本發(fā)明涉及紅芪或紅芪多糖在制備預(yù)防和/或治療缺血性血管疾病的藥物中的用途。本發(fā)明進一步涉及含有紅芪或紅芪多糖作為活性成分的藥物組合物。

背景技術(shù)：

缺血性血管疾病已經(jīng)成為威脅人類健康的主要疾病之一，其主要包括缺血性腦血管疾病、缺血性心肌病和缺血性周圍血管疾病，具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率等特點。缺血性血管疾病往往對組織、血管造成不可逆的損失，因血流量和氧供應(yīng)中斷，顯著損害其生理功能或活性，從而導(dǎo)致一系列復(fù)雜的病理生理過程，包括能量代謝紊亂、自由基損失、細胞凋亡、炎癥反應(yīng)等，這些均由缺血缺氧及血流的再灌注引發(fā)，在不同時間點發(fā)生，彼此重疊并相互聯(lián)系。

目前對于缺血性血管疾病治療方法主要集中在藥物治療、介入治療和外科手術(shù)治療，盡管這些治療手段在最近幾十年都取得了很大的進步，但療效仍然不是很明顯，特別是對病變嚴重、缺血面積廣泛的患者。怎么才能夠發(fā)現(xiàn)有效的治療手段，成為人類共同尋找的目標之一。隨著對缺血性血管疾病病理學、病理生理學和細胞分子學研究的日益深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)血管再生對損傷后組織的修復(fù)起著重要的作用。新生血管不僅為局部帶來氧和營養(yǎng)物質(zhì)，而且還增強局部的免疫力、清除壞死組織，加速傷口愈合和組織修復(fù)。促血管再生是治療缺血性血管疾病的一種有效手段，積極有效的發(fā)展、發(fā)現(xiàn)促血管再生的治療方法和藥物，是治療缺血性血管疾病的有效路徑。

在成年動物體內(nèi)根據(jù)再生血管來源的不同，可分為血管新生(Vasculogenesis)、血管生成(Angiogenesis)和動脈生成(Arteriogenesis)。血管新生是指一些相對比較幼稚的祖細胞通過外周血液循環(huán)，到達局部周圍組織，在微環(huán)境作用下在組織間隙中進一步分化成內(nèi)皮細胞，進而形成血管，如內(nèi)皮祖細胞、髓系祖細胞。血管生成是指在原有血管基礎(chǔ)上內(nèi)皮細胞增生、遷移，以出芽的方式而形成新的血管。動脈生成是指以前存在的動脈相對比較小的血管側(cè)枝通過重構(gòu)而形成更大的血管，表現(xiàn)為血管增粗、管腔增大，管腔內(nèi)血流量和血流產(chǎn)生剪切力增加，所屬側(cè)枝進一步成熟。在新生血管方面，血管生成方式占有很重要的地位，故觀察藥物對血管內(nèi)皮細胞的出芽情況，可為篩選出治療缺血性血管疾病藥物提供參考。

缺血性血管疾病屬于中醫(yī)的“虛”證的范疇，目前一致認為是本虛標實，本虛指的是五臟虛損、氣血虧虛；標實指的是痰、瘀血或有風、火。治療的重點是補虛、祛痰、化瘀、熄風、清火等。因此臨床多選擇補益藥、活血化瘀藥、豁痰開竅、熄風止痙和清熱解毒藥進行組分配伍治療缺血性疾病，而且具有一定的療效，然而從現(xiàn)代醫(yī)藥理論的角度來看，這些中藥治療缺血性血管疾病的作用機理仍不清楚，它們的中醫(yī)功效用現(xiàn)代醫(yī)學闡釋是否恰當準確，或者還有更豐富的內(nèi)涵，都需要我們利用現(xiàn)有的醫(yī)學技術(shù)進行驗證和探索。這種驗證或者探索既豐富了中醫(yī)理論，也有可能與現(xiàn)代醫(yī)學碰撞出新的理論，擴大現(xiàn)代醫(yī)學的認知領(lǐng)域。

中醫(yī)藥治療血管生成相關(guān)疾病有著悠久的歷史，且近年來不斷發(fā)現(xiàn)有中藥單體或者復(fù)方對血管生成有促進、抑制或雙向調(diào)節(jié)的效應(yīng)，雖然對治療缺血性血管疾病有很大的促進作用，但還需進一步研究和開發(fā)。紅芪作為傳統(tǒng)中藥，在中醫(yī)臨床上主要用于補氣升陽，固表止汗，利尿消腫，生津養(yǎng)血，行滯通痹，托毒排膿，斂瘡生肌。用于氣虛乏力，食少便溏，中氣下陷，久瀉脫肛，便血崩漏，表虛自汗，氣虛水腫，內(nèi)熱消渴，血虛萎黃，半身不遂，痹痛麻木，癰疽難潰，久潰不斂?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，紅芪具有抗炎、耐缺氧、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、減低血糖、防治老年性癡呆等作用，其主要提取物紅芪多糖在免疫調(diào)節(jié)方面更有突出的表現(xiàn)，能顯著減少體內(nèi)的氧自由基、抑制腫瘤生成，減低血糖，防治老年性癡呆，并能較好的保護心、肝等重要臟器。

關(guān)于紅芪及其提取物對于缺血性血管疾病的研究較少，通過實驗我們首先在觀察到紅芪多糖有促進原代血管環(huán)出芽生長情況的基礎(chǔ)上，以缺血性血管疾病中常見的缺血性腦血管疾病(缺血性腦卒中/腦梗塞)和下肢缺血性疾病為研究載體，通過組織形態(tài)學、免疫組化、神經(jīng)功能評分及腦梗死體積變化等指標考察，發(fā)現(xiàn)紅芪多糖對其均有明顯的保護作用，從而為紅芪多糖防治缺血性血管疾病提供依據(jù)。由于至今仍無紅芪多糖治療缺血性疾病的報道，因此研究紅芪多糖防治缺血性血管疾病的作用極具價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

因此，本發(fā)明一個目的為提供紅芪或紅芪多糖在制備預(yù)防和/或治療缺血性血管疾病的藥物中的用途。

其中所述缺血性血管疾病為缺血性腦血管疾病、缺血性心肌病和缺血性周圍血管疾病。所述缺血性腦血管疾病可以為短暫性腦缺血發(fā)作、動脈硬化性血栓、可逆性缺血性神經(jīng)功能損失、分水嶺腦梗死、腦栓塞、小腦梗死等；所述缺血性心肌病可以為充血型缺血性心肌病和限制型缺血性心肌??；所述缺血性周圍血管疾病可以為動脈硬化性閉塞癥、糖尿病下肢血管病變、血栓閉塞性脈管炎、多發(fā)性大動脈炎、動脈栓塞、靜脈曲張及其并發(fā)病等。

術(shù)語“缺血性腦血管疾病”是指各種原因造成的腦組織缺血性疾病的總稱。引起缺血性腦血管病的病因可分為血管因素、血液動力學因素及血液因素。1.血管因素：主要是動脈硬化，包括動脈粥樣硬化和高血壓小動脈硬化，其他血管因素有腦動脈炎、動脈栓塞(主要來自心臟)。糖尿病及高脂血癥可以促使動脈硬化形成。藥物過敏、中毒以及外傷等也可造成血管損害。2.血液動力學因素：主要是高血壓及低血壓。高血壓造成細小動脈硬化及玻璃樣變損失血管內(nèi)膜，促進動脈粥樣硬化。血壓突然下降可造成嚴重腦缺血或腦梗死。3.血液因素：主要為血液病及血液流變學的異常，如貧血、血粘度增高及糖尿病等因素。

術(shù)語“缺血性心肌病”屬于冠心病的一種特殊類型或晚期階段，是指由冠狀動脈粥樣硬化引起長期心肌缺血，導(dǎo)致心肌彌漫性纖維化，產(chǎn)生與原發(fā)性擴張型心肌病類似的臨床綜合征。

術(shù)語“缺血性周圍血管疾病”是指除心血管和腦血管之外的其他血管因缺血導(dǎo)致的相關(guān)疾病。

為臨床服用方便，所述紅芪可以按照中藥制劑的一般工藝：如直接粉碎，或者經(jīng)常規(guī)的溶媒提取后濃縮制成提取物，也包括常規(guī)溶媒提取后再進一步精制的方法，如過大孔樹脂柱，聚酰胺凝膠。這種制備工藝和方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。

例如，所述紅芪多糖可以如下方法制備：紅芪藥材粉碎，過200目篩，加10、8、6倍量水煎煮3次，每次1小時，過濾，收集濾液，濾液濃縮至1:1后；加無水乙醇至含醇量達20％，靜置，離心，棄去沉淀；繼續(xù)加無水乙醇至含醇量達70％，靜置24h，抽濾，得到沉淀，將沉淀干燥，稱重，10倍量水加熱溶解，趁熱過濾，濾液加胃蛋白酶降解大分子蛋白質(zhì)，然后用Sevag法除蛋白(氯仿：戊醇4：1混合)，得到溶液；將溶液減壓回收去除氯仿和戊醇，加無水乙醇至含醇量70％，靜置24h，抽濾，得到沉淀；將沉淀冷凍干燥，即得。

本發(fā)明進一步涉及一種用于預(yù)防和/或治療缺血性血管疾病的藥物組合物，其含有紅芪或紅芪多糖作為活性成分，以及藥學上可接受的載體。

本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的藥物組合物可以根據(jù)具體的施用方式被配制成各種本領(lǐng)域熟知的制劑形式，例如口服劑型(粉劑、片劑、膠囊、軟膠囊、液體藥物、糖漿、酏丸、散劑、囊劑、粒劑)，或局部施用制劑(乳膏、軟膏、洗劑、凝膠、香脂、膏藥、糊劑、噴霧劑、氣霧劑等等)，或注射制劑(溶液、懸浮劑、乳劑)。

根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以包含藥學上可接受的載體、佐劑或稀釋劑，例如：填充劑、崩解劑、潤滑劑、助懸劑、粘合劑、甜味劑、矯味劑、防腐劑、基質(zhì)等。填充劑例如：淀粉、預(yù)膠化淀粉、乳糖、甘露醇、甲殼素、微晶纖維素、蔗糖等；崩解劑例如：淀粉、預(yù)膠化淀粉、微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯、低取代羥丙纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉等；潤滑劑例如：硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉、滑石粉、二氧化硅等；助懸劑例如：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纖維素、蔗糖、瓊脂、羥丙基甲基纖維素等；粘合劑例如，淀粉漿、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素等。本發(fā)明的組合物可以通過利用本領(lǐng)域任何已知方法制成，以使病人用藥后能提供快速、持久或緩慢釋放的活性成分。

例如，本發(fā)明的組合物可以溶解在油、丙烯乙二醇或其它通常用于制備注射劑的溶劑中，適合的載體實例包括生理鹽水、聚乙烯乙二醇、乙醇、植物油、異丙基十四酸酯等等，但不限于它們。

紅芪或紅芪多糖在所述藥物劑型中可以單獨使用，也可以與其它藥學上有活性的化合物聯(lián)合使用。

本發(fā)明活性成分紅芪或紅芪多糖的給藥劑量可以根據(jù)個體的情況和重量、病情的嚴重程度、藥物形式、給藥途徑以及給藥周期的不同而不同，其也可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員進行選擇。劑量可以是每天單次給藥或每天分多次給藥。

本發(fā)明的藥物組合物通過各種途徑給藥至個體動物如哺乳動物(大鼠、小鼠、馴化動物或人類)，所有的給藥方式均是預(yù)期的，例如，給藥可以是口服、直腸給藥或經(jīng)靜脈、肌肉內(nèi)、經(jīng)皮、鞘膜內(nèi)、硬膜外或腦室內(nèi)注射。

以下將結(jié)合附圖和具體實施例進一步闡明本發(fā)明，但應(yīng)理解其僅是舉例說明的作用，并不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

附圖說明

圖1為顯微鏡(×100)下觀察不同處理組中血管生成的照片，其分別是，A：蒸餾水組；B：紅芪多糖低濃度組；C：紅芪多糖中濃度組；D：紅芪多糖高濃度組。

圖2為顯微鏡(×100)下觀察不同處理組中血管內(nèi)皮細胞出芽分支計數(shù)圖表。

圖3為顯微鏡(×100)下觀察下肢缺血損失模型中各個處理組處理后的蘇木素-伊紅(HE)染色組織切片，其分別是，A：蒸餾水組；B：紅芪多糖低劑量組；C：紅芪多糖中劑量組；D：紅芪多糖高劑量組。

圖4顯示顯微鏡(×400)下觀察的下肢缺血損失模型中各個處理組處理后的Endoglin染色切片，其分別是，A：蒸餾水組；B：紅芪多糖低劑量組；C：紅芪多糖中劑量組；D：紅芪多糖高劑量組。

圖5顯示下肢缺血損失模型中經(jīng)各組經(jīng)免疫組化染色后的血管數(shù)圖表。

圖6顯示各組對腦缺血作用后的神經(jīng)功能評分圖表。

圖7顯示預(yù)防給藥后各組MCAO手術(shù)24h后腦缺血大鼠腦片TTC染色結(jié)果。

圖8顯示各組對腦缺血作用后的腦梗死體積圖表。

具體實施方式

本發(fā)明體外實驗部分以培養(yǎng)Wistar雄性大鼠原代血管環(huán)作為研究的對象，用不同濃度紅芪多糖的水溶液干預(yù)，發(fā)現(xiàn)紅芪多糖不同濃度均有不同程度的促進血管內(nèi)皮細胞出芽生長。

本發(fā)明采用鼠類制作BALB/C小鼠股動脈低位結(jié)扎下肢缺血損傷模型來評價紅芪多糖治療下肢缺血性疾病作用，結(jié)果表明紅芪多糖對下肢缺血損傷模型具有很好的保護作用。

本發(fā)明采用鼠類制作腦缺血模型是抗腦缺血研究最為常用的手段，常用模型有全腦缺血、永久性局灶腦缺血和局灶腦缺血再灌，它們各有特點，從不同角度模擬了缺血性中風急性期的發(fā)病機制。本發(fā)明運用了大鼠永久性腦缺血模型(pMCAO)來評價紅芪多糖抗腦缺血藥物的療效，結(jié)果表明預(yù)防性給予永久性腦缺血大鼠紅芪多糖，可改善腦缺血損傷后的神經(jīng)功能缺失，減小腦梗死體積，實現(xiàn)缺血后的腦保護作用。

本發(fā)明使用的紅芪購自隴南市瑞達中藥材專業(yè)合作社(甘肅武都)，經(jīng)甘肅中醫(yī)學院中藥資源學教研室晉玲教授鑒定為豆科植物多序巖黃芪(Hedysarum polybotrys Hand-Mazz.)的干燥根，使用的紅芪多糖由甘肅中醫(yī)學院藥學院中藥化學教研室邵晶副教授制備并提供。

本發(fā)明使用的試劑若無特殊說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑，可以容易地商購獲得。

下述實施例用于進一步說明本發(fā)明。

實施例1紅芪多糖的提取制備

將紅芪藥材，粉碎，過200目篩，加10、8、6倍量水煎煮3次，每次1小時，過濾，收集濾液。濾液濃縮至1:1后，加無水乙醇至含醇量達20％，靜置，離心，棄去沉淀。繼續(xù)加無水乙醇至含醇量達70％，靜置24h，抽濾，得到沉淀，將沉淀干燥，稱重。10倍量水加熱溶解，趁熱過濾，濾液加胃蛋白酶降解大分子蛋白質(zhì)，然后用Sevag法除蛋白(氯仿：戊醇＝4：1混合)，得到溶液。將溶液減壓回收去除氯仿和戊醇，加無水乙醇至含醇量70％，靜置24h，抽濾，得到沉淀，將沉淀冷凍干燥，即得紅芪多糖。精密稱取1.0g紅芪多糖，用苯酚-硫酸法測定，其純度為85.4％。

實施例2膠囊劑

紅芪多糖50g與280g淀粉混合均勻，用淀粉漿(取淀粉220g用水制成淀粉漿)制顆粒，過篩，干燥，裝膠囊。

實施例3片劑1

紅芪多糖80g與淀粉340g混合均勻，用淀粉漿(取淀粉210g用水制成淀粉漿)制顆粒，過篩，干燥，加6％硬脂酸鎂，混勻，壓制成片，包薄膜衣即可。

實施例4片劑2

紅芪多糖100g，淀粉100g和纖維素適量過篩，并充分混勻，將適量聚乙烯吡咯烷酮溶液與上述的粉混合，過篩，制得濕顆粒與60℃干燥，將羥甲基淀粉鈉鹽，6％硬脂酸鎂和滑石粉預(yù)先過篩，然后加入到上述的顆粒中壓片。

實施例5緩釋制劑

將十八烷醇50g加熱融化，加入75g紅芪多糖、微晶纖維素25g等輔料，冷卻后研磨粉碎過40目篩，加入卡波姆75g混勻，直接壓片。

實驗例1紅芪多糖對原代培養(yǎng)大鼠血管環(huán)作用的研究實驗

1.材料

1.1實驗動物及來源

8周齡，SPF級雄性Wisrt大鼠，體重280-330g，購自蘭州大學實驗動物中心。

1.2藥品及試劑

鼠尾膠原(購自杭州生友生物技術(shù)有限公司)；MCDB131培養(yǎng)基(購自美國GIBCO公司)；紅芪多糖由甘肅中醫(yī)學院藥學院中藥化學教研室提供；胎牛血清(FBS，購自浙江天杭生物科技有限公司)；氫氧化鈉、乙醇等其它常規(guī)試劑均購自于北京化工廠。

1.3試驗儀器

倒置顯微鏡(型號：IX2-SLP，奧林巴斯，日本)，超速低溫離心機(Thermo，美國)，二氧化碳培養(yǎng)箱(STIK，美國)，超凈工作臺(型號：HFsafe-1500生物安全柜，海爾，中國)，數(shù)碼相機(型號：DC300，萊卡，德國)。

2方法

2.1紅芪多糖水溶液的配制

取上述制備的紅芪多糖用蒸餾水配成0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml不同濃度的水溶液，用0.22μm微孔濾器過濾除菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2實驗步驟

雄性Wistar大鼠一只，斷頸處死，在碘伏中浸泡1分鐘，放入75％乙醇中清洗，在超凈臺用彎鑷和眼科剪剪開胸腹皮膚，開胸剪開膈膜、腹膜，取腹主動脈在3cm以上。

將血管至于3ml含有10％FBS培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，用直鑷剝掉動脈外的結(jié)締組織，使血管外膜光滑，取出管腔內(nèi)的血凝塊，將血管剪成十六段，每段長0.1mm，用直鑷放入六孔板底膠上；每孔放四個血管環(huán)。

在四個氨瓶中分別加入20μl 0.1N的NaOH，然后再加入400μl I型鼠尾膠原，混勻后加入1600μL含有5％FBS的MCDB131培養(yǎng)基，吹打混勻后分別在1號瓶中加入20μL蒸餾水(蒸餾水組)，2號瓶中加入20μl 0.5mg/ml紅芪多糖水溶液(紅芪多糖低濃度組)，3號瓶中加入20μl 1.0mg/ml紅芪多糖水溶液(紅芪多糖中濃度組)，4號瓶中加入20μl2.0mg/ml紅芪多糖水溶液(紅芪多糖高濃度組)，混勻后加入六孔板蓋住血管環(huán)并鋪平，靜置十分鐘至凝膠凝固；然后，將其放入37℃5％CO₂孵箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)第二天換液一次。48小時后，觀察出芽的情況，進行拍照，記數(shù)。

2.3統(tǒng)計方法

SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)均以表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，方差齊性用LSD檢驗，方差不齊用Tamhane's T2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3結(jié)果

不同濃度紅芪多糖水溶液對原代培養(yǎng)大鼠血管環(huán)的作用

圖1為不同處理組中血管生成的照片，在顯微鏡下可見內(nèi)皮細胞通過增殖、出芽、分支連接成網(wǎng)的新生血管。對各組進行一、二級血管計數(shù)統(tǒng)計(見圖2)的結(jié)果表明，與對照組(蒸餾水組)相比，紅芪多糖低、中、高濃度組都具有促進血管生成的作用，且紅芪多糖中、高濃度組與蒸餾水組之間的差別具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。因此，確定紅芪多糖有促進血管生成的作用。

實驗例2紅芪多糖對小鼠下肢缺血的實驗研究

1.材料

1.1實驗動物及來源

8周齡，SPF級雄性BALB/C小鼠，體重28-33g，購自蘭州大學實驗動物中心。

1.2藥品及試劑

紅芪多糖由甘肅中醫(yī)學院藥學院中藥化學教研室提供(制備方法如實施例1)；Endoglin(CD105)單克隆抗體、兔抗大鼠二抗均購自abcam公司；山羊血清購自北京諾博萊德科技有限公司；PBS緩沖液、蘇木素染色液均購自武漢博士德生物工程有限公司；伊紅染色液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；曲拉通(trixon)購自Sigma公司；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)購自Amersco公司；鹽酸、乙醇、丙酮、過氧化氫(H₂O₂)均購自于北京化工廠；水合氯醛、多聚甲醛均購自于國藥集團化學試劑有限公司；松節(jié)油型透明劑(TO)I和II購自廣州市中南化工儀器有限公司；氨水購自天津市致遠化學試劑有限公司。

1.3試驗儀器

倒置顯微鏡(型號：IX2-SLP，奧林巴斯，日本)，體視顯微鏡(型號：XTZ-05，上海光學儀器六廠)，恒溫冷凍切片機(型號：DC300，萊卡，德國)。

2方法

2.1紅芪多糖水溶液的配制

取紅芪多糖用蒸餾水配成不同劑量的水溶液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2實驗步驟

SPF級雄性BALB/C小鼠40只，飼養(yǎng)環(huán)境：室溫22-25℃，相對濕度50％-60％，12小時明暗交替，適應(yīng)環(huán)境3天后進入實驗，造模。

BALB/c雄性小鼠秤重以后，按照0.3ml/kg的劑量，用1％水合氯醛腹腔注射麻醉。小鼠麻醉以后，以仰臥位的形式用皮筋固定在手術(shù)板上，用備皮刀片刮去小鼠一側(cè)后肢腹股溝至大腿內(nèi)側(cè)的毛，然后使用碘伏消毒，鋪無菌洞巾，使用眼科鑷輕輕提起皮膚，并用眼科剪從大腿內(nèi)側(cè)沿著血管走形剪開一縱形切口，長約5mm，切口遠端靠近膝關(guān)節(jié)。在10×或20×的體視顯微鏡視野下，使用尖鑷輕輕的刺破膜狀血管鞘。使用顯微器械彎鑷和直鑷分離、游離股動脈，防止損傷股靜脈和股神經(jīng)，在股深動脈起始點的遠端靠近膝關(guān)節(jié)處用7號手術(shù)縫線結(jié)扎股動脈。使用碘伏消毒并縫合皮膚，并給小鼠編號；待小鼠清醒以后放入飼養(yǎng)間飼養(yǎng)，給普通飼料和自由飲水。

模型小鼠被隨機分成四組，分別為蒸餾水組、紅芪多糖高(6g/kg)、中(3g/kg)、低(1.5g/k)劑量組。從術(shù)后第二天開始，各組給藥體積均為10ml/kg，紅芪多糖各組灌服相應(yīng)濃度的紅芪多糖，蒸餾水組灌服等體積的蒸餾水，連續(xù)灌胃7天后，處死動物，取材。

取材時將小鼠其余三個肢體固定在手術(shù)板上，抬起手術(shù)肢，剪開皮膚，完全暴露小腿肌肉。從跟腱到腘窩，使用眼科剪快速游離腓腸肌，并用剪刀修平跟腱部位，將肌肉放在包有鋁箔的硬紙片上，保證肌肉的橫切面；將肌肉和包有鋁箔的硬紙片一同放在液氮罐中保存，其中的標本一部分作石蠟切片，另一部分作后冰凍切片，進行蘇木素-伊紅(HE)染色和Endoglin染色(又名CD105染色)，進行組織學觀察。

其中蘇木素-伊紅(HE)染色步驟如下：

將石蠟切片放置在60℃的孵箱中烤12小時；分別用松節(jié)油型透明劑(TO)I和II透明十分鐘；用100％乙醇浸泡五分鐘；用95％浸泡乙醇五分鐘；用90％浸泡乙醇五分鐘；用80％浸泡乙醇五分鐘；流水沖洗拍干；使用蘇木素染色10分鐘；用流水沖洗去蘇木素染液，約1分鐘，拍干；用0.5％鹽酸-乙醇分化，約5秒鐘；流水沖洗，約1分鐘，拍干；使用氨水返藍，約2分鐘；流水沖洗，約1分鐘，拍干；使用伊紅染色約10分鐘；流水沖洗，約1分鐘，拍干；80％乙醇洗5分鐘；90％乙醇洗5分鐘；95％乙醇洗5分鐘；100％乙醇(I)洗5分鐘；100％乙醇(II)洗5分鐘；松節(jié)油型透明劑(TO)(I)透明十分鐘；松節(jié)油型透明劑(TO)(II)透明十分鐘；中性樹膠封片。

其中Endoglin染色(又名CD105染色)步驟如下：

將冰凍切片用PBS緩沖液水化10分鐘；用3％H₂O₂淬滅內(nèi)源性過氧化物酶，約15分鐘；用1％曲拉通(trixon)洗10分鐘；用PBS緩沖液洗三次，每次5分鐘；使用山羊血清封閉30分鐘；在4℃下與Endoglin的單克隆抗體按一定濃度溫孵過夜；用PBS洗滌三次，每次5分鐘；使用兔抗大鼠二抗試劑盒在37℃下溫孵1小時；用PBS洗滌三次，每次5分鐘；使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)在顯微鏡下控制顯色；將DAB沖洗收集在廢液缸中；蘇木素復(fù)染細胞核3分鐘；用流水稍洗去蘇木素染液；約1分鐘；用1％的鹽酸-酒精分化，約5秒鐘；流水稍洗，約1分鐘；使用氨水返藍，約5秒鐘；流水稍洗，約1分鐘；80％乙醇洗5分鐘；95％乙醇(I)洗5分鐘；95％乙醇(II)洗5分鐘；100％乙醇洗5分鐘；松節(jié)油型透明劑(TO)(I)透明10分鐘；松節(jié)油型透明劑(TO)(II)透明10分鐘；中性樹膠封片；用PBS緩沖液代替一抗，作為陰性對照。

2.3統(tǒng)計方法

SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)均以表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，方差齊性用LSD檢驗，方差不齊用Tamhane's T2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3結(jié)果

3.1紅芪多糖對下肢缺血損失模型組織學觀察結(jié)果

圖3為各個處理組蘇木素-伊紅(HE)染色的組織切片，各劑量組標本蘇木素-伊紅(HE)染色的組織切片上均見大面積的肌肉發(fā)生凝固性壞死，在壞死組織周圍，可見不同分化程度的再生橫紋肌細胞。在蒸餾水處理組標本中可見少許再生的骨骼肌呈條帶狀分布在壞死組織周圍，條帶比較窄(箭頭所示)。在紅芪多糖低、中和高劑量組標本中增生的橫紋肌呈帶狀分布在壞死組織周圍，且高劑量處理組標本中增生的橫紋肌條帶明顯增寬，再生的骨骼肌細胞胞漿也比較豐富(箭頭所示)。

3.2紅芪多糖對下肢缺血損失模型免疫組化染色結(jié)果

膜抗原CD105(Endoglin)作為新生血管的標記，主要表達在新生血管內(nèi)皮細胞或活化的小血管內(nèi)皮細胞細胞膜中，以細胞膜染成棕色作為陽性標準。圖4顯示處理后各組的Endoglin染色切片，圖5顯示免疫組化染色的血管數(shù)，從圖4和圖5可以看出，分別用6g/kg、3g/kg、1.5g/kg的紅芪多糖和蒸餾水灌胃處理各組標本中，Endoglin陽性血管內(nèi)皮細胞主要位于壞死的周邊區(qū)；通過采用“熱區(qū)法”計數(shù)血管密度。結(jié)果顯示紅芪多糖高劑量組中Endoglin陽性血管密度高于其他三組，并有顯著性差異(P<0.05)；3g/kg和1.5g/kg紅芪多糖劑量組中Endoglin陽性血管數(shù)比蒸餾水處理組多，但沒有統(tǒng)計學差異。

綜上，確定了紅芪多糖對下肢缺血損失模型具有保護作用。

實驗例3紅芪多糖抗腦缺血實驗研究

1.材料

1.1實驗動物及來源

6周齡，SPF級雄性SD大鼠，體重200-220g，購自北京維通利華實驗動物公司，合格證號：SCXK(京)2012-0001，飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院中藥研究所實驗動物中心。

1.2藥品及試劑

TTC(氯化2,3,5-三苯基四氮唑)購自南京綠合生化技術(shù)有限公司產(chǎn)品；紅芪多糖由甘肅中醫(yī)學院藥學院中藥化學教研室提供(制備方法同實施例1)；銀杏提取物EGB761(天津泰陽制藥有限公司，批號：H20130206)。

2方法

2.1動物分組及給藥

SPF級SD雄性大鼠40只，飼養(yǎng)環(huán)境：室溫22-25℃，相對濕度50％-60％，12小時明暗交替，適應(yīng)環(huán)境3天后進入實驗。分為假手術(shù)組、模型組、50mg/kg銀杏提取物組、50mg/kg紅芪多糖組。實驗過程中動物自由攝食和飲水，各組均以8ml/kg體積灌胃，其中假手術(shù)和模型組灌服蒸餾水，50mg/kg銀杏提取物組(即625mg銀杏提取物用蒸餾水定容置100ml容量瓶中)，50mg/kg紅芪多糖組(即625mg紅芪多糖用蒸餾水定容置100ml容量瓶中)，灌服相應(yīng)藥物，連續(xù)灌胃5天，每天早上8:00和20:00各灌胃一次。于第6天早上7:00灌胃，每組于灌胃1小時后，麻醉，采用大腦中動脈阻塞(MCAO)造模方法，并于晚上19:00各組開始第二次灌胃，并于造模后24h，神經(jīng)功能評分后，取腦，切片，染色。

2.2 MACO模型的建立

大鼠稱重，10％水合氯醛(0.35ml/kg)腹腔注射麻醉，將其仰臥位固定在解剖手術(shù)臺上，以左側(cè)大腦中動脈為手術(shù)測，頸部備皮，碘伏消毒。行頸部前正中切口，鈍性分離，分離皮下組織，暴露鼓泡腺并將其推向兩側(cè)，鈍性分離組織，暴露頸總動脈鞘。鈍性分離頸總動脈(common carotid artery,CCA)、頸內(nèi)動脈(internal carotid artery,ICA)、頸外動脈(external carotid artery,ECA)及ECA的主要分支動脈、枕動脈、甲狀腺上動脈等，保護周圍神經(jīng)如迷走神經(jīng)不受損傷。先結(jié)扎ECA的主要分支動脈，結(jié)扎CCA近心端，在遠心端置一備用絲線略做結(jié)扎，留作固定線栓用，在ICA近心端置一備用絲線，留作止血用。在CCA上兩條結(jié)扎線之間剪一V型切口，將已備好的線栓插入CCA內(nèi)，稍收緊遠心端結(jié)扎線，將線栓越過ECA和ICA的分叉處進入ICA管腔，緩慢送入顱內(nèi)，遇到輕微阻力時即到達大腦中動脈(middle cerebral artery,MCA)的起始部(插入的平均深度為距頸內(nèi)外動脈分叉處18±0.5mm)，收緊并結(jié)扎CCA上的結(jié)扎線。確認傷口無滲血，逐層縫合肌肉與皮膚，碘伏消毒手術(shù)切口，線栓末端暴露在皮膚外面，并將其標記，術(shù)后注意保溫及切口的護理，手術(shù)動物蘇醒后單籠飼養(yǎng)，保持鼠籠干燥清潔，供應(yīng)流質(zhì)，密切觀察。

假手術(shù)組模型制備同上，但經(jīng)ECA側(cè)壁插入線栓僅約10mm，即線栓并不插入ICA顱內(nèi)段。

2.3 MACO模型入選標準

參照Bederson評分，在大鼠手術(shù)麻醉清醒后進行四個功能等級評分：

0分：無神經(jīng)損傷癥狀；

1分：懸尾試驗不能完全伸展對側(cè)前爪；

2分：前肢抵抗對側(cè)推力能力下降；

3分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈。

2.4 MACO模型的排除標準

取腦時發(fā)現(xiàn)并發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血者；

TTC染色未見缺血灶者。

因上述因素導(dǎo)致各實驗組動物數(shù)不足者，隨時補齊動物數(shù)并重新造模。

3統(tǒng)計方法

SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)均以表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，方差齊性用LSD檢驗，方差不齊用Tamhane's T2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

4結(jié)果

4.1神經(jīng)功能缺損評分

最后一次給藥后24h采用盲法進行神經(jīng)功能評分，進行Bederson評分，Bederson評分分為四個功能等級，0分：無神經(jīng)損傷癥狀；1分：懸尾試驗不能完全伸展對側(cè)前爪；2分：前肢抵抗對側(cè)推力能力下降；3分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈。

4.2大鼠腦梗死體積的評價

應(yīng)用TTC染色對腦梗死體積進行評價。

MCAO大鼠缺血24h后，以10％水合氯醛過量麻醉取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，-20℃冰箱內(nèi)冷凍20分鐘后取出，自前腦額極起向后連續(xù)切出5片厚度約2mm的冠狀位腦切片，將腦片放入預(yù)先配制的2％TTC溶液中，37℃避光孵育約15分鐘，然后將腦片置于新鮮配制的4％多聚甲醛溶液中固定24h，觀察并拍照，正常腦組織呈鮮紅色，壞死區(qū)不染色而呈蒼白色。

分析：應(yīng)用IPWIN 32圖像處理軟件計算梗死體積占同側(cè)腦體積的百分比。

梗死率＝(Vc－Vl)/(Vc×2)×100％

Vc＝d×∑Ac(Ac-正常側(cè)半腦片面積)

Vl＝d×∑Al(Al-患側(cè)半腦片紅色面積)。

表1為紅芪多糖對腦缺血作用后的神經(jīng)功能評分及腦梗死率。結(jié)果顯示，與模型組比：50mg/kg銀杏提取物組、50mg/kg紅芪多糖組的神經(jīng)功能評分及腦梗死率均減低(P<0.05，參見圖6～8)

表1紅芪多糖對腦缺血作用后的神經(jīng)功能評分及腦梗死率

注：與假手術(shù)組比較，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001；與模型組比較，^△P<0.05，^△△P<0.01，^△△△P<0.001

綜上，確定紅芪多糖對腦缺血具有保護作用。

以上對本發(fā)明的實施例進行了詳細說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。