本發(fā)明涉及重組高密度脂蛋白在治療妊娠期高血壓疾病中的應(yīng)用，特別是涉及重組高密度脂蛋白的制備，及其在生產(chǎn)用于預(yù)防和治療妊娠期高血壓疾病的藥物中的應(yīng)用。重組高密度脂蛋白的主要特征是蛋白組分包括使用甲基營養(yǎng)酵母生產(chǎn)的重組人載脂蛋白A-I、重組人載脂蛋白E兩種載脂蛋白；并以維生素E代替天然高密度脂蛋白中的膽固醇酯，作為重組高密度脂蛋白的核心部分，使其具有更強(qiáng)的抗氧化活性。

背景技術(shù)：

妊娠期高血壓疾病(HDCP)是最常見的妊娠期并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅母嬰的健康，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦死亡、圍生兒發(fā)病及死亡的主要原因之一(梁娟,李維敏,王艷萍,周光萱,吳艷喬,朱軍,代禮,繆蕾.1996～2000年全國孕產(chǎn)婦死亡率變化趨勢分析.中華婦產(chǎn)科雜志,2003,38(5):257-260)。子癇前期以妊娠20周后高血壓、蛋白尿、水腫為特征，常存在不同程度的代謝綜合癥表現(xiàn)，其中血脂代謝紊亂在子癇前期中表現(xiàn)比較明顯。血脂代謝紊亂可能導(dǎo)致妊娠期高血壓疾病的發(fā)生，并且可能加重病情，引起子宮及胎盤床小動脈的急性動脈粥樣硬化，導(dǎo)致胎盤功能下降、胎兒生長受限、胎兒宮內(nèi)窘迫等不良后果。近年來隨著分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、醫(yī)學(xué)生物工程等科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，人們更加深入地認(rèn)識了HDCP的發(fā)生、發(fā)展過程，但是目前臨床治療高脂血癥的藥物都不能應(yīng)用于孕婦的治療。因此研究新型的既可以降脂同時又對母嬰無毒副作用的藥物，以糾正子癇前期患者的血脂代謝異常及減輕胎盤氧化應(yīng)激損傷，有望成為治療及預(yù)防子癇前期的有效途徑。

目前已有的研究表明，在小鼠發(fā)生子癇前期改變的同時給予高脂飲食，其妊娠結(jié)局更為不良。脂肪浸潤情況較為嚴(yán)重的孕鼠，其胎盤重量、胎仔重量明顯降低，推測胎盤脂質(zhì)過氧化物增多及脂質(zhì)代謝紊亂，導(dǎo)致胎盤滋養(yǎng)葉細(xì)胞能量供應(yīng)不足及胎盤組織細(xì)胞氧化應(yīng)激，從而引起胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮系統(tǒng)功能障礙，影響胚胎發(fā)育，最終導(dǎo)致生長發(fā)育受阻(Sun MN,Yang Z,Ma RQ.Effect of high-fat diet on liver and placenta fatty infiltration in early onset preeclampsia-like mouse model.Chin Med J(Engl),2012,125(19):3532-3538.)。

子癇前期患者體內(nèi)存在子宮螺旋動脈及胎盤床小動脈的急性動脈粥樣硬化(As)并且有著與As相似的血脂異?！狝s的危險因子血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)顯著升高；而保護(hù)因子高密度脂蛋白(HDL)及載脂蛋白A-I(ApoA-I)顯著下降。氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增多，同時幾種重要的抗氧化物缺乏，是子癇前期發(fā)病的主要機(jī)制之一。

HDL，即高密度脂蛋白，在生理上起著將肝外組織的膽固醇運(yùn)送到肝臟的作用，因而可以防止游離膽固醇在肝外組織細(xì)胞上的沉積，是一種抗動脈粥樣硬化的血漿脂蛋白，是冠心病的保護(hù)因子，俗稱“血管清道夫”。HDL的心血管保護(hù)作用主要體現(xiàn)在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)及抗炎、抗氧化功能，升高HDL己經(jīng)成為針對As的一種療效較為肯定的治療方法。HDL可下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶表達(dá)，降低活性氧簇(ROS)水平，發(fā)揮其抗氧化作用(Campbell S,Genest J.HDL-C:clinical equipoise and vascular endothelial function.Expert Rev Cardiovasc Ther,2013,11(3):343-53.)。

國內(nèi)外學(xué)者在升高血漿HDL水平方面進(jìn)行了相關(guān)研究，但是目前研究中的降脂藥物仍存在如下弊端：①他汀類、貝特類、煙酸類等降脂藥存在明顯的副作用，不能用于孕婦及哺乳期婦女。②注射天然HDL可有效糾正由高脂血癥引起的血脂代謝紊亂，預(yù)防或逆轉(zhuǎn)As等并發(fā)癥，具有巨大的臨床應(yīng)用價值。然而，獲得天然的HDL需要大量的血漿，原料來源有限，并且生產(chǎn)成本高、規(guī)模難以擴(kuò)大。③HDL替代療法中使用單一組分的ApoA-I無法實(shí)現(xiàn)HDL功能的多樣性，不能完全替代HDL用于治療。

HDL顆粒包含具有抗氧化活性的載脂蛋白，這包括ApoA-I、載脂蛋白E(ApoE)等。ApoA-I是HDL抗氧化活性的主要成份，可以通過清除LDL、動脈壁細(xì)胞或兩者中氧化的磷脂，抑制或延遲LDL氧化。ApoE的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能和顯著的抗氧化活性使其具有明確的抗動脈硬化活性。此外，ApoE作為受體識別標(biāo)志能與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)特異性結(jié)合，ApoE運(yùn)載循環(huán)中的脂蛋白殘體，與LRP結(jié)合后可以介導(dǎo)脂蛋白殘體的清除。大量的研究已證實(shí)，人早期及進(jìn)展型As斑塊中平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞均有LRP的高表達(dá)(Lupu F,Heim D,Bachmann F,Kruithof EK.Expression of LDL receptor-related protein/alpha 2-macroglobulin receptor in human normal and atherosclerotic arteries.rioscler Thromb,1994,14(9):1438-1444.)。

因此，針對目前已有研究中的不足，本項(xiàng)目利用前期工作中獲得的重組人載脂蛋白A-I(rhApoA-I)、重組人載脂蛋白E(rhApoE)為主要的蛋白成分，利用基因工程技術(shù)、發(fā)酵技術(shù)、蛋白純化技術(shù)、膽酸鈉法，獲得高活性、高產(chǎn)量、低成本的新型重組高密度脂蛋白(rhHDL)顆粒。利用rhApoE-LRP的特異性結(jié)合，使rhHDL靶向作用于子癇前期患者胎盤發(fā)生急性As的血管，發(fā)揮rhApoA-I、rhApoE調(diào)節(jié)血脂代謝，抗氧化應(yīng)激作用。此外，與天然HDL不同的是，在制備rhHDL的過程中，我們還將利用脂溶性抗氧化劑——維生素E取代rhHDL核心的膽固醇酯，使rhHDL具有更強(qiáng)的抗氧化能力。新型rhHDL顆粒治療子癇前期的創(chuàng)新之處就在于，通過rhApoE與子癇前期患者胎盤發(fā)生急性As組織中高表達(dá)的LRP結(jié)合，實(shí)現(xiàn)rhHDL的靶向作用；rhApoE-LRP特異性結(jié)合后，rhHDL顆粒的成分(rhApoA-I、rhApoE和維生素E)釋放于胎盤局部，調(diào)節(jié)血脂轉(zhuǎn)運(yùn)及抵抗氧化應(yīng)激作用雙管齊下，從而減輕子癇前期患者胎盤氧化應(yīng)激損傷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及重組高密度脂蛋白(rhHDL)的制備，特別是涉及rhHDL治療子癇前期，及其在生產(chǎn)用于預(yù)防和治療妊娠期高血壓疾病的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的一個目的是提供一種新的重組高密度脂蛋白(rhHDL)的制備方法，特征在于它的蛋白組分包括使用甲基營養(yǎng)酵母生產(chǎn)的重組人載脂蛋白A-I和重組人載脂蛋白E兩種載脂蛋白以及維生素E。利用膽酸鈉法制備rhHDL(Kato H，Nakano ST，Arai H，et al.Purification,micoheterogeneity，and stability ofhuman lipid transfer protein[J].J Biol Chem，1989，264(7)：4082-4087.)，可得到穩(wěn)定、大小適宜的顆粒。膽酸鈉可促進(jìn)載脂蛋白進(jìn)入卵磷脂的?；?。HDL中載脂蛋白的親脂基團(tuán)結(jié)合膽固醇酯，親水基因暴露在表面突入周圍水相，從而使HDL顆粒能穩(wěn)定地分散在水相中；為提高rhHDL的抗氧化活性，我們利用脂溶性的維生素E為核心合成rhHDL，即利用脂溶性維生素E替代HDL核心部分的脂溶性膽固醇酯，

根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的重組人載脂蛋白A-I是使用甲基營養(yǎng)酵母生產(chǎn)的。該方法包括在以甲醇為碳源和能源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)甲基營養(yǎng)酵母,其中所說的甲基營養(yǎng)酵母是用包括下列可操作連接的元件的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的：(1)甲基可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄啟動子；(2)編碼載脂蛋白A-I的DNA片段；(3)轉(zhuǎn)錄終止子和(4)可選擇標(biāo)志，從而重組表達(dá)產(chǎn)生人載脂蛋白A-I。

根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的重組人載脂蛋白E是使用甲基營養(yǎng)酵母生產(chǎn)的。該方法包括在以甲醇為碳源和能源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)甲基營養(yǎng)酵母,其中所說的甲基營養(yǎng)酵母是用包括下列可操作連接的元件的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的：(1)甲基可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄啟動子；(2)編碼載脂蛋白E的DNA片段；(3)轉(zhuǎn)錄終止子和(4)可選擇標(biāo)志，從而重組表達(dá)人載脂蛋白E。

根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的甲基營養(yǎng)酵母是巴斯德畢赤酵母，并且所說的甲基可誘導(dǎo)的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子均來自巴斯德畢赤酵母AOX1基因。

根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的rhHDL是用膽酸鈉法制備的。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種新的重組高密度脂蛋白(rhHDL)，其主要成分具有天然高密度脂蛋白不具有的維生素E，從而提高rhHDL的抗氧化活性。

氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增多，同時幾種重要的抗氧化物缺乏，是子癇前期發(fā)病的主要機(jī)制之一。血脂代謝紊亂可能導(dǎo)致妊娠期高血壓疾病的發(fā)生，并且可能加重病情。為研究rhHDL是否可以通過“一靶雙效”的作用，減輕子癇前期患者胎盤氧化應(yīng)激損傷。我們研究了rhHDL對子癇前期小鼠胎盤及妊娠結(jié)局的影響。通過靜脈注射一氧化氮合酶抑制劑，可誘發(fā)小鼠子癇前期病變。rhHDL治療的實(shí)驗(yàn)組動物SBP、DBP和尿蛋白水平均顯著下降。同時，rhHDL治療組血清TC、TG、LDL-C和胎盤組織中MDA水平明顯降低，血清中SOD和HDL-C升高，且與模型對照組有顯著性差異。說明rhHDL可通過調(diào)節(jié)血漿中HDL水平，提高機(jī)體抗氧化能力。另外，通過病理組織學(xué)檢查結(jié)果可見，rhHDL治療組胎盤組織纖維素樣壞死和絨毛間質(zhì)水腫有所減輕，且有隨劑量的增大而作用效果更明顯的趨勢。由此可見，rhHDL對子癇前期具有治療作用(詳見實(shí)施例2)。

因此，本發(fā)明的一個目的是提供重組高密度脂蛋白(rhHDL)在生產(chǎn)用于治療妊娠期高血壓疾病的藥物中的應(yīng)用。

根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的妊娠期高血壓疾病選自子癇前期。

附圖說明

圖1顯示透射電鏡下觀察重組高密度脂蛋白(rhHDL)的形態(tài)(放大6000倍的電鏡觀察)。

圖2顯示重組高密度脂蛋白(rhHDL)對子癇前期小鼠胎盤病理組織學(xué)改變的影響(所有組織切片均使用放大400倍的普通光學(xué)顯微鏡觀察)。其中2a為空白對照組；2b為模型對照組；2c為小劑量rhHDL組(10mg/kg)；2d為大劑量rhHDL組(20mg/kg)。

具體實(shí)施方式

以下借助實(shí)施例描述本發(fā)明的最佳實(shí)施方式。這些實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例闡明本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明待批權(quán)利要求的范圍。

實(shí)施例1：重組高密度脂蛋白(rhHDL)的制備

a.取卵磷脂4mg，維生素E10mg，溶于0.5ml無水乙醇。用皮試注射器吸入后快速注入12.1ml PBS中，N₂下攪拌15min；

b.5.4mg膽酸鈉溶于0.5ml PBS；取10mg rhApoA-I、5mg rhApoE 4mg卵磷脂溶于0.8ml PBS中。在攪拌下加入上述液體中；

c.室溫放置30min；移至4℃孵育12h，各組分聚合形成rhHDL；

d.將液體加入孔徑為10kD的蛋白透析袋中，4℃對透析液(PBS)充分透析，去除膽酸鈉。

e.rhHDL的透射電鏡觀察(見附圖1)。

透射電鏡結(jié)果顯示，通過膽酸鈉法處理，維生素E、各種載脂蛋白成分、卵磷脂、膽固醇等成功聚合為球形的rhHDL。該復(fù)合物在透射電鏡下較為均勻圓整，粒徑為150nm～200nm(見附圖1)。利用膽酸鈉法制備rhHDL，可得到穩(wěn)定、大小適宜的顆粒。膽酸可促進(jìn)載脂蛋白進(jìn)入卵磷脂的?；湥?dāng)膽酸鈉與卵磷脂的比例在1/2～2/1范圍內(nèi)，可產(chǎn)生穩(wěn)定rhHDL。

實(shí)施例2：rhHDL對子癇前期小鼠胎盤氧化應(yīng)激損傷及妊娠結(jié)局的影響

1)子癇前期小鼠模型的復(fù)制

選用健康成年性成熟ApoE^-/-60只、C57BL/6J 20只，雌雄各半，8-10周齡。在室溫20-25℃、相對濕度40％-70％的屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)，12小時晝夜戒律照明，不限食水。雌雄小鼠于前日晚10:00按1:1夜間合籠，次日晨7:00前觀察陰道栓。若觀察到陰道栓為妊娠第1天，隔離飼養(yǎng)。C57BL/6J孕鼠為正常對照組，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料；ApoE^-/-孕鼠隨機(jī)分為3組，分別為模型對照組、rhHDL小劑量組和rhHDL大劑量組，飼喂高脂飼料。

自孕11天起，ApoE^-/-孕鼠每天皮下注射一氧化氮合酶抑制劑(L-NAME)50mg/kg/d誘發(fā)子癇前期改變，rhHDL小劑量組和rhHDL大劑量組分別經(jīng)尾靜脈給予10mg/kg、20mg/kg的rhHDL；空白對照組、模型對照組于同一時間給予等量生理鹽水。

自孕2天起，每兩天用動物無創(chuàng)血壓儀檢測孕鼠血壓，連續(xù)測定三次收縮壓和舒張壓，取平均值并做記錄。于標(biāo)本采集前將孕鼠置于標(biāo)準(zhǔn)代謝籠內(nèi)，留取24h尿液，測定尿蛋白含量。通過血壓及尿蛋白進(jìn)行動物模型鑒定。

結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型對照組小鼠SBP、DBP及尿蛋白含量均顯著升高(P<0.01或P<0.001)，表明連續(xù)靜脈注射一氧化氮合酶抑制劑，可誘發(fā)小鼠子癇前期病變。給予rhHDL可顯著降低子癇前期小鼠SBP和DBP，降低尿蛋白含量，表明rhHDL對子癇前期具有治療作用(表1)。

表1 rhHDL對子癇前期小鼠血壓和尿蛋白含量的影響(n＝10)

與正常對照組比較，^**P<0.01,^***P<0.001；與模型對照組比較，^▲P<0.05,^▲▲P<0.01,^▲▲▲P<0.001

2)血脂與生化指標(biāo)測定

各組動物于孕18天進(jìn)行標(biāo)本取材。取材前禁食12h，1％戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔注射麻醉小鼠，眼球摘除法獲得血液標(biāo)本，分離血清，用于測定血脂水平以及SOD活力。另取部分胎盤用冰鹽水制成10％的組織勻漿，用于測定MDA含量。結(jié)果顯示，喂飼高脂飼料的子癇前期小鼠出現(xiàn)血脂代謝紊亂，血清TC、TG、LDL-C均顯著上升，HDL-C水平顯著下降。給予rhHDL后，血清TC、TG、LDL-C均顯著下降，HDL-C水平顯著上升，且隨劑量增加作用效果更為顯著(表2)。對小鼠血清中的SOD活力以及胎盤組織中MDA含量進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，模型對照組血清SOD活力明顯下降，胎盤組織中MDA含量顯著上升。給予rhHDL后，血清中SOD活力明顯上升，而胎盤組織中MDA含量明顯下降，說明rhHDL可通過增強(qiáng)機(jī)體抗氧化，提高機(jī)體清除自由基能力，而對子癇前期小鼠起到治療作用(表3)。

表2 rhHDL對子癇前期小鼠血脂代謝的影響(n＝10)

與正常對照組比較，^**P<0.01,^***P<0.001；與模型對照組比較，^▲▲P<0.01,^▲▲▲P<0.001

表3 rhHDL對子癇前期小鼠SOD和MDA水平的影響(n＝10)

與正常對照組比較，^**P<0.01,^***P<0.001；與模型對照組比較，^▲▲P<0.01,^▲▲▲P<0.001

3)胎仔發(fā)育情況評估

自孕鼠眼眶取血后處死孕鼠，打開孕鼠腹腔，自子宮遠(yuǎn)端沿子宮血管網(wǎng)對側(cè)剪開子宮，依次取出胎仔、胎盤，記錄胎仔數(shù)量、胎仔重量和鼻臀長。

表4rhHDL對子癇前期小鼠胎仔發(fā)育情況的影響(n＝10)

與正常對照組比較，^*P<0.05,^**P<0.01；與模型對照組比較，^▲P<0.05,^▲▲P<0.01

4)胎盤形態(tài)學(xué)觀察

胎盤組織經(jīng)固定、石蠟包埋、切片、HE染色后，于顯微鏡下觀察其病理改變，結(jié)果如下：正常對照組胎盤可見迷路樣結(jié)構(gòu)，未見異常(圖2a)。模型對照組可見纖維素樣壞死，出現(xiàn)絨毛間質(zhì)水腫(圖2b)。rhHDL小劑量組和大劑量組病變程度減輕，且有劑量依賴趨勢(圖2c、2d)。