本發(fā)明涉及化合物Fistulains A的新用途，尤其涉及Fistulains A在制備抗幽門螺桿菌藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
幽門螺旋桿菌是一種螺旋形、微厭氧、對(duì)生長(zhǎng)條件要求十分苛刻的革蘭氏陰性桿菌。1983年首次從慢性活動(dòng)性胃炎患者的胃粘膜活檢組織中分離成功，是目前所知能夠在人胃中生存的惟一微生物種類。幽門螺旋桿菌病包括由幽門螺旋桿菌感染引起的胃炎、消化道潰瘍、淋巴增生性胃淋巴瘤等。幽門螺旋桿菌病的不良預(yù)后是胃癌。因此，尋找高效、安全的抗Hp活性一類新藥物成為一個(gè)重要和迫切的任務(wù)。
本發(fā)明涉及的化合物Fistulains A是一個(gè)2015年發(fā)表(Min Zhou，et al.,Fistulains A and B,New Bischromones from the Bark of Cassia fistula,and Their Activities.Org.Lett.2015,17,2638-2641.)的新化合物，該化合物擁有全新的骨架類型，具有抗病毒作用(Min Zhou，et al.,Fistulains A and B,New Bischromones from the Bark of Cassia fistula,and Their Activities.Org.Lett.2015,17,2638-2641.)，對(duì)于本發(fā)明涉及的Fistulains A在制備抗幽門螺桿菌藥物中的用途屬于首次公開。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有Fistulains A研究中未發(fā)現(xiàn)其具有抗幽門螺桿菌活性的報(bào)道的現(xiàn)狀，提供了Fistulains A在制備抗幽門螺桿菌藥物中的應(yīng)用。
所述化合物Fistulains A,結(jié)構(gòu)如式(Ⅰ)所示：
所述Fistulains A在制備抗幽門螺桿菌藥物中的應(yīng)用，幽門螺桿菌為幽門螺桿菌Helicobacter pylori，Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 43504。
一種抗幽門螺桿菌藥物，由Fistulains A為活性成分添加輔料制備而成，制備方法為取5克化合物Fistulains A,加入糊精195克，混勻，常規(guī)壓片制成1000片。
一種抗幽門螺桿菌藥物，由Fistulains A為活性成分添加輔料制備而成，制備方法為取5克化合物Fistulains A，加入淀粉195克，混勻，裝膠囊制成1000粒。
本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)istulains A的抑制幽門螺旋桿菌活性的能力比氨芐西林強(qiáng)，說(shuō)明對(duì)于與幽門螺旋桿菌密切相關(guān)的急、慢性胃炎、胃、十二脂腸潰瘍等疾病來(lái)講，F(xiàn)istulains A是一個(gè)極具開發(fā)潛力的化合物。它可直接用于相應(yīng)疾病的治療以及相關(guān)藥物的制備。
本發(fā)明涉及的Fistulains A在制備治療抗幽門螺桿菌藥物中的用途屬于首次公開，由于骨架類型屬于全新的骨架類型，而且其對(duì)于幽門螺桿菌抑制活性強(qiáng)得意想不到，不存在由其他化合物給出任何啟示的可能，具備突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)，同時(shí)用于幽門螺桿菌感染的防治顯然具有顯著的進(jìn)步。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明所涉及化合物Fistulains A的制備方法參見文獻(xiàn)(Min Zhou，et al.,Fistulains A and B,New Bischromones from the Bark of Cassia fistula,and Their Activities.Org.Lett.2015,17,2638-2641.)
以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實(shí)施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。
實(shí)施例1：本發(fā)明所涉及化合物Fistulains A片劑的制備：
取20克化合物Fistulains A,加入制備片劑的常規(guī)輔料180克，混勻，常規(guī)壓片機(jī)制成1000片。
實(shí)施例2：本發(fā)明所涉及化合物Fistulains A膠囊劑的制備：
取20克化合物Fistulains A，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉180克，混勻，裝膠囊制成1000粒。
下面通過(guò)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明其藥物活性。
實(shí)施例3：Fistulains A的藥理實(shí)驗(yàn)
1)供試菌株
幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 43504購(gòu)于美國(guó)菌種保存中心 (American Type Culture Collection，ATCC)。15株Hp臨床菌株采自江蘇省人民醫(yī)院消化科、江蘇省中醫(yī)院檢驗(yàn)科和南京市兒童醫(yī)院胃鏡室接受胃鏡檢查的患者；在連續(xù)胃鏡檢查中對(duì)消化性潰瘍、十二指腸球炎或疣狀胃炎的患者，先經(jīng)快速尿素酶實(shí)驗(yàn)確定為Hp陽(yáng)性者，再取胃竇黏膜1-2塊，切碎后接種于含8％馬血清、三甲氧芐氨嘧啶(trimethropin,TMP)1.25g/L、多粘菌素(polymyxin)B2500U/L、萬(wàn)古霉素(vancomycin)10mg/L的Columbia選擇性瓊脂培養(yǎng)基中，于37℃在微氧環(huán)境下(5％O2,10％CO2和85％N2)培養(yǎng)72小時(shí)。收集細(xì)菌，經(jīng)涂片革蘭氏染色，氧化酶、觸酶和尿素酶鑒定為陽(yáng)性后，傳代純培養(yǎng)，所得菌株作為實(shí)驗(yàn)菌株。
2)菌株培養(yǎng)
我們采用微需氧袋(購(gòu)自上海醫(yī)科大學(xué))進(jìn)行HP的菌株培養(yǎng)，它可通過(guò)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生Hp所需要的微需氧環(huán)境。
3)生物活性測(cè)定
采用紙片法測(cè)定化合物對(duì)幽門螺桿菌的抑制作用，用瓊脂稀釋法來(lái)測(cè)定供試樣品的最低抑菌濃度(MIC)。
I.紙片法實(shí)驗(yàn)
(A)準(zhǔn)備培養(yǎng)基將配制好的Columbia培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，冷卻至50-60℃，加8％馬血清或綿羊血，混勻傾注于已經(jīng)滅菌的培養(yǎng)皿中，每皿7-10ml，培養(yǎng)基厚度為1.5mm(無(wú)菌操作)。
(B)轉(zhuǎn)接實(shí)驗(yàn)菌(涂菌)用微量取樣器取稀釋好的108CFU/ml(1OD660＝108CFU/ml)Hp的菌懸液0.1ml均勻地涂抹在適宜的培養(yǎng)皿表面。倒置于37℃烘干箱中15min后取出，目的使瓊脂表面干燥，備用。
(C)貼樣品紙片用微量取樣器取6μl待測(cè)樣品(質(zhì)量濃度2mg/ml)注入已經(jīng)滅菌的圓濾紙片上。用無(wú)菌鑷子鑷取含樣品的紙片和對(duì)照空白紙片，按無(wú)菌操作分別紙片緊貼于含菌瓊脂表面，每隔一定距離貼一張紙片。每種菌做3皿，所得結(jié)果求其平均值。
(D)培養(yǎng)將各平皿置于微需氧袋中，封口，打開氣體發(fā)生器，再置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。
(E)測(cè)抑菌圈直徑取出平板后，分別測(cè)量各紙片周圍抑菌圈直徑的大小。參照對(duì)照組的結(jié)果，可得出待測(cè)樣品敏感實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。重復(fù)三次。
II.瓊脂稀釋法測(cè)定MIC
(A)藥物平板的制備首先將測(cè)試的化合物用二甲基亞砜(DMSO)溶液配制成0.5mg/ml的母液，再用無(wú)菌水稀釋，最終配成10.0，8.0，6.0，4.5，4.0，3.5，3.0，2.5，2.0，1.5，1.0，0.5和0.25μg/ml的濃度系列，DMSO在介質(zhì)中的濃度小于1％。將1ml配制好的測(cè)試化合物溶液與保溫于50℃的9ml哥倫比亞培養(yǎng)基另加1ml保溫于50℃的馬血清充分混勻，澆制入培養(yǎng)皿中冷卻即成。
(B)轉(zhuǎn)接實(shí)驗(yàn)菌(涂菌)用微量取樣器吸取稀釋好的1×108CFU/ml Hp的菌懸液0.1ml均勻地涂抹在培養(yǎng)皿表面，倒置于37℃烘干箱中15min后取出，目的使瓊脂表面干燥，備用。
(C)確定MIC將待測(cè)培養(yǎng)皿在微需氧袋(含：85％N2,10％CO2和5％O2)中，保溫37℃培養(yǎng)72小時(shí)，觀察Hp生長(zhǎng)情況，與空白組相對(duì)照，以完全沒(méi)有菌生長(zhǎng)的樣品最低濃度為最低抑菌濃度(MIC)值。陽(yáng)性對(duì)照為氨芐西林。
體外實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)istulains A具有很強(qiáng)的抗幽門螺旋桿菌活性，紙片法顯示其抑菌圈直徑為16mm(ATCC43504)。用瓊脂稀釋法顯示它能完全抑制5個(gè)隨機(jī)的臨床菌株(Hp001、Hp003、Hp004、Hp018和Hp036)和1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC43504)的生長(zhǎng)，最小抑菌濃度(MIC)均為0.56μg/ml。用氨芐西林作陽(yáng)性對(duì)照，其對(duì)6株測(cè)試菌完全抑制的最小濃度(MIC)為3.3μg/ml。
結(jié)論：Fistulains A抑制幽門螺旋桿菌活性的能力比氨芐西林強(qiáng)，說(shuō)明對(duì)于與幽門螺旋桿菌密切相關(guān)的急、慢性胃炎、胃、十二脂腸潰瘍等疾病來(lái)講，F(xiàn)istulains A是一個(gè)極具開發(fā)潛力的化合物。它可直接用于相應(yīng)疾病的治療以及相關(guān)藥物的制備。