質(zhì)含量的測定1、實驗材料儀器：UV-2450紫外可見分光光度計(日本島津公司)；5510E-DTH超聲儀(美國必能信公司)；Milli-Q超純水機(Millipore公司)；SW22恒溫震蕩儀(美國優(yōu)萊博公司)；CP225D電子分析天平(賽多利斯公司)。試藥：鎢酸鈉(分析純，上海麥克林生化科技有限公司)、鉬酸鈉(分析純，上海麥克林生化科技有限公司)、硫酸鋰(分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、碳酸鈉(分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)、鹽酸(分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)、磷酸(分析純，廣東光華化學(xué)廠有限公司)；干酪素(BR，上海麥克林生化科技有限公司)；沒食子酸對照品(四川省維克奇生物科技有限公司)；肉桂多酚組合物(昆藥集團股份有限公司自制)。2、溶液配制磷鉬鎢酸溶液的制備：取鎢酸鈉100g、鉬酸鈉25g，置1000mL的圓底燒瓶中，加水700mL使溶解，加鹽酸100mL、磷酸50mL，加熱回流10小時，放冷，再加硫酸鋰150g、水50mL和溴0.2mL，煮沸除去殘留的溴(約15分鐘)，冷卻，加水稀釋至1000mL，濾過，即得。避光保存，且本液不得顯綠色。對照品溶液的配制：精密稱取沒食子酸50mg置100mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，取5mL溶液置50mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得(C＝0.05mg/mL)。供試品溶液的配制：精密稱取60mg肉桂多酚組合物置250ml容量瓶，加150mL水溶解，超聲10min，放冷，用水稀釋至250mL，搖勻，靜置，過濾，棄去初濾液50mL。取20mL續(xù)濾液置50mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，即得。3、測定法標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密量取對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，分別置25mL棕色量瓶中，各加入磷鉬鎢酸溶液1mL，再分別加水11、10、9、8、7、6mL，用20％碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30min，以相應(yīng)的試劑為空白，在760nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。總酚：精密量取供試品溶液2mL，置25mL棕色量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項下的方法，自“加入磷鉬鎢酸試液1mL”起，加水10mL，依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量(mg)，計算，即得。不被吸附的多酚：精密量取供試品溶液25mL，加至已盛有干酪素400mg的100mL具塞錐形瓶中，密塞，置30℃水浴中保溫1小時，時時振搖，取出，放冷，搖勻，濾過，棄去初濾液，同時用水做一份干酪素空白實驗。精密量取續(xù)濾液2mL，置25mL棕色量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項下的方法，自“加入磷鉬鎢酸試液1mL”起，加水10mL，依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量(mg)，計算，即得。按下式計算鞣質(zhì)的含量：鞣質(zhì)含量＝總酚量-不被吸附的多酚量4、方法學(xué)考察線性范圍考察：按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項下的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：y＝101.17x-0.1296，R2＝0.9997。結(jié)果表明，沒食子酸對照品在0.0020～0.0120mg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。精密度試驗：精密量取對照品溶液2.0mL，置25mL棕色量瓶中，依次加入磷鉬鎢酸溶液1mL，水10mL，用20％碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30min，以相應(yīng)的空白試劑為空白，在760nm處測定吸光度，連續(xù)測定6次，結(jié)果RSD為0.12％，表明方法精密度良好。重復(fù)性試驗：分別取同一批次肉桂多酚組合物樣品6份，平行制備供試品溶液并依法測定鞣質(zhì)含量，6次測定結(jié)果的RSD為0.53％，表明本方法重現(xiàn)性良好。穩(wěn)定性試驗：樣品顯色后35分鐘內(nèi)穩(wěn)定，須于顯色后35分鐘內(nèi)完成測定。5、結(jié)果與討論本方法以《中國藥典》2015版中規(guī)定的鞣質(zhì)含量測定方法為基礎(chǔ)，根據(jù)肉桂多酚組合物的特點進(jìn)行了如下優(yōu)化：碳酸鈉濃度的選擇：精密移取對照品溶液和樣品溶液各2mL置25mL容量瓶中，加1mL磷鉬鎢酸溶液，加10mL水，分別以1％、5％、10％、15％、20％、25％、29％碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，反應(yīng)30min，以相應(yīng)的試劑為空白，在760nm處測吸光度。結(jié)果隨著碳酸鈉溶液的濃度增大，吸光值也隨著增大，在濃度為20％時，吸光值最大，之后吸光值就緩慢下降，且濃度越大，越容易結(jié)晶。故選擇碳酸鈉的濃度為20％。碳酸鈉體積的選擇：分別精密量取2mL對照品溶液置25mL容量瓶，各加1mL磷鉬鎢酸，分別加水18mL、14mL、10mL、6mL、4mL、2mL，用20％碳酸鈉溶液稀釋至刻度(分別加入4mL、8mL、12mL、16mL、18mL、20mL碳酸鈉溶液)，反應(yīng)30min，以相應(yīng)的試劑為空白，分別測吸光度。在加10mL水時(相當(dāng)于所加碳酸鈉體積為12mL)，測得的吸光度值最大。故選擇加入碳酸鈉溶液體積為12mL。干酪素用量的選擇：為了評價鞣質(zhì)沉淀的效率，對干酪素的用量(200、300、400、500、600、700、800mg)進(jìn)行選擇。結(jié)果表明，加入400mg干酪素即可完全沉淀鞣質(zhì)類成分，故選擇干酪素的用量為400mg。以本方法對5批肉桂多酚組合物的總鞣質(zhì)含量進(jìn)行了測定，結(jié)果分別為25.6％、28.4％、29.1％、32.1％和31.1％。實施例3肉桂多酚組合物總糖含量的測定1、實驗材料儀器：UV-2450紫外可見分光光度計(日本島津公司)；5510E-DTH超聲儀(美國必能信公司)；Milli-Q超純水機(Millipore公司)；CP225D電子分析天平(賽多利斯公司)。試藥：苯酚；濃硫酸；葡萄糖對照品(四川省維克奇生物科技有限公司)；肉桂多酚組合物(昆藥集團股份有限公司自制)。2、溶液配制對照品溶液的配制：精密稱取10mg葡萄糖對照品置100mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，溶解，即得0.1mg/mL的對照品溶液。供試品溶液的配制：精密稱取15mg肉桂多酚組合物樣品置50mL容量瓶中，加水30mL，超聲10min，冷卻，加水稀釋至刻度，過濾，取續(xù)濾液，即得0.3mg/mL的供試品溶液。3、測定法標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密量取對照品溶液0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL，分別置20mL刻度試管中，各加水至2.0mL，搖勻，加5％的苯酚溶液1mL，室溫下快速加入濃硫酸5mL，冷卻10min，混勻后放置20min，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見分光光度法，在490nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取肉桂多酚組合物供試品溶液1mL置20mL刻度試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項下的方法，自“加水至2.0mL”起，依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中含無水葡萄糖的重量(mg)，計算總糖含量，即得。4、方法學(xué)考察線性范圍考察：按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項下的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：y＝53.059x-0.0212，R2＝0.9997。葡萄糖對照品在0.0050～0.0175mg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。精密度試驗：取肉桂多酚組合物樣品，按對照品溶液配制方法制備對照品溶液，依測定法操作，于490nm波長處測定吸光度，連續(xù)測定6次，結(jié)果RSD為0.15％，表明方法精密度良好。重復(fù)性試驗：分別取同一批次肉桂多酚組合物樣品6份，平行制備供試品溶液并依法測定總糖含量，6次測定結(jié)果的RSD為0.98％，表明本方法重現(xiàn)性良好。穩(wěn)定性試驗：樣品顯色后50分鐘內(nèi)穩(wěn)定，須于顯色后50分鐘內(nèi)完成測定。5、結(jié)果與討論本方法以苯酚-濃硫酸比色法為基礎(chǔ)，在建立過程中根據(jù)肉桂多酚組合物的特點進(jìn)行了如下優(yōu)化：苯酚濃度和加入量選擇：本研究對苯酚的濃度(2％～7％)進(jìn)行了考察，結(jié)果以5％苯酚為優(yōu)。進(jìn)而對5％苯酚的加入量(0.4mL～1.4mL)進(jìn)行了研究，結(jié)果以1mL為優(yōu)。濃硫酸加入量選擇：本研究對濃硫酸的加入量(4mL～6mL)進(jìn)行了考察，以5mL的實驗結(jié)果最為穩(wěn)定。檢測波長選擇：本研究用紫外-可見分光光度計在波長400～600nm下進(jìn)行波譜掃描，樣品和對照品經(jīng)測定法處理后于490nm處有最大吸收，因此選擇490nm為測定波長。以本方法對5批肉桂多酚組合物的總糖含量進(jìn)行了測定，結(jié)果分別為36.1％、39.2％、41.7％、36.7％和36.5％。實施例4肉桂多酚組合物紅外指紋圖譜的測定1、實驗材料儀器：中紅外光譜測定采用德國布魯克(Bruker)TENSOR27紅外光譜儀。實驗數(shù)據(jù)相似度分析用Excel2013軟件，紅外圖譜處理及繪制用OriginPro8軟件。試藥：壓片用溴化鉀(KBr)為光譜純，其他試劑均為分析純。肉桂提取物為實施例1中制備的肉桂多酚組合物1～12。2、測定法取實施例1中制備的肉桂多酚組合物1～12各2mg，分別加入100mg溴化鉀(Kbr)，充分研磨均勻，壓制成均勻透明的樣品片，采用德國布魯克(Bruker)TENSOR27紅外光譜儀，以溴化鉀為空白背景進(jìn)行中紅外光譜檢測，測定范圍4000～400cm-1，掃描次數(shù)10次，光譜分辨率4cm-1。采用Excel對導(dǎo)出的紅外光譜數(shù)據(jù)(dpt格式)進(jìn)行處理，以平均數(shù)法生成肉桂多酚組合物對照指紋圖譜。以肉桂多酚組合物對照光譜為參照，相關(guān)系數(shù)法計算2000～400cm-1范圍的相似度，相似度計算公式：式中，xi，yi為2組光譜數(shù)據(jù)的對應(yīng)點；分別代表2組光譜數(shù)據(jù)的平均值。3、方法學(xué)考察精密度試驗：取同一批號樣品依法壓片連續(xù)測定6次紅外指紋圖譜，以平均數(shù)法生成參照指紋圖譜，以參照指紋圖譜計算各色譜圖的相似度。各色譜圖的相似度均大于0.980，且RSD小于0.5％，表明該方法的精密度良好。重復(fù)性試驗：取同一批號樣品6份，分別依法測定紅外指紋圖譜，以平均數(shù)法生成參照指紋圖譜，以參照指紋圖譜計算各色譜圖的相似度。各色譜圖的相似度均大于0.980，且RSD小于0.5％，表明該方法的精密度良好。穩(wěn)定性試驗：取同一批號樣品依法壓片，分別于制備后的0，3，6，9，12，24小時依法測定紅外指紋圖譜，以參照指紋圖譜計算各色譜圖的相似度。各色譜圖的相似度均大于0.980，且RSD小于0.5％，樣品于24小時內(nèi)穩(wěn)定。4、結(jié)果與討論近年來，紅外光譜指紋圖譜在中藥質(zhì)控領(lǐng)域取得了較大進(jìn)展。該方法具有自身鮮明的技術(shù)特點：樣品前處理簡單，基本不使用有毒、有害試劑，分析速度快，操作簡單，分析成本低。紅外光譜指紋圖譜基于分子中官能團振動、轉(zhuǎn)動的能級躍遷，直接反映化學(xué)結(jié)構(gòu)，無需化學(xué)對照品，能夠同時對樣品多種成分進(jìn)行分析表征，反映樣品宏觀(整體)化學(xué)信息，體現(xiàn)中藥作用的整體性和模糊性。本發(fā)明建立了肉桂多酚組合物的紅外指紋圖譜分析方法，該方法可用于肉桂多酚組合物的整體質(zhì)量控制。12批樣品的紅外指紋圖譜及肉桂多酚組合物對照指紋圖譜分別見圖1和圖2。12批樣品指紋圖譜的相似度均大于0.90，表明不同來源肉桂藥材制備的肉桂多酚組合物具有較好的化學(xué)等同性，提示其具有類似的藥理活性，同時也在一個側(cè)面反映了肉桂類藥材臨床混用的合理性。12批總多酚樣品紅外指紋圖的相似度分析樣品相似度樣品相似度肉桂多酚組合物10.98肉桂多酚組合物70.95肉桂多酚組合物20.97肉桂多酚組合物80.96肉桂多酚組合物30.97肉桂多酚組合物90.95肉桂多酚組合物40.95肉桂多酚組合物100.96肉桂多酚組合物50.96肉桂多酚組合物110.97肉桂多酚組合物60.95肉桂多酚組合物120.98實施例5肉桂多酚組合物的體外抗病毒活性測試1、實驗材料測試樣品：肉桂多酚組合物(昆藥集團股份有限公司自制)樣品配制：肉桂多酚組合物用無菌水溶至8mg/mL并于80℃水浴中加熱15分鐘溶解。溶液于2000RPM離心2分鐘后取上清儲存于4℃作為肉桂多酚組合物母液。參照化合物由藥明康德提供。在EC50測定實驗中，肉桂多酚組合物和參照化合物被3倍倍比稀釋測試8個濃度點，每個濃度測試雙復(fù)孔。最高測試濃度為1000μg/mL。細(xì)胞培養(yǎng)基中的DMSO最終濃度為0.5％。表1抗病毒實驗測試化合物列表病毒：本研究選用了4個不同類型的病毒測定KPC的抗病毒活性(表2)。表2測試病毒列表細(xì)胞：Hep-2細(xì)胞、VeroE6細(xì)胞、MRC5細(xì)胞和MT-4細(xì)胞。試劑：細(xì)胞活力檢測試劑CellTiter-Glo(Promega)、細(xì)胞活力檢測試劑CCK-8(天津百螢)。2、實驗方法所測試的4個病毒中，其中3個是以病毒的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)實驗測定肉桂多酚組合物的抗病毒活性。HCMV實驗則采用熒光衰減實驗測定。病毒實驗方法總結(jié)于下表。表3抗病毒實驗方法列表RSVAlong、HSV-1病毒致細(xì)胞病變實驗：細(xì)胞以一定密度(表3)接種到微孔板并于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，第二天，不同濃度的化合物和病毒(表3)的預(yù)混液加入細(xì)胞板中于37℃，5％CO2培養(yǎng)3-5天至病毒對照孔中的細(xì)胞病變完全。細(xì)胞活性隨后使用CCK8細(xì)胞活力檢測試劑盒按照檢測試劑的說明進(jìn)行檢測。化合物不同濃度下的抗病毒活性由對病毒引起的細(xì)胞病變效應(yīng)的抑制作用來決定。所有數(shù)據(jù)經(jīng)空白感染對照校準(zhǔn)。EC50由GraphPadPrism軟件進(jìn)行分析計算。HIV-1病毒致細(xì)胞病變實驗：測試化合物和參照化合物倍比稀釋后與病毒(表3)混合，隨后化合物和病毒的混合液與MT-4細(xì)胞加入微孔板并于33℃或37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-6天至病毒對照孔中的細(xì)胞病變完全。細(xì)胞活性隨后使用CCK8或CellTiterGlo細(xì)胞活力檢測試劑盒按照檢測試劑的說明進(jìn)行檢測?；衔镌诓煌瑵舛认碌目共《净钚杂蓪Σ《疽鸬募?xì)胞病變效應(yīng)的抑制作用來決定。EC50由GraphPadPrism軟件進(jìn)行分析計算。HCMV熒光衰減實驗：本實驗中使用的人巨細(xì)胞病毒(HCMV)通過基因重組插入報告基因EGFP，病毒的復(fù)制由GFP的表達(dá)水平來反映?；衔锏目共《净钚钥梢酝ㄟ^化合物對感染細(xì)胞中的GFP的表達(dá)水平的影響來測定。MRC5細(xì)胞以20,000細(xì)胞/孔的密度種入96孔板，隨后置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。第二天，不同濃度的化合物和病毒的預(yù)混液加入細(xì)胞板中并于37℃，5％CO2培養(yǎng)4天。GFP的熒光強度由AcumeneX3(TTPLabTech)檢測?；衔锏目共《净钚钥梢酝ㄟ^化合物對感染細(xì)胞中的GFP的表達(dá)水平的影響來測定。EC50由GraphPadPrism軟件進(jìn)行分析計算。數(shù)據(jù)分析：因為肉桂多酚組合物的顏色在450nm有吸光度。為了消除化合物顏色對CCK8檢測的影響，實驗測試板在加入CCK8之前檢測了本底的吸光度值。原始數(shù)據(jù)＝加入CCK8后的吸光度值-加入CCK8前的吸光度值?；衔锏目共《净钚员硎緸橐种坡?％)，計算公式如下：抑制率(％)＝(Rawdatacpd-AverageVC)/(AverageCC-AverageVC)*100Rawdatacpd表示化合物樣品孔的信號值，AverageVC、AverageCC分別表示病毒對照、細(xì)胞對照的平均信號值?；衔锏腅C50值由GraphPadPrism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理得出。3、實驗結(jié)果本實驗所有抗病毒活性實驗的參照化合物的抗病毒活性與預(yù)期符合，證明本實驗結(jié)果可靠。肉桂多酚組合物的抗病毒活性結(jié)果見表4。表4.肉桂多酚組合物抗病毒活性列表實施例6不同來源肉桂多酚組合物的體外抗HSV-1病毒活性測試1、實驗材料測試樣品：實施例1中的肉桂多酚組合物1～18；肉桂多酚組合物19～20為市售肉桂多酚組合物(購自陜西榮康生物科技有限公司，經(jīng)測定與肉桂多酚組合物對照指紋圖譜相似度大于0.90，總鞣質(zhì)含量大于15％，總糖含量大于25％)；肉桂提取物21～22為市售肉桂提取物(經(jīng)測定與肉桂多酚組合物對照指紋圖譜相似度小于0.90，總鞣質(zhì)含量小于15％，總糖含量小于25％)；CEppt1～2參照中國專利CN1897958B中CEppt的制備方法制備。樣品配制：同實施例5樣品配制。病毒：HSV-1(GHSV-UL46)。細(xì)胞：VeroE6細(xì)胞。試劑：細(xì)胞活力檢測試劑CCK-8(天津百螢)。2、實驗方法同實施例5HSV-1病毒致細(xì)胞病變實驗。3、實驗結(jié)果本實驗抗病毒活性實驗的參照化合物的抗病毒活性與預(yù)期符合，證明本實驗結(jié)果可靠。不同來源肉桂多酚組合物的抗HSV-1病毒活性結(jié)果見表5。不同來源的肉桂多酚組合物(包括不同藥材基源、不同工藝以及商品肉桂多酚組合物)均表現(xiàn)了較強的抗病毒活性。肉桂提取物21～22為市售肉桂提取物，不符合本發(fā)明肉桂多酚組合物規(guī)定的質(zhì)量要求(紅外指紋圖譜相似度、總鞣質(zhì)含量、總糖含量)，抗病毒活性很弱。CEppt較肉桂多酚組合物的抗病毒活性弱，且批間差異較大。以上結(jié)果表明，本發(fā)明的質(zhì)量控制要求可以對肉桂多酚組合物的質(zhì)量進(jìn)行有效控制，符合本發(fā)明質(zhì)量要求的肉桂多酚組合物具有較強的抗病毒活性，反之抗病毒活性微弱。本發(fā)明的肉桂多酚組合物較CEppt活性強，且質(zhì)量穩(wěn)定。表5.不同來源肉桂多酚組合物抗HSV-1病毒活性列表實施例7肉桂多酚組合物抗H1N1病毒活性測試1、實驗材料與動物分組測試樣品：肉桂多酚組合物(本發(fā)明制備)實驗病毒株：H1N1(A/PuertoRico/8/1934)。病毒通過狗腎細(xì)胞進(jìn)行繁殖。病毒株在-70℃儲存前測得其HA滴定度(HAU)為256；實驗用病毒為250HAU。實驗動物與分組：28-30天年齡的小鼠。A)PBS對照組：6只小鼠。B)病毒組(PR8攻毒組)：8只小鼠(250HAU/只)。C)肉桂多酚組合物給藥組(本發(fā)明組)，共8只小鼠。2、實驗方法指定劑量的肉桂多酚組合物(100ug/只)與病毒(250HAU/只)室溫下用適量的PBS預(yù)先混合培養(yǎng)5-10min。28-30天年齡的小鼠接種預(yù)先混合好的肉桂多酚組合物/病毒溶液或者病毒溶液。肉桂多酚組合物/病毒在PBS中的總體積為50uL/只小鼠。接種前麻醉。PBS做為空白對照。觀察小鼠28天存活水平。3、實驗結(jié)果各組小鼠28天存活水平見圖3。攻毒組小鼠在攻毒后第三天出現(xiàn)死亡，攻毒后一周內(nèi)死亡過半，存活率為37.5％(8只小鼠共計死亡5只)。肉桂多酚組合物給藥組(昆藥組)僅在攻毒后第三天死亡一只，存活率87.5％，結(jié)果揭示肉桂多酚組合物對小鼠有顯著保護(hù)性效果。實施例8肉桂多酚組合物口服制劑的制備肉桂多酚組合物片劑的制備：取肉桂多酚組合物10份，加淀粉6份和滑石粉2份，混勻，用80％(體積百分濃度)乙醇制粒，60℃以下干燥，加入硬脂酸鎂(0.2份)，混勻，壓制成片，即得。肉桂多酚組合物顆粒劑的制備：取肉桂多酚組合物50份，加蔗糖粉(63份)和糊精(31.5份)，混勻，以80％(體積百分濃度)乙醇制粒，60℃以下干燥，整粒，分裝，即得。肉桂多酚組合物膠囊劑的制備：取肉桂多酚組合物30份，加淀粉12份和滑石粉8份，混勻，用80％(體積百分濃度)乙醇制粒，60℃以下干燥，裝膠囊，即得。實施例9肉桂多酚組合物外用制劑的制備肉桂多酚組合物噴劑的制備：取肉桂多酚組合物適量，以超純水溶解，配制成1mg/mL的溶液，灌裝于噴瓶中，即得。肉桂多酚組合物噴劑的制備：取肉桂多酚組合物適量，以超純水溶解，配制成4mg/mL的溶液，灌裝于噴瓶中，即得。肉桂多酚組合物搽劑的制備：取肉桂多酚組合物適量，以超純水溶解，配制成1mg/mL的溶液，即得。肉桂多酚組合物搽劑的制備：取肉桂多酚組合物適量，以超純水溶解，配制成4mg/mL的溶液，即得。實施例10肉桂多酚組合物防病毒口罩的制備取肉桂多酚組合物適量，以超純水溶解，配制成4mg/mL的溶液，于口罩的夾層膜均勻噴涂(100mg肉桂多酚組合物/片)，即得肉桂多酚組合物防病毒口罩。當(dāng)前第1頁1 2 3